JP2020054388A - 生物薬剤フェドバッチ生産能力及び生産物品質を改善するための灌流シード培養の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】哺乳動物細胞培養において、目的のタンパク質生産物の生産効率を改善する方法を提供すること。【解決手段】具体的には、その方法は、工業規模のバイオリアクター細胞培養において、生産されるタンパク質生産物の量を増加させるか、またはタンパク質生産物の生産時間を短縮する。開示する方法は：（ａ）高い生細胞密度までＮ−１バイオリアクター培養を培養すること；及び（ｂ）高い生細胞播種密度で生産用バイオリアクター培養を播種することを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、哺乳動物細胞培養において、目的のバイオプロダクトを生産する効率を改善する方法に関する。具体的には、その方法は、工業規模で生産されるバイオリアクター細胞培養において、生産されるバイオプロダクトの量を増加させ、且つ／またはバイオプロダクトの生産時間を短縮する。開示する方法は：（ａ）Ｎ−１シードトレイン（増殖段階）バイオリアクター細胞培養で細胞を培養して高い生細胞密度を得ること；及び（ｂ）高い生細胞播種密度で生産用バイオリアクター培養に播種することを含む。

生産用バイオリアクターは、バイオプロダクト生産におけるボトルネックの１つである。従来のバッチまたはフェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）生産プロセスは、細胞集団が蓄積する非生産的な増殖期、続いて、バイオプロダクトの大部分が生成されるより生産的な静止期から成る。非生産的な増殖期は、期間を長くし、生産プロセスの容量生産性を低下させ、そしてそれは、非効率的な生産用バイオリアクターの利用となり、生産率を低下させる。容量生産性及び生産用バイオリアクターの使用法の改善は、生産段階バイオリアクターからＮ−１シードトレイン段階（増殖段階）バイオリアクターへと増殖期をシフトすることによって、認められた。（Ｐｏｈｌｓｃｈｅｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２９（１），２２２−９（２０１３）；Ｐａｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ（２０１３）。
しかしながら、Ｎ−１シードトレイン段階において高い生細胞密度を得るのは難しい。従来のバッチまたはフェドバッチＮ−１シードトレイン培養は、高い生細胞密度を維持することができない。したがって、バイオリアクターで細胞を培養するための改良方法が当該技術分野で必要とされている。

Ｐｏｈｌｓｃｈｅｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２９（１），２２２−９（２０１３） Ｐａｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ（２０１３）

本発明は、Ｎ−１シードトレインバイオリアクターにおいて、栄養分補充及び／もしくは廃棄物除去によって、そして／または灌流細胞培養プロセスを用いることによって、Ｎ−１シードトレイン段階で高い生細胞密度を得るための方法に関する。Ｎ−１シードトレインバイオリアクターでの高い生細胞密度により、生産用バイオリアクターでのより高い生細胞播種密度が可能になる。本発明により、高シード生産用バイオリアクター（ｈｉｇｈ−ｓｅｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）は、より短い培養期間で同じまたはより高い力価の生産物を送出し、それにより１運転当たりのＮ−１シードトレインバイオリアクター占有率が増加し、そして１運転当たりの生産用バイオリアクター占有率が低下する。より短い生産期間及びより高い容量生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は、１運転当たりより多くの生産バッチを与え、そしてバッチまたはフェドバッチ生産用バイオリアクター装置をほとんど変えずに生産能力を増加させる。

いくつかの実施形態では、本発明は：（ａ）Ｎ−１培養容器で目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で細胞をＮ培養容器で培養すること、を含むタンパク質を生産する方法に関する。

ある特定の実施形態では、工程（ａ）の間に、（ｉ）培養の生細胞密度を定期的に測定し；そして（ｉｉ）生細胞密度に基づいて決定されるレベルで培養に栄養分を補充する。いくつかの実施形態では、栄養分はアミノ酸、亜鉛、鉄、及び銅を含む。いくつかの実施形態では、亜鉛は、約１．８μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加える。いくつかの実施形態では、鉄は、約０．１μＭ〜約１０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加える。いくつかの実施形態では、銅は、約０．００８μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加える。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、約５０ｍＭ〜約２Ｍの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加える。

いくつかの実施形態では、本発明は：（ａ）第１のＮ−１培養容器で目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で細胞をＮ培養容器で培養すること、を含み、ここで、工程（ａ）の培養に、生細胞密度に基づいて決定されたレベルで栄養分を補充し、そして工程（ａ）の培養に加えるアミノ酸の累積量が約５０ｍＭ〜約２Ｍであることを特徴とする、目的のタンパク質を生産する方法に関する。

いくつかの実施形態では、廃棄物は本方法の工程（ａ）の間に除去される。ある特定の態様では、廃棄物の除去は、ろ過、遠心分離、傾斜細胞沈澱器（ｉｎｃｌｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｔｔｌｅｒ）、交互接線流、接線流、またはそれらの組み合わせによって行う。

ある特定の実施形態では、廃棄物は工程（ａ）の間に除去され、そしてアミノ酸が約７５ｍＭ〜約５００ｍＭの累積量で加えられる。ある特定の実施形態では、廃棄物は工程（ａ）の間に除去され、そしてアミノ酸が約７５ｍＭ〜約８００ｍＭの累積量で加えられる。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）での乳酸塩レベルは、１５ｍＭ未満に維持される。他の実施形態では、工程（ａ）での乳酸塩レベルは、１０ｍＭ、１ｍＭ、または０．１ｍＭ未満に維持される。

本方法の工程（ａ）における細胞は、高い細胞密度まで培養される。いくつかの実施形態では、本方法の工程（ａ）における細胞は、高い生細胞密度まで培養される。いくつかの実施形態では、少なくとも３０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度は、工程（ａ）の間に達成される。他の実施形態では、少なくとも３５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも４５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも５０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも５５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも６０×１０^６生細胞／ｍｌ、または少なくとも６５×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約１０回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約９回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約８回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約７回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約６回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約５回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約４回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約３回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約２回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１分当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１時間当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約４回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約３回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約２回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、継続的に測定される。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の細胞培養は灌流細胞培養として行われる。ある特定の実施形態では、灌流細胞培養における灌流量は約０．１０ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、灌流細胞培養における灌流量は約０．０７ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、灌流細胞培養における灌流量は約０．０５ｎＬ／細胞／日である。いくつかの実施形態では、灌流細胞培養における灌流は交互接線流である。他の実施形態では、灌流細胞培養における灌流は接線流である。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の細胞培養は約３日〜約８日の間維持される。

いくつかの実施形態では、工程（ｂ）におけるＮ培養容器は、約８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される。他の実施形態では、工程（ｂ）におけるＮ培養容器は、約１０×１０^６生細胞／ｍｌ、約１５×１０^６生細胞／ｍｌ、２０×１０^６生細胞／ｍｌ、２５×１０^６生細胞／ｍｌ、または３０×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の培養はフェドバッチ培養として行われる。他の実施形態では、工程（ｃ）の培養は灌流培養として行われる。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の培養は約８日〜約２３日間維持される。

様々な細胞株を、本発明の方法で使用することができる。本方法のある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は：ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、及びＣＯＳ細胞から成る群より選択される。

いくつかの実施形態では、本方法は、Ｎ培養容器における細胞によって生産される目的のタンパク質を捕集する工程を更に含む。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質生産物は抗体である。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質生産物は、抗体、融合タンパク質、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＲＴ、Ｌｉｎｇｏ、ａＢＤＣＡ２、抗ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＸ−１００、Ｔｗｅａｋ、ダクリズマブ、ペグ化インターフェロン、インターフェロン、エタナーセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｉｔｕｘａｎ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、またはＣＤ２０に結合する任意の他のタンパク質から選択される。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）におけるＮ−１培養容器の容積は約５０リットル〜約２０，０００リットルである。他の実施形態では、工程（ａ）におけるＮ−１培養容器の容積は約１００リットル〜約４０００リットルである。

いくつかの実施形態では、工程（ｂ）におけるＮ培養容器の容積は約２００リットル〜約２０，０００リットルである。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び工程（ｃ）の細胞培養は異なる温度で増殖させる。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）の細胞培養は、工程（ａ）の培養に比べて、より低い温度で増殖させる。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）の細胞培養は約３０℃で増殖させ、工程（ａ）の細胞培養は約３６℃で増殖させる。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の培養は約６．８〜約７．４のｐＨで増殖させる。他の実施形態では、工程（ａ）の培養は約６．８〜約７．３のｐＨで増殖させる。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗体を効率的に生産する方法に関する。

また、本発明は、本発明の方法によって生産されるバイオプロダクトにも関する。いくつかの実施形態では、そのバイオプロダクトは抗体または抗体様ポリペプチドである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）Ｎ−１培養容器で目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；
（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び
（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で前記細胞を前記Ｎ培養容器で培養すること
を含み、ここで、工程（ａ）における培養に、生細胞密度に基づいて決定されたレベルで栄養分を補充し、そして工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約５０ｍＭ〜約２Ｍであることを特徴とする、目的のタンパク質の生産方法。
（項目２）
工程（ａ）の間に、前記培養の生細胞密度を定期的に測定する項目１に記載の方法。
（項目３）
前記栄養分が、アミノ酸、亜鉛、鉄、及び銅を含む項目２に記載の方法。
（項目４）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、及びＣＯＳ細胞から成る群より選択される項目１〜３のいずれか一つに記載の方法。
（項目５）
廃棄物を、工程（ａ）の間に除去する項目１〜４のいずれか一つに記載の方法。
（項目６）
前記廃棄物の除去を、ろ過、遠心分離、傾斜細胞沈澱器、交互接線流、または接線流によって行う項目１〜５のいずれか一つに記載の方法。
（項目７）
少なくとも３０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜６のいずれか一つに記載の方法。
（項目８）
少なくとも３５×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
（項目９）
少なくとも４０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜８のいずれか一つに記載の方法。
（項目１０）
少なくとも５０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜９のいずれか一つに記載の方法。
（項目１１）
少なくとも６０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が、工程（ａ）の間に達成される項目１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
（項目１２）
工程（ａ）における培養の生細胞密度を、１秒当たり１回測定する項目２〜１１のいずれか一つに記載の方法。
（項目１３）
工程（ａ）における培養の生細胞密度を、１秒当たり１０回測定する項目２〜１１のいずれか一つに記載の方法。
（項目１４）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約１．８μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
（項目１５）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約５μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
（項目１６）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約１０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
（項目１７）
工程（ａ）における培養に加えられる亜鉛の累積量が、約５０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜１６のいずれか一つに記載の方法。
（項目１８）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約０．１μＭ〜約１０ｍＭまたは鉄キレート剤の非存在下で約２μＭ〜約１０ｍＭである項目１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
（項目１９）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約０．１μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
（項目２０）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約１μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９のいずれか一つに記載の方法。
（項目２１）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約１０μＭ〜約５ｍＭである項目１〜２０のいずれか一つに記載の方法。
（項目２２）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の存在下で約５００μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
（項目２３）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約２μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
（項目２４）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約５μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９及び項目２３のいずれか一つに記載の方法。
（項目２５）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約１０μＭ〜約５ｍＭである項目１〜１９、項目２３及び２４のいずれか一つに記載の方法。
（項目２６）
工程（ａ）における培養に加えられる鉄の累積量が、鉄キレート剤の非存在下で約１００μＭ〜約１ｍＭである項目１〜１９及び項目２３〜２５のいずれか一つに記載の方法。
（項目２７）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．００８μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
（項目２８）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．０５μＭ〜約１ｍＭである項目１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
（項目２９）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約０．０５μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜２８のいずれか一つに記載の方法。
（項目３０）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約１０μＭ〜約０．５ｍＭである項目１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
（項目３１）
工程（ａ）における培養に加えられる銅の累積量が、少なくとも約１００μＭ〜約０．２ｍＭである項目１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
（項目３２）
工程（ａ）のＮ−１培養容器における培養を灌流する項目１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
（項目３３）
前記灌流量が、約０．１ｎＬ／細胞／日である項目１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
（項目３４）
前記灌流量が、約０．０５ｎＬ／細胞／日である項目１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
（項目３５）
灌流が交互接線流である項目１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
（項目３６）
灌流が接線流である項目１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
（項目３７）
前記Ｎ培養容器における細胞によって生産される目的のタンパク質を捕集する工程を更に含む項目１〜３６のいずれか一つに記載の方法。
（項目３８）
工程（ｃ）の培養をフェドバッチモードで行う項目１〜３７のいずれか一つに記載の方法。
（項目３９）
工程（ｃ）のＮ培養容器における培養を灌流する項目１〜３７のいずれか一つに記載の方法。
（項目４０）
目的のタンパク質生産物が抗体である項目１〜３９のいずれか一つに記載の方法。
（項目４１）
目的のタンパク質生産物が、抗体、融合タンパク質、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＲＴ、Ｌｉｎｇｏ、ａＢＤＣＡ２、抗ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＸ−１００、Ｔｗｅａｋ、ダクリズマブ、ペグ化インターフェロン、インターフェロン、エタナーセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｉｔｕｘａｎ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ（またはＣＤ２０に結合するあらゆるもの）である項目１〜４０のいずれか一つに記載の方法。
（項目４２）
前記Ｎ培養容器が約８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４３）
前記Ｎ培養容器が約１０×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４４）
前記Ｎ培養容器が約１５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４５）
前記Ｎ培養容器が約２０×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４６）
前記Ｎ培養容器が約２５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４７）
前記Ｎ培養容器が約３０×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される項目１〜４１のいずれか一つに記載の方法。
（項目４８）
工程（ａ）の培養を約３日〜約８日間維持する項目１〜４７のいずれか一つに記載の方法。
（項目４９）
工程（ｃ）の培養を約８日〜約２３日間維持する項目１〜４８のいずれか一つに記載の方法。
（項目５０）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約５０リットル〜約２０，０００リットルである項目１〜４９のいずれか一つに記載の方法。
（項目５１）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約５０リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５０のいずれか一つに記載の方法。
（項目５２）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約１００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５１のいずれか一つに記載の方法。
（項目５３）
前記Ｎ−１培養容器の体積が約１００リットル〜約４，０００リットルである項目１〜５２のいずれか一つに記載の方法。
（項目５４）
前記Ｎ培養容器の体積が約２００リットル〜約２０，０００リットルである項目１〜５３のいずれか一つに記載の方法。
（項目５５）
前記Ｎ培養容器の体積が約２００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５４のいずれか一つに記載の方法。
（項目５６）
前記Ｎ培養容器の体積が約１０００リットル〜約１０，０００リットルである項目１〜５５のいずれか一つに記載の方法。
（項目５７）
前記Ｎ培養容器の体積が約１０００リットル〜約５，０００リットルである項目１〜５６のいずれか一つに記載の方法。
（項目５８）
工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が、約７５ｍＭ〜約１Ｍである項目１〜５７のいずれか一つに記載の方法。
（項目５９）
工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである項目１〜５８のいずれか一つに記載の方法。
（項目６０）
廃棄物を灌流培養における工程（ａ）の間に除去し、ここで工程（ａ）の培養に加えられるアミノ酸の累積量が約７５ｍＭ〜約５００ｍＭである項目１〜５７のいずれか一つに記載の方法。
（項目６１）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１５ｍＭ未満に維持する項目１〜６０のいずれか一つに記載の方法。
（項目６２）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１０ｍＭ未満に維持する項目１〜６１のいずれか一つに記載の方法。
（項目６３）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において１ｍＭ未満に維持する項目１〜６２のいずれか一つに記載の方法。
（項目６４）
乳酸塩レベルを工程（ａ）の培養において０．１ｍＭ未満に維持する項目１〜６３のいずれか一つに記載の方法。
（項目６５）
工程（ａ）の培養のｐＨを約６．８〜約７．４に維持する項目１〜６４のいずれか一つに記載の方法。
（項目６６）
工程（ａ）の培養のｐＨを約６．９〜約７．３に維持する項目１〜６５のいずれか一つに記載の方法。

細胞株Ａに関するＮ−１培養における灌流の最適化。プロセス期間を短縮し、ＣＳＰＲを低下させ、そして灌流培地を濃縮すると、より良好な増殖（Ａ，Ｂ）、より低いｐＣＯ_２（Ｃ）、及びより低い灌流体積消費（Ｄ）が得られる。すべてのデータはＮ＝１であった。（Ａ）中の白丸は細胞生存率を意味している。●＝１ｘ培地、０．１ ＣＳＰＲ ■＝１ｘ培地、０．０５−０．０７ ＣＳＰＲ ▲＝２ｘ培地、０．０５ ＣＳＰＲ。 細胞株Ａに関する高シードフェドバッチ生産培養。高シード増殖（Ａ）、代謝（Ｂ、Ｃ）、及びタンパク質生産（Ｄ）は、対応する低シードプロセスのそれを辿っている。すべてのデータは少なくともＮ＝２であった。（Ａ）中の白丸は細胞生存率を意味している。●＝低シードプロセス ■＝高シードプロセス 細胞株Ｂに関する高シードフェドバッチ生産培養。高シード増殖（Ａ）、代謝（Ｂ、Ｃ）、及びタンパク質生産（Ｄ）は、対応する低シードプロセスのそれを辿っている。すべてのデータは少なくともＮ＝２であった。（Ａ）中の白丸は細胞生存率を意味している。●＝低シードプロセス ■＝高シードプロセス 生産能力に関する、設備レイアウト、シードトレイン期間、及び生産用バイオリアクター期間の効果。年間の能力／生産量（１年当たりのバッチ数）は図４Ｅに示した経験式から算出した。強調されている細胞は、低シード（３日Ｎ−１／１７日Ｎ）及び高シード（５日Ｎ−１／１２日Ｎ）生産体制の生産量に対応している。生産運転（ｃａｍｐａｉｇｎ）の長さは３６５日と仮定し、バイオリアクター所用時間は２日と仮定した。生産バッチに関する年間能力は１（Ａ）、２（Ｂ）、及び３（Ｃ）のＰ／Ｓ比で示してある。（Ｄ）は、Ｐ／Ｓ比の関数として、細胞株Ａ及びＢに関する低シード及び高シードプロセスの年間能力を示している。シードトレイン１つ当たりの生産容器数の増加は、ボトルネックがシードトレインへとシフトするので、収穫逓減をもたらす。 細胞株Ｃに関するＮ−１培養における灌流。（Ａ）中の白丸は細胞生存率を意味している。●＝２ｘ培地、０．０５〜０．１０ ＣＳＰＲ ■＝１ｘ培地、０．１０〜１２ ＣＳＰＲ 細胞株Ｃに関する高シードフェドバッチ生産培養。高シードは、開始温度の違いに起因して、対応する低シードプロセスと比較して、完全に異なる増殖（Ａ）、代謝（Ｂ、Ｃ）、及びタンパク質生産（Ｄ）プロフィールをもたらす。すべてのデータはＮ＝１であった。（Ａ）中の白丸は細胞生存率を意味している。●＝低シードプロセス ■＝高シードプロセス

本発明は、栄養分補充及び／または廃棄物除去によって、または任意にＮ−１シードトレイン段階培養において灌流プロセスを使用することによって、バイオプロダクト細胞培養プロセスの増殖期を、生産段階からＮ−１シードトレイン段階へとシフトさせることにより、バイオプロダクト細胞培養プロセスの容積生産性及び生産物品質を改善する方法に関する。

本発明の方法は、Ｎ−１シードトレイン段階において高い生細胞密度を達成し、それにより、高シード生産段階が可能になる。高シード生産段階は、より短い培養期間で、同じかまたはより高い力価のバイオプロダクトを供給することができる。本発明の改善された培養方法は、シードトレイン段階での占有率を増加させ、１運転当たりの生産段階での占有率を低下させる。

本発明は：（ａ）Ｎ−１培養容器で目的のバイオプロダクトをコードする遺伝子を含む哺乳動物細胞を培養して、少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度を達成すること；（ｂ）工程（ａ）から得られた細胞を、少なくとも８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度でＮ培養容器に接種すること；及び（ｃ）目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で細胞をＮ培養容器で培養すること、を含むバイオプロダクトを生産する方法に関する。

また、本発明は、本発明の方法によって生産されるバイオプロダクトにも関する。

Ｉ．定義
文脈から明白でない限り、単数を表す「ａ」または「ａｎ」という用語の実体はその実体の１以上を指すことに注目すべきであり；例えば、「単数形のアミノ酸（ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」は１以上のアミノ酸を表すと理解される。そのようなものとして、単数を表す「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」、及び「少なくとも１」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。

更に、本明細書で用いる「及び／または」は、２つの明示した特徴または構成要素の各々のいずれかまたは両方の具体的開示として理解すべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」というフレーズで使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を包含することが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のようなフレーズで使用される用語「及び／または」は、次の実施形態：すなわちＡ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を含むことが意図されている。

本明細書において「含む」という言い回しで実施形態が記述される場合はいつでも、「から成る」及び／または「から本質的に成る」によって記述される他の類似の実施形態も提供されることが理解されよう。

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示と関連がある分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。例えばｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語に関する一般的な辞書を提供する。

単位、接頭辞、及び符号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で認められている形態で表示する。数値範囲は、範囲を示す数値も含まれる。特に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ配向で、左から右へと表記する。本明細書で提示されている発明の名称は、本開示の様々な実施形態を限定するものではなく、本明細書全体を参照することによって理解される。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することにより、更に詳細に定義される。

本明細書中で使用される用語「培地（ｍｅｄｉａ）」、「複数の培地（ｍｅｄｉｕｍ）」、「細胞培養培地」、「培養培地」、「複数の組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」、「組織培養培地（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」、及び「増殖培地」は、増殖している培養真核細胞を養う栄養分を含有する溶液を指す。典型的には、これらの溶液は、最小限の増殖及び／または生存のために細胞によって要求される必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、及び微量元素を提供する。その溶液は、最低限の速度を超えて、成長及び／または生存を高める成分、例えばホルモン及び増殖因子を含むこともできる。その溶液は、細胞の生存及び増殖に最適なｐＨ及び塩濃度となるように配合される。媒体は、タンパク質、加水分解産物または未知組成の成分を含有していない無血清培地である「特定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」または「既知組成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」であることもできる。特定培地は、動物由来成分を含有しておらず、すべての成分は公知の化学構造を有する。当業者は、特定培地が組換え糖タンパク質またはタンパク質、例えばホルモン、サイトカイン、インターロイキン及び他のシグナル伝達分子を含むことができるが、それらに限定されない、ことを理解している。

本明細書で使用される用語「基本培地配合」または「基本培地」は、補充によって、またはある特定の成分の選択的な除去によって改変されなかった、培養細胞に対して使用される任意の細胞培養培地を指す。

本明細書で使用される用語「培養」、「細胞培養」及び「真核細胞培養」は、細胞集団の生存及び／または増殖に適する条件下で、培地（以下の「培地」の定義を参照されたい）において維持または増殖される表面に付着されたまたは懸濁された真核細胞集団を指す。当業者には明らかとなるように、本明細書で使用されるこれらの用語は、哺乳動物細胞集団及びその集団が懸濁される培地とを含む組み合わせを指すことができる。

本明細書で使用される用語「バッチ培養」は、細胞を培養する際に最終的に使用されるすべての成分、例えば培地（以下の「培地」の定義を参照されたい）ならびに細胞それら自体が培養プロセス開始時に提供される細胞培養方法を指す。バッチ培養は典型的にはある時点で停止され、培地における細胞及び／または成分は回収され、そして任意に精製される。

本明細書で使用される用語「フェドバッチ培養」は、追加の成分が培養プロセス開始後のある時点で培養に提供される細胞培養方法を指す。フェドバッチ培養は、基本培地を使用して開始することができる。追加の成分が培養プロセス開始後のある時点で培養に提供される培養培地は流加培地である。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に消費された細胞用栄養補給剤を含む。フェドバッチ培養は、典型的には、ある時点で停止され、そして培地中の細胞及び／または成分が回収され、そして任意に精製される。

本明細書で使用される用語「灌流培養」は、培養プロセスの開始後に、培養に対して継続的または半継続的に追加の成分を供給する細胞培養方法を指す。提供される成分は、典型的には、培養プロセス中に消費された細胞用栄養補給剤を含む。培地中の細胞及び／または成分の一部は、典型的には、継続的または半継続的に回収され、そして任意に精製される。

細胞培養の「増殖期」とは、細胞が一般的に急速に分裂している指数細胞増殖の期間（対数期）を指す。この期間中に、細胞は、ある期間、通常は１〜４日の間、細胞増殖が最大化される条件下で、培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、想定される特定の宿主細胞について過度の実験なしに決定することができる。「ある期間及び細胞増殖が最大化される条件下で」などは、特定の細胞系にとって、細胞増殖及び分裂に最適であると決定される培養条件を指す。増殖期間中、最適な増殖が特定の細胞系に関して達成されるように、加湿制御された雰囲気中で、一般的には約２５〜４０℃で、必要な添加剤を含有する栄養培地において細胞を培養する。細胞は、約１〜７日間、例えば２〜６日間、例えば６日間、増殖期において維持される。特定の細胞に関する増殖期の長さは、不要な実験をせずに、決定することができる。例えば、培養が増殖条件下で維持される場合、増殖期の長さは、最大の生細胞密度の約２０％〜８０％の範囲内の生細胞密度まで特定の細胞を複製させることができる十分な期間である。

細胞培養の「生産期」または「タンパク質生産期」とは、細胞増殖がプラトーに達した期間を指す。生産期の間、対数の細胞増殖は終わり、バイオプロダクト生産が主になっている。この期間中、連続バイオプロダクト生産を支援し、そして所望のバイオプロダクトを得るために、培地は、一般的に補充される。

本明細書で使用される用語「細胞生存率」は、所定の一連の培養条件または実験変動（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の下で生存するための、培養時の細胞の能力を指す。また、本明細書で使用される用語「細胞生存率」は、特定の時期の培養において、生きている細胞と死んでいる細胞の総数に対する、その特定の時期に生存している細胞の割合も指す。

本明細書で使用される用語「細胞密度」は、培地の所定の体積中に存在する細胞の数を指す。

本明細書で使用される用語「バイオリアクター」または「培養容器」は、哺乳動物細胞培養を増殖させるために使用される任意の容器を意味している。バイオリアクターは、哺乳動物細胞の培養に役立つ限りにおいて、あらゆるサイズであり得る。

本明細書で使用される用語「バイオリアクター運転」は、細胞培養サイクル中の誘導期、対数期、またはプラトー期の増殖期間のうちの１つ以上を包含し得る。

本明細書で使用される用語「第１培養容器」、「Ｎ−１培養容器」、「Ｎ−１シードトレイン培養容器」、「Ｎ−１容器」、「第１バイオリアクター」、「Ｎ−１バイオリアクター」、「Ｎ−１シードトレインバイオリアクター」は、Ｎ培養容器（生産用培養容器）の直前に存在し、そしてＮ（生産用）培養容器中へのその後の接種のための高い生細胞密度まで細胞培養を増殖させるために使用される培養容器を指す。Ｎ−１培養容器で増殖される細胞培養は、Ｎ−１培養容器の前のいくつかの容器で、例えばＮ−４、Ｎ−３、及びＮ−２容器で細胞を培養した後に、得ることができる。

本明細書で使用される用語「Ｎ培養容器」、「第２培養容器」、「生産用培養容器」、「Ｎ容器」、「Ｎバイオリアクター」、「第２バイオリアクター」、「生産用バイオリアクター」なる用語は、Ｎ−１バイオリアクター後のバイオリアクターを指しており、目的のバイオプロダクトの生産で使用される。

本明細書で使用される用語「従来の生産プロセス」は、（ａ）指定された時点でバイオリアクターに対してボーラス供給で栄養培地を加える従来プロセス、または（ｂ）グルコース（もしくは他の単一の栄養分）が消費されるとバイオリアクターに対してグルコース（もしくは別の単一の栄養分）を加える従来プロセスを指す。従来の生産プロセスは、バイオプロダクトの収率が低く且つ／またはバイオプロダクト生産の効率が低い。

本明細書で使用される用語「播種」は、細胞培養をバイオリアクターまたは別の容器に提供するプロセスを指す。一実施形態では、細胞は、別のバイオリアクターまたは容器で前もって増殖させた。別の実施形態では、細胞を凍結し、バイオリアクターまたは容器に提供する直前に解凍した。その用語は、任意の数の細胞、例えば１つの細胞を指す。

本明細書で使用される用語「力価」は、細胞培養により生産された組換え発現糖タンパク質またはタンパク質の総量を、所定の量の培地体積によって割ったものを指す。力価は、典型的には、培地１ミリリットル当たりの糖タンパク質またはタンパク質のミリグラム数の単位で、または培地１ミリリットル当たりの糖タンパク質またはタンパク質のグラム数の単位で表される。

本明細書で使用される用語「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」は、生存するために、増殖するために、またはそうでなければバイオマスを加えるために、培養中の有機体、例えば細胞によって利用される、任意の化合物、分子、または物質を指す。栄養分の例としては、炭水化物（例えば、単糖、例えばグルコース、ガラクトース、マルトースまたはフルクトース、または更に複合糖類）、アミノ酸、ビタミン（例えば、Ｂ群ビタミン（例えば、Ｂ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン及びビオチン）、亜鉛、鉄、または銅が挙げられる。ある特定の実施形態では、栄養分を基本培地に補充して、本開示で説明される目的を達成する。「添加物」または「サプリメント」または「栄養分」は、単一の物質、例えば銅、亜鉛、アミノ酸を包含することができ、または複数の物質、例えば亜鉛及びアミノ酸を包含することができる。「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」なる用語は、それらが同時に加えられる必要がないとしても、またそれらが同じ仕方で加えられる必要がないとしても、加えられる成分のすべてを指す。例えば、「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」の１種以上の成分を、原液から単一ボーラスまたは２以上のボーラスとして加えることができ、一方、同じ「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」の他の成分を、流加培地の一部として加えることができる。更に、「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」の任意の１種以上の成分は、細胞培養の開始から、基本培地中に存在することができる。

本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、２０の標準アミノ酸、すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸、それらの単一の立体異性体、及びそれらのラセミ混合物のいずれかを指す。また、「アミノ酸」なる用語は、公知の非標準アミノ酸、例えば、４−ヒドロキシプロリン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、３―メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｏ−ホスホセリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ−アセチルリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアラニン、Ｎ−ホルミルメチオニン、γ−アミノ酪酸、ヒスタミン、ドパミン、サイロキシン、シトルリン、オルニチン、β−シアノアラニン、ホモシステイン、アザセリン、及びＳ−アデノシルメチオニンも意味することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸塩、グルタミン、リジン、チロシンまたはバリンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸塩またはグルタミンである。

本明細書で使用される用語「栄養培地」、「流加培地」、「供給」、「完全な供給」及び「完全栄養培地」は、互換的に使用することができ、そして細胞を増殖させ、繁殖させ、そして細胞株にバイオマスを加えるために使用される「完全な」培地を含む。栄養培地は、細胞株を増殖且つ繁殖させるのに単独で十分ではない物質または単純培地と区別される。したがって、例えば、他の必要とされる栄養分が存在していないので、グルコースまたは単糖単独では、栄養培地ではなく、細胞株を増殖且つ繁殖させるのに十分ではない。当業者は、細胞は、不完全培地の存在下で増殖し、生存し、そして繁殖し続けることができるが、細胞の増殖速度は不安定になり、そして／または大きく低下することを認めることができる。したがって、いくつかの実施形態では、「栄養培地」なる用語は、少なくとも２日、３日、４日、５日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、または１８週の間、安定性及び増殖速度を損なうことなく、または細胞の健康のあらゆる他の指標を低下させずに、細胞株を増殖、繁殖させるのに十分な、そしてバイオマスを細胞株に加えるのに十分な培地を含む。したがって、いくつかの実施形態では、「栄養培地」なる用語は、１種以上の必須の栄養分を欠いていてもよいが、少なくとも２日、３日、４日、５日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、または１８週の間、安定性及び増殖速度を損なうことなく、または細胞の健康のあらゆる他の指標を低下させずに、細胞株を増殖、繁殖させ続けることができ、そしてバイオマスを細胞株に加え続けることができる培地を含む。

いくつかの実施形態では、栄養培地は細胞培養培地である。最適な細胞培養培地組成物は、繁殖される細胞培養のタイプに応じて変化する。いくつかの実施形態では、栄養培地は市販の培地である。いくつかの実施形態では、栄養培地は、例えば、無機塩類、炭水化物（例えば、糖、例えばグルコース、ガラクトース、マルトースまたはフルクトース）、アミノ酸、ビタミン（例えばＢ群ビタミン（例えばＢ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン及びビオチン）、脂肪酸及び脂質（例えばコレステロール及びステロイド）、タンパク質及びペプチド（例えばアルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン及びフェチュイン）、血清（例えばアルブミン、増殖因子及び増殖阻害剤、例えばウシ胎児血清、新生仔ウシ血清及びウマ血清）、微量元素（例えば亜鉛、銅、セレン及びトリカルボン酸中間体）、加水分解産物（プラントまたは動物源に由来する加水分解タンパク質）、及びそれらの組み合わせを含有している。栄養培地の例としては、基本培地（例えばＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ）、複合培地（ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｓｃｏｖｅｓ ＤＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、ＴＣ １００）、無血清培地（例えばＣＨＯ、Ｈａｍ Ｆ１０及び誘導体、Ｈａｍ Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられるが、それらに限定されない。栄養培地で見出される一般的なバッファーとしては、ＰＢＳ、Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ、Ｅａｒｌｅｓ塩類、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、及びＥＢＳＳが挙げられる。哺乳動物細胞を培養するための培地は、当該技術分野において公知であり、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミズーリ州セントルイス）、ＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州ローガン）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カールズバッド）、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州Ｅ．ラザフォード）、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州サンタアナ）などから市販されている。栄養培地で見出される他の成分としては、アスコルビン酸塩、シトレート、システイン／シスチン、グルタミン、葉酸、グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、パルミチン酸、ピリドキサル／ピリドキシン、リボフラビン、セレン、チアミン、及びトランスフェリンが挙げられる。当業者は、本発明の範囲内に属する栄養培地に対する改変が存在することを認めるだろう。

本明細書で使用される用語「バイオプロダクト」は、細胞培養、例えば真核（例えば哺乳動物）細胞培養から生産され、そして単離することができる分子を指す。いくつかの実施形態では、バイオプロダクトなる用語は、５０ｋＤａ、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、または１５０ｋＤａを超える分子量を有する分子を指す。いくつかの実施形態では、その用語の使用は、ポリマー、例えばバイオポリマー、例えば核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、ポリペプチド（例えばタンパク質）、炭水化物、及び脂質を指す。いくつかの実施形態では、用語「バイオプロダクト」はタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、用語「バイオプロダクト」は組換えタンパク質または融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、バイオプロダクトは可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、バイオプロダクトは、抗体、抗体断片または改変抗体（例えば多価抗体、ドメイン欠失抗体、多重体抗体、ヒンジ改変抗体、安定化抗体、多重特異性抗体、直鎖抗体、ｓｃＦｖ、結合ＳｃＦｖ抗体、多価直鎖抗体、Ｆｃのない多価抗体、Ｆａｂ、多価Ｆａｂなど）、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

本明細書で使用される用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。その用語はあらゆる長さのアミノ酸鎖について言及するために使用されるが、当業者は、その用語は、長い鎖に限定されるものではなく、ペプチド結合を介して一緒に連結された２つのアミノ酸を含む最小の鎖を指し得ることも理解するだろう。単一のポリペプチドが別個の機能性単位であり、別個の機能性単位を形成するために他のポリペプチドと永続的な物理的結合を必要とする場合、本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、互換的に使用される。別個の機能性単位が、互いに物理的に結合している１個を超えるポリペプチドから成る場合、本明細書で使用される「タンパク質」なる用語は、物理的に結合され、そして別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。本明細書で使用される用語「タンパク質」は、単一の「タンパク質」ならびに複数の「タンパク質」を含むことを意図している。したがって、本明細書で使用される場合、限定するものではないが「ペプチド」、「ポリペプチド」、「アミノ酸鎖」を包含する用語またはアミノ酸の鎖（単数または複数）に言及するために使用される任意の他の用語は、「タンパク質」の定義に包含され、そして用語「タンパク質」は、これらの用語の任意のものに代えてまたは互換的に使用することができる。その用語は、更に、翻訳後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、または非天然アミノ酸による修飾を受けたタンパク質も含む。また、タンパク質は、多量体、例えば二量体、三量体などを形成するポリペプチドも含む。また、タンパク質なる用語は、融合タンパク質、例えば、タンパク質（またはタンパク質の断片）が抗体（または抗体の断片）に結合される遺伝子融合プロセスを介して生成されるタンパク質も含む。本発明の融合タンパク質の例としては、ヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＥ、ならびにリンフォトキシンβ受容体免疫グロブリンＧ１由来の連結Ｆｃ領域から成るジスルフィド連結二官能性タンパク質が挙げられる。

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前記の組み合わせなどの標的を認識し特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味するために使用される。本明細書で使用される場合、その用語は、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片など）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つの無傷抗体から作製される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、一価または単一特異性の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、ならびに抗体が所望の生物活性を示す限りにおいて抗原認識部位を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を含む。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖定常ドメインの同定に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのいずれか、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であり得る。

本明細書で使用される用語「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖抗体、一本鎖抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されない。

本明細書で使用される用語「組換え発現ポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」は、そのポリペプチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞から発現されるポリペプチドを指す。その組換え発現ポリペプチドは、哺乳動物宿主細胞で通常発現されるポリペプチドと同一または類似であり得る。また、その組換え発現ポリペプチドは、宿主細胞に対して外来であることもでき、すなわち、哺乳動物宿主細胞において通常発現されるポリペプチドに対して異種であることもできる。あるいは、組換え発現ポリペプチドは、ポリペプチドの一部が、哺乳動物宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似であるアミノ酸配列を含有する一方で、他の部分が宿主細胞に対して外来であるという点で、キメラであり得る。本明細書で使用される場合、用語「組換え発現ポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」は、ハイブリドーマによって生産される抗体も含む。

本明細書で使用される用語「ハイブリドーマ」は、免疫学的源に由来する不死化細胞と抗体生産細胞との融合によって生成される細胞を指す。得られるハイブリドーマは、抗体を生産する不死化細胞である。ハイブリドーマを生成するために使用される個々の細胞は、任意の哺乳動物源、例えば、限定するものではないがラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びヒトに由来し得る。また、その用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞系との間の融合生成物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合体の子孫が後に形質細胞と融合されると生じるトリオーマ細胞株も含む。更に、その用語は、例えばクアドローマなどの、抗体を生産する任意の不死化ハイブリッド細胞株を包含するものである（例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）を参照されたい）。

ＩＩ．細胞培養
本発明は、細胞培養によって、バイオプロダクト、例えばタンパク質及び／またはポリペプチドを生産する改善されたシステムを提供する。本発明は、Ｎ−１培養容器で目的のバイオプロダクトをコードする遺伝子を含む細胞を培養して、高い生細胞密度（少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌ）を達成すること；少なくとも８．５×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で、Ｎ−１培養容器からＮ培養容器中に細胞を接種すること；及び目的のタンパク質の生産を可能にする条件下で細胞をＮ培養容器で培養することを含む、細胞を培養する方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程（ａ）における培養は、生細胞密度に基づいて決定されたレベルで栄養分を補充する。他の実施形態では、約５０ｍＭ〜約２Ｍの累積アミノ酸量を工程（ａ）の培養に加える。

典型的な細胞培養プロセスは、ある播種密度での栄養培地への開始細胞の接種に続き、誘導期増殖を含む。誘導期の後に培養の対数期増殖が続き、最終的にプラトー期となる。しかしながら、本発明の改善された細胞培養プロセスは、Ｎ−１培養容器（Ｎ−１シードトレインバイオリアクター）においてＮ−１シードトレイン培養で細胞を増殖させて（増殖段階）、高い生細胞密度を得ること、次いで、Ｎ−１培養容器から細胞を採取し、そして高い生細胞播種密度でＮ培養容器（生産用バイオリアクター）に細胞を播種して目的のバイオプロダクトを生産することを含む。

細胞培養（バッチ培養、フェドバッチ培養、及び灌流培養）によって、タンパク質またはポリペプチドなどのバイオプロダクトを生産するために哺乳動物細胞を調製する様々な方法は当該技術分野で公知である。発現を達成するのに十分な核酸（典型的には、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子及び任意の操作可能に連結された遺伝子制御エレメントを含有するベクター）を、任意の数の技術によって、宿主細胞株に導入することができる。典型的には、細胞をスクリーニングして、どの宿主細胞が実際にベクターを取り込んだかを決定し、そして目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現させる。哺乳動物細胞によって発現された目的とする特定のポリペプチドまたはタンパク質を検出する従来の方法としては、免疫組織化学、免疫沈澱、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術、生物学的活性アッセイ、及びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、それらに限定されない。当業者は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質を検出する他の適当な技術に気づくであろう。多数の宿主細胞が、目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する場合、列挙した技術の一部またはすべてを使用して、どの細胞が、そのポリペプチドまたはタンパク質を最も高いレベルで発現するかを明らかにすることができる。

目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が同定されると、その細胞は、当業者には公知の様々な方法のいずれかによって、培養で繁殖される。目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞は、典型的には、その細胞を所定の温度で、また、細胞の生存、増殖及び生存率に役立つ培地において増殖させることによって繁殖される。

本発明では、細胞は、Ｎ−１培養容器において繁殖／増殖させて、生産用細胞培養容器に播種するのに十分な体積を得る。

Ｎ−１培養容器におけるＮ−１シードトレイン細胞培養
Ｎ−１培養容器に播種したら、その細胞培養を、細胞培養の生存、増殖及び生存率に役立つ条件下、初期増殖期に維持する。厳密な条件は、細胞型、細胞が得られる生物、そして発現されるポリペプチドまたはタンパク質の性質と特徴に応じて変わる。

初期増殖期における細胞培養の温度は、主に細胞培養が生育可能な状態に維持される温度範囲に基づいて選択する。例えば、初期増殖期の間、ＣＨＯ細胞は３７℃でよく増殖する。一般的に、ほとんどの哺乳動物細胞は約２５℃〜４２℃でよく増殖する。好ましくは、哺乳動物細胞は約３５℃〜４０℃で増殖する。当業者は、実施者による細胞のニーズ及び要求生産量に応じて、細胞を増殖させる適当な一つの温度または複数の温度を選択することができる。

本発明の一実施形態では、初期増殖期の温度は、単一で一定の温度に維持する。別の実施形態では、初期増殖期の温度は、温度の範囲内に維持する。例えば、温度は、初期増殖期の間、徐々に上昇または低下させることができる。あるいは、温度は、初期増殖期の間、様々な時点で、不連続な量で上昇または低下させることができる。当業者は、単一の温度または複数の温度を用いるべきか否か、及び温度を徐々にまたは不連続な量で調整するべきか否かを決定することができよう。

細胞は、初期増殖期の間、実施者のニーズ及び細胞自体の必要条件に応じて、更に長いまたは短い時間にわたって増殖させることができる。一実施形態では、細胞は、障害なく成長することが可能である場合に細胞が最終的に達するであろう最大生細胞密度の所定のパーセンテージである生細胞密度を達成するのに十分な期間にわたり増殖させる。

細胞培養は、細胞に対する酸素付加及び栄養分の分散を増加させるために、初期培養期の間、撹拌または振盪することができる。本発明にしたがって、当業者は、初期増殖期の間、バイオリアクターのある特定の内部条件、例えば、限定するものではないがｐＨ、温度、酸素付加などを制御または調節することは有益であり得ることを理解するであろう。例えば、ｐＨは酸または塩基を適当な量を供給することによって制御することができ、酸素付加は当該技術分野で周知である散布装置で制御することができる。

Ｎ−１培養容器の培養体積は、任意のサイズであることができるが、しばしば、目的のポリペプチドまたはタンパク質の最終的な細胞増殖及び生産で使用される生産用細胞培養容器／バイオリアクターの培養体積に比べて小さい。細胞は、生産用バイオリアクターに播種する前に、体積を増加させるＮ−１シードトレインバイオリアクターで、数回、継代させることができる。細胞培養は、撹拌または振盪して、培地の酸素付加及び細胞への栄養分の分散を増やすことができる。あるいはまたは更に、当該技術分野で公知である特別な散布装置を使用して、培養の酸素付加を増加させ且つ制御することができる。本発明にしたがって、当業者は、バイオリアクターのある特定の内部条件、例えば、限定するものではないがｐＨ、温度、酸素付加などを制御または調節することは有益であり得ることを理解するであろう。

初期培養容器における細胞培養は、生産用培養容器に播種する前に、所望の密度まで増殖させる。播種前に、細胞のほとんどが生存したままであることが好ましいが、完全またはほとんど完全な生存率は必要ない。いくつかの実施形態では、少なくとも２５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも３０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも３５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも４０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも４５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも５０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも５５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも６０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも６５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも７０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも７５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも８０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも８５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも９０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも９５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１００×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１１０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１１０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１２０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１３０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１３５×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１４０×１０^６生細胞／ｍｌ、少なくとも１４５×１０^６生細胞／ｍｌまたは少なくとも１５０×１０^６生細胞／ｍｌの細胞密度が達成される。

本発明の一実施形態では、細胞は、例えば低速遠心分離によって、上清から取り出すことができる。次のバイオリアクターに播種する前に、培地を有する取り出された細胞を洗浄して、あらゆる不必要な代謝廃棄物または培地成分を除去することもできる。その培地は、細胞が以前に増殖した培地であり得るか、または本発明の実施者によって選択された異なる培地もしくは洗浄溶液であり得る。

当業者は理解できるように、異なる栄養分（異なる濃度の栄養分）が、細胞培養サイクルの異なる増殖期で必要とされ得る。本発明のある特定の実施形態では、増殖細胞培養の特定の条件は、定期的にモニターすることができる。非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、積分生細胞密度、乳酸塩レベル、アンモニウムレベル、容量オスモル濃度、または発現されたポリペプチドもしくはタンパク質の力価をモニターすることは、有益または必要であり得る。多数の技術は、当該技術分野で公知であり、当業者はこれらの条件を測定することができる。例えば、細胞密度は、血球計、クールター計数器、または細胞密度検査（ＣＥＤＥＸ）を使用して、測定することができる。生細胞密度は、トリパンブルーによる培養サンプルを染色することによって測定することができる。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むので、生細胞密度は、細胞の総数を計数し、染料を取り込んだ細胞の数を細胞の総数で割り、そして逆数をとることによって、決定することができる。ＨＰＬＣを使用して、ラクテート、アンモニウム、または発現されたポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを決定することができる。あるいは、発現されたタンパク質のレベルは、標準的な分子生物学技術、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色、ウェスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、及びＵＶ吸光度によって決定することができる。発現されたポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾、例えばリン酸化及びグリコシル化をモニターすることも有益または必要であり得る。

サンプル採集装置、分析装置、加工プログラム、または供給装置の１つ以上を自動化することができる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、バイオプロダクト生産プロセスにおける任意またはすべての工程の間（すなわち、その最中）に、変動性を低下させ、バイオプロダクトの量及び／または品質を最適化または向上させるために、オフライン（ｏｆｆ−ｌｉｎｅ）、アットライン（ａｔ−ｌｉｎｅ）、オンライン（ｏｎ−ｌｉｎｅ）またはインライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）であり得る自動化サンプル採集装置及び／または分析装置を利用することができる。

本説明のために、「オフライン」分析とは、サンプルを、生産プロセスから永久に取り出し、そしてより後のポイントで生産プロセスから離して分析するので、結果として、データ分析がプロセス内条件についてリアルタイムまたはリアルタイムに近い情報を伝えない、ことを示そうとしている。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される１つ以上の分析装置はオフラインである。

本説明のために、「アットライン」とは、サンプルを、生産プロセスから永久に取り出すが、取り出された時間に極めて接近している時間枠で分析し、それによって、プロセス内条件を自動的に制御または変えるために使用され得るリアルタイムまたはリアルタイムに近い情報を提供する、ことを示そうとしている。「アットライン」分析は、自動化または半自動化方式で行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される分析装置の１つ以上はアットラインである。

本説明のために、「オンライン」とは、サンプルを、生産プロセスから分流し、サンプルが取り出された時間に極めて接近している時間枠で分析し、それによって、プロセス内条件を自動的に制御または変えるために使用され得るリアルタイムまたはリアルタイムに近い情報を提供し、そしてここで、そのサンプルは、生産プロセスに戻すことができる（しかし必ずしも戻されるわけではない）、ことを示そうとしている。「オンライン」分析は、自動化または半自動化方式で行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される分析装置の１つ以上はオンラインである。

本説明のために、「インライン」とは、サンプルを、生産プロセスから取り出さないが、その代わりに、プロセス「サンプル」を、侵襲性または非侵襲性手段によってリアルタイムでモニターし、それにより、プロセス内条件を自動的に制御または変えるために使用され得るリアルタイムまたはリアルタイムに近い情報を提供する、ことを示そうとしている。例えば、分析装置（もしくはそれに接続されるセンサー部分）は、バイオリアクターもしくは精製ユニット中に直接に導入することができ、または分析装置もしくはセンサー部分は、適当なバリアまたは膜によってバイオリアクターもしくは精製ユニットから分離することができる。「インライン」分析は、自動化または半自動化方式で行うことができる。インライン及びオンライン分析は、通常、オフライン及びアットライン分析法と比較して、有意により高い頻度（連続または不連続を含む）で行うことができるので、有利である。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される分析装置の１つ以上はインラインである。

いくつかの実施形態では、ある特定の細胞培養条件をモニターするために、分析用に培養の小さいアリコートを取り出す必要がある。当業者は、そのような取り出しは、細胞培養中に汚染を潜在的にもたらす可能性があり、そのような汚染のリスクを最小限に抑えるように適切に注意することを理解するだろう。

本発明の方法の例示的な実施形態では、バイオリアクターサンプルからのリアルタイムでの１つ以上のマーカー、例えば細胞生存率の直接（アットライン、インライン、またはオンライン）測定は、自動的で動的なフィードバック制御された、アミノ酸及びグルコースなどのサプリメントの添加及び／またはアンモニウム及び乳酸塩などの廃棄物の除去を実施するために行われる。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）でのＮ−１培養容器における培養の生細胞密度は、１秒当たり約１０回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約９回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約８回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約７回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約６回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約５回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約４回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約３回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約２回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約複数回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１分当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１時間当たり約１回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約４回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約３回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１秒当たり約２回測定される。別の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、１日当たり約１回測定される。他の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、連続して測定される。他の実施形態では、培養の生細胞密度は、キャパシタンスを介して測定される。

他の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、２秒毎に約１回、３秒毎に約１回、４秒毎に約１回、５秒毎に約１回、１０秒毎に約１回、１５秒毎に約１回、２０秒毎に約１回、３０秒毎に約１回、４０秒毎に約１回、５０秒毎に約１回、毎分約１回、２分毎に約１回、３分毎に約１回、４分毎に約１回、５分毎に約１回、１０分毎に約１回、１５分毎に約１回、２０分毎に約１回、３０分毎に約１回、毎時約１回、２時間毎に約１回、５時間毎に約１回、１日当たり約４回、１日当たり約２回、または１日当たり約１回測定される。他の実施形態では、工程（ａ）における培養の生細胞密度は、連続して測定される。

いくつかの実施形態では、廃棄物、例えばアンモニウム及び乳酸塩は、Ｎ−１培養容器における本発明の工程（ａ）の間に除去される。ある特定の態様では、廃棄物の除去は、ろ過、遠心分離、傾斜細胞沈澱器（ｉｎｃｌｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｓｅｔｔｌｅｒ）、交互接線流、接線流、またはそれらの組み合わせによって行う。

いくつかの実施形態では、工程（ａ）の細胞培養における乳酸塩レベルは、１５ｍＭ未満に維持される。他の実施形態では、工程（ａ）の細胞培養における乳酸塩レベルは、１２ｍＭ、１０ｍＭ、８ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、または０．０５ｍＭ未満に維持される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の細胞培養では乳酸塩は存在していない。

いくつかの実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養は、培養の生細胞密度に基づいて添加剤（またはサプリメントまたは栄養分）が補充される。「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」は、単一の物質、例えば銅、亜鉛、アミノ酸を包含することができ、または複数の物質、例えば亜鉛及びアミノ酸を包含することができる。「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」なる用語は、それらが同時に加えられる必要がないとしても、またそれらが同じ仕方で加えられる必要がないとしても、加えられる成分のすべてを指している。例えば、「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」の１種以上の成分を、原液から単一ボーラスまたは２以上のボーラスとして加えることができ、一方、同じ「添加剤」または「サプリメント」または「栄養分」の他の成分を、流加培地の一部として加えることができる。更に、「添加剤」または「サプリメント」の任意の１種以上の成分は、細胞培養の開始から、基本培地中に存在することができる。栄養分補充は、細胞特異的灌流量（ＣＳＰＲ）に基づいて決定される。

いくつかの実施形態では、栄養分はアミノ酸、亜鉛、鉄及び銅を含む。いくつかの実施形態では、亜鉛は、約１．８μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。他の実施形態では、亜鉛は、約１．８μＭ〜約０．５ｍＭ、約１．８μＭ〜約０．１ｍＭ、約１．８μＭ〜約０．０５ｍＭ、約１．８μＭ〜約０．０１ｍＭ、約１．８μＭ〜約０．００５ｍＭ、約５μＭ〜約１ｍＭ、約５μＭ〜約０．５ｍＭ、約５μＭ〜約０．１ｍＭ、約５μＭ〜約０．０５ｍＭ、約５μＭ〜約０．０１ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．０５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、約１００μＭ〜約０．１２５ｍＭ、約２００μＭ〜約１ｍＭ、約２００μＭ〜約０．５ｍＭ、または約５００μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。

いくつかの実施形態では、鉄は、約０．１μＭ〜約２０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。他の実施形態では、鉄は、約０．５μＭ〜約２０ｍＭ、０．５μＭ〜約１０ｍＭ、０．５μＭ〜約５ｍＭ、約０．５μＭ〜約１ｍＭ、約０．５μＭ〜約０．５ｍＭ、約０．５μＭ〜約０．１ｍＭ、約０．５μＭ〜約０．０１ｍＭ、約１μＭ〜約２０ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１μＭ〜約１ｍＭ、約１μＭ〜約０．５ｍＭ、約１μＭ〜約０．１ｍＭ、約１μＭ〜約０．０１ｍＭ、約２μＭ〜約２０ｍＭ、約２μＭ〜約５ｍＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約２μＭ〜約０．５ｍＭ、約２μＭ〜約５ｍＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約２μＭ〜約０．５ｍＭ、約２μＭ〜約０．１ｍＭ、約２μＭ〜約０．０１ｍＭ、５μＭ〜約２０ｍＭ、５μＭ〜約１０ｍＭ、約５μＭ〜約５ｍＭ、約５μＭ〜約１ｍＭ、約５μＭ〜約０．５ｍＭ、約５μＭ〜約０．１ｍＭ、約５μＭ〜約０．０１ｍＭ、１０μＭ〜約２０ｍＭ、１０μＭ〜約１０ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、５０μＭ〜約２０ｍＭ、５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５０μＭ〜約５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、１００μＭ〜約２０ｍＭ、１００μＭ〜約１０ｍＭ、約１００μＭ〜約５ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、１ｍＭ〜約２０ｍＭ、１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。

好ましい実施形態では、鉄は、トロポロンのような鉄キレート剤の非存在下で、約２μＭ〜約２０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。いくつかの実施形態では、鉄は、約２μＭ〜約２０ｍＭ、２μＭ〜約１０ｍＭ、２μＭ〜約５ｍＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約２μＭ〜約０．５ｍＭ、約２μＭ〜約０．１ｍＭ、約２μＭ〜約０．０１ｍＭ、５μＭ〜約２０ｍＭ、５μＭ〜約１０ｍＭ、約５μＭ〜約５ｍＭ、約５μＭ〜約１ｍＭ、約５μＭ〜約０．５ｍＭ、約５μＭ〜約０．１ｍＭ、約５μＭ〜約０．０１ｍＭ、１０μＭ〜約２０ｍＭ、１０μＭ〜約１０ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、５０μＭ〜約２０ｍＭ、５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５０μＭ〜約５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、１００μＭ〜約２０ｍＭ、１００μＭ〜約１０ｍＭ、約１００μＭ〜約５ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、１ｍＭ〜約２０ｍＭ、１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭの累積量で、鉄キレート剤の非存在下で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。別の好ましい実施形態では、鉄は、鉄キレート剤の存在下で、約０．１μＭ〜約２０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。他の実施形態では、鉄は、約０．１μＭ〜約２０ｍＭ、０．１μＭ〜約１０ｍＭ、０．１μＭ〜約５ｍＭ、約０．１μＭ〜約１ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．５ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．１ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．０１ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．００５ｍＭ、約０．１μＭ〜約０．００１ｍＭ、約１μＭ〜約１ｍＭ、約１μＭ〜約５ｍＭ、約１μＭ〜約１ｍＭ、約１μＭ〜約０．５ｍＭ、約１μＭ〜約０．１ｍＭ、約１μＭ〜約０．０５ｍＭ、約１μＭ〜約０．０１ｍＭ、約１μＭ〜約０．００５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．０５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５０μＭ〜約５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約５ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、約５００μＭ〜約１ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭ、約５００μＭ〜約２．５ｍＭ、または約５００μＭ〜約１ｍＭの累積量で、鉄キレート剤の存在下で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。

いくつかの実施形態では、銅は、約０．００８μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。他の実施形態では、銅は、約０．００８μＭ〜約０．５ｍＭ、約０．００８μＭ〜約０．１ｍＭ、約０．００８μＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．００８μＭ〜約０．０１ｍＭ、約０．００８μＭ〜約０．００５ｍＭ、０．００８μＭ〜約０．５μＭ、０．００８μＭ〜約０．１μＭ、０．００８μＭ〜約０．０５μＭ、０．００８μＭ〜約０．０１μＭ、０．００８μＭ〜約０．００５μＭ、約０．０５μＭ〜約１ｍＭ、約０．０５μＭ〜約０．５ｍＭ、約０．０５μＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０５μＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０５μＭ〜約０．０１ｍＭ、０．０５μＭ〜約０．００５ｍＭ、０．０５μＭ〜約０．５μＭ、約１μＭ〜約１ｍＭ、約１μＭ〜約０．５ｍＭ、約１μＭ〜約０．１ｍＭ、約１μＭ〜約０．０１ｍＭ、約１μＭ〜約０．００５ｍＭ、１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．０５ｍＭ、５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、約１００μＭ〜約０．２ｍＭ、または５００μＭ〜約１ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。

いくつかの実施形態では、アミノ酸は、約５０ｍＭ〜約２Ｍの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。別の実施形態では、アミノ酸は、５０ｍＭを超える累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。ある特定の実施形態では、１種以上のアミノ酸が、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭの累積量で、フェドバッチ培養またはバッチ培養における工程（ａ）の細胞培養に加えられる。ある特定の実施形態では、１種以上のアミノ酸が、約５０ｍＭ〜約１Ｍ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの累積量で、フェドバッチ培養またはバッチ培養における工程（ａ）の細胞培養に加えられる。いくつかの実施形態では、１種以上のアミノ酸が、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６３ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、１Ｍ、１．５ｍＭ、または２Ｍの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。いくつかの実施形態では、アンモニアの蓄積が存在する場合、１種以上のアミノ酸の任意の累積量が、灌流培養によってＮ−１培養容器に添加され得る。

ある特定の実施形態では、廃棄物は工程（ａ）の間に除去され、そして１種以上のアミノ酸が約５０ｍＭ〜約２Ｍの累積量で加えられる。他の実施形態では、廃棄物は工程（ａ）の間に除去され、そして１種以上のアミノ酸が約６３ｍＭ〜約２００ｍＭ、６３ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、１Ｍ、１．５ｍＭ、または２Ｍの累積量で加えられる。

いくつかの実施形態では、フマル酸塩は、約２μＭ〜約２０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。他の実施形態では、フマル酸塩は、約２μＭ〜約２０ｍＭ、２μＭ〜約１０ｍＭ、２μＭ〜約５ｍＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約２μＭ〜約０．５ｍＭ、約２μＭ〜約０．１ｍＭ、約２μＭ〜約０．０１ｍＭ、５μＭ〜約２０ｍＭ、５μＭ〜約１０ｍＭ、約５μＭ〜約５ｍＭ、約５μＭ〜約１ｍＭ、約５μＭ〜約０．５ｍＭ、約５μＭ〜約０．１ｍＭ、約５μＭ〜約０．０１ｍＭ、１０μＭ〜約２０ｍＭ、１０μＭ〜約１０ｍＭ、約１０μＭ〜約５ｍＭ、約１０μＭ〜約１ｍＭ、約１０μＭ〜約０．５ｍＭ、約１０μＭ〜約０．１ｍＭ、５０μＭ〜約２０ｍＭ、５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５０μＭ〜約５ｍＭ、約５０μＭ〜約１ｍＭ、約５０μＭ〜約０．５ｍＭ、約５０μＭ〜約０．１ｍＭ、１００μＭ〜約２０ｍＭ、１００μＭ〜約１０ｍＭ、約１００μＭ〜約５ｍＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約１００μＭ〜約０．５ｍＭ、１ｍＭ〜約２０ｍＭ、１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、５．０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、または２０ｍＭの累積量で、工程（ａ）の細胞培養に加えられる。

ある特定の実施形態では、工程（ａ）の培養のｐＨは約６．８〜約７．４に維持される。他の実施形態、工程（ａ）の培養のｐＨは約６．９〜約７．３に維持される。いくつかの実施形態では、所望のｐＨは、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを加えることなく、灌流培地ｐＨを滴定することによって維持される。他の実施形態では、所望のｐＨは、塩基、例えば水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを加えることによって維持される。

Ｎ−１培養容器における細胞培養は、バッチ培養、フェドバッチ培養または灌流培養で培養することができる。一実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養はバッチ培養である。別の実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養はフェドバッチ培養である。

目的のポリペプチドを生産する典型的な手順は、バッチ培養及びフェドバッチ培養を含む。従来のバッチ及びフェドバッチ培養に関する持続的な未解決の問題は、代謝廃棄物の生成であり、それは、細胞増殖、細胞生存率及び発現されるポリペプチドの生産に関して有害効果を有する。特に有害な効果を有する２つの代謝廃棄物は、乳酸塩及びアンモニウムであり、それは、それぞれグルコース及びグルタミン代謝の結果として生じる。グルタミン代謝の結果としてのアンモニウムの酵素生産に加えて、アンモニウムはまた、時間とともに非代謝分解の結果として細胞培養に蓄積する。したがって、ある特定の実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養は、灌流培養である。いくつかの実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養のための灌流量は約０．０１ｎＬ／細胞／日〜約０．２ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養のための灌流量は、約０．０１ｎＬ／細胞／日〜約０．１５ｎＬ／細胞／日、約０．０１ｎＬ／細胞／日〜約０．１ｎＬ／細胞／日、約０．０１ｎＬ／細胞／日〜約０．０５ｎＬ／細胞／日、約０．０５ｎＬ／細胞／日〜約０．２ｎＬ／細胞／日、約０．０５ｎＬ／細胞／日〜約０．１５ｎＬ／細胞／日、約０．０５ｎＬ／細胞／日〜約０．１ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日〜約０．２ｎＬ／細胞／日、約０．１ｎＬ／細胞／日〜約０．１５ｎＬ／細胞／日、約０．１２ｎＬ／細胞／日〜約０．２ｎＬ／細胞／日、約０．１２ｎＬ／細胞／日〜約０．１５ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養のための灌流量は、０．０１ｎＬ／細胞／日、０．０２ｎＬ／細胞／日、０．０３ｎＬ／細胞／日、０．０５ｎＬ／細胞／日、０．０７ｎＬ／細胞／日、０．１０ｎＬ／細胞／日、０．１２ｎＬ／細胞／日、０．１４ｎＬ／細胞／日、０．１５ｎＬ／細胞／日、０．１６ｎＬ／細胞／日、０．１８ｎＬ／細胞／日、０．０５ｎＬ／細胞／日、０．０８ｎＬ／細胞／日、０．１ｎＬ／細胞／日、または０．２ｎＬ／細胞／日である。いくつかの実施形態では、灌流培養における灌流は交互接線流である。他の実施形態では、灌流細胞培養における灌流は接線流である。いくつかの実施形態では、灌流細胞培養における灌流は、ろ過装置、例えば中空糸及び開口チャネルフィルターを使用する。

典型的には、Ｎ−１培養容器の体積は、４０００リットル未満、３７５０リットル未満、３５００リットル未満、３２５０リットル未満、３０００リットル未満、２７５０リットル未満、２５００リットル未満、２２５０リットル未満、２０００リットル未満、１７５０リットル未満、１５００リットル未満、１２５０リットル未満、または１０００リットル未満である。いくつかの実施形態では、Ｎ−１培養容器は、約５０〜約２０，０００リットル、約５０〜約１５，０００リットル、約５０〜約１０，０００リットル、約５０〜約３５７０リットル、約５０〜約３５００リットル、約５０〜約３０００リットル、約５０〜約２５００リットル、約５０〜約２０００リットル、約５０〜約１５００リットル、約５０〜約１０００リットル、約５０〜５００リットル、約１００〜約１０，０００リットル、約１００〜約５０００リットルまたは約１００〜約４０００リットルである。ある特定の実施形態では、Ｎ−１培養容器は、４０００リットル、３７５０リットル、３５００リットル、３２５０リットル、３０００リットル、２７５０リットル、２５００リットル、２２５０リットル、２０００リットル、１７５０リットル、１５００リットル、１２５０リットル、１０００リットル、７５０リットル、５００リットル、２５０リットル、２００リットル、１００リットル、または５０リットルである。バイオリアクターの内部条件、例えば限定するものではないがｐＨ及び温度は、典型的には、培養期間中制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で、培地中に懸濁された哺乳動物細胞培養を保持するのに適している任意の材料、例えばガラス、プラスチックまたは金属から成ることができる。

工程（ａ）のＮ−１培養容器における細胞培養は、定義された期間、維持することができる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）での細胞培養は、約３〜約８日、約３〜約７日、約３〜約６日、約３〜約５日、４〜約８日、約４〜約７日、約４〜約６日、約４〜約５日、約５〜約８日、約５〜約７日、約５〜約６日、約６〜約８日、約６〜約７日、または約７〜約８日の間維持される。ある特定の実施形態では、工程（ａ）での細胞培養は、３日、４日、５日、６日、７日、または８日間維持される。

工程（ａ）からの細胞は、工程（ｂ）で生産用バイオリアクターに播種するために、適当な密度まで希釈することができる。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、生産用バイオリアクターで使用される同じ培地中に希釈される。あるいは、細胞は、本発明の実施者のニーズ及び要望に応じて、または、生産用バイオリアクターに播種する前に細胞を短期間保存しなければならない場合に、細胞それら自体の特定の必要条件に適応させるために、別の培地または溶液中に希釈され得る。

Ｎ培養容器における生産細胞培養
Ｎ−１シードトレイン培養容器で増殖される細胞は、採取され、そして、高い生細胞播種密度で、生産細胞培養のためのＮ培養容器中に播種／接種される。いくつかの実施形態では、Ｎ培養容器は、約８．５×１０^６生細胞／ｍｌ、約１０×１０^６生細胞／ｍｌ、１５×１０^６生細胞／ｍｌ、２０×１０^６生細胞／ｍｌ、２５×１０^６生細胞／ｍｌ、または３０×１０^６生細胞／ｍｌの播種密度で接種される。

当業者は、Ｎ培養容器における生産細胞培養は、バッチ培養、フェドバッチ培養または灌流培養であり得ることを認めるだろう。ある特定の実施形態では、生産培養はフェドバッチ培養である。他の実施形態では、生産培養は灌流培養である。

したがって、一実施形態では、本発明の方法によるＮ−１培養容器及び／またはＮ培養容器における細胞培養は、バッチ培養である。別の実施形態では、本発明の方法によるＮ−１培養容器及び／またはＮ培養容器における細胞培養は、フェドバッチ培養である。更なる実施形態では、本発明の方法によるＮ−１培養容器及び／またはＮ培養容器における細胞培養は、灌流培養である。いくつかの実施形態では、Ｎ−１培養容器における細胞培養は、灌流培養である。

他の実施形態では、Ｎ−１培養容器における培養はフェドバッチ培養であり、そしてＮ培養容器における培養はバッチまたはフェドバッチ培養である。別の実施形態では、Ｎ−１培養容器における培養は灌流培養であり、そしてＮ培養容器における培養はフェドバッチまたはバッチ培養である。別の実施形態では、Ｎ−１培養容器における培養はバッチまたはフェドバッチ培養であり、そしてＮ培養容器における培養は灌流培養である。

工程（ｂ）のＮ培養容器における生産細胞培養は、定義された期間維持することができる。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）での細胞培養は、約８〜約２３日、約８〜約２０日、約８〜約１５日、約１０〜約２３日、約１０〜約２０日、約１０〜約１５日、約１５〜約２３日、約１５〜約２０日、約１２〜約２３日、または約１２〜約２０日の間維持される。ある特定の実施形態では、工程（ｂ）での細胞培養は、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、２０日、２２日または２３日の間維持される。

典型的には、Ｎ培養容器の体積は、約２００リットル〜約２０，０００リットル、約２００リットル〜約１５，０００リットル、約２００リットル〜約１２，０００リットル、約２００リットル〜約１０，０００リットル、約２００リットル〜約８，０００リットル、約２００リットル〜約５，０００リットル、約１０００リットル〜約２０，０００リットル、約１０００リットル〜約２０，０００リットル、約１０００リットル〜約１５，０００リットル、約１０００リットル〜約１２，０００リットル、約１０００リットル〜約１０，０００リットル、約１０００リットル〜約８，０００リットル、または約１０００リットル〜約５，０００リットルである。いくつかの実施形態では、Ｎ培養容器の体積は、約２００リットル、約５００リットル、約８００リットル、約１０００リットル、約１２００リットル、約１５００リットル、約２０００リットル、約２５００リットル、約５０００リットル、約７５００リットル、約１０，０００リットル、約１２，０００リットル、約１５０００リットル、約１８０００リットル、または約２０，０００リットルである。いくつかの実施形態では、Ｎ培養容器の体積は約２０，０００リットル以下である。

一実施形態では、本発明の方法による細胞培養は無血清培養である。別の実施形態では、本発明の方法による細胞培養は既知組成培養である。更なる実施形態では、本発明の方法による細胞培養は動物性タンパク質非含有培養である。

発現されたポリペプチドの単離または捕集
生産細胞培養で生産される目的のタンパク質はＮ培養容器から捕集される。一実施形態では、発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、培地中に分泌されるので、精製プロセスの第一工程として、例えば遠心分離またはろ過によって、取り出すことができる。

あるいは、発現されるポリペプチドは宿主細胞の表面に結合され得る。この実施形態では、培地が取り出され、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する宿主細胞は精製プロセスの第一工程として溶解される。当業者に公知の任意の数の手段によって、例えばガラスビーズによる物理的な粉砕及び高いｐＨ条件への曝露によって、哺乳動物宿主細胞の溶解を達成することができる。

ポリペプチドは、標準的方法によって、例えば、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲルろ過、遠心分離、もしくは示差溶解度、エタノール沈澱によって、または、タンパク質精製のための任意の他の利用可能な技術によって、単離及び精製され得る（例えば、参照によりすべてが本明細書に組み込まれる、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；及びＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．（編），Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ １８２），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７を参照されたい）。免疫アフィニティークロマトグラフィーについて、特に、タンパク質は、そのタンパク質に対して作製され、そして固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティーカラムにタンパク質を結合することにより単離され得る。あるいは、インフルエンザ被膜配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなアフィニティータグを、標準的な組換え技術によってタンパク質に付着させて、適当なアフィニティーカラム上を通過させることによる容易な精製を可能にすることができる。フェニルメチル弗化スルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤は、精製プロセスの間に、ポリペプチドまたはタンパク質の分解を少なくするかまたは排除するために、任意のまたはすべての段階で加えることができる。プロテアーゼ阻害剤は、発現されるポリペプチドまたはタンパク質を単離及び精製するために細胞を溶解しなければならない際に特に望ましい。当業者には、精密な精製技術は、精製されるポリペプチドまたはタンパク質の特徴、ポリペプチドまたはタンパク質が発現される細胞の特徴、そして細胞が増殖された培地の組成に応じて、変わることが理解されよう。

ＩＩＩ．細胞
細胞培養し易く且つポリペプチドを発現し易い任意の哺乳動物の細胞または細胞型を本発明にしたがって利用することができる。本発明にしたがって使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜細胞芽（ＰＥＲ．Ｃ６（オランダ、ライデンにあるＣｒｕＣｅｌｌ））；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞，Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒトヘパトーム株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。特に好ましい実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞株由来のポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現で使用される。

好ましい実施形態では、細胞はＨＥＫ−２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、またはＣＯＳ細胞から選択される。

更に、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する、多くの商業的及び非商業的に利用可能なハイブリドーマ細胞株を本発明にしたがって利用することができる。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が、異なる栄養必要量を有することができ且つ／または最適な増殖及びポリペプチドまたはタンパク質の発現について異なる培養条件を要求し得ることを十分に理解するであろうし、そして必要に応じて条件を改変することができるであろう。

上記したように、多くの場合、細胞は、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生産するように選択または操作される。しばしば、細胞は、例えば、目的のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によって、及び／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性であるか導入されるかにかかわらず）の発現を制御する調節エレメントの導入によって、高レベルのタンパク質を生産するように遺伝子操作される。

ある特定のポリペプチドは、細胞増殖、細胞生存率、または細胞のいくつかの他の特徴に関して有害な影響を及ぼす場合があり、その影響により、目的のポリペプチドまたはタンパク質の生産がなんらかの様式で最終的に制限される。特定のポリペプチドを発現するように操作された１つの特定のタイプの細胞の集団の中でも、その細胞集団内での変動性が存在し、その結果、ある特定の個々の細胞が、より良好に増殖し、且つ／または目的のポリペプチドをより多く生産する。本発明のある特定の好ましい実施形態では、細胞株は、細胞を培養するために選択される特定の条件下での堅固な増殖のために、実施者によって経験的に選択される。特に好ましい実施形態では、特定のポリペプチドを発現するように操作された個々の細胞は、細胞増殖、最終細胞密度、細胞生存率パーセント、発現されるポリペプチドの力価、もしくはこれらの任意の組み合わせに基づいて、または実施者によって重要であるとみなされる任意の他の条件に基づいて、大規模生産のために選択される。

ＩＶ．培地
本発明の細胞培養は、培養される特定の細胞に適する任意の培地で調製される。いくつかの実施形態では、培地は、例えば、無機塩類、炭水化物（例えば、糖類、例えばグルコース、ガラクトース、マルトースまたはフルクトース）、アミノ酸、ビタミン（例えば、Ｂ群ビタミン（例えばＢ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン及びビオチン）、脂肪酸及び脂質（例えば、コレステロール及びステロイド）、タンパク質及びペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン及びフェチュイン）、血清（例えば、アルブミン、増殖因子及び増殖阻害剤、例えばウシ胎児血清、新生仔ウシ血清及びウマ血清を含む組成物）、微量元素（例えば、亜鉛、銅、セレン及びトリカルボン酸中間体）、加水分解産物（プラントまたは動物源に由来する加水分解タンパク質）、及びそれらの組み合わせを含む。市販の培地、例えば、５倍濃縮ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ ｆｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＢａｌａｎＣＤ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢＤ Ｒｅｃｈａｒｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ Ｆｅｅｄ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｅｘ−細胞ＣＨＯＺＮ Ｆｅｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＨＯ Ｆｅｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＳｈｅｆｆＣＨＯ（Ｋｅｒｒｙ）、Ｚａｐ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｉａ）、ＡｃｔｉＣＨＯ（ＰＡＡ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）が例示の培養液である。更に、そのすべての開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第５，１２２，４６９号または第４，５６０，６５５号；国際公開番号ＷＯ ９０／０３４３０；及びＷＯ ８７／００１９５に記載されている培地のいずれかを培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／もしくは他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、あるいは上皮増殖因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン）、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される）、脂質（例えばリノール酸もしくは他の脂肪酸）及びそれらの適当な担体、及びグルコース、または等価なエネルギー源と一緒に補充することができる。いくつかの実施形態では、栄養培地は、無血清培地、無タンパク質培地、または既知組成培地である。任意の他の必要なサプリメントも、当業者に知られている適当な濃度で包含され得る。

一実施形態では、哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、適当な培地は、基本培地成分、例えばＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ−１２をベースとする配合物（ＤＭＥＭとＨＡＭ Ｆ１２との組成物、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８，ｐａｇｅｓ ３４６−３４９における培養培地配合物を参照されたい）、ならびに、改変された濃度のいくつかの成分、例えば、アミノ酸、塩類、糖類、及びビタミン、組換えヒトインスリン、加水分解ペプトン、例えばＰｒｉｍａｔｏｎｅ ＨＳもしくはＰｒｉｍａｔｏｎｅ ＲＬ（英国シェフィールド）、またはその同等物；細胞保護剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８もしくはまたはプルロニックポリオールの同等物；ゲンタマイシン；及び微量元素を含有する。

本発明は、本明細書に記載の他の培養工程にしたがって使用されるとき、目的の組換え糖タンパク質のグリコシル化を操作し、変質させ、または改変する能力を保持しながら、培養における細胞生存率の低下を最小化または防止する種々の培地配合物を提供する。

代謝平衡、細胞増殖及び／もしくは生存率に関して、またはポリペプチドまたはタンパク質に関して、大きな悪影響を及ぼさずに、グリコシル化を操作するのに有用であることが示された本発明の培地配合物は、本明細書に記載の培地サプリメントを含む。当業者は、本発明の培地配合物が、定義された培地及び定義されていない培地の両方を含むことを理解するだろう。

Ｖ．バイオプロダクト
ポリペプチド
宿主細胞で発現可能なあらゆるポリペプチドを本発明にしたがって生産することができる。ポリペプチドは、宿主細胞に対して内因性である遺伝子から発現され得るか、または遺伝子工学によって宿主細胞中に導入される遺伝子から発現され得る。ポリペプチドは、天然に生じるものであり得るか、または人間の手によって遺伝子操作もしくは選択された配列を有することができる遺伝子操作されたポリペプチドは、天然に個々に生じる他のポリペプチドセグメントから組み立てられ得るか、または天然に生じない１つ以上のセグメントを包含し得る。

本発明にしたがって望ましく発現され得るポリペプチドは、しばしば、興味深い生物学的または化学的な活性に基づいて選択される。例えば、本発明は、任意の薬学的または商業的に重要な酵素、受容体、抗体、ホルモン、制御因子、抗原、結合剤などを発現させるために使用することができる。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質生産物は、抗体、融合タンパク質、アルファ−シヌクレイン、ＢＡＲＴ、Ｌｉｎｇｏ、ａＢＤＣＡ２、抗ＣＤ４０Ｌ、ＳＴＸ−１００、Ｔｗｅａｋ、ダクリズマブ、ペグ化インターフェロン、インターフェロン、エタナーセプト、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ベバシズマブ、Ｔｙｓａｂｒｉ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｒｉｔｕｘａｎ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ（またはＣＤ２０に結合するあらゆるもの）である。

抗体
医薬品または他の市販の薬剤として現在使用されているかまたは研究中の多数の抗体を想定するならば、抗体の生産は、本発明にしたがう特定の目的である。抗体は、特定の抗原を特異的に結合する能力を有するタンパク質である。宿主細胞において発現され得る任意の抗体は、本発明にしたがって使用することができる。一実施形態では、発現される抗体はモノクローナル抗体である。

特定の抗体は、例えば、列挙したアミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製し発現させることによって、または列挙したアミノ酸配列をコードする遺伝子を提供するヒト生殖細胞遺伝子を変異させることによって、作製することができる。更に、これらの抗体は、例えば、以下の方法の１つ以上を使用して、生産され得る。

抗体、特にヒト抗体を得るために多くの方法が利用可能である。１つの例示の方法は、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えば米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９１／１７２７１；ＷＯ ９２／２０７９１；ＷＯ ９２／１５６７９；ＷＯ ９３／０１２８８；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／０９６９０；及びＷＯ ９０／０２８０９に記載されている。ファージ上におけるＦａｂ’ｓのディスプレイは、例えば米国特許第５，６５８，７２７号；第５，６６７，９８８号；及び第５，８８５，７９３号に記載されている。

ディスプレイライブラリーの使用に加えて、他の方法を使用して抗体を得ることができる。例えば、タンパク質またはそのペプチドは、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスターまたはラットにおける抗原として使用することができる。

一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。ヒトＩｇ遺伝子座の大きい断片を使用して、マウス抗体生産に欠けるマウス株を遺伝子操作することができる。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を生産及び選択することができる。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１、米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号、ＷＯ ９６／３４０９６及びＷＯ ９６／３３７３５を参照されたい。

別の実施形態では、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から取得し、次いで改変、例えばヒト化または脱免疫化する。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載のヒト化抗体の調製に使用できる例示的ＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全部または一部を、非ヒト抗体の少なくとも一部で置換することができる。一実施形態では、抗原に結合する有用なヒト化抗体に到達するために、そのようなＣＤＲの結合または結合決定基（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）にとって必要とされるＣＤＲを置換する必要があるのみである。

抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域に由来する等価配列で置換することによって、ヒト化抗体を作製することができる。ヒト化抗体を作製する一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７によって、Ｏｉ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４によって、そして米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第５，８５９，２０５号；及び米国特許第６，４０７，２１３号によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、そして発現させることを含む。そのような核酸源は、当業者に周知であり、例えば、上記したように、所定の標的に対する抗体を生産するハイブリドーマから、生殖系列の免疫グロブリン遺伝子から、または合成構築物から得ることができる。次いで、ヒト化抗体をコードする組換えＤＮＡを適当な発現ベクター中にクローニングすることができる。一実施形態では、その発現ベクターは、グルタミンシンセターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。（例えばＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２６（５）：１４４６−５４（２０１０）を参照されたい）。

抗体は、ヒトＦｃ領域、例えば、野生型Ｆｃ領域または１つ以上の改変を含むＦｃ領域を含むことができる。一実施形態では、定常領域を、改変、例えば突然変異させて、抗体の性質を変更する（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうちの１つ以上を増加または低下させる）。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を、１つ以上の残基、例えば、残基２３４及び２３７の１つ以上で変異させることができる。抗体は、重鎖のＣＨ２領域に、例えば、Ｆｃ受容体結合及び補体活性化などのエフェクター機能を低下または変化させる変異を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号に記載されているような変異を有し得る。また、抗体は、当該技術分野で開示されているように（例えば、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８）、免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合を安定させる変異、例えばＩｇＧ４のヒンジ領域における変異も有し得る。例えば米国特許出願公開第２００５−００３７０００号も参照されたい。

他の実施形態では、変更されたグリコシル化パターン（すなわち、本来または天然のグリコシル化パターンから変更されている）を有するように、抗体を改変することができる。ここで「変更された」とは、１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／または本来の抗体に付加された１つ以上のグリコシル化部位を有することを意味している。本願で開示されている抗体にグリコシル化部位を付加することは、グリコシル化部位のコンセンサス配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって達成することができる；そのような技術は当該技術分野で公知である。抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段としては、抗体のアミノ酸残基にグリコシドを化学的または酵素的に結合させることが挙げられる。これらの方法は、例えばＷＯ ８７／０５３３０及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９−３０６に記載されている。抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、当該技術分野で記載されているように（（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１；及びＴｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０））化学的または酵素的に達成することができる。サルベージ受容体結合エピトープを提供することによるｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延長させる改変については、例えば米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

抗体は、全長抗体の形態、または抗体の断片の形態、例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、ｄＡｂ断片、及びｓｃＦｖ断片であり得る。更なる形態としては、単一の可変領域、例えば、ラクダ由来のドメインまたはラクダ化ドメインを包含するタンパク質が挙げられる。例えば米国特許出願公開第２００５−００７９５７４号及びＤａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（６）：５３１−７を参照されたい。

一実施形態では、抗体は、全長抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ断片である。典型的には、抗体は全長抗体である。抗体は、モノクローナル抗体または単一特異性抗体であり得る。

別の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、変異抗体、親和性成熟抗体、脱免疫抗体、合成抗体、またはそれ以外のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成抗体、及びそれらの組み合わせであり得る。

抗体の重鎖及び軽鎖は、実質的に全長であり得る。タンパク質は、少なくとも１つの、好ましくは２つの完全な重鎖及び少なくとも１つの、好ましくは２つの完全な軽鎖を含むことができるか、または抗原結合断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖ断片）を含むことができる。更に他の実施形態では、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥから選択される重鎖定常領域；特に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域、更に特にＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）である重鎖定常領域を有する。典型的には、この重鎖定常領域は、ヒトの定常領域、またはヒト定常領域の改変形態である。別の実施形態では、抗体は、例えば、カッパまたはラムダから選択される軽鎖定常領域、特にカッパ（例えば、ヒトカッパ）である軽鎖定常領域を有する。

受容体
医薬品及び／または市販の薬剤として有効であるとされてきたポリペプチドの別のクラスは、受容体を含む。受容体は、典型的には、細胞外シグナル伝達リガンドを認識することによって機能する膜貫通糖タンパク質である。受容体は、典型的には、リガンド認識ドメインに加えて、リガンドを結合する際に、標的の細胞内分子をリン酸化することによってシグナル伝達経路を開始するタンパク質キナーゼドメインを有し、細胞内で発育変動または代謝変化をもたらす。一実施形態では、目的の受容体は、（単数または複数の）膜貫通ドメイン及び／または細胞内ドメインを除去するように改変され、前記ドメインの代わりに、Ｉｇドメインが任意に付着され得る。一実施形態では、本発明にしたがって生産される受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＲＴＫファミリーは、多くの細胞型の様々な機能にとって重要である受容体を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＹａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３−４７８，１９８８；Ｕｌｌｒｉｃｈ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ ６１：２４３−２５４，１９９０を参照されたい）。ＲＴＫの非限定的な例としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体ファミリーのメンバー、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ）ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、免疫グロブリン及びＥＧＦ相同性ドメイン−１（ＴＩＥ−１）受容体及びＴＩＥ−２受容体を有するチロシンキナーゼ（参照により本明細書に組み込まれるＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７６（６５３５）：７０−７４（１９９５））、ならびにそのいくつかが血管新生を直接的にまたは間接的に促進することが示唆されているｃ−Ｍｅｔ受容体（Ｍｕｓｔｏｎｅｎ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２９：８９５−８９８，１９９５）が挙げられる。ＲＴＫの他の非限定的な例としては、胎児肝臓キナーゼ１（ＦＬＫ−１）（キナーゼインサートドメイン含有受容体（ＫＤＲ）と呼ばれることもある（Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１６７７−８３，１９９１）または血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２））、血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ−１）と呼ばれることもあるｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ−１（Ｆｌｔ−１）（ＤｅＶｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５；９８９−９９１，１９９２；Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：５１９−５２４，１９９０）、ニューロピリン−１、エンドグリン、エンドシアリン、及びＡｘ１が含まれる。当業者であれば、本発明にしたがって発現され得る他の受容体を知っているであろう。

増殖因子及び他のシグナル伝達分子
医薬品及び／または市販の薬剤として有効であるとされてきたポリペプチドの別のクラスは、増殖因子及び他のシグナル伝達分子を含む。増殖因子は、典型的には、細胞により分泌され、他の細胞に結合し、他の細胞上にある受容体を活性化し、その受容体細胞において発育変動または代謝変化を惹起させる糖タンパク質である。

哺乳動物増殖因子及び他のシグナル伝達分子の非限定的な例としてはサイトカイン；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータ、例えばＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、ＴＧＦ−ベータ４、またはＴＧＦ−ベータ５；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８及びＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＴＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ及びベータ；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；抗凝血因子、例えばタンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織プラスミノゲン活性化物質（ｔ−ＰＡ））；ボンベシン；トロンビン、造血増殖因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（通常はＴ細胞で発現且つ分泌され活性化を調節する）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレキサシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）または神経成長因子、例えばＮＧＦ−ベータが挙げられる。当業者であれば、本発明にしたがって発現され得る他の増殖因子またはシグナル伝達分子を知っているであろう。

凝固因子
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は凝固因子を含む。本明細書で使用される場合、凝固因子とは、止血障害の対象における出血エピソードの期間を予防または短縮する任意の分子またはその類似化合物を意味している。例えば、本発明のための凝固因子は、全長凝固因子、成熟凝固因子、またはキメラ凝固因子であり得る。換言すれば、それは、凝固活性を有するあらゆる分子を意味している。本明細書で使用されるように、凝固活性とは、フィブリン凝塊の形成において最高点に達する、及び／または出血または出血エピソードの重症度、持続期間または頻度を減らす生化学反応のカスケードに関与する能力を意味している。凝固因子の例は、米国特許第７，４０４，９５６号で見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子またはｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子である。凝固因子は、外因性経路に関与する因子であり得る。凝固因子は、内因性経路に関与する因子であり得る。あるいは、凝固因子は、外因性経路及び内因性経路の両方に関与する因子であり得る。

一実施形態では、凝固因子は、ヒト凝固因子、または、例えば非ヒト霊長類、ブタまたは任意の哺乳動物に由来する非ヒト凝固因子であり得る。凝固因子は、キメラ凝固因子であることができ、例えば、凝固因子は、ヒト凝固因子の部分とブタ凝固因子の部分、または第１非ヒト凝固因子とＮ非ヒト凝固因子の部分を含むことができる。

別の実施形態では、凝固因子は、活性化された凝固因子であり得る。あるいは、凝固因子は、凝固因子の不活性型、例えば酵素前駆体であり得る。不活性凝固因子は、免疫グロブリン定常部領域の少なくとも一部に連結した後に活性化することができる。不活性凝固因子は、対象に投与後に活性化することができる。あるいは、不活性凝固因子は、投与前に活性化することができる。

ある特定の実施形態では、凝固因子は第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。本明細書で使用される「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」とは、特に明記しない限り、凝固でその正常な役割を担う機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を意味している。したがって、用語ＦＶＩＩＩは、機能的である変異体タンパク質を含む。一実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはネズミのＦＶＩＩＩタンパク質である。機能的ＦＶＩＩＩタンパク質は、融合タンパク質であることができ、例えば、限定するものではないが、完全または部分的にＢドメインが欠失されたＦＶＩＩＩ、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、例えばＦｃドメイン、または両方を含む融合タンパク質であることができる。無数の機能的ＦＶＩＩＩ変異体が作製されてきており、本明細書記載の組換えＦＶＩＩＩタンパク質として使用することができる。そのすべてが参照により本明細書に完全に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１１／０６９１６４ Ａ２、ＷＯ２０１２／００６６２３ Ａ２、ＷＯ ２０１２／００６６３５ Ａ２、またはＷＯ ２０１２／００６６３３ Ａ２を参照されたい。

非常に多くの機能的ＦＶＩＩＩ変異体が知られている。更に、ＦＶＩＩＩにおける何百もの機能しない突然変異は、血友病患者で同定されてきた。全体が参照により本明細書に組み込まれる、例えばＣｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：２７４−８（２００２）を参照されたい。更に、ヒト由来のＦＶＩＩＩと他の種との比較により、機能に必要とされる可能性がある保存残基が同定されてきた。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７−２２（１９９８）；ＵＳ６，２５１，６３２を参照されたい。

ある特定の態様では、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質はキメラである。本明細書で使用されるように「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」とは、異なる供給源由来のアミノ酸の少なくとも２つの広がりを中に含む、タンパク質またはポリペプチド、例えば異種部分を含むＦＶＩＩＩタンパク質を意味している。一実施形態では、異種性部分は半減期延長部分であり得る。例えば、異種性部分の例としては、免疫グロブリン定常部領域またはその断片、例えばＦｃ領域もしくはＦｃＲｎ結合パートナー、ＶＷＦ分子またはその断片、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｆｃ、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質はＦＶＩＩＩモノマーダイマーハイブリッドである。

本発明にとって有用な長時間作用または長期持続ＦＩＸポリペプチドは、ＦＩＸポリペプチド及びＦｃＲｎ結合パートナーを含むキメラポリペプチドである。特に明記しない限り、本発明のＦＩＸポリペプチドは、凝固でその正常な役割を担う機能的第ＩＸ因子ポリペプチドを含む。したがって、ＦＩＸポリペプチドは、機能的である変異体ポリペプチド、及びそのような機能的変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、及びネズミのＦＩＸポリペプチドである。ＦＩＸの全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は、多くの機能的変異体、例えば断片、変異体及び改変体が知られている。ＦＩＸポリペプチドとしては、全長ＦＩＸ、全長ＦＩＸからＮ末端のＭｅｔを引いたもの、全長ＦＩＸからシグナル配列を引いたもの、成熟ＦＩＸ（シグナル配列及びプロペプチドを引いたもの）、そしてＮ末端に追加のＭｅｔを有する成熟ＦＩＸが挙げられる。ＦＩＸは、組換え手段によって作製することができ（「組換え第ＩＸ因子」または「ｒＦＩＸ」）、すなわち、それは、天然ではなく、または血漿由来ではない。

また、凝固因子は、ＦＩＸタンパク質または任意の変異体、類似体、またはその機能的断片も含むことができる。多くの機能的ＦＩＸ変異体が公知である。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０２／０４０５４４ Ａ３は、４頁の９〜３０行及び１５頁の６〜３１行で、ヘパリンによる阻害に対する耐性の増加を示す変異体を開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０３／０２０７６４ Ａ２は、表２及び３（１４〜２４頁）、そして１２頁の１〜２７行で、低下したＴ細胞免疫原性を有するＦＩＸ変異体を開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ２００７／１４９４０６ Ａ２は、４頁の１行〜１９頁の１１行で、タンパク質安定性の増加、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期の増加、及びプロテアーゼに対する耐性の増加を示す、機能的変異体ＦＩＸ分子を開示している。また、国際公開番号ＷＯ ２００７／１４９４０６ Ａ２は、１９頁の１２行〜２０頁の９行で、キメラ及び他の変異体ＦＩＸ分子も開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０８／１１８５０７ Ａ２は、５頁の１４行〜６頁の５行で、凝固活性の増加を示すＦＩＸ変異体を開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０９／０５１７１７ Ａ２は、９頁の１１行〜２０頁の２行で、半減期の増加及び／または回復の増加をもたらす、Ｎ結合型及び／またはＯ結合型グリコシル化部位数の増加を有するＦＩＸ変異体を開示している。また、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０９／１３７２５４ Ａ２は、２頁の段落［００６］〜５頁の段落［０１１］及び１６頁の段落［０４４］〜２４頁の段落［０５７］で、グリコシル化部位数が増加している第ＩＸ因子変異体も開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０９／１３０１９８ Ａ２は、４頁の２６行〜１２頁の６行で、半減期の増加をもたらす、グリコシル化部位数が増加している、機能的変異体ＦＩＸ分子を開示している。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０９／１４００１５ Ａ２は、１１頁の段落［００４３］〜１３頁の段落［００５３］で、ポリマー（例えばＰＥＧ）の結合のために使用され得る増加した数のＣｙｓ残基を有する機能的ＦＩＸ変異体を開示している。２０１１年７月１１日に出願された国際公開番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９及び２０１２年１月１２日にＷＯ ２０１２／００６６２４として公開されたＦＩＸポリペプチドも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

更に、ＦＩＸにおける数百の非機能的変異体が、血友病患者において同定されており、これらの多くは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ ０９／１３７２５４ Ａ２の１１〜１４頁の表１に開示されている。そのような非機能的変異体は、本発明には含まれないが、どの変異体が、機能的ＦＩＸポリペプチドをもたらす可能性が高いかまたは低いかについて、更なるガイダンスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＩＸモノマーダイマーハイブリッドである。モノマーダイマーハイブリッドは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、ＦＩＸポリペプチド及び第１Ｆｃ領域を含む１つの鎖、及び第２Ｆｃ領域を含む、から本質的に成る、またはから成るもう１つの鎖を含むことができる。ある特定の態様では、ＦＩＸモノマーダイマーハイブリッドは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、ＦＩＸポリペプチドから本質的に成るまたはから成る第１鎖、及び第２Ｆｃ領域から本質的に成るまたはから成る第２鎖から本質的に成るまたはから成る。

いくつかの実施形態では、凝固因子は第ＶＩＩ因子またはその変異体の成熟形態である。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；因子７、凝固第ＶＩＩ因子、血清第ＶＩＩ因子、血清プロトロンビン転換促進因子、ＳＰＣＡ、プロコンベルチン、及びエプタコグアルファとも呼ばれる）は、凝固カスケードの一部であるセリンプロテアーゼである。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２）、及び例えばキモトリプシンのようなセリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーのうちで高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（またはペプチダーゼＳ１ドメイン）を含む。ＦＶＩＩは、単鎖チモーゲン、活性化されたチモーゲン様の二本鎖ポリペプチド及び完全に活性化された二本鎖形態として存在する。

例示的なＦＶＩＩ変異体としては、比活性が増大した変異体、例えば、その酵素活性（ＫｃａｔまたはＫｍ）の増大によってＦＶＩＩの活性が増している変異体が挙げられる。このような変異体は、当該分野で記載されており、例えばＰｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１．ＰＮＡＳ ９８：１３５８３；Ｐｅｔｒｏｖａｎ ａｎｄ Ｒｕｆ．２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６６１６；Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９１９５；Ｓｏｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７２２９；Ｓｏｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：４９０２７に記載されている、例えば、分子の変異形態が挙げられる。

一実施形態では、ＦＶＩＩの変異型としては突然変異体が挙げられる。例示の突然変異体としてはＶ１５８Ｄ−Ｅ２９６Ｖ−Ｍ２９８Ｑが挙げられる。別の実施形態では、ＦＶＩＩの変異型としては、ＦＶＩＩ成熟配列由来のアミノ酸６０８−６１９（ＬＱＱＳＲＫＶＧＤＳＰＮ，１７０ループに対応する）を、トリプシンの１７０ループ由来のアミノ酸ＥＡＳＹＰＧＫで置換したものが挙げられる。ＦＩＸの高い比活性の変異体も当該技術分野で公知である。例えば、Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００９ Ｎ．Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６１：１６７１）はＲ３３８Ｌ変異体を記載している。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８８ ＪＢＣ ２７３：１２０８９）及びＰｉｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００９ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：４７９）はＲ３３８Ａ変異体を記載している。他の変異体は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｚｏｇｇ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ．２００９ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １７：１６６９；Ｓｉｃｈｌｅｒ ｅｔｌ ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１２１；及びＳｔｕｒｚｅｂｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１２：２９５に記載されているものが挙げられる。これらの引用文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

チモーゲン様形態からの配座変化の際に生じる完全活性化は、その補助因子である組織因子に結合する際に生じる。また、組織因子の非存在下で配座変化をもたらす変異もまた導入され得る。したがって、ＦＶＩＩａへの言及は、その両方の二本鎖形態：すなわち、チモーゲン様形態（例えば、活性化可能なＦＶＩＩ）、及び完全活性化された二本鎖形態を含む。

本発明に有用な凝固因子の例を開示している様々な特許または出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、凝固因子（ＦＶＩＩ、ＦＩＸ及びＦＶＩＩＩ）を含む様々なモノマーダイマーハイブリッド構築物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ ７，４０４，９４５、ＵＳ ７，３４８，００４、ＵＳ ７，８６２，８２０、ＵＳ ８，３２９，１８２、及びＵＳ ７，８２０，１６２で開示されている。ＦＶＩＩＩキメラタンパク質の例は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７３４，９５４号または第６１／６７０，５５３号で更に開示されている。ＦＶＩＩキメラタンパク質の例は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／６５７，６８８号で開示されている。

Ｇタンパク質共役型受容体
医薬品及び／または市販の薬剤として有効であると示されてきたポリペプチドの別のクラスは、増殖因子及び他のシグナル伝達分子を含む。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は７つの膜貫通ドメインを有するタンパク質である。リガンドがＧＰＣＲに結合すると、信号が、細胞の生物学的または生理学的特性の変化をもたらす細胞内に伝達される。

ＧＰＣＲはＧタンパク質及びエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される細胞内酵素及びチャネル）と共に細胞内第二メッセンジャーの状態を細胞外入力に連結するモジュラー信号伝達システムの構成要素である。これらの遺伝子及び遺伝子産物は、疾患の潜在的原因である。

ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、異なる種を由来とする同じ受容体であるオーソログに対して、遺伝子複製（または他のプロセス）によって生じる変異体を表す受容体である、現在２５０種類を超えるパラログを含む。このスーパーファミリーは次の５つのファミリーへと分けることができる：すなわち、ファミリーＩ、ロドプシン及びベータ２−アドレナリン作動性受容体を典型とする、現在２００を超えるユニークなメンバーによって代表される受容体；ファミリーＩＩ：最近になって特性が明らかにされた副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー；ファミリーＩＩＩ：哺乳動物における代謝型グルタミン酸受容体ファミリー；ファミリーＩＶ：キイロタマホコリカビ（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）の化学走性及び発生において重要であるｃＡＭＰ受容体ファミリー；及びファミリーＶ、ＳＴＥ２などの真菌接合フェロモン受容体。

ウイルス
更に、本発明は、ウイルス学分野の当業者に公知の方法による細胞培養を使用してウイルスを生産するための方法も提供する。本発明にしたがって生産されるウイルスは、培養細胞型を感染させる公知のウイルスの範囲から選択することができる。例えば、哺乳動物細胞培養を利用する際には、ウイルスは、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス属、アレナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コロナウイルス及びアデノウイルスから選択することができる。使用されるウイルスは、野生型ウイルス、弱毒ウイルス、リアソータントウイルス、または組換えウイルスであり得る。更に、細胞をウイルスに感染させるのに使用される実際のビリオンの代わりに、感染性核酸クローンを、ウイルス学分野の当業者に公知の感染性クローントランスフェクション法にしたがって利用することができる。一実施形態では、生産されるウイルスはインフルエンザウイルスである。

前記の説明は単に代表例であって、限定することを意図していないことを理解すべきである。本発明を実施するための別の方法と材料、及び追加の用途は、当業者には明らかであって、添付の請求の範囲内に包含されることを意図している。

本発明の実施は、特に明記しない限り、当該技術分野の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は文献で詳細に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆
Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。

抗体工学の一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。タンパク質工学の一般的原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理は：Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；及びＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に記載されている。更に、当該技術分野で公知であって詳細に説明されていない免疫学の標準法は、一般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ
ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）ａｎｄ Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）にしたがう。

免疫学の一般的原理を記載している標準的な文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｄｔ ａｎｄ Ｂａｒｂａｒａ Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ ＆ Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６ｔｈ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００３）が挙げられる。

上記の文献、ならびに本明細書に記載の文献のすべては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

以下の実施例では、低密度バッチＮ−１、その後の低シードフェドバッチ生産による従来の細胞培養プロセスと比較して、高シードフェドバッチ生産と連結された高密度灌流Ｎ−１技術の使用は、タンパク質回収力価を増加させ、生産能力を最大にできることを示すために、３つの異なる組換えタンパク質を生産する３つの異なるＣＨＯ細胞株を使用している。

高シード生産は、より短期間で同じかまたはより高い回収力価を可能にするので、生産量及び生産能力を向上させた。更に、生産量の増加は、目的の我々のタンパク質の３種すべてについて、望ましい生産物品質属性をもたらした。灌流Ｎ−１／高シードフェドバッチ生産の組み合わせによって提供されるプロセス増強は、低シードフェドバッチ生産の生産物品質に匹敵する生産物品質を得ることができるか、または、低シードの生産物品質とは異なる優れた生産物品質をもたらすことができる。

実施例１
細胞株及び培養法
細胞株及び培地
３種の異なる組換えタンパク質生産物を生産する３種の異なるＣＨＯ細胞株をこれらの実験で使用した。細胞株Ａ及びＢはモノクローナル抗体を生産し、細胞株ＣはＦｃ融合タンパク質を生産する。本研究で使用された既知組成の基本培地及び流加培地は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＨＯ ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｙｐｉｃａｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２０１０，２６，（５），１４００−１０で説明されているものであった。

シード培養
３種すべての細胞株を解凍し、前述のようにして増殖させた（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，前掲書、及びＫｓｈｉｒｓａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１２，１０９，（１０），２５２３−３２）。細胞は、３６℃及び５％ＣＯ_２の培養器設定で１ｘ濃縮基本培地を使用して、３〜４日毎に１Ｌまたは３Ｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク州）で継代した。

次いで、振盪フラスコからの細胞を使用して、生産用バイオリアクターに先行する培養段階のための従来のＮ−１モードまたは灌流Ｎ−１モードでＦｉｎｅｓｓｅ ＤｅｌｔａＶ（商標）コントローラ（カリフォルニア州サンノゼ）を備えているベンチスケール５−ＬガラスＡｐｐｌｉｋｏｎ（登録商標）バイオリアクター（カリフォルニア州フォスターシティー）に接種した。両方のシードトレインバイオリアクターモードに関して、温度を３６℃に調節し、ｐＨを、１Ｍ炭酸ナトリウム（バッチモード）または０．５Ｍ水酸化ナトリウム（灌流モード）及びＣＯ_２スパージングを用いて６．９〜７．３に調整し、そして撹拌を２００回転／分〜４００回転／分で変化させた。

「従来の」バッチＮ−１（対照培養）のために、１ｘ濃縮基本培地を使用した。流加は無く、ｐＨ調整のための塩基の添加のみだった。溶解酸素は、散布している空気及び酸素を使用して、３０％で制御した。Ｎ−１バイオリアクターは、２．５Ｌの作業体積を有し、培養期間は３日であった。Ｎ−１段階の終了後、細胞を、０．４×１０^６ｖｃ／ｍＬまたは１×１０^６ｖｃ／ｍＬの標的播種密度で、従来の低シードフェドバッチ生産用バイオリアクターに分配した。

灌流Ｎ−１のために、１ｘ及び２ｘ濃縮基本培地を、細胞株及び用途に応じて使用した。本発明者は、タンパク質生産物ではなく細胞を保持するために、０．２μｍのフィルターを用いる交互接線流（ＡＴＦ４（商標）、Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州パインブルック）灌流技術を使用した。灌流培地速度は、細胞株及び培地に応じて、０．０５〜０．１２ｎＬ細胞^−１日^−１の細胞特異的灌流量（ＣＳＰＲ）で変化させた。ＡＴＦ交代速度は１．０〜２．５Ｌ／分で変化させた。ＡＴＦフィルター回収率に等しい体積灌流流量は、バイオキャパシタンスプローブ（Ａｂｅｒ，Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ，ＵＫ；参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｗｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅｓ．”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００３，４２，（１），３５−４５に記載されている）によって、自動制御した。

Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｉｇｎｕｍ（登録商標）スケールによる重量に基づくフィードバック制御を使用して、灌流Ｎ−１段階の期間全体にわたって４Ｌの総作業体積を維持するための新鮮な灌流培地を反応器に送達した。溶存酸素は、ＡＴＦユニット内での滞留時間を補償するために空気及び酸素スパージングを使用して５０％に制御した。灌流Ｎ−１培養期間は５または７日であった。灌流Ｎ−１段階の終了後に、細胞を、高シードフェドバッチ生産用バイオリアクターに分配した。

フェドバッチ生産培養法
また、フェドバッチ生産用バイオリアクターは、２．５Ｌの初期作業体積を有する５ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中でも実行された。すべての細胞株のためのすべてのフェドバッチ生産用バイオリアクターは、同じ１ｘ濃縮の基本培地及び流加培地を使用した。流加培地の添加は、低シードプロセスでは２日目または３日目で開始し、高シードプロセスでは０日目で開始した。飼料は、２４時間毎に投与し；供給体積は、対応するプロセスの生細胞の積分（ＩＶＣ）に比例した。

細胞株Ａ及びＢに関して、温度を３５℃に調節し、ｐＨを、１Ｍ炭酸ナトリウム及びＣＯ_２スパージングを用いて６．９〜７．３に調整し、そして撹拌を３００回転／分〜４００回転／分で変化させた。低シード培養期間は１７日であり、高シード培養期間は１２日であった。細胞株Ａのための高シード生産用バイオリアクターに、１０×１０^６ｖｃ／ｍＬで播種した；対応する低シード生産用バイオリアクターの播種密度の２５倍であった。

細胞株Ｃに関して、低シードプロセスは、温度を３５℃に調節した６日間、続いて温度を３０℃に調節した８日間から成っていた。高シード細胞株Ｃプロセスは１０×１０^６ｖｃ／ｍＬで接種した；対応する低シードプロセスの播種密度の１０倍であった。高シードプロセスは１２日間実行し、温度は０日目から３０℃に調節した。高シード及び低シードの両方のｐＨを、１Ｍ炭酸ナトリウム及びＣＯ_２スパージングを用いて６．９〜７．３に調整し、撹拌を２００回転／分〜３００回転／分で変化させた。

オフライン分析法
日々のバイオリアクターサンプリングを実施して、ＮＯＶＡ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ（登録商標）Ｆｌｅｘバイオセンサー（ＮＯＶＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、代謝パラメーター、例えばグルタミン、グルタミン酸塩、乳酸塩、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、及びカルシウムを測定した。生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率は、自動Ｃｅｄｅｘ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ ＡＧ、独逸国）によるトリパンブルー排除を使用して測定した。ｐＨ及びｐＣＯ_２は、ＮＯＶＡ ｐＨＯＸ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮＯＶＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して測定した。上清サンプルは、滅菌ろ過し、更なる力価及び生産物品質分析のために２〜８℃で保存した。ＩＶＣは、生細胞密度曲線の下の面積領域から決定し、所望の時間間隔にわたる台形近似の合計を用いて推定する。

タンパク質濃度及び生産物品質の分析
細胞株Ａ、Ｂ及びＣに関するタンパク質濃度は、紫外線検出器及びタンパク質Ｇアフィニティーカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州）を有するＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州）を使用して測定した。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して回収細胞培養液について小規模精製を行い、そして対応する生産物品質分析をタンパク質Ａ溶出液について行った。細胞株Ａ及びＢによって生産される抗体に関して、タンパク質Ａ溶出液における主なモノマーピークの割合を、非還元性不純物プロファイリング条件下で、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、測定した。イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ＩＣＩＥＦ）を使用して抗体電荷不均一性を測定した。親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣ）を使用して抗体Ｎ−グリカンプロフィールを測定した。

細胞株Ｃによって生産されるＦｃ融合タンパク質に関して、ＨＰＬＣ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、タンパク質Ａ溶出液に対して行って、組換えタンパク質の活性及び非活性レベルを定量化した。

実施例２
細胞株Ａ：Ｎ−１灌流最適化
細胞株Ａを、灌流Ｎ−１最適化のためのモデル系として使用した。灌流Ｎ−１の第１反復において、本発明者は、１ｘ濃縮の既知組成基本培地を使用して７日間Ｎ−１灌流培養を行った。細胞特異的灌流量（ＣＳＰＲ）は０．１ｎＬ細胞^−１日^−１であった。細胞は指数関数的に６０×１０^６ｖｃ／ｍＬを超えて増殖し、高い生存率を維持した（図１Ａ）。しかしながら、最初の灌流Ｎ−１プロセスは、ｐＣＯ_２の高蓄積及び灌流培地の高消費に起因して最適以下であった（図１Ｃ，Ｄ）。

本発明者は、最初に、ＣＳＰＲを低下させることによって灌流される灌流培地の体積を低下させようとした。ＣＳＰＲを大きく低下させると、培地の消費が低下するが、増殖が阻害されることになり、ｐＣＯ_２蓄積は解消されなかった。更に、０．０５ｎＬ細胞^−１日^−１のＣＳＰＲは、最適以下の（弱い）増殖による培養の間、０．０７まで増加させなければならなかった。

１ｘ濃縮培地を使用している０．０５のｎＬ細胞^−１日^−１ ＣＳＰＲで最適以下の結果を観察した後に、我々の基本培地の２ｘ濃縮バージョンを使用した。より高いＮ−１播種密度（元の１×１０^５ｖｃ／ｍＬの播種密度に代えて２×１０^５ｖｃ／ｍＬ）と組み合わせたより濃縮された培地により、７日から５日へと培養期間を短縮することができ、そして４０ｘ１０^６ｖｃ／ｍＬを超える指数増殖のためにより低い０．０５ｎＬ細胞^−１日^−１ＣＳＰＲの使用が可能になった。より高度にＮ−１に播種するために、本発明者は、前の接種物継代の各々の開始播種密度を徐々に増加させた。更に、より短い培養期間により、ｐＣＯ_２は１００ｍｍＨｇ未満に保たれ、そして２ｘ濃縮培地により、灌流培地のバイオリアクター体積の消費は３未満となった（図１）。灌流Ｎ−１段階の５日目及び最終日に、本発明者は、細胞を、高シードフェドバッチ生産用バイオリアクター中に分配した。

実施例３
細胞株Ａ：高シードフェドバッチ生産
高シード（１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ）フェドバッチ生産培養物を、上記のように既知組成流加培地を使用して、毎日供給した。本発明者は、０日目の高シードプロセスと５日目の低シードプロセスとを合わせると、高シード培養の性能は、ＶＣＤ、生存率、グルコース消費、乳酸塩生成、及びタンパク質生産において低シード培養の性能を辿る（図２）。高シードプロセスは、低シードプロセスの１７日目と比較して、ちょうど１２日目で、低シードプロセスと同じ回収力価に到達することができ、抗体を５ｇ／Ｌ生成した。更に、タンパク質凝集及び電荷不均一性は、高シード培養条件によって影響を受けなかった（後述の表１を参照されたい）。

実施例４
細胞株Ｂ：高シードフェドバッチ生産
２ｘ濃縮培地、より高度のＮ−１播種密度、及びより短い培養期間を用いる細胞株Ａの最適化された灌流Ｎ−１プロセスを細胞株Ｂにうまく適用した。灌流Ｎ−１段階での増殖は、指数関数的であり、そして細胞株Ａのための最適化プロセスのそれに似ており、この場合もまた、５日目で約４０×１０^６ｖｃ／ｍＬまで増殖した。５日目のＮ−１段階の終了後に、細胞を、高シード（１０×１０^６ｖｃ／ｍＬ）フェドバッチ生産用バイオリアクター培養へと分配した。細胞株Ｂに関して、より高度の播種密度は、はるかに高度の増殖をもたらす（図３Ａ）。細胞は増殖に基づいて供給されたので、全体のグルコース消費及び乳酸塩生成は、これもまた増殖に基づいて供給された低シード培養のそれと十分に傾向が同様であった（図３Ｂ、Ｃ）。細胞株Ａのように、細胞株Ｂのための高シードプロセスは、５日足らずで同量のタンパク質を生成した（図３Ｄ）。更に、これらの効率の増加は、凝集、電荷不均一性、及び高シード回収材料のグリコシル化が低シード回収材料のそれと類似していたので、生産物品質を犠牲にして得られたものではなかった（表１）。

表１では、１００％は細胞株Ａ及びＢのための低シード生産プロセスに関する平均を表しており、そして高シード生産プロセスに関する値は１００％と比較して表した。すべてのデータは、低シードＮ−グリカンデータ以外は、Ｎ＝２であった。すべての属性は、タンパク質Ａ溶出液を使用して得た。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩタンパク質プロファイリングで測定された純度、ＩＣＩＥＦで測定された電荷不均一性、及びＨＩＬＩＣ−ＵＰＬＣで測定されたＮ結合型グリコシル化は、細胞株Ａ及びＢに関する低シード回収材料と高シード回収材料との間に大きな違いはない。

実施例５
生産能力増大への影響
Ｎ−１シードトレイン段階を長くし、そしてより高度に生産用バイオリアクターに播種することによって、生産段階を短縮することができ、そしてシードトレインと生産用バイオリアクター占有率との間のバランスをより多くとることができる。これにより、より少ない時間で、重量基準で同様なまたはより多くの生産物生産量が提供される。これにより、生産用バイオリアクターがボトルネックとなることを解消し、そして生産運転のために割り当てられる時間の中でより多くの運転が可能になるので、同じ制約下でより高度なレベルのタンパク質生産が可能になる。

灌流Ｎ−１プロセスを実装することによって得られるボトルネック解消の程度は、シード及び生産段階の期間ならびに設備レイアウトに応じて決まる。例えば、１つのシードトレイン（Ｓ）容器が１つの生産（Ｐ）容器に供給する場合（Ｐ／Ｓ比＝１）、生産容器は、５日灌流Ｎ−１／１２日フェドバッチ生産シナリオのボトルネックのままであろう（図４Ａ）。１つのシードトレイン容器が２つの生産容器に供給する場合（Ｐ／Ｓ比＝２）、ボトルネックはＮ−１段階にシフトする（図４Ｂ）。Ｐ／Ｓ比が３まで増加すると、ボトルネックは、シードトレインへますますシフトし、灌流Ｎ−１シード培養へ転換する利益は減少する（図４Ｃ）。シードトレイン１つ当たりの生産容器の数の関数として生産量をプロットすると、シード培養がバッチまたは灌流であるか否かにかかわらず、シードトレイン１つ当たり複数の生産容器を有することによって得られる利益はプラトーに達することが分かる（図４Ｄ）。従来の短いバッチシードトレインでも、３を超えるＰ／Ｓ比でボトルネックになる。バッチの数を最大にするために、３日Ｎ−１／１７日Ｎプロセス（低シード）のための最適Ｐ／Ｓ比は３であり、５日Ｎ−１／１２日Ｎ（高シード）のための最適比は２である。

図４の設備レイアウトモデルに基づいて、細胞株Ａ及びＢのための灌流Ｎ−１／高シードフェドバッチへのシフトの結果としての生産量の増加を算出することができる。Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ生産設備はＰ／Ｓ＝１またはＰ／Ｓ＝２であるので、Ｎ−１を延長し且つ生産段階を短縮するために灌流Ｎ−１を実装して同じ時間でより多くのバッチを得ることができる。これらの仮定と、細胞株Ａ及びＢに関する高シードフェドバッチデータとに基づいて、選択する設備に応じて、３０％を超えて生産量を潜在的に増加させることができる（表２）。能力のより大きな相対的変化はＰ／Ｓ＝１設備を使用して得られ、一方、生産されるタンパク質のより大きな絶対質量はＰ／Ｓ＝２を使用して得られる。

表２の計算のために立てた仮定：生産用バイオリアクター１つ当たり１つのシードトレイン、生産運転期間は１年、１年間の生産運転スロット当たりの最大数のバッチ、バイオリアクター１つ当たりの所要時間２日。

実施例６
細胞株Ｃ：Ｎ−１灌流最適化
灌流Ｎ−１は細胞株Ｃでも実施した。最適化された灌流Ｎ−１プロセスは、細胞株Ｃに関しては、増殖及び生存率が低かったので、効果的に使用することができなかった（図５）。したがって、０．１０〜０．１２ｎＬ細胞^−１日^−１のより高いＣＳＰＲの灌流培地として、１ｘ濃縮基本培地の元の配合に戻した。これらのパラメーターを使用すると、細胞株Ｃ灌流Ｎ−１段階は、高い生存率で、６日目で３５ｘ１０^６ｖｃ／ｍＬ超に達した（図５）。６日目に、灌流Ｎ−１培養を１０×１０^６ｖｃ／ｍＬで高シードフェドバッチ生産用バイオリアクターへと分配した。

実施例７
細胞株Ｃ：高シードフェドバッチ生産及び生産物品質への影響
細胞株Ｃによって生産される目的のＦｃ融合タンパク質は、ミスフォールディング する傾向があり、それにより不活性型のタンパク質が蓄積することになる。より低い温度ではタンパク質の折畳みにとって熱力学的により有利であるので（Ｏｎｕｃｈｉｃ，Ｊ．Ｎ．；Ｌｕｔｈｅｙ−Ｓｃｈｕｌｔｅｎ，Ｚ．；Ｗｏｌｙｎｅｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ：ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７，４８，５４５−６００で考察されている）、ミスフォールディングを軽減するための通常のタンパク質発現技術では、培養温度を低下させる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ ｂｙ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２００５，２１，（１），２２−３０；及びＧａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ａ ｈｏｓｔ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ２００８，７，１１で考察されており、前記の両文献は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、低シード細胞株Ｃプロセスは、培養の間、３５℃〜３０℃の温度変化を用いる。温度変化日における低シードプロセスのＶＣＤは、高シードプロセスの播種密度のそれとほぼ同じＶＣＤであるので、高シードプロセスは、０日目において３０℃培養温度で直接接種した。これにより、異なる増殖、代謝、及びタンパク質生産プロフィールがもたらされた（図６）。

本発明者は、３０℃で細胞株Ｃ高シードプロセスを直接培養することによって、低シードプロセスのそれと比較して、より大きな割合で活性種を生産した（以下の表３参照）。０．５μｍの中空糸フィルターを使用することにより、より高温の３６℃の灌流Ｎ−１段階の間に、Ｎ−１容器から灌流することができた。したがって、その灌流Ｎ−１が高シードフェドバッチ生産へと分配されるとき、不活性種のキャリオーバーはほとんどなかった。次いで、高シード培養は、細胞集団を殺すことなく０日目に開始して、より熱力学的に好ましい温度３０℃で、フェドバッチ生産を始めることができた。予想されるように、より低い生産温度では、不活性種の量は低下し、活性種のレベルは増加した。

表３について、ＨＩＣ−ＨＰＬＣを使用して、活性タンパク質と不活性タンパク質の相対的な割合を測定した。すべてのデータはＮ＝１であった。２つの種を合計すると１００％である。活性力価は、活性種から成る総力価の割合と定義される。３０℃で細胞株Ｃを直接に播種すると、活性種の生産が高まり、それに対応して、活性力価の量が増加した。また、低い温度では、不活性種のレベルも低下した。

本発明を一般的に説明したが、更なる理解は、本明細書で提供される実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、説明することのみを目的とするものであって、限定することを意図していない。

本明細書に記載される様々な態様、実施形態、及びオプションのすべては、任意の及びすべてのバリエーションで組み込むことができる。

個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的且つ個別的に示されるかのごとく、本明細書記載のすべての文書、論文、刊行物、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。

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