NO883966L - Poroes uorganisk membranbaerer, samt fremstilling derav. - Google Patents

Description

PORØS. UORGANISK MEMBRANBÆRER. SAMT FREMSTILLING DERAV.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av porøse, uorganiske membranbærere før vekst av animalske- og plante-celler. Enkelte celler, såsom fibroblaster og transformerte celler, er relativt lette å dyrke. De fester og formerer seg på forskjellige faste overflater (f.eks. plast- og glassmaterialer) og kan til og med vokse i suspensjon. Imidlerid er andre pattedyrceller såsom differensierte celler avledet fra epitelvev, forankringsavhengige og vanskelige å dyrke. (Differensierte celler er slike som har spesielle funksjonelle særtrekk. De fleste celler i fler-cellede organismer er differensierte, såsom blodceller, nerveceller og muskelceller hos pattedyr). Videre behøver epitelceller, når de dyrkes på impermeable overflater, ikke utvikle differensierte særtrekk.

Imidlertid har det blitt observert at når epitelceller dyrkes på permeable bærematerialer, kan de utvikle differ-ensiering. Dette kan skyldes det faktum at permeable bærere gjør det mulig for cellen å motta næringsstoffer gjennom både øvre og nedre overflater.

Anvendelsen av membraner i vevsdyrkning for støtte til keratinocytter har blitt beskrevet av F.L.Vaughan, R.H.Gray og I.A.Bernstein (In Vitro Cellular and Developmental Biology, 22, side 141-149, 1986). Forfatterne overvåket festingen, formeringen og differensieringen av primære kulturer av keratinocytter etter utsåing og inkubering på forskjellige syntetiske organiske membraner. Forsøk på å erholde tilfredsstillende festing på de to membraner lyktes ikke. Membraner spesielt fremstilt for vevsdyrknings-prosedyrer understøttet festing og formering lik eller bedre enn dyrkningsbegrene av plast brukt som kontroller. Ingen av de tre gjennomsiktige membraner som ble utprøvet, støttet festing eller formering så godt som plastbegrene benyttet som kontroller. Noe forbedrede resultater ble erholdt ved å belegge membranene med fibronektin på forhånd. I et aspekt av foreliggende oppfinnelse fremskaffes et porøst, uorganisk membranstøttemateriale som bærer voksende celler eller som opprettholdes derpå. I et annet aspekt av oppfinnelsen fremskaffes en fremgangsmåte for dyrkning eller opprettholdelse av celler ved å påføre en cellekultur på en en porøs, uorganisk membranbærer og holde cellene under

betingelser for å fremskaffe vekst på bæreren.

Fordeler ved å bruke uorganiske membranbærere er at de generelt er inerte og ikke-toksiske for cellene, og de kan generelt bli varmet eller sterilisert på annen måte uten å skades. Membranbærerne kan dannes av forskjellige materialer, innebefattende metalloksyder såsom zirkoniumoksyd og, mer spesielt, aluminiumoksyd. Porøse, uorganiske membraner av denne type er beskrevet i litteraturen. F.eks. kan aluminium og andre metalloksyder bli dannet ved en sol-gel teknikk som beskrevet av A.F.M. Leenaars et al. i the Journal of Material Science, 19 (1984), 1077-1088, eller ved en båndstøpningsteknikk som beskrevet av R.E.Mistler et al. på side 411-448 i boken "Ceramics Processing Before Firing", redigert av G.Y.Onoda et al., Wiley, N.Y., 1978. Porøse membraner kan bli laget ved metodene beskrevet i EPA 224443 og 224444. Fortrinnsvis anvendes en anodisk aluminiumoksyd-membran.

Når et aluminiumsubstrat anodiseres i visse elektrolytter, f.eks. fortynnet svovelsyre, dannes en porøs, anodisk film på overflaten av dette, og som består i hovedsak av amorf aluminium. Porene strekker seg fra ytre overflate av filmen til nær metall/oksyd-skillet. Inntil metall/oksyd-skillet ligger et tynt koherent lag av anodisk oksyd (barriereoksyd-laget). Den anodiske oksydmembran kan separeres fra metall-substratet på hvilket det ble dannet ved flere teknikker, hvorav alle gir opphav til symmetriske membraner med i hovedsak sylindriske porer som strekker seg fra en overflate til den andre og som er av generelt uniform diameter gjennom hele sin lengde.

EPA 178.831 beskriver hvordan porøse membraner kan dannes ved å separere vanlige anodiske aluminiumoksyd-membraner fra sitt metallsubstrat ved en sakte spenningsreduksjonsteknikk beregnet til å uttynne barrierelaget og endelig oppløse alt det gjenværende barrierelag ved metall/oksyd-skillet. De resulterende asymetriske anodiske aluminiumoksyd-membraner har porer som strekker seg fra en overflate av membranen til den andre, innbefattende et system av større porer som strekker seg inn fra en flate og som binder sammen et system av mindre porer som strekker seg fra den andre flate.

Strippede porøse aluminiumoksyd-filmer av enten symmetrisk eller asymmetrisk type, er spesielt egnet som vevsdyrknings-bærer på grunn av de følgende egenskaper:

de er svært porøse,

de er generelt gjennomsiktige, noe som tillater mikro

skopisk observasjon av celler in situ,

de er glatte,

de er stive og tillater følgelig fysisk overføring av

fullstendige monolag av celler,

de er ikke-toksiske,

de angripes ikke lett av organiske kjemikalier, noe som

kan være viktig for behandling av celler for observasjon,

de er steriliserbare, f.eks. ved autoklavering eller ved

UV- eller gammastråling.

Den lave porøsiteten av enkelte organiske membraner som er kommersielt tilgjengelige for vevsdyrkningsformål, kan under enkelte betingelser begrense cellevekst. Dette problem oppstår ikke med anodiske aluminiumoksyd-membraner som kan lages til å være svært porøse. Porestørrelse i slike membraner kan lett kontrolleres ved kontroll av de anodi-serende betingelser. Generelt bør porene være små nok til å støtte voksende celler slik at cellene sitter på overflaten av membranen. I enkelte tilfeller må porene være store nok til å tillate passasje av næringsmidler til cellene, innbe fattende proteiner opp til 150 kDa. Generelt synes ikke anodiseringsbetingelser og elektrolytter å være kritiske. Det er dyrket celler med like stort hell på membraner med porer på 0,2 um og 0,02 pm i diameter, dannet ved anodisering i fosforsyre og blandede elektrolytter. Membrantykkelse er heller ikke kritisk, selv om tykkere membraner har fordelen med forbedret rigiditet, mens tynnere membraner kan ha bedre lysgjennomgangs-egenskaper. Membranene kan være flate eller kan være profilerte, f.eks. som beskrevet i Europeisk Patent 87.3 03.33 6.

Selv om naturen til cellene som dyrkes på støttemembranene ikke er kritisk, er oppfinnelsen spesielt opptatt av dyrking av pattedyrceller. Oppfinnelsen er ventet å være spesielt anvendelig for dyrkning av forankringsavhengige celler, dvs. celler som ikke vil vokse eller vil tape sine differensierte særtrekk, i suspensjon. Foreliggende oppfinnelse kan anvendes på transformerte og, mer spesielt, differensierte celler. Eksempler på cellelinjer er gitt i den forsøks-messige delen nedenfor. Oppfinnelsen er av spesiell verdi for dyrkning og opprettholdelse av vanskeligdyrkede celletyper såsom rottehetpatocytter. Humane bukspyttkjertel "islets" har blitt opprettholdt på en porøs anodisk aluminiumoksyd membranbærer.

Betingelser for cellevekst er ikke kritiske, og kan være slike som blir brukt konvensjonelt. I eksempel 2 nedenfor er det angitt observasjonen at en spesiell cellelinje ble funnet å vokse på en anodisk aluminiumoksyd-membran i et medium inneholdende kun 2,5% føtalt kalveserum, hvor slike celler ikke ville vokse på en vanlig plastbærer ved denne serumkonsentrasjon. Denne isolerte observasjon kan være en indikasjon på at bruken av porøse uorganiske membranbærere ifølge oppfinnelsen kan tillate cellevekst å finne sted ved nærvær av lavere serumkonsentrasjoner.

Det er funnet at pattedyrceller fester seg lett til de porøse uorganiske membranbærere som anvendes ifølge oppfinnelsen. Dette kunne ikke bli forutsagt. F.eks. er det kjent at pattedyrceller kun vil feste seg til glass-bærere dersom de har blitt grundig renset på forhånd. Det er vanlig praksis å på forhånd belegge porøse bærere for å forbedre celleadhesjon, f.eks. ved å bruke kollagen, laminin eller fibronektin. Imidlertid er for-belegging på denne måten ikke bare slitsom, men danner også problemer når celler etterfølgende blir farget for mikroskopisk observasjon. F.eks. innvirker kollagenbelegg på kollagen fargeprosedyrer. Faktisk gir enkelte organiske vevskultur-bærere opphav til fargeproblemer selv når de er ubelagte.

Det har blitt funnet at de porøse uorganiske membranbærere anvendt i denne oppfinnelsen generelt gir gode adhesjons-egenskaper for celler, uten behov for for-belegning. Imidlertid kan, om ønsket, bærerne være for-belagt, f.eks. med materialene nevnt ovenfor. Bæreren kan også ha et adherent monolag av celler som i seg selv virker som en bærer for ytterligere celler av forskjellig opprinnelse. Alternativt kan monolaget av celler fjernes for å etterlate kun en baso-lateral membran på den uorganiske bærer, til hvilken cellene av forskjellig opprinnelse kan tilføres.

En stor fordel ved å bruke en gjennomsiktig membranbærer er at voksende celler kan observeres in situ ved fasekontrast eller vanlig transmisjons lysmikroskopi. For å opprettholde sterilitet mens cellene neddykkes i flytende dyrkningsmedium, observeres cellene undenfra gjennom membranbæreren med belysning fremskaffet ovenfra. Celler kan fremstilles for lysmikroskopi eller for scanning elektronmikroskopi (SEM) ved standard teknikker. Uvanlig gode bilder kan erholdes ved SEM ved å bruke disse bærere. En fremgangsmåte for å fiksere og farge celler for lysmikroskopi er angitt nedenfor.

For å utføre oppfinnelsen kan et stykke av membranbæreren plasseres i et standard vevsdyrkningsbeger og en suspensjon av celler i vekstmedium kan påføres den øvre overflate. Dyrkningsbegeret er lukket, og inkuberes under egnede betingelser. Dersom dette arrangement ikke gir tilstrekke-lig tilgang for dyrkningsmediet gjennom den porøse membranbærer til de voksende celler, kan problemet løses ved å støtte cellene noe over bunnen av vevsdyrkningsbegeret. Dette oppnås best ved å feste membranskiven til en ende av en kort lengde plastrør for å danne en sylinder med åpen topp, hvis diameter er vesentlig større enn lengden. Denne sylinder er utstyrt med føtter som omgir skiven av støtte-membran, og er heretter betegnet som dyrkningsinnsats. Denne omfatter et kort rør hvis diameter typisk er større enn sin egen lengde, samt en skive av en porøs uorganisk membran såsom en porøs anodisk aluminiumoksydmembran, hvor skiven er forseglet rundt kanten til røret tilstøtende en ende derav, og levende celler holdes på (dvs. festet til) membranen inne i røret.

Det kan være fordelaktig å anbringe forskjellige medier på hver side av nedre og øvre overflater av den porøse membranbærer. F.eks. kan dyrkningsmediet inntil nedre overflate inneholde næringsstoffene som er nødvendige for cellevekst og som kan nå de voksende cellene ved å passere gjennom porene av membranbæreren. Cellene kan danne metabolitter med stor molekylvekt, kanskje for store til lett å diffun-dere gjennom de trange porene i støttemembranen. Det flytende medium inntil øvre overflate av støttemembranen kan inneholde disse metabolitter og således være av forskjellig sammensetning enn den som ligger inntil nedre overflate. Dette trekk kan være anvendelig for å bestemme viabiliteten eller egenskapene til de voksende celler.

Det skal henvises til de medfølgende tegninger, hvor:

Figur 1 er et sett diagrammer som viser foreslått bruk av porøse uorganiske membraner som bærere for forankringsavhengige celler. Figur 2 er et sidesnitt av en kulturinnsats i en brønn av en

vevsdyrkningsplate.

Figur la viser en membranbærer 10 som har et monolag 12 av epitelceller innebefattende en basolateral membran 14 og en luminal membran 16. Figur lb viser dette fullstendige oppsett som virker som bærer for et ytterligere cellelag 18 av forskjellig opprinnelse, såsom sebacytter. Figur lc viser en sammensetning hvor epitelcellene har blitt avlivet for å etterlate en underliggende mambran 20 til hvilken sebacyttcellene 18 har festet seg.

Under referanse til figur 2, omfatter en kulturinnsats i hovedsak en lengde av et generelt sylindrisk plastrør 30 hvis diameter er større enn dets lengde, en porøs uorganisk membranskive 32 forseglet innvendig rundt periferien av plastrøret ved sin nedre ende, hvor røret er nedsunket for å motta membranen, samt føtter 3 3 for å heve membranen fra underlaget. En dyrkningsplate omfatter et underlag 34, vegger 3 6 som adskiller de enkelte brønner hvorav en er vist, samt et platelokk 38. Brønnen har blitt delvis fylt med dyrkningsmedium 40. Kulturinnsatsen har blitt plassert i brønnen slik at mediet 40 står i kontakt med nedre overflate av membranen alene. Et annet medium 4 2 av samme eller forskjellig sammensetning, har blitt plassert i kulturinnsatsen. Et monolag av celler 44 er festet til øvre overflate av membranen og står i kontakt via porene i membranen med dyrkningsmediet 40.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1

Tre celletyper ble brukt.

Madin Darby gnagernyre (MDCK)

Muse-embryo fibroblast (3T3)

Bovin Korneal Endotelial (BCE) primær

Mediesammensetningen for BCE-celler var:

William E basalmedium (uten glutamin) 100 ml

Insulin 10 pg/ml

Transferrin 10 pg/ml

Penicillin/Streptomycin

Fungizone

- Hydrocortison (10 ng/100 ml)

Glutamin

- Epitelial vekstfaktor (10 ng/ml)

Sporelementer

Føtalt kalveserum 10 %

For MDCK og 3T3-celler var mediesammensetningen den samme med unntak av transferrin, hydrocortison og epitelial vekstfaktor.

Den anvendte anodiske oksydmembran var en blandet fosfor- og oksalsyretype, med både 0,2 pm og 0,02 pm porestørrelse (betegnet hhv. 0,2 ME og 0,02 ME i tabellene nedenfor).

Cellene ble rutinemessig sådd ut på 11 mm skiver i 24 brønner på vevskultur-brett med en tetthet på IO<4>celler/ml (1 ml pr. brønn). Som kontroller ble celler sådd ut med samme tetthet i brønner uten membran.

Levedyktigheten til celler som hadde blitt dyrket på plast eller membran ble bestemt ved trypsinisering, tryphan-blått farging og telling av fargede og ufargede celler. Resultatene er vist i tabell 1.

Dette viser at det ikke er noen signifikant forskjell i levedyktighet for alle tre celletyper etter enzymologisk frigjøring fra det undersøkte substrat. Dette indikerer at membranen kan behandles som et plastsubstrat ved subdyrkning.

Graden og effektiviteten av celleforankring på "Anopore" eller plast ble bestemt etter utsåing av IO<4>celler/brønn.

Tabell 2 viser at alle tre celletyper slår seg ned like godt på både plast og 0,02 pm membran. Imidlertid viser celler dyrket på 0,2 pm membran en signifikant redusert forank-ringseffektivitet av både MDCK og BCE. Dette viser følgelig at 0,02 pm ME membranen har en større kapasitet for celleforankring enn plast. Imidlertid har 0,2 pm ME mindre.

Celler ble dyrket på plast og både 0,2 pm og 0,02 pm ME membraner i 7-10 dager, og derpå subdyrket på sine respek-tive substrater ved et høyt inokulum. Cellene innhøstet fra supernatanten etter 4 og 8 timer ble så talt, og utsåings-effektiviteten regnet ut som 100x (totalt antall celler minus celler i supernatanten)/totalt celleantall. Forankringseffektiviteten ble også bestemt. 1 ml av cellesuspensjonen (2-50 celler/ml) ble plassert i tomme brønner i et 24 brønners brett samt brønner inneholdende membranskiver. Forankringseffektiviteten regnes ut fra antall kolonier i 16 brønner eller mer som viser vekst etter 5 dager.

antall dannede kolonier x 100 = forankringseffekt antall utsådde celler

Tabell 3 viser at forankringseffektiviteten av celler dyrket på plast og både 0,2 pm og 0,02 pm membraner kan sammen-lignes gunstig. Faktisk forankrer celler dyrket på 0,02 pm membraner seg i signifikant høyere grad enn på plast. Dette viser følgelig at anodiske oksydmembraner fremmer cellevekst like effektivt som plast.

Observasjoner viste at konfluens på anodiske oksydmembraner generelt oppnås ved 10-14 dager, og dette stemte også godt overens med plast.

Elektronmikroskopiske undersøkelser av BCE-celler viste at de var klart polariserte og inneholder "tight junctions".

Eksempel 2.

De følgende cellelinjer ble dyrket:

Madin Darby gnagernyre (MDCK) - forankringsavhengig.

Bovin Korneal Endotelial (BCE) - forankringsavhengig.

Muse plasmacytom (X63-AG8-6SS) - ikke forankringsavhengig. Muse hybridom PF - ikke forankringsavhengig.

Muse hybridom 3C3 - ikke forankringsavhengig.

Porøse anodiske aluminiumoksydmembraner ble sterilisert ved autoklavering, neddykking i absolutt etanol eller ved UV-bestråling. Alternativt ble dyrkningsinnsatser (åpne flasker inneholdende et kort stykke plastrør lukket ved bunnen med en membranskive) anskaffet presterilisert ved gammabestråling.

Sterile flatarks-membraner eller dyrkningsinnsatser ble plassert i 24-brønners eller 6-brønners vevskulturplater før utsåing med en cellesuspensjon.

For å subdyrke celler ble monolag av MDCK eller BCE-celler strippet i sterilt bufret EDTA inneholdende trypsin (52 pg/ml). Muse plasmacytom og hybridom cellelinjer kunne bli fjernet ved enkel risting av dyrkningsflasken eller ved pipettering. Celler ble inkubert ved 37°oC og 5 % C02/95 % luft. Medium brukt for alle cellelinjer inneholdt:

- Dulbecco's minimalt essensielt medium (DMEM)

- 10 % føtalt kalveserum (FCS)

- 4 mg/l gentamycinsulfat.

Alle celletyper ble funnet å vokse godt både på flatark-membran og dyrkningsinnsatser. Celle monolag ble gjort synlige ved vanlig lysmikroskopi (både ufarget og etter farging) og ved SEM. Fremgangsmåter for farging av celler for lysmikroskopering (se nedenfor) og for preparering for SEM ble utviklet.

BCE celler ble funnet å vokse på innsatsanordningene med 2,5 % føtalt kalveserum. Disse celler vil ikke vokse på plast-

bærere ved denne serumkonsentrasjonen.

Eksempel 3.

De følgende cellelinjer ble dyrket:

Bovin corneal endotelialceller (BCE).

Unghamsternyre (BHK).

Primære rottehjerneceller.

Vekstmedium benyttet for BCE og BHK var Glasgow modifisering av Eagles medium. For rottehjerneceller var vekstmediet DMEM. 10 % føtalt kalveserum ble benyttet i alle tilfeller. Celler ble båret på dyrkningsinnsatser og kulturene ble inkubert ved 37°C og 5 % C02/95% luft.

Alle celler vokste godt på innsatsanordningene. Immuno-fluorescente fargingsprosedyrer har blitt utviklet for både BHK og primære hjerneceller fra rotte dyrket på denne måten.

Nedenfor følger fremgangsmåter for fiksering og farging av celler på porøse gjennomsiktige uorganiske bæremedier for lysmikroskopi.

Fikseringsmidler som kan benyttes innebefatter paraformaldehyd, formaldehyd, metanol og glutaraldehyd, hvor 2% paraformaldehyd i PBSA er foretrukket. Farginger som kan benyttes innebefatter Weigart's/Van Geeson; Giemsa; Giemsa/ lys grønn; Leishmans; hematoxylin/eosin; hvor Weigart's/Van Geeson (farger kjernene purpur og kollagen lyserødt) er foretrukket. Nedenfor følger en fremgangsmåte for permanent farging av cellekulturer for lysmikroskopi.

Materialer.

1. 2 % paraformaldehyd i PBS, pH 7,3.

2. Weigerfs jern hematoxylin fremstilt som følger:

Oppløsning A 1 gram hematoxylin

100 ml absolutt alkohol

Oppløsning B 4 ml vandig jernklorid (30 %)

1 ml konsentrert HC1

95 ml destillert vann

Filtrer oppløsningene gjennom glassfiberpapir (2X). Bland like volumdeler av oppløsning A og B. Benytt umiddelbart.

3. Van Geeson's farge fremstilt som følger:

100 ml mettet picrinsyre

5 til 10 ml sur fuchsin (1 %)

Filtrer som ovenfor.

4. Etanol (30, 50, 70, 90 og 100 %). 5. "Histo-clear" (fra National Diagnostics, New Jersey,

USA) .

6. DePeX montasje (BDH Chemicals Ltd.).

Fremgangsmåte.

(Utfør fullstendig fargingsprosedyre på intakte vevskultur-innsatser). 1. Fikser våt membran i 2 % paraformaldehyd i pBS (pH 7,3).

1 time til 24 timer ved 37°C.

2. Vask grundig i destillert vann.

3. Farg i ferskt blandet Weigerfs jern hematoxylin i 5 til

10 minutter.

4. Vask grundig i destillert vann.

5. Farg i Van Geeson's farge i opp til 10 minutter.

6. Vask grundig i destillert vann.

7. Tørk i gradert etanol (30, 50, 70, 90 og 100 %) i 2 minutter hver gang.

8. Lufttørk.

9. Dypp i "Histo-Clear".

10. Monter membranen mellom glider og deksel i DePeX montasje.

Eksempel 4.

MDCK-celler ble dyrket i Dulbecco's minimal essensielt medium (DMEM), 10 % føtalt kalveserum og 4 mg/l gentamycinsulfat.

De anvendte anodiske oksydmembraner (0,2 pm og 0,02 pm porestørrelse og 25 mm diameter) ble båret i anordninger (innsatser) som beskrevet ovenfor.

MDCK-celler ble sådd ut ved 2 x IO<4>celler/cm<3>i 25 mm innsatser i brønner i 6 brønners vevskulturbrett eller direkte i brønner. Fullstendig utsåing i brønnene var ca. to ganger det som kreves for innsatsen. Totalvolumet av medium som ble brukt, var i begge tilfeller<3>ml/brønn (når innsatser ble brukt likestilles nivåene mellom indre og ytre kammere).

Vekstkurver ble dannet for celler på plast og oksydmembraner. Celleantall ble beregnet ved å bruke en spektrofoto-metrisk metode beskrevet nedenfor. Medium ble aspirert fra brønnene eller innsatsene og oppbevart (for å telle alle løse celler i suspensjon). 5 ml 0,05 % w/v trypsin i 0,04 % EDTA-oppløsning ble satt til monolagene, etterlatt i 30 sekunder og dekantert fra. Monolagene ble derpå etterlatt i 5-7 minutter ved ved 37°C, og 10 mnl oppløsning A + 10 % føtalt kalveserum ble tilsatt. Celler ble resuspendert ved forsiktig pipettering ved å bruke Ependorf pipette. Cellekonsentrsjoner og levedyktighet ble bestemt ved å bruke Erythrocin B farge-eksklusjon og et forbedret Neubauer-kammer.

En standardkurve for omdannelse av optisk tetthet (OD) mot cellantall fremkommer ved å justere konsentrasjonen av cellesuspensjonen til den ønskede toppstandard (5 x IO<5>celler/ml) med oppløsning A + 10 % FCS, og fremstille en serie doble fortynninger ned til IO<4>celler/ml. Den optiske tetthet av cellesuspensjonene leses derpå av ved 780 nm mot en bindprøve av oppløsning A + 10 % FCS. 5 replikate kulturer på de tre overflatene (0,2 og 0,02 pm membraner samt plast) ble undersøkt ved OD, og denne måling ble omregnet til celleantall. Resultatene er angitt i tabell 4.

Resultatene indikerer at vekst på de anodiske oksydmembraner er raskere enn på plast og at et høyere celleutbytte oppnås. 0,02 pm membraner synes å være bedre enn 0,2 pm membraner.

Eksempel 5.

Parenchymale hepatocytter fra rotte ble isolert enten ved konvensjonell kollagenase perfusjonsteknikk eller ved digitonin/kollagenase-perfusj on.

Hepatocyttene ble dyrket i monolag på anodiske oksydmembraner (25 mm innsatser inneholdende 0,2 pm membraner) og sammenlignet med monolag på vanlige vevskulturskåler (Lux).

To timer etter utsåing ble forankringseffektiviteten bestemt enzymatisk. Mediet ble aspirert fra platene eller innsat-satsene og en porsjon sedimentert (100 g/2 m). En ytterligere porsjon ble sonisert. Laktat-dehydrogenase-aktivitet ble bestemt og forskjellen i aktivitet (total suspensjon - supernatant) brukt som en indeks for ufestede celler.

Prosentdelen av ufestede celler etter 2 timer var lik for membran og skål-kulturene, noe som antyder en lik for-ankringsef f ektivitet.

Etter hepatocyttfesting (4 timer) ble monolagene dyrket i 2 0 - 48 timer og de metabolske effektivitet til hepatocyttene ble funnet ved å overvåke omsetningen av spesielle substrater. Hastigheten av substratomsetningen og produkt-dannelsen ble bestemt. Hastigheten av fettsyreomsetningen til ketonlegemer var lik i monolagene på anodiske oksydmembraner og på kulturskåler (Tabell 5). Hastigheter av mitokondrien pyruvat-omsetning og omdannelse til laktat var imidlertid høyere i monolagene på Anopore membraner (Tabell 6) .

Resultater indikerer derfor at anodiske oksydmembraner vil virke som gode bærere for hepatocyttkulturer og at visse metabolske aktiviteter økes på slike bærere sammenlignet med konvensjonell plast.

Hepatocytt monolag isolert fra hel-lever eller fra den periportale eller perivenøse sone ble dyrket i 2 0 timer med dexamethasone og insulin. Hastigheten for dannelse av ketonlegemer (acetonacetat + 3-hydroksy-butyrat) ble bestemt under en 2 timers inkubering med enten 0,7 5 mM palmitat, 1 mM pyruvat og 0,5 mM L-karnitin eller med 1 mM oktanoat. Verdiene er gjennomsnittlige ± standardavvik for antallet kulturskåler eller membraner vist i parentes.

Hepatocytt monolag ble dyrket i enten 2 0 timer (Eksp. 1 & 2) eller 48 timer (Eksp. 3) i serumfritt medium med 10 nM dexametasone + 10 nM insulin eller med tilsetningen i nærvær av glukagon (100 nM). Pyruvatmetabolisme ble bestemt i løpet av en 2 timers inkubering med 1 mM pyruvat og 0,75 mM palmitat. Hastigheten av mitokondrien pyruvat metabolisme ble bestemt fra minkningen i konsentrasjon av pyruvat som ikke kunne finnes som enten laktat eller alanin. Hastig-hetene er uttrykt som nmol pyruvat metabolisert per time per kultur. Verdiene er gjennomsnittlige ± standardavvik for antallet kulturskåler eller membraner vist i parantes.

Eksempel 6.

Påvisning av vekst av kinesiske hamster ovarium (CHO) celler på anodiske oksydmembraner sammenlignet med plast.

Fremgangsmåte:

100 CHO celler (bekreftet ved telling med hemocytometer) fra rutinemessig dyrkede kulturer ble brukt for å inokulere hver membran neddykket i laboratorie standard MEM medium tilsatt føtalt kalveserum.

Cellene ble inkubert i fire dager med daglig overvåkning av veksten. Ved 24 timers intervaller ble prøvemembraner og kontrollbrønner trypsinert for å løsne cellene, og celleantall per membran (eller per brønn) beregnet med hemocytometer-telling for å erholde en vurdering av de relative doblingstider for cellene. Alle kulturer ble undersøkt daglig med lysmikroskopi, og mot slutten av vekstperioden ble representative prøver høstet og brukt til å inokulere et ytterligere sett av membraner for å bekrefte at cellene forble friske og i stand til re-etablering etter vekst under forsøksbetingelsene.

For hver observasjon ble 5 prøver tatt fra en stamløsning av paralelle kulturer inokulert ved et enkelt tidspunkt.

Membraner brukt i forsøkene:

(a) Anodisk oksyd 0,02 pm porestørrelse

(b) Anodisk oksyd 0,2 pm porestørrelse

(c) Kontrollkultur dyrket på vanlig laboratorium plast-overflater.

Observasj oner:

CHO synes å feste seg og vokse godt på de anodiske oksydmembraner, og løsning ved subdyrking med trypsin på vanlig måte virket like godt som når celler ble tatt fra vanlige vevsmembraner uten noen abnormale celler påvist; koloni-dannelse syntes også å være uendret. Gjennomsnitt og standardavvik av alle celletellinger ble erholdt. Sta-tistisk analyse vist ingen signifikante forskjeller i veksthastighetene av kulturene av CHO-celler på de forskjellige overflater.

Eksempel 7.

Vekst av MDCK og BCE-celler på anodiske oksydmembraner og preparering for lys- og elektronmikroskopi.

MDCK og BCE-celler ble dyrket på 25 mm diameters membraner som tidligere beskrevet (Eksempel 1).

Det er mulig å observere celler simpelt hen ved å bruke fasekontrast mikroskopi. Det er lite, om noe, tap av bildedefinisjon sammenlignet med det fra plast. I tillegg til de farginger som er oppsummert i eksempel 3, har de følgende farginger også blitt brukt med hell med celler på de anodiske oksydmembraner:

Weigerts/Van Gieson + lys grønn

Wiegerts/Van Gieson + nøytral rød

Celestine blått + Mayers hematoxylin

Heidenhains hemotoxylin + jern alum.

Ved å bruke de ovenfor nevnte farginger er bakgrunnsfargen av membranen i seg selv minimal og visualisering av cellu-lære komponenter er så god som den på plast eller glass. Gjennomsiktigheten av membranen er en ekstremt viktig fordel. Ytterligere immuno-fluorescent farging av BHK og CHO-celler på membranene har blitt utført. Et bilde med høy kontrast med minimal bakgrunnsfluorescens har blitt erholdt.

En passende farget membran kan monteres på et mikroskopglass under et dekkglass ved å bruke standard metoder. Ingen

nedbrytning av preparatet oppstår, annet enn svekkelse av fargingen, noe som er normalt med slike preparater etter en viss tid.

Standard SEM preparat fremgangsmåter har blitt etablert for celler dyrket på anodiske oksydmembraner.

Den uorganiske membran er motstandsdyktig mot organiske kjemikalier brukt i SEM preparat fremgangsmåter, og gjør den følgelig svært nyttig i bruk. Stivheten av membranen gjør den også lettere å håndtere enn organiske polymermembraner brukt for celledyrking. Et redskap har blitt spesielt fremstilt for å løsne membranen fra innsatsanordningen som en intakt sirkulær skive. En slik skive er omtrentlig 22 mm i diameter og vil passe inn i vanlige prøveholdere av rustfritt stål som brukes for preparering av flere prøver (membraner) for elektronmikroskopi.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte ved dyrking og opprettholdelse av celler ved hjelp av en porøs uorganisk bærer, karakterisert ved å påføre en cellekultur på en overflate av en porøs uorganisk membranstøtte og opprettholde cellene under betingelser som gjør at de vokser eller opprettholdes på støtten.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bæreren er av aluminium.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at aluminium-membranen er en anodisk aluminiumoksyd-membran.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at membranstøtten er gj ennomsiktig.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at cellene er pattedyrceller.

6. Porøs, uorganisk membranbærer, karakterisert ved at den bærer celler som vokser eller opprettholdes derpå.

7. Bærer ifølge krav 6, karakterisert ved at den er egnet for fremgangsmåten ifølge kravene 1-5.

8 . Bærer ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at den omfatter et kort rør (30) og en skive (32) av porøs membran, hvor skiven er forseglet rundt sin omkrets til røret hosliggende en side derav, og hvor levende celler kan opprettholdes på membranen inne i røret.

9. Anordning for dyrkning av celler, karakterisert ved at den omfatter en porøs uorganisk membranbærer (32) med en første flate i kontakt med et første flytende medium (40) og en andre flate til hvilken voksende celler (44) fester seg i kontakt med et andre flytende medium (42), hvor det første flytende medium ikke står i forbindelse med det andre flytende medium, bortsett fra via den porøse bærer.

10. Anordning ifølge krav 9, karakterisert ved at det andre flytende medium er av en forskjellig sammensetning enn det første flytende medium.