JP2005502306A - 哺乳動物細胞の種連続増殖(seed−trainexpansion)のための装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願
本願は、引用することにより本明細書に組み込まれる2001年12月14日に37 C.F.R.§1.53(c)(2)のもとに仮出願に転換された2000年12月20日に出願された出願09/746,972の優先権を請求する。
【0002】
発明の背景
分野:本発明は、製造規模の哺乳動物細胞培養技術に、そして特に哺乳動物細胞の新規な種連続増殖法に関する。生産規模の種源となる新規に考案したバイオリアクターに直接接種するために凍結保存細胞を使用する。
【0003】
背景:哺乳動物細胞培養系の発現用の生産作戦(production campaign)のための新しい細胞種連続増殖の開始は、重要なプロセス工程である。操作上の不一致及び誤りは、しばしば、このプロセスを危うくし、著しい遅れ及び接種材料の変動につながる。典型的な生産プロトコルにおいて、新しい種連続増殖は1−2mLの凍結バイアル(マスター・ワーキング・セル・バンク、MWCB)から始まる。この容器の細胞濃度は、通常、500万−1000万細胞/mLの範囲である。細胞を融解し、凍結防止剤を除くために洗浄し、そして次にまず小型組織培養フラスコにおいて培養する(接種する)。0.5〜1 x 106細胞/mLの接種密度を用いることは哺乳動物細胞培養での標準的技法である。凍結保存後にさらに低い細胞濃度で細胞を接種することは、増殖期に入る前の延長された誘導期、乏しい細胞性能もしくは細胞死さえもたらし得る。これは、現在の細胞培養製造のやり方になっている無血清もしくはさらに無タンパク質細胞培養培地において特に際立っている。
【0004】
細胞は、それらの特定の増殖速度(細胞密度)に従って継代培養され、そして通常2−3日ごとに複数の細胞培養フラスコに分けられる。いったん十分なバイオマスが生産されると、細胞はローラーボトル、振盪もしくはスピナーフラスコのようなさらに大型の培養ボトルに拡張される。十分な細胞量が蓄積された後に、生産規模容器の種培養になるバイオリアクターに接種する。この記述する種連続増殖は、いくつかの哺乳動物細胞系の一般的技法であり、そして商業生産及び学求的世界において幅広く用いられる。Tフラスコ及びスピナーフラスコを用いる商業用種連続増殖の概要はまた、Whitaker et al.,Journal of the American Chemical Society,28−43頁、1998によっても示される。
【0005】
最適条件下で完了するのに約4〜6週かかる典型的なスケールアッププロトコルは大きな労働力を要し、そして汚染及び変動を受けやすい。小規模条件は明確に特定されず、通常、Tフラスコ、ローラーボトルもしくは振盪機フラスコ期間中のpH及びDOの設定値はなく、これはプロセスの全体にわたってさらに多くの変動をもたらす可能性があり、そして接種材料及び生成物の品質を危うくするかもしれない。
【0006】
発明の要約
我々は、哺乳動物細胞の種連続増殖のための新規なバイオリアクター及び方法を開発した。この技術は、組織培養フラスコ、ローラーボトルもしくは振盪フラスコの使用を省く。
【0007】
我々の新規な接種バイオリアクターは、哺乳動物細胞種連続増殖の改善された方法を容易にするために設計され、そしてバイオリアクターの内部に通じそして商業用種連続増殖のための哺乳動物細胞の増殖を容易にする「接種ウェル」の存在によって区別される。
【0008】
凍結保存細胞の種連続増殖のための我々の方法は、生産バイオリアクターに移す前に細胞を増やすための接種ウェルを有する専用の接種バイオリアクターの使用を含んでなる。さらに特に、我々の方法は、接種バイオリアクターの接種ウェル内の培地に凍結保存細胞を加えること、培地及び環境の条件をモニターしそして調整することによって細胞が接種ウェル内で既定の濃度まで増殖するのを可能にすること、並びにその後、最適な細胞増殖が維持されるようにリアクター内の培地の容量を増加的に増やすことを含んでなる。いったん所望の細胞密度及び容量が得られると、細胞を生産バイオリアクターに移す。
【0009】
好ましい態様として、接種バイオリアクターは、リアクター室の底面に位置する「接種ウェル」を含む。この接種ウェルには、最適な培養条件を保証する助けとなるように発酵センサー(pH、溶存酸素、温度、光学密度など)をつける。最も好ましくは、連続攪拌式タンクリアクター(CSTR)液体攪拌装置によって羽根車駆動装置を含むようにこの接種ウェルを改造する。
【0010】
特定の態様
材料及び方法
この種連続増殖法は、ヒトタンパク質を発現する組換えベビーハムスター腎臓(BHK)細胞系及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系のために最初に開発された。本発明に使用する細胞は、20 x 106細胞/mLを含有する12L灌流バイオリアクターから取った。細胞を培養し、そしてJRH(Lenexa,KS)もしくはLife Technologies(Grand Island,NY)によって製造される市販のDMEM/ハムF12配合物(1:1)に基づきそして鉄、プルロニックF68(BASF,Pardipanny,NJ)、組換えヒトインシュリン(Humulin,Eli Lilly,Indianpolis,IN)を補足しそして他のタンパク質を本質的に含まない哺乳動物細胞培養培地において凍結させた。凍結培地は、凍結防止剤として7.5%のジメチルスルホキシド(Sigma,St.Louis,MO)を含有した。
【0011】
保存に使用する凍結保存バッグ(CryocyteTM 250mLもしくは500mL,Nexell Therapeutics Inc.Irvine,CA)は、50−100mLの細胞懸濁液を含有し、そして液体N2フリーザー(Forma Scientific,OH)に移す前に−40℃のフリーザー(Revco,Asheville,NC)において凍結させた。2L容量における100万細胞/mLの初期バイオリアクター細胞密度を保証するために細胞を50mLでは約40 x 106細胞/mLに、もしくは100mLでは20 x 106細胞/mLに濃縮した。0.5−1 106細胞/mLの細胞密度は、新しい種連続増殖プロセスを開始するために一般に用いられる。
【0012】
凍結保存バッグ中のBHK細胞は、37℃の水浴を用いて融解した。細胞懸濁液を遠心管に移し、新しい培地で希釈し(1:1)、そして1000−1200rpmで穏やかに遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを新しい培地に再懸濁し、そして「接種ウェル」バイオリアクターに接種するために滅菌ボトルに移した。この洗浄工程は、DMSOの大部分を取り除くために用い、そして哺乳動物細胞培養における一般的技法である。後に、このDMSO洗浄工程を省き、そして細胞をバッグからバイオリアクターに直接移した。(DMSO洗浄工程の削除は、閉鎖系の操作及び維持を可能にし、それにより系の汚染の機会を減らす。実施例2を参照。)
同じ技術を組換えCHO細胞にも使用した。
【0013】
2つの異なるバイオリアクターを用いた。しかしながら、これらは両方とも、2L容量の「接種ウェル」に接種することができるという共通の特徴を有した。
【0014】
1.5L培養は、通気のための焼結ステンレス鋼フリット(MottMetallurgical,Farmington,CT)を備えたApplikon 7Lバイオリアクター(Schiedam,The Netherlands)において実施した。容器内で細胞を保持するためそして連続灌流形態での操作を可能にするために細胞分離装置を用いた。リアクター系は、5Lの容量において少なくとも2000万細胞/mLを維持することができる。pH、溶存酸素、温度及び光学密度は、少なくとも2Lの容量を用いる場合に培養物中に浸した探針によって測定した。リアクターは、2L容量のステンレス鋼接種ウェルで設計される。
【0015】
2.12L培養は、特注設計の15Lバイオリアクターにおいて実施した。リアクターのステンレス鋼接種ウェルは、7L容器におけるものと同じ(2L容量)であった。しかしながら、上部の直径及び容量を広げるために円錐フランジを用いた(図3)。通気は、焼結ステンレス鋼フリット(Mott Metallurgical,Farmington,CT)を通して供給した。細胞分離装置を連続灌流技術に用いた。このリアクター系は、12Lの作業容量において少なくとも2000万細胞/mLを維持することができる。
【0016】
両方のバイオリアクター系は、他で報告されるような操作条件下でB.Braun DCU(デジタル制御ユニット(Digital Control Unit),B.Braun International,Melsungen,Germany)を用いて制御した。
【0017】
使用する凍結容器のサイズ及び細胞密度と接種リアクターの接種ウェル(VIRmin)間の関係は、以下の式:
によって決定することができ、ここで、Xbagは凍結容器における細胞密度であり、そしてVbagは容量である。XIRstartは、接種リアクターの接種ウェルにおける所望の開始細胞密度、通常は1 x 106細胞/mLである。
【0018】
接種リアクターの最終容量(VIRmax)は、使用する生産リアクターの容量により決まり、そして式:
によって決定することができ、ここで、XPRは生産バイオリアクターにおける目標とする初期細胞密度(通常は1 106細胞/mL)であり、VPRは生産リアクターの容量であり、そしてXIRは接種リアクターにおける最終細胞密度である。バイオリアクターの接種ウェルは通常小さく(本発明の実施例では2Lの接種ウェルを使用した)、そして容量は、バイオリアクターの直径及び高さを増すことによって増やすことができる。VIRmaxは限定されないので、同じ「接種ウェル」概念をさらに大きいバイオリアクターの設計に適用することができる(図3を参照)。
【0019】
7及び12Lの系において実施する培養は、2Lの初期容量を有した。これは、バイオリアクターのpH、溶存酸素電極、並びに温度センサーを浸すために必要な最小容量である。通気は、接種直後にヘッドスペース通気を用いて実施する。容量は、0.8〜1.2 x 106細胞/mLの細胞密度を維持するように段階的に増やす。いったん容量が4リットルに達するとガススパージング(gas sparging)による酸素化を用いる。細胞特異的灌流速度は、常に0.5−0.7nL/細胞/日で維持した。
【0020】
細胞及び代謝産物濃度を決定するためにオフラインサンプリングを毎日実施した。細胞計数及び生存度は、血球計及びトリパンブルー排除法を用いて決定した。サンプルのグルコース、乳酸塩、グルタミン酸塩及びグルタミン濃度を測定するためにYSI分析器(Yellow Springs Instruments)を使用した。LDH及びアンモニアは、Kodak Biolyzer(Kodak Instruments,NY)を用いて測定した。溶存CO2レベルを測定するためそしてpH及び溶存酸素値を調べるためにNOVA血液ガス分析器(Nova Biomedical,Waltham,Mass.)を使用した。サンプルは、1段階凝固法(one stage coagulation method)によりrFVIII活性に関して分析した。生成物の品質は、社内で開発したウェスタンブロットアッセイによって決定した。
【0021】
実施例1
図4は、12L灌流培養を示す。EVAバッグにおいて凍結保存した50mLの細胞懸濁液を接種に用いた。細胞は、接種前にDMSOを取り除くために新しい培地で洗浄した。培養は、ヘッドスペース通気で2Lの初期容量であった。細胞生存度は、プロセスの全体にわたって95%を上回り、そして細胞密度に基づいて容量を段階的に増やした。いったん容量が4Lになるとガススパージングを用いた。容量が12Lに達した1日後に連続培地灌流を開始した。灌流速度は、0.5−0.7nL/細胞/日で維持した。20 106細胞/mLの目標細胞密度に11日後に達した。種連続増殖実験は、この新規な増殖技術の正確さを明確に実証する。中間の細胞培養フラスコを使用せず、起こりうる汚染の危険を劇的に減らし、培地及び環境を外部から制御し、そして結果として生産バイオリアクターを開始する時間を少なくとも70%減らした。
【0022】
実施例2
接種前のDMSO除去工程(洗浄/希釈)の必要性を評価した。この評価では、2つのリアクターを同じ50mLバッグ凍結ロットから同時に開始した。
【0023】
・DMSO洗浄工程を実施した12Lリアクター。
【0024】
・DMSO洗浄を省略した5Lリアクター。
【0025】
両方の培養を同じ条件下(容量増加段階、ヘッドスペース通気及びスパージング速度など)で行った。20 106細胞/mLの目標細胞密度に5L培養は11日以内に、12L培養はそれから一日後に達した。図5は、これら2つの培養の比較を示す。細胞増殖もしくは生存度におけるいかなる違いも認められなかった。DMSO洗浄工程の削除は、種連続増殖プロセス(細胞融解から先)をさらに簡素化し、そして完全に系密閉を可能にする。
【0026】
実施例3
図6は、12L「接種ウェル」リアクターにおいて実施する培養の時間プロフィールを示す。バッグにおいて凍結保存した50mLの細胞懸濁液をDMSO洗浄なしに接種に用いた。20 x 106細胞/mLの目標細胞密度に16日後に達した。
【0027】
実施例4
図7は、5Lバイオリアクターにおいて実施するCHO培養の時間プロフィールを示す。バッグ中の50mLの凍結保存細胞を接種に使用した。DMSO洗浄工程を行わなかった。目標細胞密度、ここでは10 x 106細胞/mLに6日以内に達した。
【0028】
実施例5
図8a及び8bは、接種バイオリアクターにおいて実施する2つのBHK及び2つのCHO培養の時間プロフィールを示す。50及び100mLの凍結バッグを接種に使用し、4つ全ての培養においてDMSO洗浄工程を行わなかった。50mLもしくは100mLの凍結バッグのいずれを用いても負の効果は認められなかった。
【0029】
要約
一般に、哺乳動物細胞培養の現在の種連続増殖法は、大きな労働力を要し、そしてTフラスコ、ローラーボトル及びスピナーフラスコのような複数の培養容器の使用のために微生物汚染を受けやすい。新規な種連続増殖法は、バイオリアクターにおける特注の「接種ウェル」に直接接種するために用いる50mLもしくは100mL EVA凍結保存バッグを利用して開発された。このリアクターは、生産規模系の接種源となる。この方法論は、スケールアップ中のあらゆるTフラスコ、ローラーボトルもしくはスピナーフラスコの使用を完全に除く。「接種ウェル」リアクターのサイジング及び設計の手順を提示する。この手順に従って、該方法を任意の規模の生産リアクターの直接接種に適用することができる。これらの実施例では凍結保存細胞を使用したが、凍結保存はこの技術の必要条件ではない。標準温度の哺乳動物細胞を凍結保存細胞の代わりに用いることができ、そして系の有効性及び実用性は同じままである。同様に、接種ウェルの概念及び使用の方法が維持される限り、バイオリアクターのサイズを調整することができる。
【0030】
上記に提示する実施例は、本発明の一つの構成設計を例示するために提供する。従って、本発明の範囲は、以下の請求項によってのみ限定されるべきであるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図1】
種連続増殖法の先行技術を例示する。
【図2】
本発明の好ましい方法を示す。
【図3】
接種ウェル接種バイオリアクターの概念を示す。
【図4】
50mLのバッグにおいて凍結保存したBHK細胞から開始する、5Lの「接種ウェル」を含有するバイオリアクターにおいて実施する連続灌流培養を示す。生存細胞密度(VCD[●])及び生存度プロフィール[]を示す。細胞生存度は、培養の全体にわたって高いままであった。5L規模で2000万細胞/mLの目標細胞密度に12日以内に達した。
【図5】
BHK細胞の種連続増殖中のDMSO洗浄工程の影響を例示する。12L培養(開いた記号)ではDMSO洗浄工程を実施し、一方、もう一つの5L培養(詰まった記号)には細胞を洗浄せずに直接接種した。示すように、いかなる負の効果も認められず、細胞生存度並びに細胞増殖はいかなる違いも示さなかった。
【図6】
50mLのバッグにおいて凍結保存したBHK細胞から開始する、連続12Lバイオリアクター培養を示し、接種前にDMSO洗浄を行わなかった。生存細胞密度(VCD[●])及び生存度プロフィール[]を示す。12L規模で2000万細胞/mLの目標細胞密度に14日以内に達した。
【図7】
50mLのバッグにおいて凍結保存したCHO細胞から開始する、組換えCHO細胞の5L培養を例示し、接種前にDMSO洗浄を行わなかった。生存細胞密度(VCD[●])及び生存度プロフィール[]を示す。目標細胞密度に6日以内に達した。
【図8a】
50mLのバッグにおいて凍結保存したrBHK細胞、100mLのバッグにおけるもう一つの培養物から開始する2つの5L培養を例示し、接種前にDMSO洗浄を行わなかった。生存細胞密度(VCD[●])及び生存度プロフィール[]を示す。両方の培養において5L規模で2000万細胞/mLの目標細胞密度に10日以内に達した。
【図8b】
50mL及び100mLのバッグにおいて凍結保存した組換えCHO細胞から開始する2つの12L培養を例示し、接種前にDMSO洗浄を行わなかった。生存細胞密度(VCD[●])及び生存度プロフィール[]を示す。両方の培養においていかなる負の効果も認められなかった。
Claims (9)
- a)接種ウェルを有するバイオリアクターを準備すること、
b)接種ウェル内の培地に哺乳動物細胞の懸濁液を送達すること、
c)接種ウェル内の細胞増殖を最適化するように該培地の環境条件及び組成を制御すること、
d)該ウェル内で既定の細胞密度に達するまで哺乳動物細胞を増殖させること、並びに
e)バイオリアクターが既定の容量及び細胞密度に満たされるまで最適な環境条件及び環境増殖条件を保ちながら培地容量を増加的に増やすこと、
を含んでなる哺乳動物細胞種連続増殖の方法。 - 哺乳動物細胞が凍結保存細胞である請求項1の方法。
- 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞及びベビーハムスター腎臓細胞よりなる群から選択される請求項1の方法。
- 細胞が凍結バッグ(cryobag)から得られる請求項1の方法。
- 細胞が凍結バイアル(cryovial)から得られる請求項1の方法。
- a)バイオリアクター、該バイオリアクターは室を特定する、
b)外部及び内部側面、上面部材、壁部材、並びに底面部材を有する該室、該底面部材は開口部を有する、
c)接種ウェル、該ウェルは、外部及び内部側面、上面及び底面部材、壁部材を有する室を特定する、並びに
d)該バイオリアクター開口部に連結する該上面部材における開口部をさらに含む該ウェル、その結果、ウェル室及びバイオリアクター室間にそこで両者間に制限のない動きを可能にするように流路が形成される、
を含んでなる改善された発酵バイオリアクター。 - 接種ウェル室にpHセンサー、酸素センサー、温度センサー及び光学センサーよりなる群から選択されるセンサーをつける請求項6において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
- ウェル室への培地及び作用因子の導入を可能にするために接種ウェルに該ウェルの壁を通した連絡開口部をつける請求項6において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
- 接種ウェルの中身の攪拌を可能にするために該ウェルに機械アームをつける請求項6において説明するとおりの改善されたバイオリアクター。
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