CN101061216A - 用于生产哺乳动物细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产具有改进特性(如更快生长速率和生长为更高细胞密度的能力)的哺乳动物细胞的方法。本发明还涉及用于生产具有在缺少组分(如胰岛素和胰岛素替代物)的介质中生长的能力的细胞。本发明还涉及具有改进生长特性和/或在缺少组分(如胰岛素和胰岛素替代物)的介质中生长的能力的分离哺乳动物细胞。

Description

用于生产哺乳动物细胞的方法
技术领域
本发明涉及生产(制备)具有改进的生长特性的哺乳动物细胞系，其可用于高水平生产重组蛋白和其它细胞产物。
背景技术
哺乳动物细胞经常用作用于生产重组蛋白的宿主。工业情形中的目标是在最短时间内同时在最低成本下生产最大量的重组蛋白。可采用各种常用方案来从哺乳动物细胞增加重组蛋白产率。通常，总蛋白产率可通过增加生产蛋白的细胞(其在给定时间期内生长)的数量而增加。一种用来增加获得的细胞数量的方案是增大培养基尺寸(大小)。与普通实验室培养条件相比，工业环境中生物反应器的使用允许充分增大培养体积。然而增大培养体积需要显著增加设备和介质成本。
另一种用来从哺乳动物细胞提高重组蛋白产率的方案是改进用来生产该蛋白的细胞的生长特性。例如，与通常用于工业蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞相比，生长更快和/或在培养基中生长为更高密度和/或在培养基中保持更长时间期的存活力(生存力)的细胞将有利于更高的蛋白质产率。改进的细胞生长可有效地通过优化所使用的培养基来实现。然而，优化培养基成本昂贵，并且细胞的固有特性可能限制所获得的细胞量，这与介质的改进无关。
工业规模的重组蛋白生产的成本高度取决于在培养基中所使用的成分。血清是传统包括在细胞培养基配方中的一种成分。尽管血清可提供培养基中细胞生长所需的因子，但是血清较昂贵并且是未确定的组分。在血清中发现的蛋白质和其它物质可干扰由在含血清的介质中生长的细胞所生产蛋白质的分离和纯化。另外，在用于生产生物制药产品的培养基中使用血清会引起多种安全和管理问题。血清的使用增大将污染因子(如病毒和可遗传蛋白因子)引入培养基中的可能性。因此，血清的使用受到管理机构的阻止。因此，对于从哺乳动物细胞生产重组蛋白，高度优选无血清的培养条件，并且有些情况下也是必要的。
然而，为了在无血清条件下生长哺乳动物细胞，有必要在培养基中包括替代血清的各种成分。在无血清介质中，最昂贵的成分通常是胰岛素。尽管已经知晓并可利用胰岛素替代物，但是这样的替代物如果不比胰岛素本身更昂贵，也是同等地昂贵。
鉴于前述因素和考虑，很明显，在本领域存在对于在合理成本下提高哺乳动物细胞的蛋白质产率的需要。
发明内容
本发明通过提供用于生产具有改进的生长特性和/或在缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法来满足前述需要。
根据本发明的一方面，提供了用于生产一种或多种具有改进生长特性的哺乳动物细胞的方法。根据本发明这个方面的方法包括：(a)使(i)哺乳动物细胞的初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受(经历)低于70％的细胞初始种群保持存活的选择(性)条件；以及(b)获得一种或多种在该选择条件下保持存活的哺乳动物细胞。当从选择循环(选择周期)获得的细胞和细胞初始种群在大致相同培养条件下生长时，从选择循环获得的细胞表现出的整个细胞面积(integral cell area，ICA)比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。根据本发明的这个方面，示例性的选择条件包括在生物反应器中孵育细胞(细胞的初始种群或从选择循环获得的细胞)。
本发明这个方面的基础是观察到在批处理或补料分批的生物反应器中生长的细胞的细胞存活力下降。因此，生物反应器环境可提供生产具有改进生长特性的细胞的选择压力。用于选择具有改进生长特性的细胞的生物反应器的使用在本文中可以总体地称为“生物反应器进化(bioreactor evolution)”。
根据本发明的另一方面，提供了用于生产一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法。根据本发明这个方面的方法包括：(a)使(i)不能在无胰岛素的介质中生长的哺乳动物细胞的初始种群(例如，在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中表现出低于0.20天-1的平均生长速率(增长率)的哺乳动物细胞)或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基进行接触；以及(b)获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞。从选择循环获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
根据本发明的又一方面，提供了用于生产一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞。根据本发明这个方面的方法包括实施两个单独的、连续选择过程，每一选择过程包括一个或多个选择循环。第一选择过程包括一个或多个第一选择循环，其中每一个第一选择循环包括：(a)使(i)哺乳动物细胞的初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件；以及(b)获得一种或多种在该选择条件下保持存活的哺乳动物细胞。第二选择过程包括一个或多个第二选择循环，其中每一个第二选择循环包括：(c)使(i)一种或多种从一个或多个第一选择循环获得的细胞或(ii)在步骤(d)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基进行接触；以及(d)获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞。从第二选择循环获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
根据本发明又一个方面，提供了具有改进生长特性的哺乳动物细胞。例如，本发明这个方面提供一种或多种分离的CHO细胞，当分离的CHO细胞和对照细胞在基本上相同的培养条件下生长时，该分离的CHO细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比对照细胞例如DG44 CHO细胞相应的ICA大至少25％。本发明这个方面还提供一种或多种分离的CHO细胞，其在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育时，表现出的ICA比对照细胞例如在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育的DG44 CHO细胞相应的ICA大至少25％。本发明这个方面还提供具有改进生长特性的哺乳动物细胞，其中该细胞利用任何在本文其它地方描述的本发明方法获得。
根据本发明又一方面，提供了用于生产多肽的方法。根据本发明这个方面的方法包括：(a)将编码多肽的核酸分子引入一种或多种分离的细胞中；以及(b)在其中该多肽从该核酸分子表达的条件下培养含有该核酸分子的细胞。在根据本发明这个方面的方法中，其中引入了核酸分子的细胞是：(1)任何在本文其它地方描述的本发明的细胞，和(2)利用任何在本文其它地方描述的本发明方法获得的任何细胞。
附图说明
图1是曲线图，示出了作为在补料分批工艺中时间的函数的对照细胞系(SF DG44＝“正常的(regular)”)的存活细胞密度和从生物反应器进化工艺获得的细胞系(DG44(E)＝“进化的(evolved)”)的存活细胞密度。“正常”细胞的十-天ICA为7.84×106。“进化”细胞的十-天ICA为1.43×107。相比于“正常”细胞，“进化”细胞在峰细胞密度上达到107％的增加并且在ICA上达到82％的增加。
图2是柱状图，示出了在有或者没有胰岛素的介质中连续传代后的DG44(E)细胞的生长速率。对于两个DG44-I谱系C和E示出了从去除胰岛素后的七个传代。I系列是在含有5mg/mL重组胰岛素Zn的介质中传代的相同宿主。
图3是柱状图，示出了胰岛素(重组胰岛素Zn或干复津(Intergen)胰岛素)以及钒酸盐对DG44-I细胞(谱系C和E)的生长速率的影响。生长速率是基于三天传代的，其中胰岛素或钒酸盐在传代开始时加入。对照表示没有胰岛素或钒酸盐。
图4是曲线图，示出了作为时间的函数的来自三个反复的生物反应器周期(bioreactor run)(1、2和3轮)的CHO/Test细胞系衍生物的存活细胞密度(vc/mL)。对来自每个周期的两个样品(A和B)进行检测。
图5是曲线图，比较了作为在补料分批工艺中时间的函数的CHO/Test起始细胞系的存活细胞密度(vc/mL)和CHO/Test(E)细胞系(获自生物反应器进化工艺)的存活细胞密度。
具体实施方式
改进的生长特性
本发明包括用于生产一种或多种具有改进生长特性的哺乳动物细胞的方法。本发明还包括具有改进生长特性的哺乳动物细胞。如本文所使用的，辞句“具有改进生长特性的哺乳动物细胞”意思是指这样的哺乳动物细胞，与经历基本上相同培养条件下的基准细胞或细胞种群相比，其表现出：(i)更快的生长速率，和/或(ii)达到更高细胞密度的能力，和/或(iii)保持更长时间期存活的能力。
本发明的某些方面包括使细胞的初始种群经历一个或多个选择循环。在某些情况下，选择循环可包括使细胞经历选择条件，例如低于70％的细胞初始种群保持存活的条件。相比于基准细胞或细胞种群，从选择循环获得的细胞可表现出一种或多种改进的生长特性。基准细胞或细胞种群可以是在本发明方法中所用的细胞初始种群。
在其它方面，本发明的细胞相对于本领域已知的基准细胞或细胞系具有改进的生长特性。本领域已知的示例性基准细胞系是称为DG44的CHO细胞系(Urlaub et al.，Somatic Cell and Molecular Genetics 12：555-566(1968))。DG44细胞可商购获自例如Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA。其它已知和可获得的细胞在本发明内容中可用作基准细胞。
本领域普通技术人员易于理解如何确定所给细胞是否具有如本发明上下文中使用的这个术语的改进生长特性。例如，为了确定所给细胞(例如通过本发明方法生产的细胞)是否具有改进的生长特性，本领域技术人员可测量在该细胞经历确定设置的培养条件时获得的生长速率和/或细胞密度，并将这些值与利用经历相同或基本上相同确定设置的培养条件的基准细胞获得的生长速率和/或细胞密度进行比较。在某些情况下，为了确定所给细胞是否相对于基准细胞具有改进的生长特性，将该细胞和基准细胞在缺少选择条件(例如，在缺少本发明方法的选择循环中所使用的选择条件)中进行生长。如果从由本发明方法生产的细胞获得的数值大于从基准细胞获得的数值，则通过本发明方法生产的细胞具有“改进的生长特性”。
辞句“改进的生长特性”也可用术语“整个细胞面积”(ICA)来表达。ICA计算如下：
ICA＝#天×[(最后细胞密度-初始细胞密度)]/ln(最后细胞密度/初始细胞密度)]。
在上面的等式中，“#天”是指细胞在培养基中孵育的天数，在这个时间点测量“最后细胞密度”。“初始细胞密度”是在培养周期开始时培养基中的细胞密度。ICA可用术语“X-天ICA”来表达。例如，如果细胞在培养基中孵育十天，则ICA可以表达为“十-天ICA”。其中“试验”细胞的ICA大于在相同或基本上相同培养条件下生长的基准细胞的ICA，则认为“试验”细胞具有“改进的生长特性”。
用于生产具有改进生长特性的哺乳动物细胞的方法
本发明包括用于生产一种或多种具有改进生长特性的哺乳动物细胞的方法。根据本发明这个方面的方法包括实施一个或多个选择循环，其中每一个选择循环包括：(a)使(i)哺乳动物细胞的初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件；以及(b)获得在该选择条件下保持存活的一种或多种哺乳动物细胞。
根据本发明这个方面，当从选择循环获得的细胞和细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从选择循环获得的细胞优选表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
ICA可用术语“X-天ICA”来表达。例如，如果将细胞在培养基中孵育2、3、4、5、6、7、8、9或10天，则ICA可以分别表达为2-天ICA、3-天ICA、4-天ICA、5-天ICA、6-天ICA、7-天ICA、8-天ICA、9-天ICA或10-天ICA。“细胞初始种群相应的ICA”是利用用来计算从选择循环获得的细胞的ICA相同的“天数”参数计算的细胞初始种群的ICA。例如，如果从选择循环获得的细胞的ICA用术语“十-天ICA”来表达，则细胞初始种群相应的ICA为细胞初始种群的十-天ICA。同样，如果从选择循环获得的细胞的ICA用术语“五-天ICA”来表达，则细胞初始种群相应的ICA为细胞初始种群的五-天ICA。
低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件包括任何培养条件、选择压力或产生大量的低于70％的细胞起始数量的存活细胞的操作。本领域普通技术人员将会理解这样的条件并在本文其它地方论述。
为了确定所给选择条件是否是使低于70％的细胞初始种群保持存活的条件，本领域普通技术人员可以例如用一定数量的细胞接种培养基，使该培养基经历被认为是用来减少细胞存活的条件，并随着时间监测该培养基中存活细胞的数量。可用来鉴定低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件的示例性参数包括：温度(例如，热或冷的温度)、介质组成(例如，存在有害影响细胞存活性的组分，例如毒性化合物，或缺少对于最佳细胞存活所需的组分)、大气压、氧气和CO2浓度、pH、摩尔渗透压浓度、培养基尺寸(例如，非常大或非常小的培养体积)、培养瓶类型、细胞在培养基中孵育的时间量、以及任何上述参数的组合。
因此，示例性选择条件包括但不限于：(a)在约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃或更高的温度下在培养基中孵育细胞；(b)在约20℃、约18℃、约16℃、约14℃、约12℃、约10℃、约8℃或更低的温度下在培养基中孵育细胞；(c)在培养基中孵育细胞较长时间期(例如，至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多天)；(d)在没有更新或变换介质的情况下，在培养基中孵育细胞较长时间期(例如，至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多天)；(e)在含有一种或多种外源性或内源性毒性成分的介质中孵育细胞；(f)在缺少动物衍生组分(例如，血清、BSA、水解物等)的介质中孵育细胞；以及(g)在具有在对于培养基中细胞生长的最佳pH范围之外的pH的介质中孵育细胞(例如，约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、8.0、8.5、9.0、9.5或更高的pH)。
已经观察到，在生物反应器中孵育的细胞的存活性随时间降低(参见实施例1和3)。因此，在本发明的某些方面，低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件包括在生物反应器中孵育细胞。例如，本发明的某些方面包括使哺乳动物细胞的初始种群经历一个或多个选择循环，其包括在生物反应器中孵育细胞约1至20天。用来在任何设置的生物反应器操作条件下实现低于70％存活性所花费的时间量可通过以规定间隔监测生物反应器中的细胞存活力而易于确定。多种类型的生物反应器在本领域是已知的并且是可利用的。生物反应器可从多个来源商购获得，包括例如Sartorius BBI Systems，Inc.(Bethlehem，PA)，Applikon(Schiedam，The Netherlands)，Bellco Glass，Inc.(Vineland，NJ)，Wave Biotech，LLC(Bridgewater，NJ)，Dasgip AG(Jülich，Germany)，和New Brunswick Scientific，Co.(Edison，NJ)以及其它来源。任何本领域已知和可利用的生物反应器，或利用已知方法和组件构建的生物反应器可用于本发明方法的实施。
“在生物反应器中孵育细胞”包括在标准操作参数(参见实施例1)、或在偏离这样的参数的条件下在生物反应器中孵育细胞。生物反应器周期可以是批处理培养(没有加料)或补料分批培养(在周期期间添加原料制剂)。在本发明方法的内容中可以更改的生物反应器参数包括例如使用的介质种类、温度、pH、溶解的O2、搅拌、补料次数、原料配方、以及运转周期(时间量)。
当在生物反应器中孵育细胞时，使用的介质可以是允许选择具有改进生长特性的细胞的任何介质。在某些具体实施方式中，使用的介质是已被优化用于培养所选特定细胞系的介质。用于培养哺乳动物细胞的介质在本领域是熟知的，并可从例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，MO)，HyClone(Logan，UT)，Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)，Cambrex Corporation(E.Rutherford，NJ)，JRH Biosciences(Lenexa，KS)，Irvine Seientific(SantaAna，CA)，以及其它来源获得。
在本发明的某些方面，选择条件包括在生物反应器中孵育细胞1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、5至10、5至20、5至30、5至40、5至50、5至60、5至70、5至80、5至90、5至100、或更多天。例如，选择条件可包括在生物反应器中孵育细胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或更多天。
在其它具体实施方式中，低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件包括在缺少或基本上缺少血清和/或胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育细胞。术语“胰岛素”包括来自人和非人动物的胰岛素。“胰岛素”还包括胰岛素锌(例如人胰岛素锌)和胰岛素相关(或胰岛素类)生长因子(例如，IGF-1和IGF-2)、以及融合蛋白及其衍生物(例如，LongR3，一种来源于IGF-1的融合蛋白(Morris and Schmid，Biotechnol.Prog.16：693-697(2000))。术语“胰岛素替代物”包括任何允许细胞可以在化学定义上缺少胰岛素的含锌化合物。胰岛素替代物的实例包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌以及硫酸锌(美国专利第6,733,746号)。其它胰岛素替代物包括例如具有胰岛素激动剂活性的针对胰岛素受体的抗体(美国专利第4,761,371号)。如果介质不含胰岛素和胰岛素替代物或者含有的胰岛素和胰岛素替代物的量使DG44CHO细胞在介质中的生长速率为0.20天-1或更低，则该介质“基本上”缺少胰岛素和胰岛素替代物。例如，根据本发明这个方面的方法包括使细胞初始种群经历一个或多个包括在无胰岛素介质中孵育细胞的选择循环。
在本发明的某些方面，低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件不包括使该细胞与含有外源性添加了氨和/或乳酸的培养基进行接触。
如本文所使用的，术语“经历(经受)”包括但不限于使细胞与特定组分(例如，培养基或其它固体、液体或半固体物质)进行接触，物理地操作细胞(例如，将细胞放入生物反应器，通过离心使细胞造粒，在过滤器中收集细胞，将细胞从一个培养环境转移到另一个培养环境等)，和/或操控细胞周围的环境(例如，调节细胞周围的培养基的温度或化学组成)。
根据本发明这个方面的方法可包括使细胞初始种群仅经历单个选择循环。例如，细胞初始种群可在生物反应器中生长一个时间期(例如1至20天)以使低于70％的细胞初始种群保持存活。然后获得存活细胞(例如，从生物反应器移出)并且确定它们的ICA(例如，它们的十-天ICA)并与细胞初始种群相应的ICA(例如，细胞初始种群的十-天ICA)进行比较。在某些情况下，单个选择循环将产生具有的ICA至少比细胞初始种群相应的ICA大25％的细胞。
在其它情况下，使细胞经历多个选择循环(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个选择循环)可能是理想的。例如，当希望从所述方法获得的细胞具有的ICA充分大于(例如50至100％大于)细胞初始种群相应的ICA时，多个选择循环可能是合适的。本领域普通技术人员将理解多个而不是单个选择循环什么时候是合适的。
描述使用多个选择循环的非限制性实例如下：首先，细胞初始种群在生物反应器中孵育一个时间期(例如，1至20天)以使低于70％的细胞初始种群保持存活。然后使存活细胞经历第二个生物反应器周期，例如在相同条件下并且达到如第一个生物反应器周期的相同时间量。在一些情况下，后续生物反应器周期的操作参数不同于前面周期的操作参数。然后使存活细胞经历另外的生物反应器周期或收获(例如，从该生物反应器移出)，并确定它们的ICA(例如，十-天ICA)。
在某些具体实施方式中，“恢复期”可包括在选择循环之间。在恢复期中，使从前面的周期获得的细胞经受高于70％的细胞初始种群保持存活的培养条件，即其中去除或降低选择压力的培养条件。在一些情况下，恢复期包括使从前面周期获得的细胞经受约80％至100％的细胞初始种群保持存活的培养条件。在恢复期后，使细胞经历另一个选择循环或收获该细胞(例如，从生物反应器移出)并确定它们的ICA(例如，十-天ICA)。
“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的细胞”意思是指将存活细胞从低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件移出，和/或从细胞去除选择压力。例如，细胞可通过过滤或离心“获得”。“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的细胞”可包括从非存活细胞分离存活的细胞；然而，从非存活细胞分离存活的细胞不是本发明方法实施所必需的。
“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的细胞”可包括从起始培养瓶(例如，烧瓶或生物反应器)移出细胞并将它们放入新的培养瓶或存储容器中。“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的细胞”还可以包括暂时地从起始培养瓶移出细胞并将它们放回相同的培养瓶中。
在某些情况下，“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的细胞”简单地涉及改变选择条件。例如，如果原始选择条件包括在含有随时间而耗尽的成分的介质中孵育细胞，则“获得一种或多种细胞”可简单地通过补充培养基中的该成分而实现。尽管在这样的情况下，细胞从未物理地从原始培养瓶移出(用于本发明的目的)，但是补充具有耗尽成分的介质被认为是“获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的哺乳动物细胞”。在一些情况下，在补充该成分后，使细胞经历一个或多个另外的选择循环。
从根据本发明这个方面的方法获得的细胞优选表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。本领域普通技术人员将能够容易地判断从本发明方法获得的细胞是否为表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。例如，在一个或多个选择循环之前，细胞初始种群可在特定设置的培养条件(例如以特定的介质组成，在特定培养温度等)下生长十天。测量初始细胞密度和最后细胞密度，并根据以下公式计算细胞初始种群的十-天ICA：ICA＝#天×[(最后细胞密度-初始细胞密度)/ln(最后细胞密度/初始小密度)]。通过本发明方法获得的细胞的十-天ICA可利用相同或类似的培养条件以类似方式进行确定。
当从本发明方法获得的细胞和细胞初始种群在基本上相同培养条件下生长时，通过比较从本发明方法获得的细胞的ICA(例如，它们的十-天ICA)与细胞初始种群相应的(例如，十天)ICA，本领域普通技术人员能够确定从本发明方法获得的细胞是否比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。
哺乳动物细胞的初始种群是两种或多种哺乳动物细胞的任何种群。可用于本发明方法的哺乳动物细胞种类在本文其它地方讨论。在初始种群中的个体细胞可具有相同或基本上相同的表型和/或遗传型特性。可选替换地，在初始种群中的个体细胞可具有彼此互不相同的表型和/或遗传型特性，即，细胞的初始种群可以是细胞的混合种群。
细胞的初始种群可以是能够在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的细胞。细胞的初始种群可以是能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长的细胞。如果介质不含血清或血清的量使DG44 CHO细胞在该介质中的生长速率为0.20天-1或更低，则该介质“基本上”缺少血清。在一些具体实施方式中，细胞初始种群是能够在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物以及血清的介质中生长的细胞。
在本发明的一些具体实施方式中，细胞初始种群是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物(例如已适应于无血清介质的CHO细胞)。例如，细胞的初始种群可以是CHO DG44细胞、已适应于无血清介质的CHO DG44细胞、和/或已适应于在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的CHO DG44细胞。细胞初始种群可以是CHO-K1细胞、CHO DUKX-B11细胞。其它的可用于本发明内容的细胞在本文其它地方讨论。
根据本发明的某些具体实施方式，细胞的初始种群可包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。可从外源性核酸分子表达的示例性多肽在本文其它地方讨论。外源性核酸分子可在组成型启动子的控制下或在诱导型启动子的控制下。
从本发明方法获得的细胞可以是克隆相同的。可选替换地，从本发明方法获得的细胞可以是克隆不同的。例如，在从本发明方法获得的细胞(其表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％)中，可能存在与通过该方法获得的其它细胞相比包含遗传变异的个体细胞。从本发明方法获得的细胞对于大量下游应用很有用，与它们是否是克隆相同的无关。然而，在本发明的一些具体实施方式中，该方法进一步包括亚克隆从选择循环获得的细胞。用于亚克隆哺乳动物细胞的方法在本领域是已知的。
用于生产具有在缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法
本发明还包括用于获得一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法。许多胰岛素对于本领域普通技术人员是已知的(Gilman，A.G.et al.，Eds，ThePharmacological Basis of Therapeutics，Pergamon Press，New York，1990，pp.1463-1495.)。术语“胰岛素”包括胰岛素锌(例如，人胰岛素锌)和胰岛素相关(或胰岛素类)生长因子(例如，IGF-1和IGF-2)。术语“胰岛素替代物”包括任何允许细胞可以在化学定义上缺少胰岛素的含锌化合物。胰岛素替代物的实例包括但不限于氯化锌、硝酸锌、溴化锌以及硫酸锌。如果介质不含胰岛素和胰岛素替代物或含有的胰岛素和胰岛素替代物的量使DG44 CHO细胞在介质中的生长速率为0.20天-1或更低，则该介质“基本上”缺少胰岛素和胰岛素替代物。
根据本发明这个方面的方法包括实施一个或多个选择循环，其中每一个选择循环包括：(a)使(i)在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中表现出低于0.20天-1的平均生长速率的细胞初始种群或(ii)从步骤(b)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基进行接触；以及(b)获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的细胞。从选择循环获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
根据本发明这个方面的方法还包括实施两个单独的、连续选择过程，每一个选择过程包括一个或多个选择循环。第一选择过程包括一个或多个第一选择循环，其中每一个第一选择循环包括：(a)使(i)哺乳动物细胞初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件；以及(b)获得一种或多种在该选择条件下保持存活的哺乳动物细胞。第二选择过程包括一个或多个第二选择循环，其中每一个第二选择循环包括：(c)使(i)从一个或多个第一选择循环获得的一种或多种细胞或(ii)在步骤(d)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基进行接触；以及(d)获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的细胞。从第二选择循环获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
如本文所使用的，表述“生长速率”以下等式进行定义：
生长速率＝ln(最后细胞密度/初始细胞密度)/#天。
从根据本发明这个方面的方法获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1、0.35天-1、0.40天-1、0.45天-1、0.50天-1、0.55天-1、0.60天-1、0.65天-1、0.70天-1、0.75天-1、0.80天-1、0.85天-1、0.90天-1或更高的生长速率。
根据本发明的这个方面，细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基接触的时间量达这些细胞的细胞存活性降至零的时间。在一些具体实施方式中，细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基接触1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、或4至5天。
根据本发明这个方面的方法可包括使细胞初始种群仅经历单个选择循环。例如，细胞初始种群可与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物接触例如十天。然后分离存活的细胞(例如，从该介质移出)并计算它们在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中的生长速率。在某些情况下，单个选择循环将产生在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.25天-1的生长速率的细胞。
在其它情况下，使所述细胞经历多个选择循环(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多选择循环)可能是理想的。例如，当希望从该方法获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有显著大于0.25天-1的生长速率时，则多个选择循环可能是合适的。本领域普通技术人员将理解多个选择循环而不是单个选择循环什么时候是合适的。描述使用多个选择循环的非限制性实例为如下：首先，细胞的初始种群与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质接触一个时间期(例如，4至5天)。然后存活的细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的新鲜介质接触例如另一个4至5天。然后存活的细胞或者再次与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的新鲜介质进行接触，或者收获并检测生长速率。
在某些具体实施方式中，“恢复期”可包括在选择循环之间或在多轮选择循环之间。在恢复期中，从前面周期获得的细胞在包含胰岛素和/或胰岛素替代物的介质中孵育一个时间期(例如，1至10天)。在该恢复期后，细胞进行生长速率分析或者经历另一个选择循环。
“获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的细胞”意思是指从缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中移出存活的细胞，和/或用含有或缺少胰岛素和/或胰岛素替代物的新的介质代替该介质。例如，细胞可通过过滤或离心进行分离。“获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的细胞”可包括从非存活细胞分离存活的细胞；然而，从非存活细胞分离存活的细胞对于本发明方法的实施是非必需的。
“获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞”可包括从培养瓶(例如烧瓶或生物反应器)移出细胞并将它们放入新的培养瓶或存储容器中。“获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞”还可包括暂时从培养瓶移出细胞并将它们放回到包含例如缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的新鲜介质的相同培养瓶中。
在某些情况下，“获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞”简单地涉及用也缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的新鲜介质或用含有胰岛素和/或胰岛素替代物的新鲜介质代替缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质。可选替换地，“获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞”可包括将胰岛素和/或一种或多种胰岛素替代物添加到培养基。尽管在这样的情况下，细胞从未物理地从原始培养瓶移出(用于本发明的目的)，但是介质的替代或将胰岛素和/或胰岛素替代物添加到介质被认为是“获得在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的一种或多种细胞”。
根据本发明这个方面获得的细胞，虽然它们能够在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长，但在某些具体实施方式中，与它们在缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中的生长特性相比，它们可以在补充有(a)胰岛素、(b)一种或多种胰岛素替代物、(c)钒酸盐以及(d)它们的组合的介质中表现出改进的生长特性(参见实施例2)。
哺乳动物细胞的初始种群是两种或多种哺乳动物细胞的任何种群。可用于本发明方法的哺乳动物细胞的类型在本文其它地方讨论。在初始种群中的个体细胞可具有相同或基本上相同的表型和/或遗传型特性。可选替换地，在初始种群中的个体细胞可具有彼此不相同的表型和/或遗传特性，即细胞的初始种群可以是细胞的混合种群。
细胞的初始种群可以是已根据本文所述的任何方法获得的细胞。例如，用于本发明这个方面的细胞初始种群可以是已经历一个或多个选择循环(包括使细胞初始种群经受低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件以及分离一种或多种在该选择条件下保持存活的细胞)的细胞，其中从选择循环获得的细胞表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。通过将已通过这样的方法获得的细胞用作本发明这个方面的细胞初始种群，可获得具有改进生长特性(更快生长和/或达到更高细胞密度的能力)以及在缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的细胞(参见实施例2)。
根据本发明的某些具体实施方式，细胞初始种群包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。可从外源性核酸分子表达的示例性多肽在本文其它地方讨论。外源性核酸分子可在组成型启动子的控制下或在诱导型启动子的控制下。
具有改进生长特性和/或在缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的细胞。
本发明还包括具有改进生长特性和/或在缺失胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞。
例如，本发明包括一种或多种分离的CHO细胞，当该分离的CHO细胞和DG44 CHO细胞在基本上相同的培养条件下生长时，其表现出的ICA比DG44 CHO细胞相应的ICA大至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。在某些具体实施方式中，根据本发明这个方面的分离的CHO细胞能够在缺少或基本上缺少血清和/或胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长。
本发明还包括一种或多种分离的CHO细胞，当在缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的介质中孵育时，表现出的ICA比在缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的介质中孵育的DG44CHO细胞相应的ICA大至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。在某些具体实施方式中，根据本发明这个方面的分离CHO细胞能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
用于确定ICA和用于将一个细胞种群的ICA与另一个细胞种群相应的ICA进行比较的方法在本文其它地方讨论。
本发明还包括一种或多种分离的细胞，当在缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的介质中孵育时，表现出至少0.25天-1、0.30天-1、0.35天-1、0.40天-1、0.45天-1、0.50天-1、0.55天-1、0.60天-1、0.65天-1、0.70天-1、0.75天-1、0.80天-1、0.85天-1、0.90天-1、或更高的生长速率。
根据本发明这个方面的分离细胞可以是已通过本发明的一种或多种方法的实施获得的细胞。例如，本发明包括一种或多种具有改进生长特性的哺乳动物细胞，其中该细胞通过包括实施一个或多个选择循环的方法获得，其中每一个选择循环包括：(a)使(i)细胞初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的细胞起始中保持存活的选择条件；以及(b)获得一种或多种在该选择条件下保持存活的哺乳动物细胞；其中，当从一个或多个选择循环获得的细胞和细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从一个或多个选择循环获得的细胞表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。
本发明还包括一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞，其中该细胞通过包括实施一个或多个选择循环的方法获得，其中每一个选择循环包括：(a)使在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中表现出低于0.20天-1的生长速率的细胞初始种群或在步骤(b)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质进行接触；以及(b)获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中保持存活的细胞；其中从该一个或多个选择循环获得的细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.25天-1的生长速率。
根据本发明这个方面的分离细胞可包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。可从外源性核酸分子表达的示例性多肽在本文其它地方讨论。该外源性核酸分子可在组成型启动子的控制下或在诱导型启动子的控制下。
哺乳动物细胞
本发明的哺乳动物细胞(包括在本发明方法中使用的或通过本发明方法获得的哺乳动物细胞)是能够在培养基中生长的任何哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括例如CHO细胞(包括CHO-K1、CHO DUKX-B11、CHO DG44)、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos；Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠类)、PC12、HEK-293细胞(包括HEK-293T和HEK-293E)、PER C6、Sp2/0、NS0和W138细胞。来源于任何前述细胞的哺乳动物细胞也可使用。本发明的哺乳动物细胞可以是固有细胞或能够在悬浮液中生长的细胞。本发明的哺乳动物细胞可以包括赋予一种或多种希望表型(例如，二氢叶酸还原酶缺陷(dhfr))的一种或多种突变。本发明的哺乳动物细胞可以是已适应于在某些条件下生长的细胞，例如具有在缺少或基本上缺少血清的介质中生长的能力、和/或在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力。
从本发明细胞表达的多肽
本发明的某些具体实施方式包括细胞和/或用于生产细胞的方法，其包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。“外源性核酸分子”是已被引入细胞中的核酸分子或已被引入细胞祖细胞的核酸分子。
外源性核酸分子可包括在载体中。示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌体核酸或其它能够在哺乳动物细胞中自发复制或被复制的核酸分子。典型的表达载体包含转录和翻译终止子、初始序列、以及对于调节外源性核酸分子很有用的启动子。载体还可包括含有至少一个独立终止序列、允许载体在真核细胞和原核细胞中复制(即穿梭载体)、以及用于原核细胞和真核细胞系统的选择性标记物的遗传表达盒。该载体优选包含提供用于选择转化宿主细胞(如赋予对诸如氨比西林或新霉素的抗生素的抗性)的表型特征的标记物。
外源性核酸分子可在一种或多种启动子的控制下。例如，外源性核酸分子可在组成型启动子的控制下或诱导型启动子的控制下。示例性启动子包括来源于人巨细胞病毒的启动子、金属硫蛋白(metallothionine)启动子、SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、鼠类乳腺瘤病毒启动子、劳斯(氏)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或其它证实对于在真核细胞中的表达有效的启动子。
可通过外源性核酸分子编码的多肽包括制药、医药、营养和/或工业价值的多肽。在本发明某些具体实施方式的细胞内发现的外源性核酸分子可编码例如酶(例如β-半乳糖苷酶)；激素；细胞因子；白介素；干扰素；TNF；生长因子(例如，IGF-1)；可溶性受体分子(例如，可溶性TNF受体分子)；神经递质或其前体；营养因子如BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3和NT5；载脂蛋白如ApoAI和ApoAIV；抗肌萎缩蛋白或小肌营养不良蛋白；抑制肿瘤的蛋白如p53、Rb、Rap1A、DCC和k-rev；涉及血凝固的因子如因子VII、VIII和IX；neublastin(神经营养因子)；或所有或部分的天然或人工免疫球蛋白(例如Fab和ScFv，或克隆的IgG的轻链或重链)。
在本发明某些具体实施方式中发现的外源性核酸分子还可编码例如Fit3配体、CD40配体、红细胞生成素(erythropoeitin)、血小板生成素、降钙素、Fas配体、用于NF-κB的受体激活剂的配体(RANKL)、TNF相关的诱导凋亡的配体(TRAIL)、ORK/Tek、胸腺间质衍生的淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子、表皮生长因子、RANTES、生长激素、胰岛素、胰岛素调理素、胰岛素类生长因子、甲状旁腺素、干扰素(例如干扰素β)、神经生长因子、胰高血糖素、白介素1至18、集落刺激因子、淋巴毒素-β、肿瘤坏死因子、白血病抑制因子、制瘤素-M、各种用于细胞表面分子Elk和Hek的配体(如用于eph相关的激酶的配体或LERKS)、以及抗体的轻链或重链。
在本发明某些具体实施方式的细胞中发现的外源性核酸分子还可编码例如用于任何前述多肽的受体，包括肿瘤坏死因子受体(称为p55和p75)的形式、白介素-1受体(1型和2型)、白介素-4受体、白介素-15受体、白介素-17受体、白介素-18受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、用于制瘤素-M和白血病抑制因子的受体、NF-κB的受体激活剂(RANK)、用于TRAIL的受体、BAFF受体、淋巴毒素-β受体、I型和II型TGFβ受体、以及包括死亡结构域的受体如Fas或诱导凋亡的受体(AIR)。
在本发明某些具体实施方式的细胞中发现的外源性核酸分子还可编码例如分化抗原簇的多肽(称为CD蛋白)，例如，在白细胞Tvping VI(Proceedings of the VIth InternationalWorkshop and Conference；Kishimoto，Kikutani et al.，eds.；Kobe，Japan，1996)中披露的那些，或在随后的讨论会中披露的CD分子。这样的分子包括CD27、CD30、CD39、CD40及其配体(CD27配体、CD30配体和CD40配体)。这些中的多种是TNF受体家族的成员，其还包括41BB和OX40；配体常常是TNF家族的成员(如41BB配体和OX40配体)。
在本发明某些具体实施方式的细胞中发现的外源性核酸分子还编码例如金属蛋白激酶-解聚素家族成员、各种激酶、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I、珠蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、TNF-α转化酶(TACE)、以及多种其它酶。
在本发明某些具体实施方式的细胞中发现的外源性核酸分子还可编码例如免疫球蛋白分子或其部分和嵌合抗体(例如，具有连接于鼠抗原结合区的人恒定区的抗体)或其片段。已知许多技术，通过其可操控编码免疫球蛋白分子的DNA而产生编码重组蛋白如单链抗体、具有改进亲和力的抗体或其它基于抗体的多肽的DNA(参见，例如，Larrick et al.，Biotechnology 7：934-938(1989)；Reichmann et al.，Nature332：323-327(1988)；Roberts et al.，Nature 328：731-734(1987)；Verhoeyen etal.，Science 239：1534-1536(1988)；Chaudhary et al.，Nature 339：394-397(1989))。克隆的人源化抗体包括特异结合于淋巴毒素β受体和整合素如VLA-1和VLA-4的那些。这样的抗体可以是激动剂或拮抗剂。
在本发明某些具体实施方式的细胞中发现的外源性核酸分子还可编码融合蛋白。示例性融合蛋白包括例如作为具有免疫球蛋白分子部分的融合体所表达的蛋白质、作为具有拉链部分的融合蛋白所表达的蛋白质，以及新的多功能蛋白如细胞因子和生长因子的融合蛋白(例如，GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。WO93/08207和WO 96/40918描述了制备各种可溶性寡聚形式的分子(称为CD401L)，分别包括免疫球蛋白融合蛋白和拉链融合蛋白；其中描述的技术可用于其它蛋白。
在本发明细胞包含编码多肽的外源性核酸分子的具体实施方式中，在一些情况下，所述多肽可以利用本领域的标准技术从所述细胞分离和/或纯化。例如，在外源性核酸分子编码包含纯化标签的融合多肽的情况下，多肽可以利用特异结合钙标签的抗体或其它化合物进行纯化。例如，编码标签分子的寡核苷酸可以连接在编码多肽的外源性核酸分子的5’或3’末端；该核酸分子可以编码多聚His(如六聚His)，或其它“标签”如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc(其特异结合至该标签的商购获得的抗体或其它化合物是已知的)。这种标签根据多肽的表达而通常融合至该多肽，并且可用作用于从宿主细胞亲和纯化希望的多肽的手段。亲和纯化可例如通过将针对标签的抗体用作亲和基质的柱层析来完成。可选地，该标签接着可通过各种方式如蛋白水解切割从纯化的多肽移出。
用于生产多肽的方法
本发明还包括用于生产一种或多种多肽的方法。任何多肽(包括在本文其它地方描述的那些)可根据本发明这个方面进行生产。根据本发明这个方面的方法包括：(a)实施一个或多个选择循环，其中每一个选择循环包括：(i)使(A)细胞初始种群或(B)在步骤(ii)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的细胞初始种群保持存活的选择条件；以及(ii)获得一种或多种在该选择条件下保持存活的哺乳动物细胞；(b)将编码所述多肽的核酸分子引入从一个或多个选择循环获得的细胞中；以及(c)在其中多肽从该核酸分子表达的条件下培养在(b)中获得的细胞。当从一个或多个选择循环获得的细胞和细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从一个或多个选择循环获得的细胞优选表现出的ICA比细胞初始种群相应的ICA大至少25％。
用于将核酸分子引入细胞中的方法对于本领域普通技术人员是熟知的，包括例如感染、转导、电穿孔、转染以及转化。本领域普通技术人员还将理解可用来培养细胞使多肽从核酸分子表达的条件类型。在许多情况下，其中多肽从核酸分子表达的条件包括简单地在合适介质中培养包含该核酸分子的细胞。随着细胞在培养基中生长和增生，多肽被生产。这尤其是当核酸分子在组成型启动子的控制下时的情况。当核酸分子在诱导型启动子的控制下时，其中多肽被表达的条件包括例如在存在诱导性刺激下培养细胞。核酸分子可以在遗传控制元件(其在特定物质存在于细胞周围介质中时抑制表达)的控制下。在这样的情况下，其中多肽被表达的条件可以包括在缺少抑制从核酸分子的表达的物质的情况下培养该细胞。
根据本发明这个方面的方法可以进一步包括处理该细胞以使多肽从细胞释放。用于处理细胞以使多肽(其中产生的)从该细胞释放的方法在本领域是已知的，并且包括例如化学破坏细胞和物理破坏细胞，例如煮沸、冷冻、研磨、以及物理和化学破坏细胞的组合。这样的方法包括产生从细胞萃取的蛋白质。
一旦从细胞释放，则由核酸分子编码的多肽可利用熟知的技术进行纯化。该多肽可包含有利于纯化多肽的标签，其通过使该标签与固定化合物(其特异识别和结合该标签)进行接触。
对于相关领域的普通技术人员来说很明显，在不背离本发明和其任何具体实施方式的范围的情况下，对本文描述的方法和应用的其它合适更改和变化是显而易见的并且可以形成这样的更改和变化。现已详细描述了本发明，通过参考以下实施例将使本发明更清楚地被理解，以下提供的实施例仅用于说明的目的而不用于限制本发明。
                        实施例
                        实施例1
在生物反应器中能够具有更高峰细胞密度和ICA的进化DG44
               宿主细胞系(DG44(E))的形成
介绍
用来增加从宿主细胞获得的产物的量的一种方式是增加宿主细胞的ICA。这可通过增加生长速率、增加最大细胞密度、和延迟死亡期来实现。ICA的增加可通过优化介质、进料和物化参数而在一定程度上获得。然而，通过利用遗传选择方法，甚至更大的ICA增加是有可能的。
在这个实施例中，描述了一种方法，其中在生物反应器工艺的后期发现的抗细胞死亡刺激物的细胞通过试图鉴定具有改进生长特性的细胞系加以选择。已观察到，细胞在补料分批生物反应器工艺中停止生长并开始死亡。存活性降低的可能因素包括营养限制、代谢废物堆积和摩尔渗透压浓度或氧化还原电位的变化。本实施例提供了不偏向的选择方法，其中将细胞暴露于生物反应器的“毒性”环境，以选择具有改进生长特性的细胞。
用已适应于无血清培养基的DG44 CHO细胞系(“SF DG44”)开始，利用选择可在典型补料分批的生物反应器周期的后期中建立的环境中存活的细胞的工艺来衍生新的宿主。为了获得这种新的宿主，完成4次反复的生物反应器周期，其中将细胞接种到生物反应器中，利用补料分批工艺进行生长，在存活性已降到低于50％后进行收集，可以进行恢复，然后用来接种下一轮。从这个工艺获得具有不同表型的细胞系。当相比于原始SF DG44宿主时，这种新的细胞系(称为DG44(E))能够具有更高峰细胞密度并在整个细胞面积(ICA)方面增加82％。当对转染效力和分泌能力进行测试时，发现DG44(E)可与原始无血清适应的宿主相比。
材料和方法
A.细胞
在Urlaub et al.，Somatic Cell and Molecular Genetics 12：555-566(1986)中描述了DG44细胞并可从商业源(例如Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)获得。用于本实施例中的细胞系是已适应于在无血清介质中生长的DG44衍生物(“SF DG44”)。
B.介质
在选择方案中使用两种介质。介质1用来传代和规模化。介质2用作生物反应器中的基础介质。根据下表中指示的天数将原料添加到生物反应器中：
  轮#   补料时间表   收获日   收获存活性
  1   第3、5、7天   10   40％
  2   第3、5、7、11、20*、25*天   35   40％
  3   第3、5、7天   7   45％
  4   第3、5、7天   11   39％
*在第2轮期间，加入新鲜介质而不是仅在第20天和第25天补料。在第20天和第25天，分别加入总体积的33％和40％。
C.选择方案
使无血清适应的DG44细胞系(SF DG44)处于生物反应器中。当存活性降到低于50％时开始每天无菌地收集细胞。将能够长出的来自最后一天的样品进行扩增并用来接种下一生物反应器周期。监测ICA和生长速率。在完成4轮后，将DG44(E)细胞的生长特性与原始无血清适应的DG44细胞系进行比较。标准生物反应器操作参数如下：
  参数   设定点或策略
  温度设定点   36℃
pH设定点   pH 7.25(第0～3天)pH 7.00(第3天及之后)
  溶氧(DO)设定点   30％空气饱和
搅拌   对于2L Braun反应器为214rpm(65cm/sec叶轮外缘速度)
DO控制   0.015vvm空气鼓泡，大约第5天从空气变换为富集空气(40％O2)
pH控制   1M碳酸钠和CO2鼓泡(0.015vvm)pH在第3天用0.25M HCl降低
  气体覆盖   0.00625vvm的空气
D.瞬间转染和FACS分析
将未切割的pUC 19(对照)、pX10(Test Protein(靶蛋白)表达)以及pE-GFP-C1(GFP表达)各自分别以1μg/μL、1.8μg/μL和2μg/μL的浓度再悬浮在1X Hepes缓冲盐水(HeBS：20mM HepspH7.05，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM右旋糖)中。将质粒以各种浓度(见下)混合在一起至最后体积为800μL的1X HeBS。
  转染#   DNA浓度
  1，10   100μg pUC19
  2，3，4，5，11，12，13，14   100μg pX10+20μg pE-GFP-C1
  6，7，8，9，15，16，17，18   200μg pX10+20μg pE-GFP-C1
在离心后，将2×106个细胞再悬浮在800μL的DNA/1X HeBS混合物中，并转移到Biorad 0.4cm间隙电穿孔样品池。在Biorad GenePulser上使用的设置为0.28Kv和950μFd(需要容量扩充)。允许经脉冲的细胞可以在样品池中静止10分钟，然后在10mL的补充了10％胎牛血清(Hyclone#SH30070.03)的α+MEM(Gibco#11900-024)中旋转。将每个转染物铺放在3mL的α+MEM加10％血清的一个10cm培养皿上。在三天后，收获上清液用于通过HPLC的分析(测试蛋白质表达)并且收获的细胞用于FACS分析(GFP表达)。
E.测定分析
采用HPLC-A测定来分析来自瞬间转染实验的72hr调控的介质样品。
F.计算
通过Coulter Counter来确定总细胞密度并且通过台盼蓝拒染和血细胞计数器计数来确定存活性。利用以下公式来确定存活细胞密度、生长速率以及整个细胞面积(ICA)。
存活细胞/mL＝(总细胞/mL)(％存活性/100)。
生长速率＝ln(最后细胞密度/初始细胞密度)/#天。
ICA＝#天×[(最后细胞密度-初始细胞密度)/ln(最后细胞密度/初始细胞密度)]。
结果和讨论
A.选择方案
用无血清适应的DG44宿主(也称为“正常的”)开始，实施反复生物反应器周期。每一轮表现出增加的峰细胞密度和由此增加的ICA。在4轮生物反应器选择后，DG44(E)宿主达到2.7×106的峰细胞密度并具有1.4×107的十-天ICA。起始细胞系达到1.3×106的峰细胞密度并具有7.8×106的十-天ICA。这表示在起始细胞系基础上峰细胞密度增加了107％并且ICA增加了82％(图1)。在整个工艺中，“进化的”细胞的存活性可与原始细胞相比(数据未示出)。
表I
细胞类型   单位生产率皮克/细胞/天 pX10 DNA
  正常的   0.45+/-0.11   100μg
  进化的   0.60+/-0.11
  正常的   1.85+/-0.14   200μg
  进化的   1.64+/-0.24
B.瞬间转染和FACS分析
在每一个选择周期之后，进化的细胞似乎变得更小(通过血细胞计数器观察)。或许由于更大的剪切阻力，在生物反应器中更小细胞会更好。已注意到，“进化的”细胞在尺寸上比它们的原始相对物更小，分泌能力成为关注。然而，来自瞬间转染试验的效价结果表明在DG44(E)细胞系和DG44SF宿主之间的分泌效力没有差异(表I)。在用绿色荧光蛋白(GFP)瞬间转染的细胞上的FACS扫描还表明在DG44(E)细胞系和起始宿主细胞系之间的转染效力没有差异(表II)。
表II
  细胞类型   ％GFP阳性   pX10DNA
  正常的   46％+/-4％   100μg
  进化的   59％+/-3％
  正常的   51％+/-5％   200μg
  进化的   58％+/-4％
                      实施例2
不依赖于胰岛素的DG44 CHO宿主细胞系(DG44-I)的形成介绍
胰岛素是在无血清CHO介质配方中最常使用的生长因子。其在这些配方中也是最昂贵的介质组分并且在补料分批工艺中可占＞50％的介质/原料成本。
称为DG44-I的新的宿主细胞来源于无血清适应的DG44(E)CHO宿主细胞系(参见实施例1)。DG44-I可在没有胰岛素的情况下生长。这种适应利用无胰岛素介质在四次传代中获得。新的宿主在无血清介质中具有大约0.65天-1的生长速率。DG44-I宿主已被成功转染。DG44-I宿主仍然对胰岛素响应，因为暴露于胰岛素导致生长速率最适度地增加。
材料和方法
A.细胞和介质
DG44细胞系在Urlaub et al.，Somatic Cell andMolecular Genetics 12：555-566(1986)中被描述并且可从商业来源获得(例如，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)。DG44(E)细胞系通过实施例1中描述的方法获得。DG44(E)细胞可常规地在补充有核苷的介质中被传代至1×105vc/mL。DG44-I宿主可在具有或没有胰岛素的相同介质中被传代。
B.钒酸盐
当正确制备时，原钒酸钠将是透明和无色的。如果溶液具有浅橘黄色，这表明存在钒酸盐聚阳离子，这不是最佳的。为了避免聚阳离子的形成，应避免较大的pH变化。在Kadota et al.，J.Biol.Chem.262：8252-8256(1987)中描述的方法如下。制备用HCl调节至pH6.8的碳酸氢盐/HEPES缓冲液(118.5mM NaCl，4.7mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，24.9mM NaHCO3，30mM HEPES)。将原钒酸钠添加到这种缓冲液中至5mM的浓度，其一定程度上升高pH。然后pH用NaOH调节至7.4并且无菌过滤该溶液。
C.选择方案
DG44-I宿主通过在没有胰岛素的无血清介质中连续传代而来源于DG44(E)宿主。在第一传代中，胰岛素通过介质交换和PBS清洗而被除去。对于接下来的三个传代，细胞每3至4天经历完全的介质交换。在第四传代后，细胞已获得＞0.6天-1的生长速率并通过每3至4天分成1×105-2×105存活细胞/mL。在总共8次传代之后，将该细胞用来形成16瓶的较小库。
D.生长速率
生长速率利用以下公式来确定：
生长速率＝ln(最后细胞密度/初始细胞密度)/#天。
结果与讨论
用来产生DG44-I宿主的方法是在单一步骤中除去胰岛素。这种方法的基本原理是基于前面的工作，其中证实部分转染物是不依赖胰岛素的。如果大部分DG44(E)宿主是不依赖胰岛素的，则也许“cold turkey(突然完全戒毒)”方法在这里也可以使用。大于0.6天-1的生长速率在少于5个传代中获得的事实支持这个主张。
A.选择
多种不依赖胰岛素的生长路径在第一传代中起动。在这些中，有2个进行8次传代和冷冻。谱系C最开始以1.1×105vc/mL接种并且谱系E最开始以3×105vc/mL接种。在第一传代之后，这两个谱系以相同方式进行传代。
在8次传代期间，谱系C中的存活性从未降到低于90％。谱系E的存活性在第一次传代结束时为78％，在第二次传代结束时为89％并且在所有接下来的传代结束时＞90％。这些结果表明，DG44(E)宿主不是高度依赖于胰岛素。
两个谱系在第一传代中经历了适度的生长速率下降(图2)。在整个接下来的传代期间，生长速率增加至可与在含胰岛素的介质中的DG44(E)宿主相比的水平。在第四传代后，生长速率稳定在0.6和0.75天-1之间。由于这种生长速率大于宿主足够的生长速率，所以在第八传代后使用该细胞来形成较小库。
B.对胰岛素和钒酸盐的响应
既使DG44-I宿主可在没有胰岛素的情况下生长，但是它仍然对胰岛素响应。宿主还响应于钒酸盐(V2O5)，其是可在动物和细胞培养中用作胰岛素“增强”剂的磷酸盐类似物(Shechter et al.，Mol.Cell Biochem.153：39-47(1995))。将来自从C和E谱系传代的细胞接种到具有核苷的无血清介质中并且没有含0.5mg/L重组胰岛素Zn、0.5mg/L Intergen胰岛素、5μM钒酸盐的胰岛素或没有添加(图3)。在每一种情况下，胰岛素或钒酸盐的添加导致在开始三天中生长速率的增加。当这些培养在7天完成时，不存在明显的差异(数据未示出)。这种生长速率“turbo boost”可能在一些应用中很有用。还不清楚这种影响是否持续超过一个传代。
C.转染
DG44-I宿主(谱系E)已被用于许多转染。在这些转染中，在所筛选的细胞系的转染效力或生产能力上没有观察到显著的差异。
                     实施例3
应用“生物反应器进化”以增加表达Test Protein的CHO细
                  胞的ICA和生产率
介绍
表达Test Protein(CHO/Test)的新的CHO细胞系利用“生物反应器进化”工艺进行衍生。生物反应器进化是选择可在生物反应器工艺后期建立的环境中存活的细胞的工艺(参见实施例1)。为了获得这种新的细胞系，实施三个反复的生物反应器周期，其中将细胞接种到生物反应器中，在标准生物反应器条件下生长，在存活性已降至40％以下后收集，可以进行恢复，然后用来接种下一轮。从这种方法获得具有新的表型的细胞系。当相比于CHO/Test细胞系(表IV)时，这种新的细胞系(称为CHO/Test(E))能够具有更高峰细胞密度、整个细胞面积(ICA)增加29％，并且生产率增加34％。当检查产物质量时，发现CHO/Test(E)可与CHO/Test细胞系相比。
材料和方法
A.细胞
CHO/Test细胞系是含有表达Test Protein的转基因的CHODUKX-B11衍生的细胞系。
B.介质
在选择方案中使用两种介质。介质3用于传代和规模化。介质4用作生物反应器中的基础介质。将原料在下表中指示的天数添加到生物反应器中：
  轮#   补料时间表   收获日   收获存活性
  1   第2、4、5、7天   10   11％
  2   第2、4、5、7天   9   32％
  3   第2、4、5、7天   11   ＜10％
C.选择方案
使CHO/Test细胞系处于生物反应器中。当存活性降至40％以下时开始每天无菌地收集细胞。将能够长出的来自最后一天的样品扩增并用来接种下一生物反应器周期。监测ICA、生长速率和单位生产率。在完成3轮之后，将CHO/Test细胞与CHO/Test对照细胞对比运转。使用的生物反应器参数如下：
  参数   设定点或策略
  温度设定点   37℃
  pH设定点   pH 7.4
  溶氧(DO)设定点   30％空气饱和
搅拌   对于2L Braun反应器为214rpm(65cm/sec叶轮外缘速度)
DO控制   0.015vvm空气鼓泡，大约第5天从空气变换为富集空气(40％O2)
  pH控制   0.5摩尔的碳酸钠和CO2鼓泡(0.015vvm)
  气体覆盖   0.0125vvm的空气
D.测定分析
采用HPLC蛋白质-A测定来确定总Test Protein效价。HPLC蛋白质-A测定用来确定百分数聚集和单体效价。通过等电子聚焦和碳水化合物图谱来评价产物质量。
F.计算
通过Coulter Counter来确定总细胞密度并且通过台盼蓝拒染和血细胞计数器计数来确定存活性。利用以下公式来确定存活细胞密度、生长速率、单位生产率以及ICA。
存活细胞/mL＝(总细胞/mL)(％存活性/100)。
生长速率＝ln(最后细胞密度/初始细胞密度)/#天。
ICA＝#天×[(最后细胞密度-初始细胞密度)/ln(最后细胞密度/初始细胞密度)]
生物反应器生产率＝(mg/L)(生物反应器工艺的天数和周转期)。
结果与讨论
A.选择方案
用CHO/Test细胞系开始，实施三次反复的生物反应器周期。每一轮表现为增加的峰细胞密度和由此增加的ICA(图4)。在三轮生物反应器选择之后，以头对头地与CHO/Test相比，CHO/Test(E)细胞系达到7.7×106vc/mL的峰细胞密度和2.6×107个细胞/mL/天的7-天ICA(图5)。这表示在CHO/Test细胞系对照基础上，峰细胞密度增加38％、ICA增加29％以及生产率增加34％(表III)。
表III：CHO/Test对CHO/Test(E)、生长、效价和生长能力
  CHO/Test   CHO/Test(E)   ％增加
  峰细胞密度(vc/mL)   5.6×106   7.7×106   38
  整个细胞面积(vc/mL/天)   1.98×107   2.55×107   29
  效价(mg/L)   138   188   36
  单体效价(mg/L)   140   188   34
  生产能力(mg/L/天)   15.6   20.9   34
当检查由CHO/Test(E)生产的Test Protein的产物质量时，发现其可与CHO/Test对照的产物质量相比(表IV-IX)。
表IV：生产率(毫克/升/天)(收获单体效价/9[7-天工艺+2天周转时间])
  进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  第6天
  第7天   20.9   15.6
  第8天
  第10天   17.8   13.4
表V：单位生产率(皮克/细胞/天)
  进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  第5天   5.4   8.6
  第6天
  第7天   7.4   7
  第10天   6.1   5.4
表VI：百分数聚集
  进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  第5天
  第6天
  第7天   6.8％   6.2％
  第8天
  第10天   7.2％   6.1％
表VII：总百分数唾液酸
  进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  第5天
  第6天
  第7天   81.55％   80.97％
  第8天
  第10天   77.66％   77.66％
表VIII：IEF
  进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  第7天   良好相比   良好相比
  第10天   良好相比   良好相比
表IX：百分数多聚糖分布
  天   进化的CHO/Test   CHO/Test对照
  TetraLac-NaX   第7天   5.48％   3.8％
  Tetra-NaX   第7天   27.5％   23.7％
  Tri-NaX   第7天   19.39％   18.54％
  Bi-NaX   第7天   23.35％   28.66％
  Bi-1Gal   第7天   10.44％   10.58％
  Bi-2Gal   第7天   13.55％   14.18％
结论
这个实施例证实了可以使用已转染的细胞系，并通过使其经历生物反应器进化，增加该生物反应器的生产率同时没有损害表达蛋白的产物质量。如果介质形成或其它工艺改变是不利的，则生物反应器进化可以是用来增加ICA和生产率的可选替换方法。由于“生物反应器进化”的选择性，所以有可能产生的CHO/Test(E)种群不是同源种群。在“进化”后的亚克隆可能对于挑选出能够甚至比已达到的生产率更高的细胞系是很有用的。
现已通过用于清楚理解目的的说明和实施例在一些细节上充分描述了本发明，对本领域普通技术人员很明显，在不影响本发明或其任何特定具体实施方式的范围的情况下，可在所述条件、配方和其它参数的较宽和等同范围内通过更改或变化本发明而加以实施，并且这样的更改或变化也涵盖在所附权利要求的范围内。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请是本发明所属领域的技术人员水平的表示，并通过如同将单个出版物、专利或专利申请具体地和单个地指明通过引用并入本文一样以引用方式并入本文作为参考。

Claims (89)

1.一种用于生产一种或多种具有改进生长特性的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括实施一个或多个选择循环，其中每一个选择循环包括：
(a)使(i)哺乳动物细胞的初始种群或在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的所述细胞初始种群保持存活的选择条件，其前提是所述选择条件不包括使所述细胞与含有外源性添加了氨的培养基进行接触；以及
(b)获得一种或多种在所述选择条件下保持存活的哺乳动物细胞；
其中，当将从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞和所述细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比所述细胞初始种群相应的ICA大至少25％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞约1至100天。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞约5至50天。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞约5至30天。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞约5至20天。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞达使得低于60％的所述细胞初始种群保持存活的时间量。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞达到使得低于50％的所述细胞初始种群保持存活的时间量。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞达到使得低于40％的所述细胞初始种群保持存活的时间量。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，所述生物反应器在补料分批条件下工作。
11.根据权利要求2所述的方法，其中，所述生物反应器在批处理模式条件下工作。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述选择条件包括在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育所述细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞初始种群经历1至20个所述选择循环。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述细胞初始种群经历1至10个所述选择循环。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细胞初始种群经历1至5个所述选择循环。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述细胞初始种群经历1至4个所述选择循环。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述细胞初始种群经历3或4个所述选择循环。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述选择条件是其中在所述一个或多个选择循环之后5％和50％之间的所述细胞初始种群保持存活的条件。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述选择条件是其中在所述一个或多个选择循环之后10％和50％之间的所述细胞初始种群保持存活的条件。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述选择条件是其中在所述一个或多个选择循环之后20％和50％之间的所述细胞初始种群保持存活的条件。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述选择条件是其中在所述一个或多个选择循环之后30％和50％之间的所述细胞初始种群保持存活的条件。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞初始种群能够在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长。
23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞初始种群能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞初始种群包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在组成型启动子的控制下。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在诱导型启动子的控制下。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，一种或多种所述多肽是抗体或其片段。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞初始种群是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODG44细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODUKX-B11细胞。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述CHO细胞能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
33.根据权利要求28所述的方法，其中，所述CHO细胞包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，一种或多种所述核酸分子在组成型启动子的控制下。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，一种或多种所述核酸分子在诱导型启动子的控制下。
36.根据权利要求29所述的方法，其中，所述CHO DG44细胞包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。
37.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述选择循环之间，使在步骤(b)中获得的所述细胞经历包括在缺少所述选择条件的情况下孵育所述细胞的恢复期。
38.一种用于生产多肽的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述多肽的核酸分子引入通过权利要求1所述方法获得的一种或多种细胞中；以及
(b)在其中所述多肽从所述核酸分子表达的条件下培养包含所述核酸分子的所述细胞。
39.根据权利要求1所述的方法，其中，当将从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞和所述细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞表现出的ICA比所述细胞初始种群相应的ICA大至少50％。
40.根据权利要求1所述的方法，其中，当将从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞和所述细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞表现出的ICA比所述细胞初始种群相应的ICA大至少70％。
41.根据权利要求1所述的方法，其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
42.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括亚克隆从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞。
43.一种用于生产一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括实施一个或多个选择循环，其中每一个选择循环包括：
(a)使(i)在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中表现出低于0.20天-1的生长速率的哺乳动物初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的培养基进行接触；以及
(b)获得一种或多种在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的所述介质中保持存活的细胞；
其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.30天-1的生长速率。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述细胞初始种群是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODG44细胞。
46.根据权利要求44所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODUKX-B11细胞。
47.根据权利要求44所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
48.根据权利要求44所述的方法，其中，所述CHO细胞能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
49.根据权利要求43所述的方法，其中，所述细胞初始种群能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
50.根据权利要求43所述的方法，其中，在步骤(a)中的所述细胞与所述培养基接触1至10天。
51.根据权利要求43所述的方法，其中，在步骤(a)中的所述细胞与所述培养基接触2至5天。
52.根据权利要求43所述的方法，其中，在步骤(a)中的所述细胞与所述培养基接触3或4天。
53.根据权利要求43所述的方法，其中，使所述细胞初始种群经历1至20个所述选择循环。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，使所述细胞初始种群经历1至10个所述选择循环。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，使所述细胞初始种群经历1至5个所述选择循环。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，使所述细胞初始种群经历1至4个所述选择循环。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，使所述细胞初始种群经历3或4个所述选择循环。
58.根据权利要求43所述的方法，其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.40天-1的生长速率。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.50天-1的生长速率。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.65天-1的生长速率。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中具有至少0.75天-1的生长速率。
62.根据权利要求43所述的方法，其中，在所述选择循环之间，使在步骤(b)中获得的所述细胞经历包括在含胰岛素或胰岛素替代物的培养基中孵育所述细胞的恢复期。
63.一种用于生产多肽的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述多肽的核酸分子引入通过权利要求43所述方法获得的一种或多种细胞中；以及
(b)在其中所述多肽从所述核酸分子表达的条件下培养包含所述核酸分子的所述细胞。
64.一种用于生产一种或多种具有在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长的能力的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
(a)实施包括一个或多个选择循环的第一轮选择，其中所述第一轮的每一个所述选择循环包括：
(i)使(A)哺乳动物细胞的初始种群或(B)在步骤(ii)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的所述细胞初始种群保持存活的选择条件；
(ii)获得在所述选择条件下保持存活的一种或多种哺乳动物细胞；
(b)实施包括一个或多个选择循环的第二轮选择，其中所述第二轮的每一个所述选择循环包括：
(iii)使(C)从所述第一轮选择循环获得的一种或多种细胞或(D)在步骤(iv)中获得的一种或多种细胞与缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的培养基进行接触；和
(iv)获得在缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的所述介质中保持存活的一种或多种细胞；
其中，从所述第二轮选择获得的所述细胞在缺少或基本上缺少胰岛素或胰岛素替代物的所述介质中具有0.30天-1的生长速率。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述选择条件包括在生物反应器中孵育所述细胞约1至50天。
67.根据权利要求65所述的方法，其中，所述细胞初始种群是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODG44细胞。
69.根据权利要求67所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHODUKX-B11细胞。
70.根据权利要求67所述的方法，其中，所述CHO细胞是CHO-K1细胞。
71.一种或多种分离的CHO细胞，当所述分离的CHO细胞和DG44 CHO细胞在基本上相同的培养条件下生长时，所述分离的CHO细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比所述DG44CHO细胞相应的ICA大至少25％。
72.根据权利要求71所述的分离细胞，其中，当所述分离的CHO细胞和所述DG44 CHO细胞在基本上相同的培养条件下生长时，所述细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比所述DG44 CHO细胞相应的ICA大至少50％。
73.根据权利要求72所述的分离细胞，其中，当所述分离的CHO细胞和所述DG44 CHO细胞在基本上相同的培养条件下生长时，所述细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比所述DG44 CHO细胞相应的ICA大至少70％。
74.根据权利要求71所述的分离细胞，其中，所述细胞能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
75.根据权利要求71所述的分离细胞，其中，所述细胞能够在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长。
76.根据权利要求71所述的分离细胞，其中，所述细胞能够在缺少或基本上缺少血清以及缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中生长。
77.根据权利要求71所述的分离细胞，其中，所述细胞包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。
78.根据权利要求77所述的分离细胞，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在组成型启动子的控制下。
79.根据权利要求77所述的分离细胞，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在诱导型启动子的控制下。
80.根据权利要求77所述的分离细胞，其中，一种或多种所述多肽是抗体或其片段。
81.一种用于生产多肽的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述多肽的核酸分子引入权利要求71所述的一种或多种分离细胞中；以及
(b)在其中所述多肽从所述核酸分子表达的条件下培养包含所述核酸分子的所述细胞。
82.一种或多种具有改进生长特性的分离的哺乳动物细胞，其中，所述细胞通过包括实施一个或多个选择循环的方法进行生产，其中每一个选择循环包括：
(a)使(i)细胞的初始种群或(ii)在步骤(b)中获得的一种或多种细胞经受低于70％的所述细胞初始种群保持存活的选择条件，其前提是所述选择条件不包括使所述细胞与含有外源性添加了氨的培养基进行接触；以及
(b)分离在所述选择条件下保持存活的一种或多种哺乳动物细胞；
其中，当将从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞和所述细胞初始种群在基本上相同的培养条件下生长时，从所述一个或多个选择循环获得的所述细胞表现出的整个细胞面积(ICA)比所述细胞初始种群相应的ICA大至少25％。
83.一种或多种分离的CHO细胞，当在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育时，其表现出的整个细胞面积(ICA)比在缺少或基本上缺少胰岛素和胰岛素替代物的介质中孵育的DG44CHO细胞相应的ICA大至少25％。
84.根据权利要求83所述的分离CHO细胞，其中，所述细胞能够在缺少或基本上缺少血清的介质中生长。
85.根据权利要求83所述的分离CHO细胞，其中，所述细胞包含一种或多种编码一种或多种多肽的外源性核酸分子。
86.根据权利要求85所述的分离CHO细胞，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在组成型启动子的控制下。
87.根据权利要求85所述的分离CHO细胞，其中，一种或多种所述外源性核酸分子在诱导型启动子的控制下。
88.根据权利要求85所述的分离CHO细胞，其中，一种或多种所述多肽是抗体或其片段。
89.一种用于生产多肽的方法，所述方法包括：
(a)将编码所述多肽的核酸分子引入权利要求83所述的一种或多种分离细胞中；以及
(b)在其中所述多肽从所述核酸分子表达的条件下培养包含所述核酸分子的所述细胞。
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