TWI314953B - A device and method for seed-train expansion of mammalian cells - Google Patents

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1314953 — -Μ- η < 酋清案第 9013 1399 號 t Annin Tsln 0Π1^17ωλ __ 次口0句3日/ι、 修正後無劃線說明一¥ _附伴了^

五、势明况六I V 1 ) 1----Am-wKicd PgCTy-TrrrnyChinese SpecificatiAn V (民國98年6月1孓日送呈厂〜^ (Submitted on June 19, 2009) 相關申請案 本申請案主張於2000,12,20提出之09/746,972申請案 之優先權’其於 2001，12，14 依 37 C.F.R· §1.53(c)(2)轉為 臨時申請案，於此併入為參考文件。 5 發明背景 里爸L .本發明係關於生產規模之哺乳動物細胞培養技 術，及哺乳動物細胞種子列車擴張之特定之新方法。冷凍 保存之細胞係用於直接接種至一新設計之生物反應器中， 10 其係作為生產規模之種子來源。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ϋ: 一哺乳動物細胞培養系統表現產能推進之新式 細胞種子列車擴張之開始為一重要的程序步驟。操作不一 致及錯誤常危及其製程，造成明顯的延誤及接種系的變 異。典型生產方案的新式種子列車擴張開始於一 1_2毫升 15的冷凍瓶（主要運作之細胞銀行，MWCB)。此容器之細胞 濃度常在5-10百萬細胞/毫升之範圍。（冷存）細胞於融 化，洗除冷存保護劑後先於小型組織培養燒杯中培養（育 種）。哺乳動物細胞培養標準作法採用接種密度0.5至IX 106細胞/毫升。冷凍保存後以更低細胞濃度育種可能造成 20進入生長期之前，遲滯期之延長、細胞生長不良或甚炱細 胞死亡。此於已成為現行細胞培養製造操作模式的無血清 或甚至無蛋白培養基更形嚴重。 此細胞按其特定生長速率（細胞密度）行次培養，在常 每2-3天分開至多個細胞培養燒杯。一伺生產至充足之生 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（210x297公釐）

物質塊，細胞就擴充至車父大的培養瓶如滾式瓶、搖或旋式 燒杯。累積充足之細胞質塊後’接種一作為生產升級容器 的種子培養（器）的生物反應器1此所述之種子列車擴張 為多種哺乳動物細胞(培養)之-般作&，廣用於商業性生 5產及學術研究。採用T-燒杯及旋式繞杯之商業性種子列車 擴張法有Whitaker等人於J. of如細—⑽Chemicd

Society 1998, 28-43 頁之中概述。 典型升級方案需於最適狀況下約4至6週才可完成， 又為勞力密集，易受污染及變異。低產量級的條件並不明 10確：於T-燒杯，滚式瓶或搖式燒杯階段的pH及DO常無 界定點，此於（生產）程序中可造成更多變異，而危及接種 及產物之品質。 發明之概述 15 吾等已研發一新式哺乳動物細胞種子列車擴張之生物 反應器及方法。此技術可淘汰組織培養燒杯、滾式瓶或搖 式燒杯之使用。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 吾等之新式接種用生物反應器之設計可便利一改良式 哺乳動物細胞種子列車擴張之方法，以接通生物反應器内 20部而方便商業性種子列車擴張哺乳動物細胞生長之“接種 井”之存在為特點。 本冷凍保存細胞種子列車擴張方法含使用一供接種， 附一於移至生產用生物反應器前，擴充細胞之接種井之生 物反應器。本方法尤特定含添加經冷凍保存細胞，至接種 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1314953 A7 B7 Ψ μ：：· 五、發明說明（3) 用生物反應器之接種井中之培養液，由監視及調整培養液 及環境之狀況使接種井中之細胞可生長至一預定之濃度， 而增量式地提升反應器中培養液之體積，以維持最適的細 胞生長。一旦達到所求的細胞密度及體積’細胞就移入生 5 產用生物反應器。 一較佳具體實施例之接種用生物反應器含一位於反應 器腔底部之“接種井”。接種井設有醱酵感測器（pH，溶 解之〇2，溫度’光學密度等）以輔助確保最適培養狀況。 接種井設成含一由連續攪拌筒式反應器（CSTR)液體攪拌裝 10 置驅動之攪拌器最宜。 圖式之簡述 圖1說明種子列車擴張法之先前技藝 圖2顯示本發明之較佳方法 15 圖3顯示（含)接種井之接種用生物反應器之概念 圖4顯示於含5 l “接種井，，生物反應器中，〜以冷束 保存於50 i；升袋之BHK乡田胞開始實行的連續灌注^培 養。繪出活細胞密度(VCD[·])及活性曲線[]。培養 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 胞活性保持於高階。於5 L量級2千萬個細胞/毫升細胞 20 度的目標於12天内達成。 匕… 圖5說明BHK細胞於種子列車擴張法中，DMs〇洗 除步驟的影響。於實行DMS〇洗除步驟的12 L培養級（办 心符號（曲線)），（活性率）與細胞不經洗、直接接種的第二 個5 L培養級（實心符號（曲線))(的活性率）相近。如此^ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公髮） A7 1314953 五、發明說明（4) 出：未觀察到負面作用，細胞活性率及生長皆無差異。 圖6顯示以50毫升袋冷凍保存BHK細胞開始的連 續式12 L生物反應器培養（級），接種前不行DMSO洗 除。繪出活細胞密度(VCD[ ·])及活性曲線[]。於12 L量 5 級，2千萬個細胞/毫升細胞密度的目標於14天内達成。 圖7說明以50毫升袋冷凍保存的基因重組CHO細 胞開始的5 L培養級，接種前不行DMSO洗除。繪出活細 胞密度(VCD[ ·])及活性曲線[]。細胞密度目標於6天内 達成。

10 圖8a說明由50毫升及100毫升袋冷凍保存的rBHK 細胞開始的二5 L培養級，接種前不行DMSO洗除。繪出 活細胞密度(VCD[ ·])及活性率[]。於5L量級，細胞密度 2千萬細胞/毫升的目標於二培養皆於10天内達成。 圖8b說明二以於50毫升及100毫升袋冷凍保存之 15 重組CHO細胞開始之12 L培養級，接種前不行DMSO洗 除。繪出活細胞密度(VCD[ ·])及活性曲線[]，二培養級 皆無負效應。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 特定具體實例 20 材料及方法 種子列車擴充法最初研發供表現人類蛋白質之一重組 幼田鼠腎（BHK)細細胞及一中國田鼠卵巢(CHO)細細胞之 用。本發明所用之細胞取自含20xl06個細胞/毫升之12 L 灌注式生物反應器。細胞培養及冷凍用的哺乳動物細胞培 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1314953 A7 „ 11 ,

五、發明說明（5) 養基基於一 JRH (Lenexa, KS)或 Life Technologies (Grand Island, NY)所製造上市的 DMEM/Ham’s F12 配方（1 : 1)， 並加鐵、Pluronic F68 (BASF, Pardipanny，NJ)、重組人類 胰島素(Humulin，Eli Lilly, Indianapolis, IN)補充，而重點 為：不含其他蛋白質。冷凍培養基含7.5% DMSO(Sigma, St· Louis, MO)作為冷凍保護劑。 10 貯存用冷束保存袋(Cryocyte™ 250毫升或500毫升， Nexell Therapeutics Inc. Irvine, CA)含 50-100 毫升細胞懸 浮液，於一-40°C冷涞器（Revco, Asheville, NC)冷束，再移 入一液氮冷凉·器（Forma Scientific, OH)。細胞濃縮至約40χ 1〇6個細胞/毫升之50毫升或至20χ106細胞/毫升之1〇〇 毫升以確保初始生物反應器之2 L體積細胞密度達1百萬 細胞/毫升。細胞密度0.5-lxlO6細胞/毫升常用於開始新 的種子列車擴充程序。 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 冷凍保存袋的BHK細胞以37°C水浴融化。細胞懸浮 液移入一離心管’以新鮮培養基（1 ·· 1)稀釋並溫和地於 1000-1200 rpm離心。拋棄上清液，沈澱細胞以新鮮培養 基再懸浮並移入無_瓶以接種“接種井”生物反應器。洗 除步驟可除去大部分DMSO,為哺乳動物細胞培養的常 20例。此後消除洗除DMSO之步驟，細胞直接由袋移入生 物反應器。（消除洗除DMSO之步驟容許一封閉系統之操 作及維護，而降低系統污染的機會。見例2.) 重組CHO細胞亦用相同技術。 使用二種不同的生物反應器。但二者有可接種一 2 l 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1314953 A7 B7 <v 五、發明說明（6) 年~ 、-· ' " ' ! 體積“接種井”之共同特點。 1.於設有一燒結不銹鋼料濾、具（Mott Metallurgical,

Farmington，CT)供通氣之Applik〇n 7 L生物反應器 (Schiedam，The Netherlands)中進行 5 L 培養級。以一細胞 5 分離設備保留細胞於容器中，並以連續灌注模式操作。反 應器系統能支援5 L體積最少2千萬個細胞/毫升。使用最 少2 L體積時，pH，溶化的〇2 ’溫度及光學密度就可由 浸沒於培養基中之感測器測量。反應器設計附一 2 L體積 不銹鋼接種井。 10 2.於s丁做设什的15 L生物反應器進行12 L培養級。 反應器的不銹鋼接種井與7 L容器的（2 L體積）井相同。但 以一錐型凸緣擴大頂部的直徑及體積（圖3)。以—燒結不 銹鋼料濾具（Mott Metallurgical，Farmington, CT)提供通 氣。以一細胞分離裝置用於連續灌注技術。反應器系統能 15 支援12 L工作體積至少2千萬細胞/毫升。 二生物反應器系統於如別處所報告之操作狀況下，以 一 B. Braun DCU (Digital Control Unit, B. Braun International, Melsungen，Germany)控制。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 所用之冷凍容器及接種反應器接種井之大小及細胞密 20 度間之關係ViRmin可由下列公式決定：

Xbag · Vbag

Vir min—--

XlR start 25 其中Xbag為冷;東谷益中之細胞您度，而Xbag為盆中之體 積。XlR start為接種反應裔接種井中理想的開始細胞密度， 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1314953 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（7) 10 15 20 25 fe· 系為1 x 10 細胞/宅升。 接種反應器之終體積(vIR max)決定於所要用的生產反 應器的體積’而可由公式決定： VIR max —

XpR · V

PR

XlR 其中XpR為生產用生物反應器中的把標初始細胞密度（常為 lxio6細胞/毫升），VPR為生產用反應器的體積，XiR為接 種物生物反應器之終細胞後度。生物反應器的接種井常為 小型（本例用2 L接種井）而其體積可由生物反應器直徑及 高度的增加而增大。因VIR max非限制性，故同„ 接種 井觀念可應用於較大生物反應器之設計（參見圖3)。 於7及12 L系統實行的培養級初始體積為2 L。此為 /父/又生物反應器之pH，溶化〇2電極，及溫度感測器的必 要最小體積。於接種後以上層空間通氣(機)實行通氣。體 積逐步加大保持細胞密度於〇.8_l 2xl〇6個細胞/毫升。體 積一達到4 L就經氣體噴洒(機)供氧。細胞(種別）特定灌注 速率全程維持0.5-0.7nL/細胞/天。 採樣每天實行以測定細胞及代謝物濃度。細胞計數及 活性以血球計及離線採樣法測定。以一 YSI (Ydl〇w Spring Instruments)分析機測量樣品的葡萄糖、乳酸、麩酸 及麩酸胺浪度。LDH及氨以K〇dak Bi〇iyzer (K〇dak Instruments，NY)測量。以一 n〇Va血液氣體分析機測量 溶化C〇2之ϊ及檢查pH及溶化〇2之值。針對（測量） 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2i〇x297公复） .1314953 A7 五、發明說明⑴ 滅 rFVIII活性的樣品以單階段凝結法分析。產品品質以一内 部研發的西方印斑分析測定。 實例1 5 圖4為一 12 L灌注培養（系）。以於EVA袋冷凍保存 的細胞懸浮液50毫升接種。接種前細胞以新鮮培養基洗 除DMSO。培養初體積2 L附行上層空間通氣。細胞活性 全程超過95%，而體積視細胞密度逐步加大。體積為4 L 時用氣體喷洒。體積達12 L後1天開始連續式培養基灌 10 注。灌注速率維持0.5-0.7 nL/細胞/天。11天後達到靶標 細胞密度20xl06個細胞/毫升。種子列車擴充實驗明顯地 證實此新擴充技術之高超。不採用中間細胞培養燒瓶，可 能的感染危險大減，培養基及環境由外控制，而結果開始 一生產用生物反應器的時間至少降低70%。 15 實例2 評估接種前DMSO移除(洗除/稀釋）的必要。評估之 中，二反應器由相同的50毫升袋冷凍批平行開始。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 • 12 L反應器行DMSO洗除步驟。 20 . 5 L反應器省略DMSO洗除。

二培養器以同一狀況（體積加大步驟，上層空間通氣及喷 洒速率等）運行。5 L培養器於11天内達到靶標細胞密度 20xl06細胞/毫升，12 L培養器晚一天。圖5為此二培養 器之比較。未察覺細胞生長或活性之差異。消除DMSO -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1314953 A7 %--—^ 五、發明說明（9) ----------------------------」 洗除步驟使種子列車擴充程序更流暢（由細胞融化開始）而 使系統全程密閉。 實例3 5 圖6為於12 L “接種井”反應器實行之培養的時間曲 線。以於袋中冷凍保存之細胞懸浮液50毫升，不行 DMSO洗除而接種。靶標細胞密度20xl06細胞/毫升於16 天後達到。 10 實例4 圖7為於5 L生物反應器實行一 CHO培養的時間曲 線。以於袋中冷凍保存的細胞50毫升接種。不行DMSO 洗除步驟。此之靶標細胞密度ΙΟχΙΟ6細胞/毫升於6天内 達到。 15 實例5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖8a及8b為於接種用生物反應器中行二BHK及二 CHO培養系之時間曲線。50及100毫升冷凍袋用於接 種，4個培養系皆不行DMSO洗除。未察覺50毫升或 20 100毫升冷冻·袋有差異。 概述 已有之哺乳動物細胞培養法種子列車擴充法常因使用 多個培養容器如T-燒瓶，滾式瓶及旋式瓶而為勞力密集而 -11- 本紙張尺度適用t國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1314953 at 一 - _ _______..___ _B7 ——， 五、發明說明（ίο) 3恭务· ^微生物污染° -新式種子列車擴充法之研發使用5〇 *升及100毫升EVA冷;東保存袋直接接種訂製的生物反 應器中之“接種井，，。反應器充作一生產量級系統的接種 源。此法完W除升級擴充之中任何了_燒瓶，滚式瓶或旋 5式瓶的使用。建議(採行）“接種井”反應器訂尺寸及設計 之程序。根據此程序，其方法可應用於任何級化生產用反 應器之直接接種。此些實例使用冷束保存細胞，但冷冰保 存並非此技術之必要。標準溫度的哺乳動物細胞可取代冷 凍保存細胞，而系統的效率及應用維持不變。相同地，只 10要接種井及使用法的觀念維持不變，生物反應器的大小亦 可調整。 以上提示之實例在提供本發明一機構設計之說明。因 此，主張本發明之領域只受限於下述之申請專利 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

Claims (1)

1. Αδ Β8 C8 w ! ---- \ 1--Am.曰修(更' ί請案第9013丨399號 ^ J latent Appln. No.90131399 請專利範圍中文本—附件（三） inly Claims in rhin^cg - Enci.mr^ 年6月19日送呈） (Submitted on June 19, 2009) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 1· 一種哺乳動物細胞種子列車擴充之方法，含： a) 提供一有一接種井之生物反應器， b) 輸送一哺乳動物細胞懸浮液至接種井内之培養 基， c) 控制培養基之環境狀況及組成物使接種井内細胞 生長最適化， d) 育成哺乳動物細胞直至井中達到一預定之細胞密 度，及 e) 增量式地加大培養基體積，並維持最適環境狀況 及環境生長狀況，直至生物反應器充滿預定之體 積及細胞密度。 2. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中哺乳動物細 胞為冷凍保存細胞。 3. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中哺乳動物細 胞選自含中國田鼠卵巢細胞及幼田鼠腎細胞之組。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中細胞得自冷 凍袋。 ? 5，根據申請專利範圍第1項之方法，其中細胞得自冷 冻瓶。 6. —種改良之醱酵生物反應器，其包含： a) —生物反應器’該生物反應器界定一腔室， b) 該腔室有外及内面，一頂部，壁部及底部，底部 有一開口， c) 一接種井，該井界定一有外及内面、頂及底部、 -13 - J:\menu\Pending-90\9Mjn

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   —壁部之腔窒，及 d)該井進-步包含-於頂部連接至生物反應器開口 之開口，以形成一井腔室及生物反應器腔室間之 通道，其間容許不受限之移動。 7·如申請專利範圍第6項之改良之醱酵生物反應器， 其中接種井腔配備有選自下列之感測器：pH感測 器、〇2感測器、溫度感測器及光學感測器。 8. 如申請專利範圍第6項之改良之醱酵生物反應器， 其中接種井配備有一經該井之壁之通聯開口，以容 許將培養基及（培養）劑引入井腔室内。 9. 如申請專利範圍第6項之改良之醱酵生物反應器， 其中接種井配備有一機械臂以容許攪拌井之内容 物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14 - J:\menu\Pending-90\906S8-^ .doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公楚） 1314953

   專利申請案第90131399號 ROC Patent Appin. No. 90131399 修正之圖式中文本-附件(七） Amended Drawings in Chinese - EnclYVID (民國98年6月19日送呈） (Submitted on June 19,2009) CO to 寸 o 08 09 f%J#al-)i5 ocvl 0

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