JPH01165371A - 細胞増殖方法及びそのための膜状支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野： 本発明は動植物細胞の増殖のために多孔性無機質膜支持
体を使用することに関する１例えば線維芽細胞及び形質
転換細胞のようなある種の細胞は、培養するのが比較的
容易である。それらは、種々の固体（例えばプラスチッ
クまたはガラス）表面にけ着し、増殖し、またサスペン
ションで増殖することもできる。しかしその他の哺乳類
動物細胞、例えば上皮組織から誘導された分化細胞は、
付着培養性であり、増殖するのが困難である［分化細胞
は特異機能特性を有する細胞である。多細胞生物におけ
るほとんどの細胞は、例えば呻乳類動物の血液細胞、神
経細胞及び筋肉細胞は分化される］。さらには、上皮細
胞は、不透過性表面上で増殖されるとき、分化特性を発
現しないことがある。

しかし、上皮細胞を透過性支持体上で増殖させる場合に
、それらの細胞は分化特性を発現することが見出されて
いる。これは、透過性支持体によって、細胞が上面及び
下面の両方から栄養を受けるようにされることによるも
のであろう。

ケラチノサイトの支持のために組織培養において膜を使
用することは、Ｆ、Ｌ、バウグハン（Ｖａｕｇｈａｎ）
、Ｒ，Ｈ，グレイ（Ｇ　ｒａｙ）及び１．Ａ。

ベルンスタイン（Ｉ３　ｅｒｎｓｔｅｉｎ）によって「
イン・ビトロ・セルラー・アンド・ディベロブメンタン
・バイオロジイ（Ｉ　ｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ　　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ）」、２２（１９８６）。

１４１〜１４９に発表されている。これらの著者は、ケ
ラチノサイトを種々の合成有機膜上に接種した後にその
付着、増殖及び分化を観察している。

二つの膜への満足すべき付着を得るための企みは、不成
功であった０組織培養操作のために特別に作った膜は、
対照体として用いたプラスチック製培養器と同等または
それよりも良好に付着及び増殖を支持した。試験は三つ
の透明膜のいずれも（対照体として用いたプラスチック
製培養器と同様に）、付着及び増殖を支持しなかった。

若干の改善された結果は、膜をフィブロネクチンでプレ
コートすることにより得られたことが記載されている。

−Ｕ様において、本発明は増殖している細胞または維持
されている細胞を担持する多孔性無機質膜支持体を提供
する。別の一郭様において、本発明は、多孔性無機質膜
支持体に細胞培養物を適用し、細胞を増殖させる条件下
でその支持体上に細胞を維持することにより細胞を増殖
または維持する方法を提供する。

無機質膜を使用することの利点は、それらが−般に細胞
に対して不活性でありまた非毒性であり、そして一般に
加熱またはその他の方法で滅菌しても破損しないことで
ある。無機質膜支持体は種々の材料、例えば酸化ジルコ
ニウム及び殊に酸化アルミニウムのような金属酸化物か
ら作ることができる。この種の多孔性無機質膜は、文献
に記載されており、例えばアルミナ及びその他の金属酸
化物の膜は、「ザ・ジャーナル・オブ・マテリアル−サ
イエンス（Ｊ　、　ｏｆ　　Ｍａｔｅｒｉａｌ　　５ｃ
ｉｅｎｃｅ）」１９（１９８６）、１０７７〜１０８８
頁のＡ、Ｆ、Ｍ、リーナース（Ｌｅｅｎａａｒｓ）等の
論文のゾル・ゲル法により、または「セラミックス・プ
ロセッシング・ビフォア・ファイヤリング（Ｃｅｒａｌ
ｌ−ｉｃｓ　　ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＢｅｆｏｒｃ　　
ＦｉｒｉｎＦｌ）」１９７８年ニュー・ヨーク、ウイリ
イ社発行、Ｇ、Ｙ、オノダ（Ｏｎｏｄａ）等編４１１〜
４４８頁にＲ，Ｅ、ミスドラ−（Ｍｉｓｔｌｅｒ）等に
よって記載されているテープ・キャスティング法により
作ることができる。

多孔性膜は、欧州特許第２２４４４３号及び同第２２４
４４４号明細書に記載されている方法で作ることもでき
る。好ましくは陽極酸化膜を用いる。

ある種の電解液（例：希硫酸）中でアルミニウム基極を
陽極酸化処理するとほぼ無定形（アモルファス）アルミ
ナからなる多孔性陽極酸化アルミナ膜がその表面上に形
成される。４Ｉ孔は膜の外表面から金属／酸化物界面付
近まで延在している。金属／酸化物界面に隣接して薄い
陽極酸化物の６着（非孔性）層、すなわちバリヤー層が
存在する。陽極酸化膜は、それが形成された金属基板か
らいくつかの方法で分離させることができ、どの方法で
も一方の面から他方の面へ向けて延在するほぼ円筒状で
かつその長さにわたってほぼ一定の直径をもつ多数の細
孔をもつ対称性膜を得ることができる。

欧州特許第１７８８３１号明細書には、バリャ−層を薄
化し、最終的には金属／酸化物界面のところに残留して
いるバリヤー層を溶解させるように意図された低速電圧
降下法によって、従来法で生成された陽極酸化アルミニ
ウム膜をその金属基板から分離する方法が記載されてい
る。得られる非対称性陽極酸化膜は、膜の一方の面から
他方の面へ向けて延在する細孔を含むが、一方の面から
内向きに延び、そして他方の面から内向きに延びる相対
的に小さな細孔の系を結び合せている相対的に大きな（
径の）細孔の系を含んでいる。

剥離された多孔性陽、８ｉｉ′ｅｊｉ化膜（対称性また
は非対称性）は、下記の特性故に組織培養担体（支持体
）として特に適当て′ある。

一高度に多孔性である。

一一最に透明であり、このことによりその場での細胞の
顕微鏡観察が可能である。

−平滑である。

一剛性であり、従って完全細胞単層の物理的移動が可能
である。

一非毒性である。

一有機薬品によって容易に攻撃されることがない、この
ことは観察のための細胞の処理のために重要である。

−例えばオートクレーブ法により、またはＵＶもしくは
ガンマ線照射により、滅菌されうる。

組織培養用に市販されているある種の有機質膜の低細孔
性は、ある種の条件下では細胞の増殖を制限することが
ある。この間には高度の細孔性となしうる陽極酸化アル
ミニウム膜では生じない。

そのような膜における細孔寸法は、陽極酸化処理条件を
制御することにより容易に制御することができる。一般
に、細孔は、増殖細胞を支持するのに充分に小さくて、
細胞が膜の表面上に置かれるようでなければならない、
若干の場合には、細孔は１５０ｋＤａまでのタンパク質
を含む細胞培養を通過させるのに充分な大きさであるこ
とが必要とされることがある。一般に陽極酸化条件及び
電解液の種類は、重要因子でないようである。我々は燐
酸電解液及び混合酸電解液中で作った０、２ミクロンの
直径の膜と、　０．０２ミクロンの直径の膜とで、細胞
の同等な良い増殖結果を得ている。膜の厚さも重要因子
ではないが、厚い膜はど良い剛性の利点を示し、また薄
い厚さほど良好な光透過性を示しうる。膜は平坦であっ
ても、あるいは立体付形されていてもよい（欧州特許第
８７３０３３３６号明細書参照）。

支持体膜上で増殖される細胞の種類は重要因子ではない
が、本発明は殊に哺乳類動物細胞の増殖に関している０
本発明は、付置培養性細胞（すなわちサスペンションに
おいては増殖しないか、または分化特性を失なうような
細胞）の増殖のために特に有用でありうる０本発明は、
形質転換された（さらに特定的には、分化された）細胞
に応用できる。セルラインの例は、以下の実施例に示さ
れている１本発明はラット肝細胞のような厭食性細胞の
増殖または維持のために特に有用である。我々は、ヒト
膵臓島を多孔性陽極酸化アルミニウム膜支持体上に維持
した。

細胞増殖条件は、特別なものでなくてよく、慣用条件で
あってよい。以下の実施例２には、特定セルラインがわ
ずか２．５ｚの胎児ウシ血清を含む培地により陽極酸化
アルミニウム膜上で増殖することが判明したことが報告
されている（この細胞は、この血清濃度においては、従
来のプラスチック製支持体上では増殖しないものである
）、この特定例の観察は本発明による多孔性無機質膜支
持体の使用によって、より低い血清濃度において細胞増
殖を起こさせうろことを示唆するものである。

哺乳類動物細胞が本発明で使用の多孔性無機質膜に容易
に付着することが発見されたが、このことは予想外のこ
とであった。例えば哺乳類動物細胞は、ガラス支持体を
前もって極めて充分に清浄化した場合にのみ、ガラス支
持体に付着することが知られている。細胞の付着を良好
にするために、例えばコラーゲン、ラミニンまたはフィ
ブロネクチンを用いて支持体をプレコートすることが一
般的に行なわれている。しかし、この方式のルコート処
理は、面倒であるばかりでなく、次に顕微鏡観察のため
細胞を染色するときに問題を生じうる０例えばコラーゲ
ン被膜は、コラーゲン染ｆ！！、操作を妨害する。実際
、若干の組織培養用有機質支持体は、プレコート処理し
ない場合でさえも染色問題を起こす。

本発明で使用の多孔性無機質膜支持体は、一般にプレコ
ート処理の必要なく良好な細胞付着性を示す、しかし所
望ならば、例えば上記例示の物質で支持体をプレコート
してもよい、あるいは支持体上に、相異なる起源の別の
細胞のための支持体として作用する粘着性細胞単層を担
持してもよい。

別法として、無機質支持体上にちょうど基底外側膜を残
すように細胞の単層を除去し、その残った部分に異なる
起源の細胞を適用することもできる。

透明な支持体を使用することの大きな利点の一つは、増
殖中の細胞を位相差ｍ微鏡または、通常透過光顕微鏡で
その場で観察できることである。

細胞が液体培地中に浸漬されているときに無菌性を保つ
ためには、照明を上から行なって細胞を膜支持体を介し
て下から観察する。細胞は標準的な方法により、光学顕
ｖ！１鏡または走査閉微鏡（ＳＥＭ）での観察のために
準備調整できる。これらの支持体を用いてのＳＥＭ法に
よって極めて良好な像を得ることができる。光学頴微鏡
法のための細胞の固定及び染色のためのプロトコルを以
下に示す。

本発明を実施するために一片の膜支持体を標準的組織培
養容器内に入れ、増殖培地中の細胞懸濁物をその上面に
塗布する。培養容器の蓋を閉じ、適当な条件下でインキ
ュベーションする。このような構成配置によって、培地
が多孔性買収支持体を通過して増殖細胞に十分に接近し
ないならば、この問題は膜を組織培養容器の底面よりも
わずかに上に保持することにより解消しうる。これは改
円板を背の低いプラスチック管の一端部に取り付けて上
部開口円筒（その直径は高さよりも可成り大きい）を作
ることにより、最も良く達成できる。

この円筒は支持体膜の円板の周囲に足を備えている（こ
のような組立体を以下「培養挿入体」と称する）、この
挿入体は長さ（背の高さ）よりも大きな直径の背の低い
管と、多孔性陽極酸化アルミニウム膜のような多孔性無
機質膜の円板とからなり、その円板がその周縁のところ
で管に対して管の一端部に近いところに密封されており
、生活細胞が管内の膜の上に保持される（例えば付着さ
れる）。

多孔性膜支持体の下面及び上面に隣接してそれぞれ異な
る培地を与えるのが有利であることがある。例えば、下
面に隣接する培地に細胞増殖に必要な栄養素を含ませる
ことができ、このものは膜支持体細孔内を通過すること
により増殖細胞に達することができる０Ｍ１胞は（おそ
らく膜支持体の狭い細孔を介して容易に拡散するには余
りにも大きいような）大きな分子量の代謝産物を産生ず
ることがある。その支持体膜の上面に隣接する培地は、
これらの代謝産物を含むことがあり、従って下面に隣接
するものと異なる組成でよいことがある。この特徴は、
増殖細胞の生存力または性質を決定（測定）するのに有
用である。

ここで図面を参照すると、第１図は付着培養細胞のため
の支持体としての多孔性無機質膜の使用ρ１の概略図で
ある。第２図は組織培養板の一つの穴（ウェル）におけ
る「培養挿入体」（前記参照）の−例の断面図である。

第１ａ図は基底外側膜１４及び管腔膜１６を含む上皮細
胞単層１２を担持する膜支持体１０を示す、第１ｂ図は
相異なる起源の細胞（例、セパサイ）　；ｃｅｂａｃｙ
ｔｅ）のさらに別の一層１８のための支持体として作用
する第１ａ図の支持体を示す。第１ｃ図は基底外側細胞
が殺されて基底膜２０を残こ１−た状態を示すものであ
りその膜２０にセパイト細胞１８が付着されている。

第２図において、培養挿入体は、長さよりも直径が大き
いほぼ円筒状のプラスチック管３０；そのプラスチック
管の上端部付近において管の内側にその周縁が密封され
ている多孔性無機質膜円板３２（その管は膜を受は入れ
るために凹状清か付けられている）；及び床面よりも膜
を上位にするための足３３；からなっている。培養板は
床３４、個々の穴（ウェル）を規定する壁３６（そのう
ちの一つの穴が示されている）及び板蓋３８からなって
いる。穴は培地４０で部分的に満たされている。

培養挿入体は穴内に配置されており、培地４０がＷｉ３
２の下面のみを接触するようになっている。

別の培地４２（同一または相異なる組成）が培養挿入体
中に入れられている。細胞の単層４４が膜の上面へ付着
されており、膜の細胞を介して培地４０と接触している
。

本発明を以下の実施例で説明する。

火１匠り 下記の三つのタイプの細胞を使用した。

マウス胎児線維芽絹胞　　　　　（３Ｔ３）ウシ角膜内
皮　　　　　　　　　（ＢＣＥ）−次ＢＣＥ細胞のため
の培地組成は下記の通りであった。

一インスリン　　　　　　　　　　１０μｇ／端ｌ−ト
ラスフェリン　　　　　　　　１０Ｊｉｇｏｍｌ−ペニ
シリン／ストレプトマイシン ーファンジゾン ーヒドロコルチゾン（１０Ｈｇ／１００ｍｊり一グルタ
ミン 一上皮生長因子（１０＋＋ｙ／輸ｌ） −微量元素 一胎児つシ血清ｔＯＳ ＭＤＣＫ及び３Ｔ３綱胞についての培養組成は、トラン
スフェリン、ヒドロコルチゾン及び上皮生長因子を除い
た外は上記のものと同じであった。

使用した陽極酸（ヒ膜はｇＪｅｉ／シュウ酸混合電解液
タイプのものであり、細孔寸法は０．２μ−（以下ｒｏ
、２Ｍ　Ｅ　Ｊと称する）ものと、０．０２Ｍ輪（以下
ｒｏ、０２ＭＥＪと称する）ものとを用いた。

細胞は、２４穴組織培養皿の１１ｍｍの円板中へ１０４
細胞／ｍ１（１穴当り１−りの濃度で接種した。

対照試験体として、膜を使用しないで同じ細胞濃度で穴
（ウェル）に細胞を接種した。

プラスチックまたは膜上で増殖した細胞の生存力を、ト
リプシン処理、トリパン青染色、及び染色及び非染色細
胞の計数により測定した。結果を表１に示す。

これは試験基板からの酵素処理による解放後にはすべて
のタイプの細胞の生存力に有意な差異がないことを示し
ている。このことは、サブカルチャーするときに膜をプ
ラスチック基板として処理しうろことを示している。

細胞タイプ　プラスチック　０．２Ｍ　Ｅ　　０．０２
Ｍ　ＥＭＤＣＫ８３＄＋１１．９７２％：ｌ：１４．９
７０＄±６．７３７３　　　７０＄＋　３．８　　６６
１＋　４．８　８１＄±１５．４Ｉ３ＣＥ　　　　９５
Ｈ：５．２　　８１＄＋７．６　７６＄＋２．３陽極酸
化ａまたはプラスチックへの細胞付着の速度及び効率を
、１０’ａｌ胞／穴の濃度での接種後に測定した。

表２は、三つのタイプすべての細胞がプラスチック及び
０．０２μ−細孔膜（０，０２Ｍ　Ｅ　）に同じように
良く接種されたことを示している。しかし０．２μＩＩ
Ｉ＋１１１孔膜（０，２Ｍ　Ｅ　＞上で増殖した細胞は
、１４ＤｃＫ及びＢＣＥについて著しく低い接種効率を
示している。このことは、従って、０．０２ＭＥ膜がプ
ラスチックよりも細胞付着について大きな能力を有する
ことを示している。しかし０．２Ｍ　Ｅ　ｒＦＡは小さ
い細胞付着能力を有する。

夫−１ 接種効率％　標準平均誤差（ｓ、ｅ、ｖＡ）ｎ・３４時
間 細胞タイプ　プラスチック　０．２Ｍ　Ｅｏ、０２Ｍ　
ＥＭＤＣＫ　　　３３＄＋１２．１　　２１＄＋１０．
４　２６＄＋６．６３７３　　　　１４１±４．８　　
　　１１＄＋５．４　　１９１±３．９８ＣＥ　　　　
２９ｆｆ＋５．５　　　１６０＝７．１　３１＄＋８．
６８時間 細胞タイプ　プラスチック　０．２Ｍ　Ｅ　　　０．０
２Ｍ　ＥＭＤＣＫ　　　３９＄＋３．６　　　２１＄＋
１１．１　２６＄＋６．４３７３　　　２４＄＋６．９
　　　１９＄＋２．３　２５＄＋１．８８ＣＥ　　　　
４１＄＋７．８　　　２７１）３．６　３５＄＋５細胞
をプラスチック、０．２ＭＥ及び０．０２Ｍ　Ｅ膜上で
７〜１０日間増殖させ、次いでそれぞれの基板上で高濃
度でサブカルチャーした。次いで４時間及び８時間後に
上澄液中で回収された細胞を計数した。そして接種効率
を下記式で計算した（％）。

平板培養効率も下記のようにして測定した。１ｗａｌｌ
の細胞サスペンション（２〜５０Ｍ胞／ｎＮ）を２４穴
トレーの空穴及び膜円板を含む穴に入れた。

５日間増殖後の１６個またはそれ以上の細胞を含むコロ
ニーの数から平板培養効率を下記式で計算して求めた。

表３は、プラスチック上及び０．２Ｍ　Ｅ及び０．０２
ＭＥ膜上で増殖した細胞の平板培養効率は対照的である
ことを示している。実際に０．０２Ｍ　Ｅ膜平板上で、
細胞は、プラスチック平板上でよりも著しく高い増殖し
な、従って、このことは、陽極酸化膜はプラスチック平
板と同等またはそれ以上に細胞の増殖を促進することを
表わすものである。

観察によれば、陽ｉ酸化膜上での交会は、一般に１０〜
１４日間で達成されることが判ったが、これはプラスチ
ック平板での成績よりも非常に良い。

ムーニＬ 種々の基板上での３種のタイプの細胞の平板培養効率±
ｓ、　ｅ、漬（ｎ＝３）％ 細胞タイプ　プラスチック　０．２Ｍ　Ｅ　　０．０２
Ｍ　ＥＭＤＣＫ　　　２３ｇ＋４．３　　１９ｇ＋６．
２　２７１＋７．８３３Ｔ３　　　１１２：ｉ：２．１
　　　９Ｅ−１，９１９ｆ＝ｆ：５８Ｃ２１７＄±２．
２　　１７１＋３．７　２８＄＋１．５ＢＣＥ細＋ｔａ
をＴＥＭ検査したところ、それらの細胞が明確に分極し
、また強い接合を有していることが判った。

丸１１え 下記の各セルラインを増殖させた６ 「マデイン・ダービイ」イヌ腎Ｍ（ＭＤＣ＋（）・・・
付着培養性 ウシ角膜内皮（ＢＣＥ）・・・付着培養性マウス・ブラ
スマ細胞１ｔＴｉ（Ｘ６３−ＡＧ８−６ＳＳ）・・・非
付着壇上性 マウス・ハイブリドーマＰＦ・・・非付着培養性マウス
・ハイブリドーマ３Ｃ３・・・非付着培養性多孔性陽極
酸化アルミニウム膜を、オートクレーブ法、無水アルコ
ールへの浸漬、またはＵｖ照射によって滅菌した。ある
いは培養挿入体く前記参照）をガンマ線照射により予備
滅菌状態としたものを用いた。

無凹状君のシート状膜または培養挿入体を２４穴または
６穴組識培養平板に装入してから、細胞サスペンション
を接種した。

細胞をサブカルチャーするため、Ｍ　Ｄ　ＣＫまたはＤ
ＣＥ細胞の単層を、トリプシン（５２μｇ／＋＾１）含
右桜街ＥＤＴＡ液（無菌状）中で剥離した。マウス・プ
ラスマ細胞腫及びハイブリドーマセルラインは、培養器
を靜かに振とうすることによりまたはピペット吸引によ
り簡単に除去できた。細胞を３７°Ｃにおいて５％Ｃ○
２／９５％空気の雰囲気中でインキュベーションしな。

朗用培地くすべての細胞について）は下記のものを含ん
でいた。

一ダルベツコ（Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ＞８低必須培地（Ｄ
ＭＥＭ）＝１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２） 一４ｍｇ／ｊ！ゲンタマイシン硫酸塩 すべてのタイプの細胞が平坦シート状膜上及び培養挿入
体上で良好に増殖することが判った。細胞単層を通常光
学ｚｍ鏡（染色しないもの及び染色したものの両方）及
びＳＥＭ（走査電子顕微Ｓｆ４＞でＲ察できた。光学顕
Ｖ＆鏡法のための細胞染色及びＳＥＭ法のための細胞の
調整準備法は、後述のプロトコルによって行なった。

Ｂ　ＣＥ　ｍ胞は２．５％のウシ胎児血清を用いて培養
挿入体中で増殖することが判った。これらの細胞は、こ
のような血清濃度を用いたときにはプラスチック支持体
上では増殖しないであろう。

及１鮭１ 下記のセルラインを増殖させた。

一ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥ） 一ハムスター嬰児腎臓（Ｂｌ−１１０ −一次ラット脳細胞 ＢＣＥ及びＢＨＫについて使用した増殖培地はイーグル
ス（Ｅ　ａｇｌｅｓ）培地のグラスボウ（Ｇ　ｌａｓｇ
ｏｗ）改変培地であった。ラット脳細胞についての増殖
培地はＤＭＥＷであった。すべての場合に１０％のウシ
胎児血清を添加した。細胞を培養挿入体上に担持して、
３７℃及び５％Ｃｏ、／９５％空気の雰囲気下にインキ
ュベーションした。

すべての細胞が培養挿入体上で良好に増殖した。

このように増殖させたｎ　１−Ｉ　Ｋ及びラット−次脳
細胞についての下記のような蛍光染色法（プロトコル）
を開発した。

下記は光学顕微鏡観察のための多孔性透明無機質支持媒
体上での細胞の固定及び染色についての技法プロトコル
である。

使用しうる固定剤の例には、パラホルムアルデヒド、ホ
ルムアルデヒド、メタノール及びグルタルアルデヒドが
あり、ＰＢＳＡ中に２％のパラホルムアルデヒドを添加
したものが好ましい、使用しうる染料の例としては、ウ
ェイガード／ファンゲーゾン（ＷｅｉｇａｒＬ’ｓ／　
Ｇｅｃｓｏｎ）、ギイームサ（Ｇ　ｉｅｍｓａ）、ギイ
ームサ／ライトグリーン、ライシュマンス（Ｌ　ｅｉｓ
ｌ＋ｍａｎｓ）、ヘマトキシリン／エオシン、があり、
核を紫色にそしてコラーゲンを桃色に染めるウェイガー
ト／ファン・ゲーゾンが好ましい。

下記は光学顕微鏡法のために細胞培養物を永久染色する
ための技法（プロトコル）である。

薬ｍ社Ｉ− １、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド；ｐＨ７，３ ２、ライガート鉄へマドキシリン（下記のように調製） Ａ液・・・１ｇのヘマトキシリン １００社の無水アルコール（エタノール）Ｂ液・・・４
ｔｓｌの塩化第２鉄水溶液（３０％）１＠１の濃１（Ｃ
Ｉ ９５社の蒸留水 これらの液をガラス繊維ろ紙で２回ろ過し、同容積のＡ
、Ｂ両液を混合し、直ちに使用する。

３、ファン・ゲーゾン染料 １００ｍｆの飽和ピクリン酸及び５〜１０ｍ１の酸性ツ
クシン（１％）液を上記のようにろ過することにより作
る。

４、エタノール（３０％、５０％、７０％、９０％及び
１００％） ５、「ヒスト　クリヤー（夏（１ｓｔｏ　−ｃｌｅａｒ
）　：前原」：（米国ニュージャーシイ州ナショナル・
ダイアグノスナックス社製） ６、「デペックス（ＤｅＰｅｘ）（商標）」マウント材
（ＢＤＨケミカル社製） 友Ｌ１１ （組織培養した培養挿入体そのものについての染色法プ
ロトコル） １　、　、Ｐ　Ｂ　Ｓ中の２％パラホルムアルデヒド液
（ｐＨ７，３）で湿潤膜を固定、３７℃で１〜２４時間
。

２、蒸留水で良く洗浄。

３、混合したばかりのウェイガード鉄ヘマトキシリンで
５〜１０分染色。

４、蒸留水で良く洗浄。

５、ウアン　ゲーゾン染液中で１０分までの間染色。

６、蒸留水で良く洗浄。

７、濃度が段階的に高いエタノール（３０％、５０％、
７０％、９０％及び１００％）中でそれぞれ２分間乾燥
。

８、空気中で乾燥。

９、「ヒスト・クリヤー」に浸漬。

１０６「デペックス」マウント材のスライドとカバース
リップとの間に膜を装着。

及１匠土 ＭＤＣＫ細胞を「ダルベツコ！最低・必須培地（ＤＭＥ
Ｍ＞、１０％ウシ胎児血清及び４Ｉ＊ｌＦ／１のゲンタ
、マイシンｖｉ酸塩からなる培地で増殖した。

使用した陽極酸化アルミニウム膜（０，２ＭＥ及び０．
０２Ｍ　Ｅ　、直径２５＋ｅ＋ａ）を前記構造の培養挿
入体に担持させた。

Ｍ　Ｄ　ＣＫ細胞を２Ｘ１０’細胞／社の濃度で、６穴
ｊＨ織培養トレーの穴中の２５＋ｎＩｏ（径）挿入体中
へ、または穴へ直接に接種した。六への直接接種したも
のの合計量は、挿入体について必要とされるものの約２
倍であった０両方の場合に使用した培地の容積は３ｖｍ
ｌ／穴であった（挿入体使用の場合、濃度は内室及び外
室間で平衡化する）。

プラスチック上及び酸化物膜上での細胞の増殖曲線を作
った。下記の分光分析法を用いて細胞数を推定した。培
地を穴または挿入体から吸引採取して、サスペンション
中に失なわれた細胞数を計数するために保存した。　０
．０４％ＥＤＴＡ溶液中の０．０５％−／ｖトリプシン
を５ｎ１、単層に対して加え、３０秒間放置し、次いで
デカンテーションにより除いた０次いで単層を３７℃で
５〜７分間放置し、１０％のウシ胎児血清を添加した溶
液Ａを１０＠１添加した。エペンドルフ・ピペット装置
を使用して静かにピペット吸引することにより、細胞を
再懸濁させた。細胞濃度及び生存力をエリスロシンＢ染
料排除法及び改良ノイバウエル・チェンバー分用いて測
定した。

光学濃度（ＯＤ　＞を細胞数に換算するための標準曲線
は、細胞サスペンションの濃度を溶液Ａ（＋１０％ウシ
胎児血清）により所望の高位標準（５×１０５ａ胞／ａ
＋Ｚ）に調節し、そして連続的に２倍希釈して１０４細
胞／ＩＩｌの濃度まで段階的な濃度とすることにより、
得た０次いでこれらの細胞サスペンションの光学濃度を
、溶液Ａ（＋１０％ウシ胎児血清）ブランクと対比して
７８０ｎｍで読み取り、標準曲線を作った。

プラスチック０．２Ｍ　Ｅ及び０．０２Ｍ　Ｈの三種の
表面上での５つの（反復）培養物をＯＤ法で測定し、そ
してこの測定値を細胞数に換算した。結果を表４に示す
。

これらの結果は、陽極酸化膜上での増殖からプラスチッ
ク上での増殖よりも速いこと、及びまたより高い細胞収
量が得られることを示している。

０．０２Ｍ　Ｅ膜の方が０．２Ｍ　Ｅ膜よりも良好のよ
うである。

日数　　　プラスチック　　０．２ミクａシ　　　０，
０２ミクロン４　　　　　　　　８．５　　　　　　　
　６．５　　　　　　９．５７　　　　　　　１７．５
　　　　　　　１２　　　　　　　１５１１　　　　　
　　　１６　　　　　　　　　１９　　　　　　　２６
．５χｍΣ ラット・異常発達肝細胞を慣用のコラゲナーゼパーヒユ
ージョン法により、またはディジトニン／コラゲナーゼ
バーヒユージョン法により単離した。

この肝細胞を０．２Ｍ　Ｅ陽極酸化膜（前記のような培
養挿入体の形に組込んだもの：径２５Ｉ）上で単層で培
養し、これを慣用ｊ１１織培養皿（Ｌｕｘ）で培養した
ものと比較した。

接種後２時間のときに平板培養効率を酵素法により測定
した。培地を平板または挿入体から吸引で取出し、その
一定量を沈静化させた（１００ｇ／２輪）。別の一定量
を超音波処理した。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を
測定し、活性の差（サスペンション全体：上澄液）をＪ
ｌｌｆ！　ｉＪ　ｍ胞の指標として使用した。

２時間後の脱ｉ紺胞の割合は膜培養及び皿培養について
同等であり、このことは同等な平板培養効率であること
を示すものであった。

肝細胞（＝１着後（４時＋ｉ’ｌ）、単層を２０〜４８
時間培養し、肝細胞の代謝機能を、特定基の代謝を監視
することにより、評定した。基質代謝速度及び代謝産物
生成速度を測定した。脂肪酸のケトン体への代謝速度は
、陽極酸化膜上の単層及び培養皿での単層において同様
であった（表５９照）、シかしミトコンドリアピバリン
酸塩代謝速度及び乳酸への転化速度は、陽極酸化膜上で
の単層において、より高かった（表６９照）。

従って、結果は、陽極酸化膜が肝細胞培養のための良好
な支持体として機能すること、及びある種の代謝活性が
その支持体上で（慣用プラスデック材と比較して）、増
大されること、を示している。

去−５ 培養皿または陽極酸化膜上での肝細胞ｍ層におけるパル
基質： （１）　０．７５Ｊ−バルミチシ酸塩＋１ｍＭ−パルビ
ン酸塩実＠１（細胞全体）　　　　（３）　１４１上３
（３）１６フ±２４実＠２（門脈周囲）　　　　（４）
　１５８±１０　（４）　１５８±１３実験３（静脈周
囲）　　　　（４）　１２９±５　　（４）　１１５±
１０（２）　　Ｉｎ＋Ｍ−オクタン酸塩 実験１（細胞全体）　　　　（３）　１０８±４　　（
３）　１０９±１５−　　２Ｍ、−５１７４±１２　５
　１９２±２１肝全体からまたは門脈周囲もしくは静脈
周囲部分から単離した肝細胞単層をデキサメタシン及び
インスリンと一緒に２０時間培養した。ケ１−ン木（ア
セトアセテート＋３−ヒドロキシブチレート）の生成速
度を、０．７５ｍＭパルミヂン酸塩１ｍＭピルビン酸塩
及び０．５ｍＭ　　Ｌ−カ一二チンと共に、または１Ｍ
Ｍオクタン酸塩と共に、２時間インキュベーションして
いる間に測定した。数値はく）内に示した培養皿または
膜の数についての平均上Ｓ、Ｄ、（標準濱差）である。

及−」卜 培養皿及び陽極酸化膜上での肝細胞単層中のミドコン実
験１（静脈周囲） ミドコシドリアピルビン酸塩代謝　（４）　　１０６±
８　　　（４）　　２３２±３６乳酸生成　　　　　　
　　　２５０±８３０６±１８実験２（門脈周囲） ミドコシドリアピルビン酸塩化：Ｊ（＜４）　　２３０
±３２　　＜４）　　３８Ｑ±１２乳酸生成　　　　　
　　　　１４４±３０　　１５０±１０実験３（全体） ミドコシドリアピルビン酸塩代謝　（３）　　１５４±
８　　　（３）　　１９４±１５乳酸生成　　　　　　
　　　１５２±２３　　２５０上１フ実験３會グｎゴシ ミドコシドリアピルビン酸塩代謝　（３）　　１７８±
６　　　（３）　　２３４±１０、−　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１９３±７　　　　　３０
２±８肝（実質）細胞単層を、血清を含まず、ｌＱｎＭ
のデキサメタシン＋ｌＱｎＭのインスリンを加えた培地
、または血清を含まず、上記のものにさらにグルカゴン
（１００ｎＭ）を加えた培地で２０時間（実＠１及び２
）または４８時間（実験３）培養した。ミトコンドリア
（糸粒体）ピルビン酸塩代謝速度を、乳酸塩またはアラ
ニンの原因となり得なかったピルビン酸塩の濃度低減か
ら測定した。速度は１カルチヤー（培養）当り１時間当
り代謝されたピルビン酸塩のｎモル数で表わされている
。数値はく）内に示した培養皿または膜の数についての
平均±Ｓ、Ｄ、（標準偏差）である。

尺１１灸 チャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞の増殖
を陽極酸化膜上及びプラスチック培養皿上で比較評定し
た。

プロトコル（記録）。

通常増殖培養物からの１００藺のＣｔｌ　Ｏ細胞（ヘモ
シトーターターで計数）を用いて、外膜に接種した。外
膜は牛胎児血清を加えた研究用標準ＭＥＭ培地に浸漬し
た。

これらのイ囲胞を４日間インキュベージコンして、毎日
その増殖を観察した。２４時間の間隔で、試？’ｌ膜及
び対叩穴をｌ・リブシン処理して、細胞を脱離させ、１
つの膜（または穴）当りの細ｌａ数をヘモシトメーター
による計数により推定して、細胞の相対的倍増時間を推
定した。すべての培養物を毎日光学顕微鏡でｉ察し、増
殖期間の終了時において代表試料を採取して、さらに別
の一組の膜を接種し、細胞が８１能的に完全に＜ｒａｍ
＞でありまたこの試験条件下での増殖後に再び活動でき
ることを確認した。

各観察について、５つの試料を、ある−時点で接種され
た並列培養物ストックから採取した。

この試験に用いた膜は： ａ）　陽極酸化０．０２μｓ細孔膜 ｂ）　陽極酸化０．２μ彌細孔膜 Ｃ）　通常の研究用プラスチック表面（対照体）であっ
た。

観　察： ＣＨＯ細胞は陽極酸化膜に１１着して良好に増殖してい
た。サブカルチャーで、通常の方法でトリプシンにより
脱離し、慣用組織膜から採取された細胞と同じようにｆ
ｉ能したく異常細胞は検出されなかった）、コロニーの
形成も何ら変えるところは認められなかった。すべての
６・Ｊ胞の計数の平均及び標準（ｉＪ差を得た。統計学
的分析によって、これらの相異なる表面上でのＣＨＯ細
胞の培養物の増殖速度における存念な差は認められなか
った。

火１涯り 陽極酸化膜上でのＭＤＣＫ及びＢＣＥ則胞の増殖、及び
光字ならびに電子顕微鏡検査のための調整。

実施例１に記載の２５ｍｍの直径の陽極酸化膜上でＭ　
Ｄ　ＣＫ及びＢＣＥ細胞を増殖した。

位相差顕微鏡を用いるだけで細胞を観察することができ
る。プラスチック上での像と比較して、像の鮮明度の低
下は、たとえあったとしても、はとんどない、実施ＰＡ
３に述べた染！′１に加えて下記のものに＠極酸化膜上
の細胞について良好に使用できた。

ウェイガード／ファン・ゲーゾン＋ライトグリーン ウェイガード／ファン・ゲーゾンーニュートラルレッド セレスチン青／メチャースへマドキシリン上記の染料を
用いて、膜自体の背景染色はほとんどなく、細胞構成部
分の可視化はプラスチックまたはガラス板の場自と同様
に良好である９陽極酸化膜が透明であることは、非常に
有利である。

さらには、陽極酸化膜上でのＢ　ＨＫ及びＣＨＯａｌ胞
の蛍光染色も実施したが、背景の蛍光染色がほとんどな
く高コントラストの像が得られた。

適当に染色された膜はｔ！ｙ、型駒操作によって、カバ
ースリップの下のｍ微鏡スラ・イド上に装着できる。プ
レバレージョンの劣化は、時間の経過により通学生じる
褪色以外には、生じない。

基本的ＳＥＭプレバレージョン操作は陽極酸（上膜上で
の増殖細胞について確立できた。

無機質膜はＳＥＭプレバレージョン操作に用いられる有
機薬剤に耐えるので、非常に有利である。

膜の剛性も、細胞培養に用いられている有底重合体膜を
用いる場きよりも、取扱いを容易にする。

前記培養挿入体から円形の完全な形のまま膜を取り出す
ための特製器具も作った。この円板は直径的２２「１で
あり、電子顕微鏡のための多数サンプルを作るために用
いられる標準的ステンレス製サンプルホルダー中に嵌合
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は付着培養細胞のための支持体としての多孔性無
ｔａ質膜の使用例（ａ〜Ｃ）の断面図。 第２図はＡ１１織培養板の一つの穴（ウェル）に入れた
支持体のアセンブリイの一例の断面図。 膜支持体　　１０　　　細胞−ｔｉｔＮ１２無樋質膜円
板３２　　　培地　　４゜ 手続補正書（方式） 特許庁長官　　　吉　１）文　毅　　殿　　　　　　　
　　　　　　　　−一−１、事件の表示 昭和６３年特許願第２２４３８３号 ２、発明の名称 細胞増殖方法及びそのための膜状支持体３、補正をする
者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　アルカン・インターナショナル・リミテッド
新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の目付　　昭和６３年１２月２０目　（Ｊ
Ｕ口）６、補正の対象 適正な図面（享２１Ｓ！＋）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔性無機質膜支持体の表面へ細胞の培養物を適用
   し、その支持体上で細胞を増殖させるかまたは維持する
   条件下に細胞を保持することを特徴とする多孔性無機質
   膜支持体によって細胞を増殖または維持する方法。 ２、膜支持体がアルミナよりなる請求項１記載の方法。 ３、アルミナ膜が陽極酸化アルミニウム膜である請求項
   ２記載の方法。 ４、膜支持体が透明である請求項１〜３のいずれかに記
   載の方法。 ５、細胞が哺乳類動物細胞である請求項１〜４のいずれ
   かに記載の方法。 ６、その上で増殖しているかその上に維持されている細
   胞を担持している多孔性無機質膜支持体。 ７、請求項１〜５のいずれかの方法で作られる請求項６
   記載の支持体。 ８、背の低い管（３０）と多孔性膜の円板（３２）とか
   らなり、その円板がその周縁で管の一方の端部に隣接し
   て管へ密封されており、生活細胞が管内でその膜上に保
   持されている請求項６または７記載の支持体。 ９、第１の液体培地（４０）と接する第１の表面と；増
   殖細胞（４４）を付着して、第２の液体培地（４２）と
   接する第２の表面と；を有する多孔性無機質膜支持体（
   ３２）からなる細胞増殖用装置であって：第１の液体培
   地がその多孔性支持体を介する以外は第２の液体培地と
   連通しないことを特徴とする上記装置。 １０、第２の液体培地は第２の液体培地とは異なる組成
   である請求項９記載の装置。