JP2019129775A - 人工肝組織及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、
前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群と、
を含む、人工肝組織。
[2] 前記シート状細胞群が、細胞シートである、[1]に記載の人工肝組織。
[3] 前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、[2]に記載の人工肝組織。
[4] 前記間質細胞が、線維芽細胞である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の人工肝組織。
[5] 前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の人工肝組織。
[6] 薬剤代謝の評価に用いるための、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の人工肝組織。
(i)培養基材上にコラーゲン床を形成する工程、
(ii)前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
(iii)前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程、
を含む、方法。
[8] 前記シート状細胞群が、細胞シートである、[7]に記載の方法。
[9] 前記細胞シートが、刺激応答性培養基材上で培養された細胞群を、刺激を与えることで剥離させることで得られた細胞シートである、[8]に記載の方法。
[10] 前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、[8]又は[9]に記載の方法。
[11] 前記間質細胞が、線維芽細胞である、[7]〜[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、[7]〜[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13]人工肝組織が、薬剤代謝の評価に用いるための人工肝組織である、[7]〜[12]のいずれか1項に記載の方法。
(i)培養基材上に細胞接着性ハイドロゲル床を形成する工程、
(ii)前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
(iii)前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程。
各実施例では、以下の材料を用いた。
・φ35mm培養皿(BD Falcon、#353001)
・コラーゲンIコート6ウェルプレート(サーモフィッシャー)
・コラーゲンゲル溶液(0.5%タイプIコラーゲン溶液)(KOKEN社、IAC−50)
・温度応答性培養皿(セルシード(日本)、UpCell(登録商標)、φ35mm)
・凍結ヒト肝細胞(サーモフィッシャー、HMCPTS)
・マウス線維芽細胞(3T3)
・ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)
・ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(シグマアルドリッチ、D6429;コーニング、10−017−CVR)
・フィブリノーゲン(シグマ、F8630)
・トロンビン(シグマ、F4648)
・(比較例用)Cell−able(商標)96ウェルプレート(東洋合成工業、日本)
2−1.人工肝組織の製造方法
図1は、一実施態様における本発明の人工肝組織の製造方法を示す概略図である。また、図2は、一実施態様における本発明の人工肝組織の製造方法のスケジュールを示す。
(1)細胞シートを積層する3〜5日前にマウス線維芽細胞(3T3)又はヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)(1×106個)をφ35mmの温度応答性培養皿に播種し、37℃、5%CO2雰囲気下において、ダルベッコ改変イーグル培地(10%(v/v)のウシ胎児血清、1%(v/v)のペニシリン‐ストレプトマイシン溶液を含む)中で培養した。
(2)φ35mmの培養皿内に内径18mmの円形のシリコーン枠を設置し、その枠内に100μLのコラーゲンゲルを加え、直径約18mmのコラーゲンゲル床(厚さ:約400μm)を作製した。
(3)細胞シートを積層する1日前に解凍した凍結ヒト肝細胞(20×104個又は10×104個)をコラーゲンゲル床に播種し、播種用培地(William’s培地E(サーモフィッシャー、A1217601)にHeptocyte Plating Supplements(サーモフィッシャー、CM3000)を加えたもの)を加えて、24時間、37℃、5%CO2雰囲気下において培養した。
(4−1)マウス線維芽細胞(3T3)又はヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を培養している温度応答性培養皿を20℃まで温度を下げ、マウス線維芽細胞(3T3)又はヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)を細胞シート(以下、それぞれ「3T3細胞シート」又は「NHDF細胞シート」という。)として剥離した。
(5−1)3T3細胞シート又はNHDF細胞シートを培地ごとピペットで吸い取り、コラーゲンゲル床に播種された肝細胞上(事前に播種用培地は除去されている)に、3T3細胞シート又はNHDF細胞シートを排出することで積層した。その後、培養用培地(March et al.(2015),Nat.Protocols,10:2027−2053.に記載のHepatocyte medium)を加えて、37℃、5%CO2雰囲気下において培養した。
(6)2〜3日毎に、新鮮な培養用培地に交換した。
(5−2)コラーゲンゲル床に播種された肝細胞上(事前に播種用培地は除去されている)にフィブリノーゲン2μLを滴下した。その後、NHDF細胞シートが接着したゼラチンゲルをスタンプデバイスから切り出し、肝細胞と接する面にトロンビン2μLを滴下し、肝細胞上に載せた。5分間静置後、37℃にて10分間インキュベートした。ゼラチンが溶けた後、温めたPBSで溶けたゼラチンを洗い流した。その後、培養用培地に交換し、37℃、5%CO2雰囲気下において培養した。
上記で作製した人工肝組織において、2日後、5日後、7日後、14日後及び21日後において、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4の活性を測定した。具体的には、肝組織にCYPの基質3種(100μM フェナセチン、200μM ブプロピオンおよび50μM ミダゾラム)を溶解したWilliam’s培地Eを添加し、10分後および30分後に培地を取得した。取得培地中の各基質に対応する代謝成分(アセトアミノフェン、OH−ブプロピオン、OH−ミダゾラム)の濃度を液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS/MS)にて定量し、各CYPの活性値を求めた。10分後および、30分後に取得した培地の内、高い活性値を示した方のデータを採用した。
上記で作製した人工肝組織において、尿素合成量を測定した(図8)。具体的には、以下の人工肝組織において、6日目〜21日目に、培地上清中に含まれる尿素合成量を測定した。
・L20:20×104個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、NHDF細胞シート(1×106個)を積層した系;
・C20:20×104個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、NHDF細胞シートを積層していない系;
・L10:10×104個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、NHDF細胞シート(1×106個)を積層した系
・C10:10×104個のヒト肝細胞をコラーゲンゲル床上に播種し、NHDFシートを積層していない系
・FBS20:20×104個のヒト肝細胞を、FBS(ウシ胎児血清)をプレコートした培養皿上に播種した系(コントロール)
図3は、コラーゲンコートプレート上に播種した肝細胞(コラーゲンコート培養)と細胞シート積層人工肝組織(細胞シート積層肝モデル)の、フェナセチン代謝(CYP1A2)及びミダゾラム代謝(CYP3A4)におけるCYP酵素活性を示す図である。点線は、懸濁培養系の肝細胞の活性値(Day0)を示している。図からも明らかであるように、本発明の人工肝組織は、長期間にわたって、コラーゲンコートプレート上で培養した肝細胞よりも、CYP活性が維持されている。また、その値は、従来行われている濁培養系(Day0)のCYP活性(CYP1A2:93.2pmol/min/106cell、CYP3A4:217pmol/min/106cell)を超える値を示した。
図4〜6は、コラーゲンコートプレート上に播種した肝細胞(コラーゲンコート培養);コラーゲンゲル床に播種した肝細胞(コラーゲンゲルのみ);コラーゲンゲル床に播種した肝細胞上に3T3細胞シートを被覆した人工肝組織(3T3シート積層);コラーゲンゲル床に播種した肝細胞上にNHDF細胞シートを被覆した人工肝組織(NHDFシート積層);及びコラーゲンゲル床に播種した肝細胞上に3T3細胞を播種した人工肝組織(3T3播種)の、フェナセチン(図4、CYP1A2)、ブプロピオン(図5、CYP2B6)又はミダゾラム代謝(図6、CYP3A4)におけるCYP酵素活性を示す図である。
図7は、本発明によって得られる人工肝組織(細胞シート積層系)と、市販されている人工肝組織作製キット(Cell−able(登録商標))(東洋合成工業、日本)(比較例)のCYP酵素活性を比較した結果を示す。Cell−able(登録商標)は、付属の説明書に従って人工肝組織を調製した。3種の基質(フェナセチン、ブプロピオン、およびミダゾラム)を溶解した培地を添加し、10分または30分後に取得した培地中の各基質に対応する代謝成分(それぞれ、アセトアミノフェン、OH−ブプロピオン、OH−ミダゾラム)の濃度をLC/MS/MS法にて定量し、求めた各CYP酵素活性を示す。
図8は、肝細胞の細胞数の違いと、細胞シートの有無による、尿素合成量(μg/106個の肝細胞/日)の経時変化を示すグラフである。図8の結果より、20万個の細胞を播種した方が10万個播種した場合よりも、肝機能の指標となる尿素合成量が大きくなり、持続時間も長くなることが明らかとなった。
Claims (13)
- 細胞接着性ハイドロゲル床と、
前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に播種された肝細胞と、
前記肝細胞を被覆する、間質細胞を含むシート状細胞群と、
を含む、人工肝組織。 - 前記シート状細胞群が、細胞シートである、請求項1に記載の人工肝組織。
- 前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、請求項2に記載の人工肝組織。
- 前記間質細胞が、線維芽細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の人工肝組織。
- 前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の人工肝組織。
- 薬剤代謝の評価に用いるための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の人工肝組織。
- 人工肝組織の製造方法であって、
(i)培養基材上に細胞接着性ハイドロゲル床を形成する工程、
(ii)前記細胞接着性ハイドロゲル床の上に、肝細胞を播種して、培養する工程、
(iii)前記肝細胞の上に、間質細胞を含むシート状細胞群を載せ、培養する工程、
を含む、方法。 - 前記シート状細胞群が、細胞シートである、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞シートが、刺激応答性培養基材上で培養された細胞群を、刺激を与えることで剥離させることで得られた細胞シートである、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞シートが、収縮した細胞シートである、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記間質細胞が、線維芽細胞である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞接着性ハイドロゲル床が、コラーゲンゲル床である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 人工肝組織が、薬剤代謝の評価に用いるための人工肝組織である、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
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