DE60124780T2

DE60124780T2 - Vorrichtung und verfahren zur serienvermehrung von säugerzellen zum animpfen

Info

Publication number: DE60124780T2
Application number: DE60124780T
Authority: DE
Inventors: Rudiger Emeryville HEIDMANN; Mokhtar Orinda MERED; D. James Oakland MICHAELS; Konstantin Walnut KONSTANTINOV
Original assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Bayer Pharmaceuticals Corp
Priority date: 2000-12-20
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: AU2002232726A1; JP2005502306A; CA2431230A1; WO2002050251A3; ES2276853T3; TWI314953B; DE60124780D1; WO2002050251A2; CA2431230C; EP1395647B1; JP4176472B2; EP1395647A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet: Diese Erfindung betrifft ein Säugetierzellkulturverfahren im Produktionsmaßstab und insbesondere ein neues Impfgut-Folgevermehrungsverfahren („seed-train expansion") für Säugetierzellen. Kryokonservierte Zellen werden verwendet, um direkt in einen neu entworfenen Bioreaktor zu inokulieren, der als Impfgutquelle im Produktionsmaßstab dient.
Hintergrund: Der Beginn einer neuen Zellenimpfgut-Folgevermehrung für eine Produktionskampagne zur Expression eines Säugetierzellkultursystems ist ein kritischer Verfahrensschritt. Unbeständigkeiten und Fehler im Betrieb kompromittieren oftmals das Verfahren, was zu signifikanten Verspätungen und Inokulum-Variabilität führt. In typischen Produktionsprotokollen beginnt eine neue Impfgut-Folgevermehrung aus einem 1- bis 2-ml-Kryoröhrchen (Master Working Cell Bank, MWCB). Die Zellkonzentration dieses Behälters liegt normalerweise im Bereich von 5–10 Millionen Zellen/ml. Die Zellen werden aufgetaut, gewaschen, um das Gefrierschutzmittel zu entfernen, und danach erstmals in kleinen Gewebskulturflaschen gezüchtet (beimpft). Bei Säugetierzellkulturen ist es standardmäßig üblich, Inokulationsdichten von 0,5 bis 1 × 10⁶ Zellen/ml zu verwenden. Das Beimpfen von Zellen bei niedrigeren Zellkonzentrationen nach der Kryokonservierung kann zu einer verlängerten Verzögerungsphase vor dem Beginn der Wachstumsphase führen sowie zu schlechter Zellleistung oder sogar zum Zelltod. Dies ist besonders bei den serumfreien oder sogar in den proteinfreien Zellkulturmedien hervorgehoben, die der modus operandi in der aktuellen Zellkulturherstellung geworden sind.
Die Zellen werden gemäß ihrer spezifischen Wachstumsrate (Zelldichte) subkultiviert und normalerweise alle 2–3 Tage in mehrere Zellkulturflaschen aufgeteilt. Ist einmal genügend Biomasse produziert worden, werden die Zellen in größere Kultivierungsflaschen, wie z.B. Rollflaschen, Schüttelflaschen oder rotierende Flaschen, expandiert. Nachdem genug Zellmasse angehäuft worden ist, wird ein Bioreaktor, der für den Reaktor im Produktionsmaßstab zu der Impfgutkultur wird, inokuliert. Diese be schriebene Impfgut-Folgevermehrung ist ein allgemein übliches Verfahren für mehrere Säugetierzelllinien und wird in der kommerziellen Herstellung und in der Wissenschaft auf breiter Basis verwendet. Ein Überblick über eine kommerzielle Impfgut-Folgevermehrung unter Verwendung von T-Flaschen und Rollflaschen ist ebenso bei Whitaker et al., Journal of the American Chemical Society, 28–43 (1998), zu finden.
Typische Protokolle zur Maßstabsvergrößerung, deren Vollendung unter optimalen Bedingungen etwa vier bis sechs Wochen benötigen, sind arbeitsintensiv und anfällig für Verunreinigungen und Variabilität. Die Bedingungen in kleinem Rahmen sind nicht klar definiert, normalerweise gibt es keinen Sollwert für pH und DO während der T-Flaschen-Periode, der Rollflaschenperiode oder der Schüttelflaschenperiode, was während des ganzen Verfahrens zu mehr Variabilität führen kann und die Qualität des Inokulum und des Produkts kompromittieren könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben einen neuen Bioreaktor und ein Verfahren für die Impfgut-Folgevermehrung von Säugetierzellen entwickelt. Dieses Verfahren eliminiert die Verwendung von Gewebskulturflaschen, Rollflaschen oder Schüttelflaschen.
Der neue Inokulations-Bioreaktor der Erfinder ist so gebaut, dass er ein verbessertes Verfahren einer Säugetierzellenimpfgut-Folgevermehrung erleichtert, und zeichnet sich durch das Vorhandensein eines „Inokulationswells" aus, der mit dem Inneren des Bioreaktors in Verbindung steht und der das Wachstum von Säugetierzellen zur kommerziellen Impfgut-Folgevermehrung erleichtert.
Das Verfahren der Erfinder zur Impfgut-Folgevermehrung von kryokonservierten Zellen umfasst die Verwendung eines spezifischen Inokulations-Bioreaktors mit einem Inokulationswell zur Expansion der Zellen vor ihrem Transfer in einen Produktionsbioreaktor. Spezifischer umfasst das Verfahren der Erfinder die Zugabe der kryokonservierten Zellen zu Medien in dem Inokulationswell des Inokulations-Bioreaktors, das Ermöglichen des Wachstums der Zellen bis zu einer vorbestimmten Konzentrati on in einem Inokulationswell durch Beobachten und Anpassen der Bedingung der Medien und der Umgebung sowie das darauf folgende schrittweise Vergrößern des Volumens der Medien im Reaktor, so dass ein optimales Zellwachstum beibehalten wird. Ist die gewünschte Zelldichte und das Volumen einmal erreicht, so werden die Zellen in einen Produktionsbioreaktor transferiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Inokulations-Bioreaktor einen „Inokulationswell", der sich am Boden der Reaktorkammer befindet. Dieser Inokulationswell ist mit Fermentationssensoren (pH, gelöster Sauerstoff, Temperatur, optische Dichte etc.) ausgestattet, um bei der Sicherstellung optimaler Kulturbedingungen zu helfen. Insbesondere wird bevorzugt, wenn der Inokulationswell so adaptiert ist, dass er einen Impellerantrieb durch eine Flüssigkeitsbewegungsvorrichtung eines kontinuierlich gerührten Reaktors (CSTR) umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt den Stand der Technik des Impfgut-Folgevermehrungsverfahrens.
2 zeigt das bevorzugte Verfahren dieser Erfindung.
3 zeigt das Konzept des Inokulationswell-Inokulationsbioreaktors.
4 zeigt eine kontinuierliche Perfusionskultur, die im Bioreaktor, der den 5-l-„Inokulationswell" enthält, durchgeführt wird, beginnend mit BHK-Zellen, die im 50-ml-Beutel kryokonserviert sind. Die lebensfähige Zelldichte (VCD [•]) und das Viabilitätsprofil [] werden gezeigt. Während der Kultur war die Lebensfähigkeit der Zellen hoch. Die Target-Zelldichte von 20 Millionen Zellen/ml bei einer Größe von 5 l wurde innerhalb von 12 Tagen erreicht.
5 zeigt die Wirkung eines DMSO-Waschschritts während der Impfgut-Folgevermehrung von BHK-Zellen. In der 12-l-Kultur (leere Symbole) wurde ein DMSO-Waschschritt durchgeführt, während die zweite 5-l-Kultur (ausgefüllte Symbole) direkt ohne Waschen der Zellen inokuliert wurde. Wie angegeben, wurde keine negative Wirkung beobachtet, sowohl die Zell-Lebensfähigkeit als auch das Zellwachstum zeigten keinen Unterschied.
6 zeigt eine kontinuierliche 12-l-Bioreaktor-Kultur, die mit im 50-ml-Beutel kryokonservierten BHK-Zellen begonnen wurde, es wurde keine DMSO-Waschung vor der Inokulation durchgeführt. Die lebensfähige Zelldichte (VCD [•]) und das Viabilitätsprofil [] werden gezeigt. Die Target-Zelldichte von 20 Millionen Zellen/ml bei einer Größe von 12 l wurde innerhalb von 14 Tagen erreicht.
7 zeigt eine 5-l-Kultur rekombinanter CHO-Zellen, die mit im 50-ml-Beutel kryokonservierten CHO-Zellen begonnen wurde, es wurde keine DMSO-Waschung vor der Inokulation durchgeführt. Die lebensfähige Zelldichte (VCD [•]) und das Viabilitätsprofil [] werden gezeigt. Die Target-Zelldichte wurde innerhalb von 6 Tagen erreicht.
8a zeigt zwei 5-l-Kulturen, die mit im 50-ml-Beutel, eine zweite Kultur mit in einem 100-ml-Beutel, kryokonservierten rBHK-Zellen begonnen wurde, es wurde keine DMSO-Waschung vor der Inokulation durchgeführt. Die lebensfähige Zelldichte (VCD [•]) und das Viabilitätsprofil [] werden gezeigt. Die Target-Zelldichten von 20 Millionen Zellen/ml bei einer Größe von 5 l wurde bei beiden Kulturen innerhalb von 10 Tagen erreicht.
8b zeigt zwei 12-l-Kulturen, die mit in 50-ml- und 100-ml-Beuteln kryokonservierten rekombinanten CHO-Zellen begonnen wurde, es wurde keine DMSO-Waschung vor der Inokulation durchgeführt. Die lebensfähige Zelldichte (VCD [•]) und das Viabilitätsprofil [] werden gezeigt. In beiden Kulturen wurden keine negativen Auswirkungen bemerkt.
SPEZIFISCHE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Materialien und Verfahren
Dieses Impfgut-Folgevermehrungsverfahren wurde anfänglich für eine rekombinante Baby-Hamsternieren-(BHK-)Zelllinie sowie eine Chinahamster-Ovarial-(CHO-)Zellinie entwickelt, die menschliche Proteine exprimierten. Die für diese Erfindung verwendeten Zellen wurden einem 12-l-Perfusions-Bioreaktor entnommen, der 20 × 10⁶ Zellen/ml enthält. Die Zellen wurden kultiviert und in Säugetierzellkulturmedium eingefroren, das auf einer im Handel erhältlichen DMEM/Ham-F12-Formulierung (1:1), hergestellt von JRH (Lenexa, KS) oder Life Technologies (Grand Island, NY), basiert und mit Eisen, Pluronic F68 (BASF, Pardipanny, NJ), rekombinantem menschlichem Insulin (Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN) ergänzt und im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist. Das Gefriermittel enthielt 7,5 % Dimethylsulfoxid (Sigma, St. Louis, MO) als Gefrierschutzmittel.
Die zur Lagerung verwendeten Kryokonservierungsbeutel (Cryocyte^TM 250 ml oder 500 ml, Nexell Therapeutics Inc. Irvine, CA) enthielten 50–100 ml Zellsuspension und wurden vor dem Transfer in ein Flüssig-N₂-Gefriergerät (Forma Scientific, OH) in einem –40-°C-Gefriergerät (Revco, Asheville, NC) eingefroren. Die Zellen wurden auf etwa 40 × 10⁶ Zellen/ml in 50 ml oder auf 20 × 10⁶ Zellen/ml in 100 ml konzentriert, um eine anfängliche Bioreaktor-Zelldichte von 1 Million Zellen/ml in 2 l Volumen sicherzustellen. Zelldichten von 0,5–1 × 10⁶ Zellen/ml werden normalerweise verwendet, um ein neues Impfgut-Folgevermehrungsverfahren zu beginnen.
Die BHK-Zellen im Kryokonservierungsbeutel wurden unter Verwendung eines 37-°C-Wasserbads aufgetaut. Die Zellsuspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen transferiert, mit frischem Medium (1:1) verdünnt und bei 1000 bis 1200 U/min leicht zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und in eine sterile Flasche transferiert, um den „Inokulationswell"-Bioreaktor zu inokulieren. Dieser Waschschritt wird verwendet, um das meiste des DMSO zu entfernen, und wird bei Säugetierzellkultur häufig angewendet. Später wurde dieser DMSO-Waschschritt eliminiert, und die Zellen wurden vom Beutel direkt in den Bioreaktor transferiert. (Elimination des DMSO-Waschschritts ermöglicht den Betrieb und Erhalt eines geschlossenen Systems, wodurch die Möglichkeit für eine Verunreinigung des Systems reduziert wird. Siehe Beispiel 2.)
Dieselbe Technologie wurde auch für rekombinante CHO-Zellen verwendet.
Es wurden zwei verschiedene Bioreaktoren verwendet. Beide von ihnen wiesen das gemeinsame Merkmal der Fähigkeit der Inokulation in einen „Inokulationswell" mit einem Volumen von 2 Litern auf.

1. 5-l-Kulturen wurden in 7-l-Applikon-Bioreaktoren durchgeführt (Schiedam, Niederlande), die zur Belüftung mit einer gesinterten Edelstahl-Fritte ausgestattet waren (Mott Metallurgical, Farmington, CT). Eine Zelltrennungsvorrichtung wurde verwendet, um Zellen innerhalb des Gefäßes zu halten und um einen Betrieb im kontinuierlichen Perfusionsmodus zu ermöglichen. Das Reaktorsystem ist in der Lage, zumindest 20 Millionen Zellen/ml in einem Volumen von 5 l zu unterstützen. pH, gelöster Sauerstoff, Temperatur und optische Dichte wurden durch Sonden gemessen, die in die Kultur eingetaucht waren, wenn ein Volumen von zumindest 2 l verwendet wurde. Der Reaktor wurde mit einem Edelstahl-Inokulationswell mit einem Volumen von 2 l entworfen.
2. 12-l-Kulturen wurden in einem maßgeschneiderten 15-l-Bioreaktor durchgeführt. Der Edelstahl-Inokulationswell des Reaktors war derselbe (2 l Volumen) wie beim 7-l-Gefäß. Es wurde jedoch ein konischer Flansch verwendet, um den Durchmesser und das Volumen des oberen Teils (3) zu vergrößern. Eine Belüftung wurde durch eine gesinterte Edelstahl-Fritte erreicht (Mott Metallurgical, Farmington, CT). Für die kontinuierliche Perfusionstechnologie wurde eine Zelltrennvorrichtung verwendet. Dieses Reaktorsystem ist in der Lage, zumindest 20 Millionen Zellen/ml in einem Arbeitsvolumen von 12 l zu unterstützen.

Beide Bioreaktorsysteme wurden unter Verwendung einer DCU von B. Braun (Digitalen Steuereinheit, B. Braun International, Melsungen, Deutschland) gesteuert, und zwar zu den anderswo beschriebenen Betriebsbedingungen.
Das Verhältnis zwischen der Größe und der Zelldichte des verwendeten Kryobehälters und des Inokulationswells (V_{IR min}) des Inokulationsreaktors kann durch die folgende Formel bestimmt werden:
wobei X_bag die Zelldichte im Kryobehälter und V_bag das Volumen ist. X_IR
start ist die gewünschte Start-Zelldichte im Inokulationswell des Inokulationsreaktors, normalerweise 1 × 10⁶ Zellen/ml.
Das Endvolumen des Inokulationsreaktors (V_{IR max}) hängt vom Volumen des Produktionsreaktors ab, der verwendet wird, und kann mittels folgender Formel bestimmt werden:
wobei X_PR die angestrebte anfängliche Zelldichte im Produktions-Bioreaktor ist (normalerweise 1 × 10⁶ Zellen/ml), V_PR das Volumen des Produktionsreaktors ist und X_IR die Endzelldichte im Inokulum-Bioreaktor ist. Der Inokulationswell des Bioreaktors ist normalerweise klein (bei den vorliegenden Beispielen wurde ein 2-l-Inokulationswell verwendet), und das Volumen kann durch Erhöhen des Durchmessers und der Höhe des Bioreaktors vergrößert werden. Da V_{IR max} nicht einschränkend ist, kann dasselbe „Inokulationswell"-Konzept auf das Design größerer Bioreaktoren angewandt werden (siehe 3).
Die in den 7-l- und 12-l-Systemen durchgeführten Kulturen wiesen ein anfängliches Volumen von 2 l auf. Dies ist das minimale Volumen, das notwendig ist, um den pH-Sensor, die Elektroden für gelösten Sauerstoff und den Temperatursensor einzutauchen. Unter Verwendung der Kopfraum-Belüftung wird direkt nach der Inokulation eine Belüftung durchgeführt. Das Volumen wird schrittweise erhöht, um die Zelldichte zwischen 0,8 und 1,2 × 10⁶ Zellen/ml zu halten. Eine Sauerstoffanreicherung mittels Gas-Besprengung wird verwendet, wenn das Volumen einmal vier Liter erreicht hat. Die zellspezifische Perfusionsrate wurde zu allen Zeiten bei 0,5–0,7 nl/Zelle/Tag gehalten.
Eine Oftline-Probenahme wurde täglich durchgeführt, um Zell- und Metaboliten-Konzentrationen zu bestimmen. Zellzählungen und die Viabilität wurden unter Verwendung eines Hämacytometers und dem Trypanblau-Exklusionsverfahren bestimmt. Es wurde ein YSI-Analysegerät (Yellow Springs Instruments) verwendet, um Glucose-, Lactat-, Glutamat- und Glutamin-Konzentrationen der Proben zu messen. LDH und Ammoniak wurden unter Verwendung eines Kodak-Biolysegeräts gemessen (Kodak Instruments, NY). Es wurde ein NOVA-Blut-Gas-Analysegerät (Nova Biomedical, Waltham, Mass.) verwendet, um die gelöste CO₂-Menge zu messen und um den pH und den Wert des gelösten Sauerstoffs zu überprüfen. Proben wurden durch das einstufige Koagulationsverfahren auf ihre rFVIII-Aktivität analysiert. Die Produktqualität wurde durch einen im eigenen Haus entwickelten Western-Blot-Test bestimmt.
BEISPIEL 1
4 zeigt eine 12-l-Perfusionskultur. Es wurden 50 ml der in einem EVA-Beutel kryokonservierten Zellsuspension für die Inokulation verwendet. Die Zellen wurden mit frischem Medium gewaschen, um das DMSO vor der Inokulation zu entfernen. Die Kultur lag bei einem anfänglichen Volumen von 2 l mit der Kopfraum-Belüftung. Die Lebensfähigkeit der Zellen überstieg 95 % während des gesamten Verfahrens, und das Volumen wurde, basierend auf der Zelldichte, schrittweise angehoben. Lag das Volumen einmal bei 4 l, so wurde Gas-Besprengung verwendet. Einen Tag nachdem das Volumen 12 l erreicht hatte wurde eine kontinuierliche Mediumperfusion begonnen. Die Perfusionsrate lag bei 0,5–0,7 nl/Zelle/Tag. Die Targetzelldichte von 20 × 10⁶ Zellen/ml wurde nach 11 Tagen erreicht. Das Impfgut-Folgevermehrungsexperiment zeigt die Eleganz dieser neuen Vermehrungstechnologie klar und deutlich. Es wurden keine Zwischen-Zellkulturflaschen verwendet, das Risiko einer möglichen Verunreinigung wurde dramatisch reduziert, die Medien und die Umgebung wurden extern kontrolliert, und als Resultat wurde die Zeit, um einen Produktions-Bioreaktor zu starten, um zumindest 70 % reduziert.
BEISPIEL 2
Die Notwendigkeit des DMSO-Entfernungsschritts (Waschen/Verdünnung) vor der Inokulation wurde evaluiert. Bei dieser Evaluierung wurden zwei Reaktoren parallel aus derselben 50-ml-Beutel-Gefriercharge gestartet.

• 12-l-Reaktor, in dem ein DMSO-Waschschritt durchgeführt wurde.
• 5-l-Reaktor, in dem ein DMSO-Waschschritt ausgelassen wurde.

Beide Kulturen wurden unter denselben Bedingungen laufen gelassen (Volumenzunahmeschritte, Kopfraum-Belüftung und Besprengungsraten etc.). Die 5-l-Kultur erreichte die Target-Zelldichte von 20 × 10⁶ Zellen/ml innerhalb von 11 Tagen, die 12-l-Kultur einen Tag später. 5 zeigt einen Vergleich dieser beiden Kulturen. Es wurde kein Unterschied beim Zellwachstum oder der Lebensfähigkeit bemerkt. Die Elimination des DMSO-Waschschritts führt zu einem weiteren Streamlining des Impfgut-Folgevermehrungsvertahrens (beginnend mit dem Auftauen der Zellen) und ermöglicht eine Schließung des Systems während des Verfahrens.
BEISPIEL 3
6 zeigt das Zeitprofil einer Kultur, die im 12-l-„Inokulationswell"-Reaktor durchgeführt wurde. 50 ml Zellsuspension, in einem Beutel kryokonserviert, wurden zur Ino kulation verwendet, ohne eine DMSO-Waschung. Die Target-Zelldichte von 20 × 10⁶ Zellen/ml wurde nach 16 Tagen erreicht.
BEISPIEL 4
7 zeigt das Zeitprofil einer CHO-Kultur, die im 5-l-Bioreaktor durchgeführt wurde. 50 ml der kryokonservierten Zellen in einem Beutel wurden zur Inokulation verwendet. Es wurde kein DMSO-Waschschritt durchgeführt. Die Targetzelldichte – hier 10 × 10⁶ Zellen/ml – wurde innerhalb von 6 Tagen erreicht.
BEISPIEL 5
Die 8a und 8b zeigen die Zeitprofile von zwei BHK- und zwei CHO-Kulturen, die in den Inokulations-Bioreaktoren durchgeführt wurden. 50- und 100-ml-Kryobeutel wurden zur Inokulation verwendet, es wurde in allen vier Kulturen kein DMSO-Waschschritt durchgeführt. Es wurde sowohl bei der Verwendung der 50-ml-Kryobeutel als auch der 100-ml-Kryobeutel keins negative Wirkung beobachtet.
ZUSAMMENFASSUNG
Im Allgemeinen sind die existierenden Impfgut-Folgevermehrungsverfahren für Säugetierzellkulturen arbeitsintensiv und anfällig für mikrobielle Verunreinigung aufgrund der Verwendung mehrerer Kulturgefäße, wie z.B. T-Flaschen, Rollflaschen und rotierende Flaschen. Unter Verwendung von 50-ml- oder 100-ml-EVA-Kryokonservierungsbeutel, die verwendet werden, um direkt in einen maßgeschneiderten „Inokulationswell" in einem Bioreaktor zu inokulieren, wurde ein neues Impfgut-Folgevermehrungsverfahren entwickelt. Dieser Reaktor dient als Inokulationsquelle für ein Produktionssystem in großem Maßstab. Diese Verfahrensweise eliminiert die Verwendung jeglicher T-Flaschen, Rollflaschen oder rotierenden Flaschen während der Maßstabsvergrößerung vollständig. Es wird ein Verfahren zur Dimensionierung und zum Design des „Inokulationswell"-Reaktors vorgeschlagen. Gemäß dieser Methode kann das Verfahren für die direkte Inokulation eines Produktionsreaktors in jedem beliebi gen Maßstab verwendet werden. In diesen Beispielen wurden kryokonservierte Zellen verwendet, die Kryokonservierung ist jedoch kein Erfordernis dieses Verfahrens. Säugetierzellen können bei Standardtemperaturen anstatt der kryokonservierten Zellen verwendet werden, und die Wirksamkeit und Nützlichkeit des Systems würde dieselbe bleiben. Auf ähnliche Art und Weise kann die Größe des Bioreaktors angepasst werden, so lange die Konzepte eines Inokulationswells und des Verwendungsverfahrens beibehalten werden.

Claims

Verfahren zur Säugetierzellenimpfgut-Folgevermehrung („seed-train expansion"), umfassend: a) das Bereitstellen eines Bioreaktors mit einem Inokulationswell, b) das Zuführen einer Suspension von Säugetierzellen zu einem Medium im Inokulationswell, c) das Kontrollieren der Umgebungsbedingungen und der Zusammensetzung des Mediums, sodass das Zellwachstum im Inokulationswell optimiert wird, d) das Züchten der Säugetierzellen, bis eine vorbestimmte Zelldichte im Well erreicht ist, und e) das schrittweise Erhöhen des Medienvolumens, während die optimalen Umgebungsbedingungen und Umgebungswachstumsbedingungen aufrechterhalten werden, bis der Bioreaktor mit einem vorbestimmten Volumen und einer vorbestimmten Zelldichte gefüllt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Säugetierzellen kryokonservierte Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Säugetierzellen aus der aus Chinahamster-Ovarialzellen und Babyhamster-Nierenzellen bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zellen aus einem Kryobeutel stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zellen aus einem Kryoröhrchen stammen.
Fermentationsbioreaktor, umfassend: a) einen Bioreaktor, wobei der Bioreaktor eine Kammer definiert, b) wobei die Kammer eine Außen- und eine Innenseite, ein Deckelement, ein Wandelement und ein Basiselement aufweist, wobei das Basiselement eine Öffnung aufweist, c) einen Inokulationswell, wobei der Well eine Kammer mit einer Außen- und einer Innenseite, einem Deck- und Basiselement und einem Wandelement definiert und d) wobei der Well weiters eine Öffnung im Deckelement aufweist, die mit der Bioreaktoröffnung verbunden ist, sodass ein Kanal zwischen der Wellkammer und der Bioreaktorkammer gebildet wird, der eine uneingeschränkte Bewegung dazwischen erlaubt, e) wobei die Wellkammer mit einem optischen Sensor ausgestattet ist.
Bioreaktor nach Anspruch 6, worin die Inokulationswellkammer mit Sensoren ausgestattet ist, die aus der aus pH-Sensor, Sauerstoffsensor, Temperatursensor bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Bioreaktor nach Anspruch 6, worin der Inokulationswell mit einer Kommunikationsöffnung durch die Wand des Wells ausgestattet ist, um die Einführung eines Mediums und von verschiedenen Agenzien in die Wellkammer zu ermöglichen.
Bioreaktor nach Anspruch 6, worin der Inokulationswell mit einem mechanischen Arm ausgestattet ist, um das Rühren des Inhalts des Wells zu ermöglichen.