ES2276853T3 - Dispositivo y procedimiento para expansion en serie de semillas de celulas de mamifero. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de expansión en serie de semillas de células de mamífero que comprende: a) proporcionar un biorreactor que tiene un pocillo de inoculación, b) suministrar una suspensión de células de mamífero a medios dentro del pocillo de inoculación, c) controlar las condiciones ambientales y la composición de dichos medios de modo que se optimice el crecimiento celular dentro del pocillo de inoculación, d) cultivar las células de mamífero hasta que se alcanza una densidad celular predeterminada dentro de dicho pocillo, y e) aumentar gradualmente el volumen de los medios mientras se mantienen condiciones ambientales y condiciones de cultivo ambientales óptimas hasta que el biorreactor se llena a un volumen y densidad celular predeterminados.
Description
Dispositivo y procedimiento para expansión en
serie de semillas de células de mamífero.
Ésta invención se refiere a la fabricación de
tecnología de cultivo de células de mamífero a escala y
específicamente a un nuevo procedimiento de expansión en serie de
semillas para células de mamífero. Se usan células crioconservadas
para inocular directamente en un biorreactor de diseño reciente, que
sirve como fuente de semillas para la producción a escala.
El comienzo de una nueva expansión en serie de
semillas para una campaña de producción para la expresión de un
sistema de cultivo de células de mamífero es una etapa crítica del
procedimiento. Las contradicciones y errores de funcionamiento a
menudo ponen en peligro el procedimiento, conduciendo a retrasos
significativos y a variabilidad del inóculo. En los protocolos de
producción típicos, una nueva expansión en serie de semillas
comienza a partir de un criovial de 1-2 ml (master
working cell bank, MWCB). La concentración de células de este
recipiente normalmente está en el intervalo de 5 - 10 millones de
células/ml. Las células se descongelan, se lavan para retirar el
crioprotector y se cultivan (siembran) en pequeños matraces de
cultivo celular. Es una práctica convencional con cultivos
celulares de mamífero usar densidades de inoculación de 0,5 a 1 x
10^{6} células/ml. La siembra de células a concentraciones de
células inferiores después de la crioconservación puede dar como
resultado una fase de retraso prolongada antes de entrar en la fase
de cultivo, mal desarrollo celular o incluso muerte celular. Esto
se acentúa especialmente en los medios de cultivo sin suero o
incluso sin proteínas que se ha convertido en el modus
operandi para la preparación actual de cultivo celular.
Las células se sub-cultivan de
acuerdo con su tasa específica de crecimiento (densidad celular), y
normalmente se dividen en múltiples matraces de cultivo celular
cada 2 - 3 días. Una vez que se produce suficiente biomasa, las
células se expanden en frascos de cultivo mayores tales como frascos
rotativos, matraces de agitación o rotativos. Después de que se ha
acumulado suficiente masa celular, se inocula en un biorreactor, que
se convierte en el cultivo de semillas para el recipiente de
producción a escala. Esta expansión en serie de semillas descrita
es una práctica general para varias líneas celulares de mamífero y
se usa ampliamente en la producción comercial y en el mundo
académico. Una revisión de una expansión en serie de semillas
comercial usando matraces T y matraces rotativos se da también por
Whitaker y col., Journal of the American Chemical Society,
páginas 28-43, 1998.
Los protocolos típicos de aumento a escala que
necesitan aproximadamente de cuatro a seis semanas para completarse
en condiciones óptimas, son de trabajo intensivo y susceptibles a
contaminación y variabilidad. Las condiciones de pequeña escala no
están bien definidas - normalmente no existe punto fijado para pH y
DO durante el periodo de matraz T, frasco rotativo o matraz de
agitación, lo que puede conducir a más variabilidad durante todo el
procedimiento y puede poner en peligro la calidad del inóculo y del
producto.
Se ha desarrollado un nuevo biorreactor y un
procedimiento para la expansión en serie de semillas de células de
mamífero. Esta tecnología elimina el uso de matraces de cultivo
celular, frascos rotativos o matraces de agitación.
El nuevo biorreactor de inoculación está
diseñado para facilitar un procedimiento mejorado de expansión en
serie de semillas de células de mamífero, y se distingue por la
presencia de un "pocillo de inoculación" que comunica con el
interior del biorreactor y que facilita el crecimiento de células de
mamífero para expansión en serie comercial de semillas.
El procedimiento para expansión en serie de
semillas de células crioconservadas comprende el uso de un
biorreactor dedicado a la inoculación que tiene un pocillo de
inoculación para expandir las células antes de su transferencia a
un biorreactor de producción. Más específicamente, el procedimiento
comprende añadir las células crioconservadas a medios dentro del
pocillo de inoculación del biorreactor de inoculación, permitiendo a
las células crecer hasta una concentración predeterminada dentro
del pocillo de inoculación controlando y ajustando las condiciones
de los medios y el entorno, y, en lo sucesivo, aumentando
gradualmente el volumen de los medios dentro del reactor de modo
que se mantenga el crecimiento celular óptimo. Una vez que se han
alcanzado la densidad y volumen celulares deseados, las células se
transfieren a un biorreactor de producción.
En una realización preferida, el biorreactor de
inoculación incluye un "pocillo de inoculación" situado en la
base de la cámara del reactor. Este pocillo de inoculación está
provisto de sensores de fermentación (pH, oxígeno disuelto,
temperatura, densidad óptica, etc.) para ayudar a asegurar las
condiciones óptimas de cultivo. Más preferiblemente, este pocillo
de inoculación se adapta para incluir un rotor impulsor mediante un
dispositivo de agitación de líquidos en un tanque reactor
continuamente agitado (CSTR).
La Figura 1 muestra la técnica anterior del
procedimiento de expansión en serie de semillas.
La Figura 2 muestra el procedimiento preferido
de esta invención.
La Figura 3 muestra el concepto del biorreactor
de inoculación con pocillo de inoculación.
La Figura 4 muestra un cultivo de perfusión
continua realizado en el biorreactor de 5 l que contiene "pocillo
de inoculación", comenzado con células BHK crioconservadas en la
bolsa de 50 ml. Se muestran la densidad celular viable (VCD
[\bullet]) y el perfil de viabilidad [ ]. La viabilidad celular
permaneció alta durante todo el cultivo. La densidad celular diana
de 20 millones de células/ml a escala de 5 l, se alcanzó en 12
días.
La Figura 5 ilustra la influencia de una etapa
de lavado de DMSO durante la expansión en serie de semillas de
células BHK. En el cultivo de 12 l (símbolos huecos) se realizó una
etapa de lavado de DMSO donde el segundo cultivo de 5 l (símbolos
rellenos) se inoculó directamente sin lavar las células. Como se
indica, no se observó ningún efecto negativo, la viabilidad celular
así como el crecimiento celular no mostraron ninguna diferencia.
La Figura 6 muestra un cultivo continuo en
biorreactor de 12 l, que comienza con células BHK crioconservadas
en la bolsa de 50 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la
inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD
[\bullet]) y el perfil de viabilidad [ ]. La densidad celular
diana de 20 millones de células/ml a escala de 12 l, se alcanzó en
14 días.
La Figura 7 ilustra un cultivo de 5 l de células
CHO recombinantes, que comienza con células CHO crioconservadas en
una bolsa de 50 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la
inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD
[\bullet]) y el perfil de viabilidad [ ]. La densidad celular
diana se alcanzó en 6 días.
La Figura 8a ilustra dos cultivos de 5 l que
comienzan con células rBHK crioconservadas en una bolsa de 50 ml,
un segundo cultivo en una bolsa de 100 ml, no se realizó lavado de
DMSO antes de la inoculación. Se muestran la densidad celular
viable (VCD [\bullet]) y el perfil de viabilidad [ ]. Las
densidades celulares diana de 20 millones de células/ml a escala de
5 l se alcanzó en 10 días en los dos cultivos.
La Figura 8b ilustra dos cultivos de 12 l que
comienzan con células CHO recombinantes crioconservadas en bolsas
de 50 ml y 100 ml, no se realizó lavado de DMSO antes de la
inoculación. Se muestran la densidad celular viable (VCD
[\bullet]) y el perfil de viabilidad [ ]. No se apreciaron efectos
negativos en los dos cultivos.
Este procedimiento de expansión en serie de
semillas se desarrolló inicialmente a partir de una línea celular
recombinante de riñón de cría de hámster (BHK) y una línea celular
de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban proteínas humanas.
Las células usadas para esta invención se tomaron de un biorreactor
de perfusión de 12 l que contenía 20 x 10^{6} células/ml. Las
células se cultivaron y congelaron en medio de cultivo de células
de mamífero basado en una formulación disponible en el mercado de
DMEM/Ham F12 (1:1) fabricada por JRH (Lenexa, KS) o Life
Technologies (Grand Island, NY), y se suplementaron con hierro,
Pluronic F68 (BASF, Pardipanny, NJ), insulina humana recombinante
(Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN), y esencialmente libre de
otras proteínas. El medio de congelación contenía dimetilsulfóxido
al 7,5% (Sigma St. Louis, MO) como crioprotector.
Las bolsas de crioconservación (Cryocite^{TM}
250 ml o 500 ml, Nexell Therapeutics Inc. Irvine, CA) usadas para
almacenamiento contenían 50 - 100 ml de suspensión celular y se
congelaron en un congelador a -40ºC (Revco, Asheville, NC) antes de
transferirlas a un congelador de N_{2} líquido (Forma Scientific,
OH). Las células se concentraron a aproximadamente 40 x 10^{6}
células/ml en 50 ml, o a 20 x 10^{6} células/ml en 100 ml para
asegurar una densidad celular inicial en el biorreactor de 1 millón
de células/ml en 2 l de volumen. Comúnmente se usan densidades
celulares de 0,5 - 1 x 10^{6} células/ml para iniciar un nuevo
procedimiento de expansión en serie de semillas.
Las células BHK en la bolsa de crioconservación
se descongelaron usando un baño de agua a 37ºC. La suspensión
celular se transfirió a un tubo de centrífuga, se diluyó con medio
recién preparado (1:1) y se centrifugó suavemente a 1000 - 1200
rpm. El sobrenadante se descarto, el precipitado celular se
resuspendió en medio recién preparado y se transfirió a un frasco
estéril para inocular el biorreactor con "pocillo de
inoculación". Esta etapa de lavado se usa para retirar la
mayoría del DMSO y es práctica común en el cultivo de células de
mamífero. Más adelante, esta etapa de lavado de DMSO se eliminó y
las células se transfirieron directamente al biorreactor desde la
bolsa. (La eliminación de la etapa de lavado de DMSO permite el
manejo y mantenimiento de un sistema cerrado, reduciendo de este
modo la oportunidad de contaminación del sistema. Véase el Ejemplo
2).
La misma tecnología se usó también para células
CHO recombinantes.
\newpage
Se usaron dos biorreactores diferentes. Sin
embargo, los dos tenían la característica común de ser capaces de
inocular en un "pocillo de inoculación" de 2 l de volumen.
1. Se realizaron cultivos de 5 l en
biorreactores Applikon de 7 l (Schiedam, Países Bajos) equipados
con una frita de acero inoxidable sinterizado (Mott Metallurgical,
Farmington CT) para aireación. Se usó un dispositivo de separación
celular para retener a las células dentro del recipiente y para
permitir el funcionamiento en modo de perfusión continua. El
sistema reactor es capaz de soportar al menos 20 millones de
células/ml en 5 l de volumen. Se midieron el pH, el oxígeno
disuelto, la temperatura, y la densidad óptica mediante sondas que
se sumergieron en el cultivo cuando se usaba un volumen de al menos
2 l. El reactor se diseña con un pocillo de inoculación de acero
inoxidable de 2 l de volumen.
2. Se realizaron cultivos de 12 l en un
biorreactor de diseño personalizado de 15 l. El pocillo de
inoculación de acero inoxidable era el mismo (2 l de volumen) que en
el recipiente de 7 l. Sin embargo, se usó un reborde cónico para
prolongar el diámetro y el volumen de la parte superior (figura 3).
Se proporcionó aireación a través de una frita de acero inoxidable
sinterizado (Mott Metallurgical, Farmington CT). Se usó un
dispositivo de separación celular para tecnología de perfusión
continua. Este sistema de reactor es capaz de soportar al menos 20
millones de células/ml en un volumen de trabajo de 12 l.
Los dos sistemas de biorreactor se controlaron
usando una DCU B. Braun (Unidad de Control Digital, B. Braun
International, Melsungen, Alemania) en condiciones de funcionamiento
como se ha indicado en otra parte.
Las relaciones entre el tamaño y la densidad
celular del crio-recipiente usado y el pocillo de
inoculación (V_{RI\ min}) del reactor de inoculación puede
determinarse mediante la siguiente fórmula:
V_{RI \ min} =
\frac{X_{bolsa} * V_{bolsa}}{X_{RI \ de \
partida}}
donde X_{bolsa} es la densidad
celular en el crio-recipiente y V_{bolsa} el
volumen. X _{RI\ de\ partida} es la densidad celular de partida
deseada en el pocillo de inoculación del reactor de inoculación,
normalmente 1 x 10^{6}
células/ml.
El volumen final del reactor de inoculación (V
_{RI\ max}) depende del volumen del reactor de producción que se
usará y puede determinarse mediante la fórmula:
V_{RI \ max} =
\frac{X_{RP} *
V_{RP}}{x_{RI}}
Donde X_{RP} es la densidad celular de partida
diana en el biorreactor de producción (normalmente 1 x 10^{6}
células/ml), V_{RP} el volumen del reactor de producción, y
X_{RI} la densidad celular final en el biorreactor de
inoculación. El pocillo de inoculación del biorreactor normalmente
será pequeño (en los presentes ejemplos se usó un pocillo de
inoculación de 2 l) y el volumen puede aumentar aumentando el
diámetro y la altura del biorreactor. Puesto que V _{RI\ max} no
es limitante, puede aplicarse el mismo concepto de "pocillo de
inoculación" al diseño de biorreactores más grandes (véase la
figura 3).
Los cultivos realizados en los sistemas de 7 y
12 l tenían un volumen inicial de 2 l. Este es el volumen mínimo
necesario para sumergir los electrodos de pH, oxígeno disuelto del
biorreactor, así como el sensor de temperatura. La aireación se
realiza usando aireación de la parte superior justo después de la
inoculación. El volumen aumenta por etapas para mantener la
densidad celular entre 0,8 y 1,2 x 10^{6} células/ml. Se usa
oxigenación mediante dispersión de gas una vez que el volumen
alcanza los cuatro litros. La tasa de perfusión específica de
células se mantuvo a 0,5 - 0,7 nl/célula/día en todo momento.
Se realizó un muestreo fuera de línea
diariamente para determinar las concentraciones celulares y de
metabolitos. Se determinaron los recuentos y la viabilidad
celulares usando un hematocitómetro y el procedimiento de exclusión
por azul de tripano. Se usó un analizador YSI (Yellow Spring
Instruments) para medir las concentraciones de glucosa, lactosa,
glutamato y glutamina de las muestras. La LDH y el amoniaco se
midieron usando un Bioanalizador Kodak (Kodak Instruments, NY). Se
usó un analizador de gas en sangre NOVA (Nova Biomedical, Walthman,
Mass.) para medir el nivel de CO_{2} disuelto y para comprobar
los valores de pH y oxígeno disuelto. Se analizó la actividad
rFVIII en las muestras mediante el procedimiento de coagulación en
una etapa. La calidad del producto se determinó mediante un ensayo
de transferencia de Western de desarrollo propio.
Ejemplo
1
La Figura 4 muestra un cultivo de perfusión de
12 l. Se usaron 50 ml de suspensión celular crioconservada en una
bolsa EVA para inoculación. Las células se lavaron con medio recién
preparado para retirar el DMSO antes de la inoculación. El cultivo
estaba a un volumen inicial de 2 l con aireación de la parte
superior. La viabilidad celular superaba el 95% durante todo el
procedimiento y el volumen aumentaba por etapas en base a la
densidad celular. Se usó dispersión de gas una vez que el volumen
estaba en 4 l. la perfusión continua de medio se inició un día
después de que el volumen alcanzó 12 l. La tasa de perfusión se
mantuvo a 0,5 - 0,7 nl/célula/día. La densidad celular diana de 20
x 10^{6} células/ml se alcanzó después de 11 días. El experimento
de expansión en serie de semillas demuestra claramente la elegancia
de esta tecnología de multiplicación. No se usaron matraces de
cultivo celular intermedios, se redujo de manera drástica el riesgo
de posible contaminación, los medios y el entorno se controlaron
externamente, y como resultado el tiempo para poner en marcha un
biorreactor de producción se redujo en al menos el 70%.
Ejemplo
2
Se evaluó la necesidad de la etapa de retirada
de DMSO (lavado/dilución) antes de la inoculación. En esta
evaluación, se pusieron en marcha dos biorreactores de forma
paralela a partir del mismo lote de bolsas congeladas de 50 ml.
Reactor de 12 l donde se realizó una etapa de
lavado de DMSO.
Reactor de 5 l donde se omitió una etapa de
lavado de DMSO.
Los dos cultivos se realizaron en las mismas
condiciones (etapas de aumento de volumen, aireación de la parte
superior y tasas de dispersión, etc.). El cultivo de 5 l alcanzó la
densidad celular diana de 20 x 10^{6} células/ml en 11 días, el
cultivo de 12 l un día después. La Figura 5 muestra una comparación
entre estos dos cultivos. No se apreciaron diferencias en
crecimiento o viabilidad celulares. La eliminación de la etapa de
lavado de DMSO hace más eficiente aún el procedimiento de expansión
en serie de semillas (a partir de la descongelación de células) y
permite el cierre del sistema durante todo el procedimiento.
Ejemplo
3
La Figura 6 muestra el perfil temporal de un
cultivo realizado en el reactor con "pocillo de inoculación"
de 12 l. Se usaron 50 ml de suspensión celular, crioconservados en
una bolsa, para inoculación sin un lavado de DMSO. La densidad
celular diana de 20 x 10^{6} células/ml se alcanzó después de 16
días.
Ejemplo
4
La Figura 7 muestra el perfil temporal de un
cultivo de CHO realizado en el biorreactor de 5 l. Se usaron 50 ml
de células crioconservados en una bolsa para inoculación. No se
realizó etapa de lavado de DMSO. La densidad celular diana - aquí
10 x 10^{6} células/ml, se alcanzó en 6 días.
Ejemplo
5
La Figura 8a y 8b muestran los perfiles
temporales de dos cultivos de BHK y dos de CHO realizados en los
biorreactores de inoculación. Se usaron criobolsas de 50 y 100 ml,
no se realizó etapa de lavado de DMSO en ninguno de los cuatro
cultivos. No se apreció efecto negativo usando criobolsas de 50 ml o
100 mm.
En general, los procedimientos existentes de
expansión en serie de semillas son de trabajo intensivo y
susceptibles a la contaminación microbiana debida al uso de
múltiples recipientes de cultivo tales como matraces T, frascos
rotativos y matraces rotativos. Se desarrolló un nuevo procedimiento
de expansión en serie de semillas usando bolsas de crioconservación
EVA de 50 ml o 100 ml que se usan para inocular directamente en un
"pocillo de inoculación" hecho a medida en un biorreactor.
Este reactor sirve como la fuente de inoculación para un sistema de
producción a escala. Esta metodología elimina completamente el uso
de matraces T, frascos rotativos o matraces rotativos cualesquiera
durante el aumento a escala. Se propone un procedimiento para
clasificar por tamaño y diseñar el "pocillo de inoculación".
Siguiendo este procedimiento, puede aplicarse el procedimiento para
la inoculación directa de cualquier reactor de producción a escala.
En estos ejemplos se usaron células crioconservadas, pero la
crioconservación no es un requisito de esta tecnología. Las células
crioconservadas pueden sustituirse por células de mamífero a
temperaturas convencionales y la eficacia y utilidad del sistema
seguirían siendo las mismas. Análogamente, puede ajustarse el
tamaño del biorreactor, siempre que se mantengan los conceptos de
un pocillo de inoculación y el procedimiento de uso.
Claims (9)
1. Un procedimiento de expansión en serie de
semillas de células de mamífero que comprende:
- a)
- proporcionar un biorreactor que tiene un pocillo de inoculación,
- b)
- suministrar una suspensión de células de mamífero a medios dentro del pocillo de inoculación,
- c)
- controlar las condiciones ambientales y la composición de dichos medios de modo que se optimice el crecimiento celular dentro del pocillo de inoculación,
- d)
- cultivar las células de mamífero hasta que se alcanza una densidad celular predeterminada dentro de dicho pocillo, y
- e)
- aumentar gradualmente el volumen de los medios mientras se mantienen condiciones ambientales y condiciones de cultivo ambientales óptimas hasta que el biorreactor se llena a un volumen y densidad celular predeterminados.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las células de mamífero son células crioconservadas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las células de mamífero se seleccionan entre el grupo
constituido por células de ovario de hámster chino y células de
riñón de cría de hámster.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las células se obtienen de una criobolsa.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que las células se obtienen de un criovial.
6. Un biorreactor de fermentación que
comprende:
- a)
- un biorreactor, definiendo dicho biorreactor una cámara,
- b)
- teniendo dicha cámara lados exterior e interior, un miembro superior, miembro de pared, y miembro base, teniendo dicho miembro base un orificio,
- c)
- un pocillo de inoculación, definiendo dicho pocillo una cámara que tiene lados exterior e interior, miembros superior y de base, un miembro de pared, y
- d)
- incluyendo además dicho pocillo un orificio en dicho miembro superior unido a dicho orificio del biorreactor, de modo que se forma un canal entre la cámara del pocillo y la cámara del biorreactor para permitir el movimiento sin restricción entre ellas.
- e)
- estando dicha cámara del pocillo provista de un sensor óptico.
7. Un biorreactor de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la cámara del pocillo de inoculación
está provista de sensores seleccionados entre el grupo constituido
por: sensor de pH, sensor de oxígeno, sensor de temperatura.
8. Un biorreactor de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el pocillo de inoculación está provisto
de un orificio de comunicación a través de la pared de dicho pocillo
para permitir la introducción de medios y agentes en la cámara del
pocillo.
9. Un biorreactor de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el pocillo de inoculación está provisto
de un brazo mecánico para permitir la agitación de los contenidos de
dicho pocillo.
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