JP2007053972A - 高分子膜を用いた重層化細胞培養物の作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 細胞培養器の中にスペーサーを置き、その上に透明な支持体を載せ、さらにその上にシート状の高分子膜からなる細胞培養担体を置いて、該細胞培養担体の上で第二の細胞を培養して第二の培養細胞層を形成した後に、別の細胞培養器内に形成されている第一の細胞培養層の上に、シート状の高分子膜上に形成されている前記第二の培養細胞層を、該第二の培養細胞層の面が第一の培養細胞層の上面と接触するように重層することを含む、重層化細胞培養物の作製方法。
【選択図】 なし
Description
好ましくは、前記透明な平板は高分子シートである。
好ましくは、前記透明な支持体はガラス板または高分子シートである。
好ましくは、前記シート状の高分子膜はコラーゲンからなる膜である。
好ましくは、前記シート状の高分子膜は多孔質膜である。
好ましくは、第二の培養細胞は血管平滑筋細胞または内皮細胞である。
本明細書において、重層化細胞培養物とは2個以上の細胞層の重層化により得られる培養物をいい、2個以上の細胞層が重層化細胞培養物となったあと、実質的に1個の細胞層を形成しているものも含む。本発明において、重層化される細胞層及び重層化細胞培養物はシート状のものが好ましい。
(1)本発明の方法で作製した重層化細胞培養物を含む培地中に物質を添加する工程、及び
(2)該物質の添加後の該培地中の産生物を分析する工程、
を含む。ここで、培地としてはD-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地Waymouth MB752/1培地、William's E培地等の培地を使用できる。分析としては、代謝産物の同定、定量等が挙げられ、具体的には、出発物質から毒性化又は無毒化された代謝産生物の同定、定量などが挙げられる。重層化細胞培養物を含む培地中の産生物を分析することにより、種々の動物の肝臓での代謝のパターンを短期間で判断することができる。
12穴マイクロプレート(FALCON社製、No.3505)に滅菌済みステンレス製のスペーサーを敷き[図1の1)]、その上に18mm径カバーガラス(MATSUNAMI製)を敷く[図1の2)]。この中にリン酸緩衝液(PBS)(GIBCO製,No.20012-027)を2mL添加する[図1の3)]。この上から直径18mmの円形にカットした膜厚約30umのコラーゲン膜を載せ浮遊させる[図1の4)]。37℃、5%CO2条件下にて18時間静置した後、コラーゲン膜をピンセット等で完全に浸漬させる[図1の5)]。次に、ピペット等でPBSを除去する。さらに、10%FBSを含む10%FBS ダルベッコMEM培地(GIBCO社製)を2mL添加し、重層細胞用プレートを作製した。
組織培養の技術〔第二版〕 日本組織培養学会編 朝倉書店 P135に記載の方法により採取したラット初代肝細胞を12穴マイクロプレート(FALCON社製、No.3505)に50000個/well播種し37℃、5%CO2条件下にて24時間培養(培地は10%FBSおよび0.5%マトリゲルを含むWilliam’s E培地 GIBCO社製)した。同じく例1で作製した培養細胞用12穴マイクロプレートにラット血管平滑筋細胞A-10(大日本製薬社製)を100000個/well播種し[図1の6)]、37℃、5%CO2条件下にて72時間培養(培地は10%FBS ダルベッコMEM培地 GIBCO社製を使用)して、ラット初代肝細胞層とラット血管平滑筋細胞層[図1の7)]を作製した。
血管平滑筋細胞を含むコラーゲン膜とカバーガラスをいっしょにピンセットで取出し[図1の8)]、上下を反転させる[図1の9)]。肝細胞の入ったウェル上で血管平滑筋細胞が下面になるようにして、カバーガラスを引き抜き[図1の10)]、コラーゲン膜をウェルの培地に浮かべる[図1の11)]。培地をピペットで少しずつ吸い取り、ウェル内の培地をすべて除去することにより、血管平滑筋細胞を含むコラーゲン膜と肝細胞を接着させる[図1の12)]。培地を除去した状態で、37℃、5%CO2条件下にて5分間静置し2種の細胞を完全に接着させる。その後、12ウェルプレートを37℃、5%CO2条件下にて18時間培養し、上述の肝細胞培養用培地を各ウェルあたり100μLずつ静かに添加[図1の13)]した後、37℃、5%CO2条件下にて18時間培養して2種の細胞を重層化する。
12ウェルプレートの培地を毎日除去し、新鮮な上述の肝細胞培養用培地を1mL添加[図1の14)]して37℃、5%CO2条件下にて培養を続ける。
ELISA(レビス アルブミンELISAキット ラット用)を用いてアルブミン量を経時測定した。結果を図2に示す。図2から分かるように、重層化細胞培養物に含まれるラット初代肝細胞は24日間以上P-450活性を80%以上維持した。それに対し、単層培養した初代肝細胞(作製手順の具体的な説明)では、7日間未満でP-450活性は80%以下に低下した。
Claims (10)
- 細胞培養器の中にスペーサーを置き、その上に透明な支持体を載せ、さらにその上にシート状の高分子膜からなる細胞培養担体を置いて、該細胞培養担体の上で第二の細胞を培養して第二の培養細胞層を形成した後に、別の細胞培養器内に形成されている第一の細胞培養層の上に、シート状の高分子膜上に形成されている前記第二の培養細胞層を、該第二の培養細胞層の面が第一の培養細胞層の上面と接触するように重層することを含む、重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記スペーサーが透明な平板または金属類の冶具である、請求項1に記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記透明な平板が高分子シートである、請求項2に記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記透明な支持体がガラス板または高分子シートである、請求項1から3の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記シート状の高分子膜が、細胞外マトリクス成分からなる膜、ポリエチレンテレフタレートからなる膜、又はポリエチレンテレフタレート上に細胞外マトリクスをコートして得られる膜である、請求項1から4の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記シート状の高分子膜がコラーゲンからなる膜である、請求項1から5の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 前記シート状の高分子膜が多孔質膜である、請求項1から6の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 培養液中で培養されている第一の培養細胞層を含む容器の該培養液の上面に、シート状の高分子膜上に形成されている第二の培養細胞層を、該第二の培養細胞層の面が第一の細胞層の上面と接触できるように第二の培養細胞層を下側かつ高分子膜を上側となるように置き、次いで、容器内の培養液を除去して、第二の培養細胞層を第一の培養細胞層に接触させて第一の培養細胞層と第二の培養細胞層とを積層する、請求項1から7の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 第一の培養細胞が肝細胞である、請求項1から8の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
- 第二の培養細胞が血管平滑筋細胞または内皮細胞である、請求項1から9の何れかに記載の重層化細胞培養物の作製方法。
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