KR20210095233A - 고-밀도 세포 뱅킹 방법 - Google Patents

고-밀도 세포 뱅킹 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210095233A
KR20210095233A KR1020217023366A KR20217023366A KR20210095233A KR 20210095233 A KR20210095233 A KR 20210095233A KR 1020217023366 A KR1020217023366 A KR 1020217023366A KR 20217023366 A KR20217023366 A KR 20217023366A KR 20210095233 A KR20210095233 A KR 20210095233A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cells
density
culture
bioreactor
Prior art date
Application number
KR1020217023366A
Other languages
English (en)
Inventor
샤오샤 진
하오디 동
클라우디아 부저
Original Assignee
젠자임 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50687645&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20210095233(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 젠자임 코포레이션 filed Critical 젠자임 코포레이션
Publication of KR20210095233A publication Critical patent/KR20210095233A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/16—Hollow fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/22—Means for packing or storing viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명의 개시는 세포의 관류 배양 기술 및 비-원심분리적 농축을 이용한 고-밀도 냉동보존 세포 뱅크의 생성을 위한 방법을 제공한다. 이러한 고-밀도 냉동보존 세포 뱅크를 이용한 생성 방법이 또한 제공된다.

Description

고-밀도 세포 뱅킹 방법{HIGH-DENSITY CELL BANKING METHODS}
관련 출원
본 출원은 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 제61/793,021호에 대한 우선권을 주장한다.
배경
통상적인 세포 뱅킹(cell banking)은 치료적으로 관련된 단백질의 생성을 포함하는 다수의 적용에서 사용하기 위해 해동될 수 있는 특성 규명된 동결 세포의 스톡을 유지시키기 위해 널리 사용된다. 통상적으로, 냉동보존된 스톡은 낮은 밀도로 유지되거나, 저장을 위한 더 높은 밀도의 분취량을 생성시키기 위해 원심분리된다. 더 낮은 밀도의 스톡은 큰 부피의 배양물의 효과적인 접종을 가능케 하지 않는 반면, 원심분리-기반 농축 방법은 세포에 매우 손상을 줄 수 있다(이는 냉동보존 과정 동안 더욱 더 취약해질 것이다). 따라서, 개선된 세포 뱅킹 방법이 필요하다.
개요
본 발명의 개시는 세포 뱅크(bank)의 생성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 세포 뱅킹 방법은 세포 배양물 생성에서 이후에 사용하기 위해 우수한 세포 생활력을 유지하면서 예기치 않게 높은 세포 밀도로 냉동보존을 가능케 하는 세포의 관류 배양 기술 및 비-원심분리적 농축을 이용한다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 세포 잔류 시스템에 커플링된, 단계; b) 상기 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; 및 c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 세포 잔류 시스템은 필터를 포함하는 교대 접선 유동 여과 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터는 적어도 0.3 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.5 내지 약 1.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.7 내지 약 0.8 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 2.0 내지 약 3.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 4 내지 약 5 ㎡의 표면적을 갖는다.
한 구현예에서, 필터는 약 0.2 ㎛의 포어 크기를 갖는다.
한 구현예에서, 농축된 세포 집단은 적어도 약 1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 농축된 세포 집단은 약 1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 냉동보존은 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 냉동보존은 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기에서 농축된 세포 집단의 적어도 일부를 동결시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 바이얼(vial)이다. 한 구현예에서, 용기는 적어도 2㎖의 부피를 갖는다. 한 구현예에서, 용기는 약 5 ㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 4.5 x 10^8개의 세포를 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 크라이오백(cryobag)이다. 또 다른 구현예에서, 크라이오백은 약 5 내지 약 150 ㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도는 적어도 약 0.2 nℓ/세포/일이다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 약 7의 pH 및 적어도 약 40%의 용존 산소 농도를 갖는다.
한 구현예에서, 생물반응기는 가요성 백(bag) 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 10 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 20 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 하나의 딥 튜브(dip tube)를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 60%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 90%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 95%의 해동 후 생활력을 갖는다.
한 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 구현예에서, 포유류 세포는 CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 세포는 트랜스펙션된 세포이다.
한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 교대 접선 유동 여과 시스템에 커플링된 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 가요성 백 생물반응기를 포함하고, 상기 필터가 적어도 0.3 ㎡의 필터 표면적 및 적어도 50 kDa의 MWCO 크기를 갖는 필터를 갖는, 단계; b) 교대 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 약 1 x 10^8 세포/㎖의 밀도를 갖는 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계로서, 상기 냉동보존이 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함하는, 단계를 포함하며; 상기 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 자동화 방법에 의해 제어된다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 비-자동화 방법에 의해 제어된다. 또 다른 구현예에서, pH 및 DO는 하기 중 어느 하나 이상을 통해 제어된다: 배양물로 도입되는 기체 혼합물의 조정, 생물반응기의 로크 속도(rock rate)의 조정, 또는 생물반응기의 로크 각도(rock angle)의 조정.
한 구현예에서, 생물반응기는 8°의 로크 각도와 함께 15 rpm에서 로킹된다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 세포 잔류 시스템에 커플링되는, 단계; b) 상기 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; 및 c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 세포 잔류 시스템은 필터를 포함하는 교대 접선 유동 여과 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터는 적어도 0.3 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.5 내지 약 1.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.7 내지 약 0.8 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 2.0 내지 약 3.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 4 내지 약 5 ㎡의 표면적을 갖는다.
한 구현예에서, 필터는 약 0.2 ㎛의 포어 크기를 갖는다.
한 구현예에서, 농축된 세포 집단은 적어도 약 1.1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 농축된 세포 집단은 약 1.1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 냉동보존은 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 냉동보존은 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기에서 농축된 세포 집단의 적어도 일부를 동결시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 바이얼이다. 한 구현예에서, 용기는 적어도 2㎖의 부피를 갖는다. 한 구현예에서, 용기는 약 5㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 4.5 x 10^8개의 세포를 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 크라이오백이다. 또 다른 구현예에서, 크라이오백은 약 5 내지 약 150 ㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도는 적어도 약 0.2 nℓ/세포/일이다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 약 7의 pH 및 적어도 약 40%의 용존 산소 농도를 갖는다.
한 구현예에서, 생물반응기는 가요성 백 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 10 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 20 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 하나의 딥 튜브를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 60%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 90%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 95%의 해동 후 생활력을 갖는다.
한 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 구현예에서, 포유류 세포는 CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 세포는 트랜스펙션된 세포이다.
한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 교대 접선 유동 여과 시스템에 커플링된 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 가요성 백 생물반응기를 포함하고, 상기 필터가 적어도 0.3 ㎡의 필터 표면적 및 적어도 50 kDa의 MWCO 크기를 갖는 필터를 갖는, 단계; b) 교대 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 약 1.1 x 10^8 세포/㎖의 밀도를 갖는 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계로서, 상기 냉동보존이 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함하는, 단계를 포함하며; 상기 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 자동화 방법에 의해 제어된다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 비-자동화 방법에 의해 제어된다. 또 다른 구현예에서, pH 및 DO는 하기 중 어느 하나 이상을 통해 제어된다: 배양물로 도입되는 기체 혼합물의 조정, 생물반응기의 로크 속도의 조정, 또는 생물반응기의 로크 각도의 조정.
한 구현예에서, 생물반응기는 8°의 로크 각도와 함께 15 rpm에서 로킹된다.
한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 효과적인 혼합 및 기체 교환을 위해 진탕되고, 상기 생물반응기가 세포 잔류 시스템에 커플링되는, 단계; b) 상기 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; 및 c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 세포 잔류 시스템은 필터를 포함하는 교대 접선 유동 여과 시스템을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 필터는 적어도 0.3 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.5 내지 약 1.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 0.7 내지 약 0.8 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 2.0 내지 약 3.0 ㎡의 표면적을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 필터는 약 4 내지 약 5 ㎡의 표면적을 갖는다.
한 구현예에서, 필터는 0.2 ㎛, 0.4 ㎛, 및 0.65 ㎛로 구성된 군으로부터 선택된 포어 크기를 갖는다.
한 구현예에서, 농축된 세포 집단은 1.0 x 10^8 세포/㎖, 1.1 x 10^8 세포/㎖, 1.2 x 10^8 세포/㎖, 1.3 x 10^8 세포/㎖, 1.5 x 10^8 세포/㎖, 1.7 x 10^8 세포/㎖, 및 2.0 x 10^8 세포/㎖로 구성된 군으로부터 선택된 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 냉동보존은 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 냉동보존은 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기에서 농축된 세포 집단의 적어도 일부를 동결시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 바이얼이다. 한 구현예에서, 용기는 적어도 2㎖의 부피를 갖는다. 한 구현예에서, 용기는 약 5㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 4.5 x 10^8개의 세포를 포함한다.
한 구현예에서, 용기는 크라이오백이다. 또 다른 구현예에서, 크라이오백은 약 5 내지 약 150 ㎖의 부피를 갖는다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 1 x 10^8 세포/㎖의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 내의 관류 속도는 약 0.02 nℓ/세포/일 내지 약 0.5 nℓ/세포/일이다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 약 6.8 내지 약 7.2의 pH를 갖는다.
한 구현예에서, 관류 생물반응기 세포 배양물은 적어도 약 30%의 용존 산소 농도를 갖는다.
한 구현예에서, 생물반응기는 가요성 백 생물반응기이다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 10 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 20 ℓ의 부피를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 가요성 백 생물반응기는 적어도 하나의 딥 튜브를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 60%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 90%의 해동 후 생활력을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 고-밀도 동결 세포 뱅크는 적어도 95%의 해동 후 생활력을 갖는다.
한 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 또 다른 구현예에서, 포유류 세포는 CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구현예에서, 세포는 트랜스펙션된 세포이다.
한 양태에서, 본 발명은 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키기 위한 비-원심분리적 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 교대 접선 유동 여과 시스템에 커플링된 관류 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계로서, 상기 생물반응기가 가요성 백 생물반응기를 포함하고, 상기 필터가 적어도 0.3 ㎡의 필터 표면적 및 적어도 50 kDa의 MWCO 크기를 갖는 필터를 갖는, 단계; b) 교대 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 세포를 비-원심분리적으로 농축시켜 약 1.0 x 10^8 세포/㎖ 초과의 밀도를 갖는 농축된 세포 집단을 생성시키는 단계; c) 농축된 세포 집단을 냉동보존시켜 고-밀도 동결 세포 뱅크를 생성시키는 단계로서, 상기 냉동보존이 약 5% 내지 약 10%(부피/부피)의 최종 농도로 DMSO를 농축된 세포 집단에 첨가하는 것을 포함하는, 단계를 포함하며; 상기 고-밀도 동결 세포 뱅크는 약 10^8개의 세포의 세포 밀도를 갖는다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 자동화 방법에 의해 제어된다.
한 구현예에서, 배양물의 pH 및 DO는 비-자동화 방법에 의해 제어된다. 또 다른 구현예에서, pH 및 DO는 하기 중 어느 하나 이상을 통해 제어된다: 배양물로 도입되는 기체 혼합물의 조정, 생물반응기의 로크 속도의 조정, 또는 생물반응기의 로크 각도의 조정.
한 구현예에서, 생물반응기는 적어도 8°의 로크 각도와 함께 적어도 15 rpm의 속도에서 로킹된다.
한 구현예에서, 생물반응기는 8°의 로크 각도와 함께 15 rpm의 속도에서 로킹된다.
한 구현예에서, 생물반응기는 10°의 로크 각도와 함께 22 rpm에서 로킹된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 고밀도 세포 크라이오뱅킹(cryobanking) 과정의 도면이다.
도 2는 다양한 세포 잔류 방법을 이용한 WAVE® 관류 배양의 세포 성장 프로파일을 도시하는 차트이다.
도 3은 성장 동안 다수의 시점에서 수거된 배양물을 이용하여 제조된 미니-뱅크(mini-bank)의 뱅킹 후 성능(살아 있는 세포 밀도(Xv), 생활력)의 도표이다.
도 4는 성장 동안 다수의 시점에서 수거된 배양물을 이용하여 제조된 미니-뱅크의 뱅킹 후 성능(후기 아폽토시스)의 도표이다.
도 5는 자동화된 pH 및 DO 피드백 제어의 이용 및 자동화된 pH 및 DO 피드백 제어의 부재에서의 세포 성장을 나타내는 차트이다.
도 6은 자동화된 pH 및 DO 피드백 제어의 이용 및 자동화된 pH 및 DO 피드백 제어의 부재에서의 pH 및 DO 프로파일을 나타내는 차트이다.
도 7a 및 도 7b는 농축 전, 농축 후, 및 DMSO에 대한 노출 0 내지 120분 후의 다양한 단계에서의 세포의 살아 있는 세포 밀도 (A) 및 후기 아폽토시스 (B)의 차트이다.
도 8a 및 도 8b는 정상 밀도 뱅크에 비한 rCHO 세포주 1 고밀도 뱅크의 뱅킹 후 성능 (A) 및 후기 아폽토시스 (B)의 차트이다.
도 9a 및 도 9b는 정상 밀도 뱅크에 비한 rCHO 세포주 2 고밀도 뱅크의 뱅킹 후 성능 (A) 및 후기 아폽토시스 (B)의 차트이다.
도 10a 및 도 10b는 정상 밀도 뱅크에 비한 rCHO 세포주 3 고밀도 뱅크의 뱅킹 후 성능 (A) 및 후기 아폽토시스 (B)의 차트이다.
도 11은 다양한 세포 잔류 시스템을 이용한 시간 경과에 따른 배양물의 농도를 나타내는 차트이다.
상세한 설명
본 발명의 개시는 비-원심분리적 세포 잔류 장치와 연결된 관류 배양 시스템의 사용을 포함하는 고-밀도 세포 크라이오뱅킹 방법을 제공한다.
I. 정의
본원에서 사용되는 용어 "회분식(batch) 배양"은 일정량의 새로운 배양 배지에 대수 성장기로 신속하게 진입하는 세포가 접종되고, 배양 성장 배지가 연속적으로 제거되지 않고, 새로운 배지로 대체되는 세포 배양 기술을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "유가식(fed batch) 배양"은 일정량의 새로운 배양 배지에 세포가 먼저 접종되고, 배양 종료 전에 주기적 세포 및/또는 생성물 수거와 함께 또는 주기적 세포 및/또는 생성물 수거 없이 배양 과정 동안 배양물에 추가 배양 영양소가 공급(연속적 또는 불연속 증가액)되는 세포 배양 기술을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "관류 배양"은 일정량의 새로운 배지에 대수 성장기로 신속히 진입하는 세포가 접종되고(상기와 같음), 성장 배지가 연속적으로 배양물로부터 제거되고, 새로운 배지로 대체되는 세포 배양 기술을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "생물반응기"는 세포를 배양하기 위한 용기를 나타낸다.
한 구현예에서, 생물반응기는 "가요성 백 생물반응기"이다. "가요성 백 생물반응기"는 액체 배지를 수용할 수 있고, 연결기, 포트, 어댑터 및 가요성 배관을 추가로 포함하는 멸균 챔버이다. 한 구현예에서, 챔버는 플라스틱으로 제조된다. 특정 구현예에서, 챔버는 다층화된 박판 투명 플라스틱으로 제조된다. 추가의 특정한 구현예에서, 챔버는 다층화된 박판 투명 플라스틱으로 제조되고, USP 등급 VI 에틸렌 비닐 아세테이트/저밀도 폴리에틸렌 공중합체로 제조된 유체 접촉 층을 가지는 한편, 외부층은 저밀도 폴리에틸렌으로 제조된다.
또한, 연결기, 포트, 및 어댑터는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리카르보네이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 종류의 플라스틱으로 제조될 수 있는 한편, 배관은 열가소성 탄성체 또는 실리콘(예를 들어, 백금-경화 실리콘)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 종류의 플라스틱으로 작제될 수 있다.
적절한 "가요성 백 생물반응기" 챔버는 당 분야에서 일반적으로 발견될 수 있으며, 이는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 제6,544,788호에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"가요성 백 생물반응기" 챔버는 배양 배지로 부분적으로 충전될 수 있고, 이후 팽창되어 굳어질 수 있다. 이후, 이는 미리 설정된 로킹 각 및 미리 설정된 로킹 속도를 통해 앞뒤로 이동하는 로킹 플랫폼(예를 들어, GE Healthcare Life Sciences로부터의 BASE20/50EHT 로킹 유닛) 상에 위치될 수 있다. 이러한 로킹 이동은 배양 배지에서의 파도와 같은 이동을 유도하고, 진탕 및 산소 전달을 촉진하여, 세포 배양의 성능을 개선시킬 수 있다. 미리 설정된 로킹 각도는 적어도 약 4도, 예를 들어, 약 4도, 5도, 6도, 7도, 8도, 9도, 10도, 11도, 또는 12도일 수 있다. 또한, 미리 설정된 로킹 속도는 적어도 약 6 rpm, 예를 들어, 약 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm, 또는 40 rpm인 분 당 로크 속도(rpm)로 설정될 수 있다. 특정 구현예에서, 분 당 로크 속도는 약 8 rpm이다. 특정 구현예에서, 분 당 로크 속도는 약 15 rpm이다. 또 다른 특정 구현예에서, 분 당 로크 속도는 약 22 rpm이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 잔류 시스템"은 필터의 사용에 의해 장치 내의 배지 및 노폐물로부터 세포를 분리시키는 능력을 갖는 모든 장치를 나타낸다. 필터는 나권형, 관형, 또는 시트형을 포함하는 임의의 형태의 막, 세라믹, 또는 금속 필터를 포함할 수 있다. 필터는 다양한 표면적의 필터일 수 있다. 예를 들어, 필터 표면적은 약 0.3 ㎡ 내지 약 5 ㎡, 예를 들어, 약 0.3 ㎡, 0.4 ㎡, 0.5 ㎡, 0.6 ㎡, 0.7 ㎡, 0.77 ㎡, 0.8 ㎡, 0.9 ㎡, 1.0 ㎡, 1.1 ㎡, 1.2 ㎡, 1.3 ㎡, 1.4 ㎡, 1.5 ㎡, 1.6 ㎡, 1.7 ㎡, 1.8 ㎡, 1.9 ㎡, 2.0 ㎡, 2.1 ㎡, 2.2 ㎡, 2.3 ㎡, 2.4 ㎡, 2.5 ㎡, 2.6 ㎡, 2.7 ㎡, 2.8 ㎡, 2.9 ㎡, 3.0 ㎡, 3.1 ㎡, 3.2 ㎡, 3.3 ㎡, 3.4 ㎡, 3.5 ㎡, 3.6 ㎡, 3.7 ㎡, 3.8 ㎡, 3.9 ㎡, 4.0 ㎡, 4.1 ㎡, 4.2 ㎡, 4.3 ㎡, 4.4 ㎡, 4.5 ㎡, 4.6 ㎡, 4.7 ㎡, 4.8 ㎡, 4.9 ㎡, 또는 약 5 ㎡일 수 있다. 특정 구현예에서, 필터 모듈은 약 10 킬로달톤(kDa) 내지 약 100 kDa의 분자 질량 컷 오프(MWCO) 크기를 가지며, 예를 들어, 이는 약 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 또는 100 kDa이다. 다른 구현예에서, 필터 모듈은 약 0.1 ㎛ 내지 약 3 ㎛, 예를 들어, 약 0.1 ㎛, 0.2 ㎛, 0.3 ㎛, 0.4 ㎛, 0.5 ㎛, 0.6 ㎛, 0.65 ㎛, 0.7 ㎛, 0.8 ㎛, 0.9 ㎛, 1.0 ㎛, 1.1 ㎛, 1.2 ㎛, 1.3 ㎛, 1.4 ㎛, 1.5 ㎛, 1.6 ㎛, 1.7 ㎛, 1.8 ㎛, 1.9 ㎛, 2.0 ㎛, 2.1 ㎛, 2.2 ㎛, 2.3 ㎛, 2.4 ㎛, 2.5 ㎛, 2.6 ㎛, 2.7 ㎛, 2.8 ㎛, 2.9 ㎛, 또는 약 3.0 ㎛의 메쉬(mesh) 또는 포어 크기를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "냉동보존"은 시간 또는 효소 또는 화학 활성에 의해 야기되는 손상에 민감한 세포, 조직, 또는 임의의 다른 물질이 이들을 0도 아래의 온도로 냉각시키고 저장함으로써 보존되는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "크라이오뱅킹"은 세포가 동결방지제(예를 들어, 하이드록시에틸 전분(HES)을 갖거나 갖지 않는 DMSO)와 혼합되고, 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기에 배치되는 기술을 나타낸다. 이후, 이들 용기는 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 동결되고, 낮은 온도, 통상적으로 약 -130℃ 내지 약 -195℃에서 저장된다. 상기 과정에 의해 수득된 세포의 수집물이 세포 뱅크이다.
한 구현예에서, 세포 뱅크는 고밀도 세포 뱅크이다. 본원에서 사용되는 용어 "고밀도 세포 뱅크"는 고밀도로 동결된 세포의 크라이오뱅킹된 분취량을 나타내며, 여기서 밀도는 적어도 약 7 x 10^7개의 살아 있는 세포/㎖이고, 예를 들어, 이는 약 7 x 10^7개의 살아 있는 세포/㎖, 8 x 10^7개의 살아 있는 세포/㎖, 9 x 10^7개의 살아 있는 세포/㎖, 1 x 10^8개의 살아 있는 세포/㎖, 2 x 10^8개의 살아 있는 세포/㎖, 또는 3 x 10^8개의 살아 있는 세포/㎖이다. 세포는 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 임의의 용기에서 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법에 따라 동결될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포 뱅크는 마스터 세포 뱅크이다. 본원에서 사용되는 용어 "마스터 세포 뱅크"는 단일 클론으로부터 성장되고, 저장 용기로 분배(예를 들어, 단일 작업으로 용기로 분배됨)되고, 상기 기재된 바와 같이 냉동보존 조건하에서 저장되는 세포(예를 들어, 완전히 특성 규명된 세포)의 배양물을 나타낸다. 특정 구현예에서, 세포는 세포 배양물 생성 및 이에 의해 생성된 치료적으로 관련된 단백질의 추가 수거에서의 이후의 사용에 적합하다.
또 다른 구현예에서, 세포 뱅크는 미니 세포 뱅크이다. 본원에서 사용되는 용어 "미니-뱅크"는 "크라이오뱅킹" 절차(상기 기재된 바와 같음)에 따라 냉동보존되나, 세포 뱅크를 생성시키기 위해 일반적으로 사용되는 것보다 적은 샘플로 구성되는 세포의 분취량을 나타낸다. 이러한 유형의 뱅크는 "마스터 세포 뱅크"와 같은 세포 뱅크가 생성되기 전에 세포주의 냉동보존을 위해 고려되는 조건을 최적화시키기 위해 일반적으로 사용될 수 있다. 예로서, "미니-뱅크"는 본 발명의 개시에서 기재된 고밀도 세포 뱅킹 절차를 위한 최적 세포 밀도를 결정하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기"는 약 -130℃ 내지 약 -195℃에서의 세포 저장에 적절한 조건하에서 사용될 수 있는 임의의 용기를 포함한다. 이들 용기는 냉동보존에 적합한 물질로 제조되는 바이얼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 물질은 중합체(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 또는 폴리프로필렌)를 포함한다. 또한, 냉동보존 조건을 개선시키기 위해 냉동보존 바이얼의 표면에 표면 처리가 적용(예를 들어, 흡착 및 변성을 감소시키는 친수성 코팅)될 수 있다. 예시적 구현예에서, 바이얼은 약 0.1 ㎖ 초과의 부피를 가질 수 있고, 예를 들어, 바이얼은 약 0.1 ㎖, 약 0.5 ㎖, 약 0.75 ㎖, 약 1 ㎖, 약 2 ㎖, 약 2.5 ㎖, 약 5 ㎖, 약 10 ㎖, 약 15 ㎖, 약 20 ㎖, 약 25 ㎖, 또는 약 50 ㎖의 부피를 가질 수 있다. 용기는 또한 크라이오백일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "크라이오백"은 액체 배지를 수용할 수 있고, 약 -130℃ 내지 약 -195℃에서의 세포 저장에 적절하고, 연결기, 포트, 어댑터 및 가요성 배관을 추가로 포함할 수 있는 멸균 챔버이다. 크라이오백은 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 및 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 적절한 물질로 작제될 수 있다. 예시적 크라이오백은 KryoSure® 냉동보존 백, PermaLife™ 백(OriGen Biomedical), CryoStore 동결 백, Freeze-Pak™ 바이오-용기(Bio-container)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "진탕 플라스크"는 배양 플라스크로서 사용되는 용기를 나타내며, 그 안의 배지는 인큐베이션 동안 항상 진탕된다.
본원에서 사용되는 용어 "진탕 플라스크 시드 트레인"은 세포의 분취량이 먼저 진탕 플라스크에서 배양(시딩)되고, 그 안에서 성장되는 세포 확장 방법을 나타낸다. 세포는 이들의 성장 속도에 따라 배양되고, 생물량이 생물반응기에 접종시키기에 충분한 수준에 도달할 때까지 이들의 성장 동안 더 크고/크거나 다수의 용기로 일반적으로 분할된다.
본원에서 사용되는 용어 "시드 밀도"는 플라스크 또는 생물반응기에 접종되는 최초 세포 밀도를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "치료적으로 관련된 단백질"은 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 원숭이, 유인원, 및 인간을 포함하는 동물에서 질병 또는 장애의 치료를 발생시키거나 질병 또는 장애를 치료하기 위해 이용될 수 있는 임의의 단백질을 나타낸다. 이들 단백질은 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 모노클로날 항체, Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 뼈 형태형성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 및 혈전용해제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 폴리펩티드" 또는 "결합 폴리펩티드"는 관심 표적 항원(예를 들어, 인간 항원)에 선택적으로 결합하는 것을 담당하는 적어도 하나의 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 나타낸다. 예시적 결합 부위는 항체 가변 도메인, 수용체의 리간드 결합 부위, 또는 리간드의 수용체 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 결합 폴리펩티드는 다수(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 또는 그 초과)의 결합 부위를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 관심 항원(예를 들어, 종양 관련 항원)에 대한 유의한 공지된 특정 면역반응 활성을 갖는 상기 어셈블리(예를 들어, 온전한 항체 분자, 항체 단편, 또는 이들의 변이체)를 나타낸다. 항체 및 면역글로불린은 경쇄와 중쇄 사이에 사슬간 공유 결합을 갖거나 갖지 않는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물 시스템에서의 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다.
일반적 용어 "항체"는 생화학적으로 구별될 수 있는 항체의 5개의 다른 부류를 포함한다. 모든 5개 부류의 항체는 명백히 본 발명의 개시의 범위 내이고, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 관한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 약 23,000 달톤의 분자량의 2개의 동일한 경쇄, 및 분자량 53,000 내지 70,000의 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4개의 사슬은 "Y" 입체형태로 이황화결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하고 가변 영역을 통해 연속되는 중쇄를 하나로 일괄시킨다.
II. 관류 세포 배양
전통적인 세포 배양은 "회분식" 배양 과정을 수반한다. 이러한 유형의 배양에서, 일정량의 새로운 배지에 대수 성장기로 신속히 진입하는 세포가 접종된다. 이들 세포가 성장하고 분열함에 따라, 이들은 배지로부터 이용 가능한 영양소를 소모하고, 유해한 노폐물을 배출한다. 시간 경과에 따라, 배양은 안정 성장기, 및 최종적으로 감쇠기로 진입할 것이다. "회분식" 배양 과정에 대한 변형이 시간 경과에 따라 이를 더욱 효과적으로 만드나, 발생된 변형된 회분식 배양 프로토콜은 신속한 성장 및 감쇠 주기를 여전히 발생시킨다. 또한, "회분식" 배양 과정은 고밀도 세포 뱅킹을 가능케 하는데 필요한 세포 밀도의 수준에 도달하는 제한된 능력을 갖는다.
"유가식" 배양 과정은 전통적인 "회분식" 배양 기술에 비해 세포 배양 기술에 있어서 추가 개선을 나타낸다. 이러한 과정은 더 높은 세포 밀도 성장을 가능케 하나, 고밀도 세포 배양물의 효과적인 성장을 가능케 하고, 이에 따라 고밀도 세포 뱅킹을 위해 효과적으로 세포를 발생시키는 이의 능력에 있어서 여전히 제한적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 관류 배양 과정을 이용한다. 관류 배양은 일정량의 새로운 배지에 대수 성장기에 신속히 진입하는 세포가 접종되고(상기와 같음), 성장 배지가 배양물로부터 연속적으로 제거되고, 새로운 배지로 대체되는 세포를 성장시키기 위한 방법이다. 이러한 방식으로, 배양물은 고수준의 영양소를 갖는 새로운 배지를 항상 수용하는 한편, 노폐물 및 낮은 수준의 영양소를 함유하는 배지가 제거된다. 이러한 유형의 배양은 적어도 하나의 배양 부피가 하루마다 교환되고, 세포 농도가 전통적 또는 변형된 회분식 배양으로 달성된 것보다 훨씬 높을(2 내지 10배 초과의 증가) 수 있는 세포의 대수 성장의 유지를 가능케 한다. 본 발명의 한 구현예에서, 세포 특이적 관류 속도(CSPR)는 약 0.02 nℓ 세포-1일-1 내지 약 0.5 nℓ 세포-1일-1일 수 있고, 예를 들어, 이는 약 0.02 nℓ 세포-1일-1, 0.05 nℓ 세포-1일-1, 0.1 nℓ 세포-1일-1, 0.2 nℓ 세포-1일-1, 0.3 nℓ 세포-1일-1, 0.4 nℓ 세포-1일-1, 또는 0.5 nℓ 세포-1일-1일 수 있다. 특정 구현예에서, 관류 배양은 최소 하나의 딥 튜브를 갖는 생물반응기에서 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 배양물의 pH, 온도, 용존 산소 농도(DO), 및 오스몰농도는 배양물 활력 및 생산성을 최대화시키기 위해 조정될 수 있다. 배양물의 DO 및 pH를 제어하는 한 방법은 자동화 피드백 제어기를 통해 이루어진다. 이러한 유형의 자동화 제어기는 배양물의 pH 및 DO를 모니터하고 조정함으로써 세포 성장을 위한 최적 조건을 유지시키기 위해 마이크로프로세서-기반 컴퓨터를 이용하여 작동한다. 그러나, 이들 자동화 피드백 제어 시스템은 고비용이다. 따라서, 특정 구현예에서, 이들 파라미터를 제어하는 비-자동화 방법이 이용될 수 있다. 한 예시적 구현예에서, 배양 전체에 걸친 기체 혼합물 유동의 조정, WAVE® 로크 속도의 조정, 또는 배양물의 로크 각도의 조정 중 임의의 조정이 선택된 파라미터(예를 들어, pH 또는 DO)를 제어하기 위해 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 분 당 약 0.2리터의 공기 유량(lpm)과 함께 이산화탄소 기체의 시작 수준은 약 10%이고, 산소 기체의 시작 수준은 약 20%이다. pH가 약 6.9 이하인 경우, CO2 설정 포인트는 10%로부터 5%로 감소될 수 있다. pH가 이후 시점에서 여전히 약 6.9 이하인 경우, CO2 설정 포인트는 5%로부터 0%로 추가로 감소될 수 있다. pH가 여전히 약 6.9 이하인 경우, 관류 속도는 증가될 수 있다. DO가 약 45% 이하인 경우, O2 설정 포인트는 20%로부터 30%로 상승되어야 한다. DO가 이후 시점에서 약 45% 이하인 경우, O2 수준은 30%로부터 40%로 상승되어야 하고, 로크 속도는 약 25 rpm으로 증가되어야 하고, 로크 각도는 약 12°로 변경되어야 한다.
구현예에서, 배양물의 로크 속도는 또한 세포 잔류 시스템으로의 공기의 포함을 피하기 위해 최종 농축 단계 동안 조정될 수 있다.
i. 세포 배양 배지
세포의 배양에 적합한 세포 배양 배지의 임의의 유형이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 적절한 세포 배지를 선택하기 위한 지침은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Chapters 8 and 9 of Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss; 및 Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons]에 제공되어 있다. 이들 참고문헌 각각은 전체내용이 본원에 포함된다. 국제 특허 출원 번호 WO97/05240호, WO 96/26266호, 및 WO 00/11102호, 미국 특허 번호 제6,100,061호, 제6,475,725호, 및 제8,084,252호에서 관찰되는 것과 같은 동물 유래 성분 비함유 및 단백질 비함유 조건 하에서의 세포 배양물의 제조 및 유지를 위한 추가 방법(CHO 세포와 관련된 방법을 포함함)이 당 분야에 존재한다. 상기 문헌 각각은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 한 구현예에서, 동물 유래 성분(ADC) 비함유 배지가 이용될 수 있다. 통상적인 합성 최소 배지는 무기 염, 아미노산, 비타민, 탄수화물 공급원, 및 물을 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 사용될 수 있는 배지는 CD-CHO(GIBCO, Invitrogen Corp.; 화학적으로 규정되고, 단백질, 가수분해물, 또는 공지되지 않은 기원의 성분을 함유하지 않는 동물 기원 비함유 배지)이다. 추가로, 배지는 글루타민 및/또는 메토트렉세이트 또는 성장 또는 부착을 도울 수 있는 다른 인자를 포함하는 추가 성분을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 성분은 약 2 mM 내지 약 8 mM, 예를 들어, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 또는 약 8 mM로 첨가되는 GLUTAMAX-1 또는 L-글루타민일 수 있다.
ii. 숙주 세포 및 발현 벡터
특정 구현예에서, 본 발명의 세포 뱅킹 과정에서 이용되는 세포는 치료적으로 관련된 단백질 또는 다른 관심 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 작제물을 갖는 숙주 세포이다. 관심 폴리펩티드(예를 들어, 결합 폴리펩티드)를 발현시키기 위해 이용될 수 있는 임의의 세포가 본원에 기재된 방법에 따라 이용될 수 있다. 세포는 자연 발생 또는 재조합 핵산 서열, 예를 들어, 관심 폴리펩티드를 함유하는 발현 벡터를 임의로 함유할 수 있다. 발현 벡터는 임의로 적절한 전사 및 번역 조절부를 함유할 수 있고, 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 발현 벡터는 당 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 숙주 세포로 전달될 수 있고, 이후 형질전환된 세포는 본 발명의 방법에 따라 배양되어 고-밀도 세포 뱅크를 생성시킬 수 있다. 또한, 고-밀도 세포 뱅크는 이후 인코딩되는 관심 단백질을 생성시키기 위해 당 분야에 공지된 기술에 따라 해동되고 배양될 수 있고, 요망시, 이러한 단백질은 이후에 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, 치료적으로 관련된 단백질을 생성시키기 위해 다양한 숙주 발현 시스템이 이용될 수 있다. 또한, 숙주 발현 시스템은 포유류 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유류 세포 시스템(예를 들어, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst 세포, PER.C6, SP2/0-Agl4, 및 하이브리도마 세포)일 수 있다. 포유류 세포와 함께 바이러스-기반 발현 시스템이 또한 이용될 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359] 참조). 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소 및 전사 종료자를 포함하는(이에 제한되지는 않음) 요소의 포함에 의해 향상될 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544] 참조).
다른 구현예에서, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 요망되는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 가공하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 다양한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적 및 특이적 메커니즘을 갖는다. 발현되는 폴리펩티드(예를 들어, 결합 폴리펩티드)의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 상기 세포는, 예를 들어, 확립된 포유류 세포주 및 동물 세포뿐만 아니라 곤충 세포주, 진균 세포, 및 효모 세포를 포함한다.
iii. 생물반응기
관류 배양 조건하에서 세포를 배양하기에 적합한 임의의 생물반응기가 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 생물반응기는 적절한 시드 밀도의 세포의 분취량(예를 들어, 세포 또는 종균 배양으로부터의 세포의 바이얼, 예를 들어, 상기 밀도로 배양된 진탕 플라스크 또는 진탕 플라스크 시드 트레인)을 이용하여 접종될 수 있다. 배양물의 적절한 시드 밀도는 사용되는 세포 유형 및 접종되는 생물반응기를 포함하는 여러 요인에 좌우된다. 적절한 시드 밀도는 당 분야에서 이용 가능한 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 생물반응기는 일회용 특성의 생물반응기일 수 있고, 예를 들어, 생물반응기는 가요성 배관에 의해 세포 잔류 장치에 연결되는 가요성 백 또는 플라스틱 플라스크일 수 있다. 이는 약 1 ℓ, 2 ℓ, 5 ℓ, 10 ℓ, 약 20 ℓ, 50 ℓ, 75 ℓ, 85 ℓ, 100 ℓ, 150 ℓ 또는 약 400 ℓ의 부피를 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 생물반응기는 2개의 딥 튜브, 즉, 배지 또는 생성물을 분리시키기 위해 사용되는 튜브로 맞춤화된 10 ℓ 가요성 백이다. 예시적 일회용 생물반응기는 WAVE® cellbag 생물반응기(GE Healthcare, Pittsburgh, PA), 예를 들어, 20 ℓ WAVE® 생물반응기이다. 이들은 특히 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Singh, 1999, Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, p.149-158]에 기재된 관류 생물반응기 시스템이다.
반응기의 작업 부피는 배양물이 차지한 부피이다. 작업 부피는, 예를 들어, 배양물의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 초과일 수 있으나, 바람직하게는 75% 이하이다.
대안적으로, 생물반응기는 일회용이 아닌 특성의 생물반응기일 수 있다. 예를 들어, 생물반응기는 스테인리스 강철 또는 유리로 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 대안적 생물반응기는 진탕 플라스크, 교반 탱크 용기, 공수 용기(airlift vessel), 및 로킹, 진탕, 또는 교반에 의해 혼합될 수 있는 일회용 백을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
구현예에서, 생물반응기는 빌트-인(built-in) 필터, 스핀 배스킷(spin basket) TFF 시스템, 및 ATF 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 세포 잔류 시스템에 커플링될 수 있다.
II. 비-원심분리적 농축
관류 배양은 세포에 대한 손상을 최소화시키면서 배양물로부터의 영양소 고갈 및 노폐물 함유 배지를 제거하는 능력에 의존한다. 고갈된 배지가 배양된 세포로부터 분리되는 세포 잔류의 최초 방법은 종종 전단력의 생성과 같은 고유한 문제를 통해 세포에 손상을 준다. 이는 종국적으로 필터의 클로깅(clogging) 및 관류 장치의 고장을 발생시키며, 이 중 많은 것은 배양 시스템 내부에서 발생하는 것이다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명의 개시는 배지 교환을 가능케 하고, 크라이오뱅킹을 위해 세포 배양물을 추가로 농축시키기 위해 이후에 이용되는 "세포 잔류 시스템"을 사용하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 사용되는 세포 잔류 시스템의 유형은 "빌트 인" 유형 필터이며, 상기 필터는 생물반응기의 챔버 내에 배치되고, 챔버 내에서 자유롭게 이동한다. 필터는 챔버 외부로 연장된 튜브 중 하나에 커플링될 수 있어, 이에 의해 여과된 배지가 배양물로부터 배출되도록 할 수 있다. "빌트 인" 유형 필터의 한 예는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 제6,544,788호에서 발견될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 사용되는 세포 잔류 시스템은 접선 유동 여과 시스템(TFF)이다. TFF 시스템에서, 배양 배지는 여과 모듈을 통해 배양 용기로부터 순환되고, 이후 여과 모듈과 배양 용기 사이의 배관에 부착된 펌프에 의해 배양 용기로 역행되어, 필터 모듈 전체에 걸쳐 접선 유동을 생성시킨다. 두번째 펌프가 필터 모듈의 여과액 측면에 위치되고, 여과액이 제거되는 속도를 제어하는데 사용된다. 중공-섬유 막 필터의 사용이 상기 시스템에서 바람직한데, 이는 이들이 멸균시키기에 용이하고, 필터 모듈 전체에 걸친 균일한 유동의 유지를 가능케 하기 때문이다. 그러나, 중공 섬유 필터가 상기 시스템에서 이용되는 경우, 이들은 단방향 유동이 내강 입구에서 특정 물질의 응집을 발생시킴에 따라 클로깅을 발생시키기 쉽다.
특정 구현예에서, 이용되는 세포 잔류 시스템의 유형은 교대 접선 유동(ATF) 시스템이다. 세포 잔류 시스템의 ATF 유형에서, 여과 구획은 한 말단에서 저장 용기에 연결되고, 다른 말단에서 다이아프램 펌프에 연결된다. 펌프는 먼저 필터 엘리먼트를 통해 용기로부터 펌프로 배지를 이동시킨 후, 필터를 통해 펌프로부터 다시 용기로 배지를 보내기 위해 역행하여, 양방향성 또는 교대 유동을 발생시킨다. 이는 교대 접선 유동(ATF)으로 언급되는데, 이는 필터 모듈에서 교대 접선 유동이 존재하고, 즉, 필터 모듈의 막 표면에 대해 동일 방향(상기 표면에 대해 접선)의 한 유동이 존재하고, 상기 표면에 대해 실질적으로 수직인 또 다른 유동이 존재하기 때문이다. 이러한 유형의 여과는 2000년 이래로 문헌에 존재하며, 신속하고, 저전단이고, 균일한 유동을 발생시킨다. ATF 여과는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 제6,544,424호에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한, 교대 접선 유동 시스템이 Refine Technology와 같은 제조업체로부터 상업적으로 이용가능하며, 다양한 모델, 예를 들어, ATF2, ATF4, ATF6, ATF8, 및 ATF10 시스템을 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 필터는 관형 막 필터이고, 이는 또한 중공 섬유 필터일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 고밀도의 세포의 비-원심분리적 농축을 가능케 한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 배양물은 적어도 1 x 10^7 세포/㎖, 예를 들어, 약 1 x 10^7 세포/㎖, 약 2 x 10^7 세포/㎖, 약 3 x 10^7 세포/㎖, 약 4 x 10^7 세포/㎖, 약 5 x 10^7 세포/㎖, 약 6 x 10^7 세포/㎖, 약 7 x 10^7 세포/㎖, 또는 약 8 x 10^7 세포/㎖의 밀도로 성장되고, 상기 성장 기간 후, 비-원심분리적 방법을 이용하여 수행되는 추가 농축 단계가 존재한다. 이러한 농축 단계는 적어도 5 x 10^7 세포/㎖, 예를 들어, 약 5 x 10^7 세포/㎖, 6 x 10^7 세포/㎖, 7 x 10^7 세포/㎖, 8 x 10^7 세포/㎖, 9 x 10^7 세포/㎖, 10 x 10^7 세포/㎖, 11 x 10^7 세포/㎖, 12 x 10^7 세포/㎖, 13 x 10^7 세포/㎖, 14 x 10^7 세포/㎖, 15 x 10^7 세포/㎖, 16 x 10^7 세포/㎖, 또는 17 x 10^7 세포/㎖의 밀도로 배양물을 농축시킬 수 있다. 배양물을 추가로 농축시키기 위해 사용되는 비-원심분리적 방법은 당 분야에 공지된 임의의 세포 잔류 시스템(예를 들어, 상기 기재된 것을 포함하는 "빌트 인" 유형 필터, TFF 시스템, 또는 ATF 시스템)을 이용할 수 있다.
III. 냉동보존 및 세포 뱅킹
냉동보존은 시간 또는 효소 또는 화학 활성에 의해 야기되는 손상에 민감한 세포, 조직, 또는 임의의 다른 물질이 이들을 0도 아래의 온도로 냉각시키고 저장함으로써 보존되는 과정을 나타낸다. 중요한 세포주의 냉동보존의 중요성은 과소평가될 수 없는데, 이는 (다른 중요한 장점 중에서) 냉동보존이 이들 세포주를 일정한 배양으로 유지시킴이 없이 이들 세포주의 유지를 가능케 하고, 오염의 위험을 감소시키고, 유전 변이의 위험을 감소시키기 때문이다.
냉동보존 방법을 이용하는 경우, 동결 과정 동안 얼음의 형성을 통해 추가 손상을 야기시킴이 없이 이들을 낮은 온도에 도달시키고 낮은 온도에서 유지시키는 것이 중요하다. 당 분야의 방법은 전통적으로 동결방지제로 언급되는 세포에 대한 동결 손상을 감소시키는 물질을 이용한다. 동결방지제는 동결 과정 전에 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 사용되는 동결방지제는 글리세롤 또는 디메틸 설폭시드(DMSO) 중 하나 이상일 수 있다. 또한, 동결방지제는 하이드록시에틸 전분(HES)와 함께 또는 HES 없이 첨가될 수 있다. 추가의 특정한 구현예에서, DMSO는 적어도 5%의 농도로 첨가될 수 있고, 예를 들어, 이는 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 적어도 18%, 약 19%, 또는 적어도 20%로 첨가될 수 있다.
동결방지제가 첨가된 배양물은 이후 냉동보존 조건하에서의 저장에 적절한 용기로 분배될 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 용기는 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 또는 폴리프로필렌을 포함(이에 제한되지는 않음)할 수 있는 물질로 제조된 바이얼일 수 있다. 특정 구현예에서, 바이얼은 냉동보존 조건을 개선시키기 위해 추가 표면 처리(예를 들어, 흡착 및 변성을 감소시키는 친수성 코팅)를 가질 수 있다. 예시적 구현예에서, 바이얼은 약 0.1 ㎖ 초과의 부피를 가질 수 있고, 예를 들어, 바이얼은 약 0.1 ㎖, 약 0.5 ㎖, 약 0.75 ㎖, 약 1 ㎖, 약 2 ㎖, 약 2.5 ㎖, 약 5 ㎖, 약 10 ㎖, 약 15 ㎖, 약 20 ㎖, 약 25 ㎖, 또는 약 50 ㎖의 부피를 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용기는 또한 크라이오백일 수 있다. 크라이오백은 중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 플루오르화 에틸렌 프로필렌(FEP) 및 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 적절한 물질로 작제될 수 있다. 예시적 일회용 생물반응기는 KryoSure® 냉동보존 백, PermaLife™ 백(OriGen Biomedical), CryoStore 동결 백, Freeze-Pak™ 바이오-용기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이들 용기는 이후 낮은 온도, 통상적으로 약 -130℃ 내지 약 -195℃에서 저장되기 전에 당 분야에 널리 공지된 기술 및 장치를 이용하여 동결된다. 한 구현예에서, 이용되는 동결 기술은 제어-속도 및 느린 동결(느린 프로그램화 동결, 또는 SPF로도 언급됨)일 수 있다. 상기 과정에 의해 수득된 세포의 수집물이 세포 뱅크이다.
구현예에서, 세포 뱅크는 고밀도 세포 뱅크, 마스터 세포 뱅크, 또는 미니 뱅크일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
IV. 세포 생활력의 결정
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 이후 사용을 위해 우수한 세포 생활력을 보유하면서 고밀도로 세포 뱅킹을 가능케 한다. 본원에서 사용되는 용어 "세포 생활력"은 제공된 샘플에서의 활력이 있는 세포의 수 또는 백분율로 정의될 수 있다. 세포의 생활력은 기재된 고밀도 세포 뱅킹 과정에서 임의의 포인트에서 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 세포 생활력의 결정을 위한 일반적으로 사용되는 방법은 살아 있는 세포가 특정 염료, 예를 들어, 트리판 블루(디아조 염료), 에오신, 또는 프로피듐을 배출시키는 온전한 세포막을 갖는 반면, 죽은 세포는 그렇지 않는다는 원리를 주로 기초로 한다.
한 구현예에서, 트리판 블루는 일정량의 세포를 염색시키고, 이에 의해 온전한 막을 갖는 세포의 존재(착색되지 않음) 및 파열된 막을 갖는 세포의 존재(청색)를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 이후, 이들 세포는 배양물 내의 살아있는 세포 및 죽은 세포 둘 모두의 수를 결정하기 위해 계수될 수 있고, 배양물의 상대 활력을 나타내기 위해 백분율로 제시될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 생활력은 농축되었으나, 아직 동결되지 않은 배양물(즉, 동결 전 배양물)을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 생활력은 농축되고, 동결된 후, 해동된 배양물(즉, 해동 후 배양물)을 이용하여 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 생활력은 약 60% 초과, 예를 들어, 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%일 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 해동 후 생활력은 약 80% 초과, 85% 초과, 90%, 또는 95% 내지 100% 이하이다.
아폽토시스는 프로그램화된 세포 사멸이고, 세포 성장 및 증식의 능동 제어 경로이다. 세포는 특정 유도 신호에 반응하여, 특징적인 생리학적 변화를 발생시킨다. 이들 변화는 초기 아폽토시스 경로 동안 세포 외부면으로의 포스파티딜세린(PS)의 외부화이다. Guava Nexin® 검정은 아폽토시스 세포의 외부막 상의 PS를 검출하기 위해 Annexin V-PE(PS에 대한 높은 친화성을 갖는 칼슘-의존성 인지질 결합 단백질)를 이용한다. 세포 불투과성 염료 7-AAD가 또한 세포막 구조 온전성의 지표로 사용된다. 7-AAD는 살아 있는 활력이 있는 세포뿐만 아니라 초기 아폽토시스 세포로부터 배출된다. 세포의 3개 집단이 이러한 검정으로 구별될 수 있다:
1) 비-아폽토시스 세포(또는 활력이 있는 세포):
2) Annexin V(-) 및 7-AAD(-).
3) 초기 아폽토시스 세포: Annexin V(+) 및 7-AAD(-)
4) 후기 단계 아폽토시스 및 죽은 세포: Annexin V(+) 및 7-AAD(+)
후기 아폽토시스 세포의 양은 해동 후 배양물의 활력의 또 다른 척도이며, 이는 도 4 및 도 7b에 제시된 바와 같이 모니터될 수 있다. 특정 구현예에서, 해동 후 후기 아폽토시스 세포는 살아 있는 세포 집단의 30% 미만이어야 한다. 또 다른 구현예에서, 해동 후 후기 아폽토시스 세포는 살아 있는 세포 집단의 20% 미만이어야 한다. 또 다른 구현예에서, 해동 후 후기 아폽토시스 세포는 살아 있는 세포 집단의 10% 미만이어야 한다.
V. 치료적으로 관련된 단백질
본 발명의 고-밀도 세포 크라이오뱅킹 방법으로부터 유래된 세포는 단백질의 제조를 위한 이후의 생성 단계에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 생물반응기에서 증식되고, 고-밀도 뱅크 분취량으로 동결된 세포는 치료적으로 관련된 단백질을 포함하는 생물학적 물질의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이들 생물학적 물질은 바이러스(예를 들어, WO200138362호 참조), 결합 폴리펩티드, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 및 이들의 단편, 예를 들어, fab 단편; Fc 융합 단백질, 항응고제, 혈액 인자, 뼈 형태형성 단백질, 조작된 단백질 스캐폴드, 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 및 혈전용해제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 생물학적 물질은 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법을 이용하여 수거될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 생물학적 물질의 생성에 적합한 조건하에서 생물학적 물질을 발현할 수 있는 세포를 배양하는 것을 포함하는 생물학적 물질을 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 세포는 관류 배양 및 비-원심분리적 농축 방법을 이용하여 생성된 고-밀도 동결 세포 뱅크로부터 수득되었다. 생물학적 물질은 단백질(예를 들어, 임의의 치료적으로 관련된 단백질)(그러나 이에 제한되지는 않음)일 수 있다.
실시예
본 발명은 더 나아가 제한으로 간주되어선 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 도면 및 모든 참고문헌, 특허, 및 공개된 특허 출원의 내용은 그 전체내용이 참조로서 본원에 명백히 포함된다.
실시예 1: 고-밀도 세포 뱅킹 프로토콜의 설계 및 수행
본 고-밀도 세포 크라이오뱅킹 프로토콜을 2.0 내지 2.4 x 10^7개의 살아 있는 세포/㎖의 대략적인 밀도(정상 세포 냉동보존 조건)로 2㎖ 마스터 세포 뱅크 바이얼의 세포(작업 부피 1.5㎖)로 시작하였다. 이후, 세포를 관류 배양으로 성장시키고, 교대 접선 유동을 통해 농축시켰다. 농축된 세포 배양물로의 DMSO의 첨가 후, 이러한 고밀도의 세포 배양물을 고밀도 세포 뱅크(약 10 x 10^7 세포/㎖)로서의 저장을 위해 약 200개의 독립된 5㎖ 바이얼(약 4.5 ㎖ 작업 부피)로 분배하였다.
실시예 2: 신속한 세포 성장 및 농축 속도의 지지를 위한 최적 세포 잔류 방법의 결정
고밀도 세포 배양물 뱅킹 시스템(도 1)의 생성에서 사용하기 위한 최적 세포 잔류 방법을 결정하기 위해, 표준 GE 관류 생물반응기 내의 빌트-인 부유 필터, TFF(접선 유동 여과), ATF2, 및 ATF4를 규정된 파라미터(표 1) 하에서 증가된 세포 성장 및 살아 있는 세포 밀도를 지지하는 이들의 능력에 대해 평가하였다.
표 1: 세포 잔류 방법의 비교를 위해 사용된 실험 파라미터
Figure pat00001
ATF4 교대 접선 유동 시스템은 필터 오염 없이 신속한(30분) 최종 4배 배양물 농도와 함께 상기 파라미터를 이용하여 더욱 신속한 세포 성장을 달성하는 것을 지지하였다. 시험 중인 다른 방법은 더 낮은 농축 효율을 나타내는 ㎖ 당 더 낮은 농도의 살아 있는 세포를 발생시켰고/발생시켰거나, 배양 및/또는 농축 동안 오염을 발생시켰다. 이들 결과는 도 2, 도 11, 및 표 2에서 관찰될 수 있다.
표 2: 다양한 세포 잔류 방법의 비교로부터의 결과
Figure pat00002
실시예 3: 농축 및 고-밀도 뱅킹을 위해 배양된 세포를 수거하기 위한 최적 시간의 결정
이후의 최종 농축 및 고-밀도 세포 크라이오뱅킹을 위한 최적 세포 수거 시기를 결정하기 위해, rCHO 세포주 1의 배양물을 교대 접선 유동 시스템을 사용한 관류 배양 조건하에서 맞춤 10-L WAVE® (GE Healthcare Life Sciences) 셀백(cellbag) 생물반응기에서 성장시켰다. 다양한 세포 밀도(14x106, 33x106, 56x106/㎖)의 세포를 미니 뱅크를 제조하기 위해 관류 배양 동안 다수의 시점에서 수거하였다(도 1).
이들 뱅크를 성장 속도, 생활력, 및 세포 사멸(아폽토시스)에 관하여 세포의 해동 후 품질을 비교함으로써 평가하였다. 이들 세포를 최초 배양 동안 성장시킨 파라미터 및 뱅킹 후 평가에서의 파라미터가 표 3에 제시된다.
표 3: 최적 세포 수거를 위한 시기의 결정을 위해 사용된 실험 파라미터
Figure pat00003
상기 배양으로부터 다양한 세포 밀도로 제조된 미니 뱅크의 해동 후 세포 성능은 이들의 세포 성장 속도, 생활력(도 3), 및 아폽토시스 속도(도 4)에 관하여 동등하였다. 이들 데이터는 세포가 활력이 있고, 대략 60 x 10^6 세포/㎖ 이하의 수거를 위해 준비된 것을 나타낸다.
배양 기간을 단축시키고, 상기 과정을 더욱 실행 가능하게 만들기 위해 대략 (30 내지 40) x 10^6 세포/㎖의 수거물 밀도를 선택하였다. 이후, 이들 배양물을 교대 접선 유동 시스템을 이용하여 30분 동안 11 x 10^7 세포/㎖ 초과까지 추가로 농축시켰다.
실시예 4: 고-밀도 세포 배양 동안의 최적 WAVE ® 파라미터의 결정
상기 고밀도 세포 배양 및 뱅킹 과정을 더욱 확실하게 하고, GMP 실행가능하게 만들기 위해, 상기 배양이 자동 pH 및 DO 제어의 부재하에서 유지될 수 있는 시스템을 확립시키기 위해 WAVE® 작업 파라미터를 연구하고 규정하였다.
이들 WAVE® 작업 파라미터를 표 4에서 관찰된 파라미터를 이용하여 규정된 교대 접선 유동 시스템과 조합된 관류 배양 시스템에서 시험하였다.
표 4: WAVE ® 작업 파라미터의 결정을 위해 사용된 실험 파라미터.
Figure pat00004
산소 물질 전달(kLa) 연구는 WAVE® 로크 속도 및 각도가 산소 전달에 영향을 미치는 중요한 파라미터인 것을 나타낸다. 또한, 산소 및 이산화탄소 둘 모두의 헤드스페이스(headspace) 농도는 DO 및 pH에 유의하게 영향을 미칠 수 있다.
높은 관류 속도와 조합된 WAVE® 로킹 및 기체발생 조정(표 5)을 포함하는 간소화된 생물반응기 작업 조건을 자동화 제어 없이 표적 DO 및 pH 수준을 달성하기 위해 적용시켰다.
표 5: pH 및 DO 제어가 없는 성장 동안의 WAVE ® 작업 파라미터
Figure pat00005
혈액 기체 분석기(BGA)에 의해 측정된 바와 같은 오프라인 pH가 ≤ 6.9인 경우, CO2 설정 포인트를 10%로부터 5%로 감소시켰다. 측정된 오프라인 pH가 다시 ≤ 6.9인 경우, CO2 설정 포인트를 5%로부터 0%로 감소시켰다. 오프라인 pH가 여전히 ≤ 6.9인 경우, 관류 속도를 증가시켰다. DO가 ≤ 45%에서 측정된 경우, O2 설정 포인트를 20%로부터 30%로 상승시켰다. 측정된 DO가 다시 ≤ 45%인 경우, 로크 속도를 25 rpm으로 증가시켰고, 로크 각도를 12°로 변경시켰다. 또한, O2 수준을 30%로부터 40%로 상승시켰다.
이러한 방법은 ATF4 시스템으로의 공기의 포함을 피하기 위해 최종 농축 단계 동안 로크 속도를 조정(표 6)함으로써 추가로 개선되었다.
표 6. 농축 동안의 WAVE ® 작업 파라미터
Figure pat00006
WAVE® 로킹 및 기체발생 조정을 포함하는 생물반응기 작업 조건의 간소화된 설정은 자동화된 pH 및 DO 피드백 제어의 의존함이 없이 동등한 세포 성장 성능을 발생시켰다, 도 5 및 6. 로킹 조정은 또한 ATF4 농축 단계 동안 최소의 공기 포함을 발생시켰다.
실시예 5: 세포 활력에 대한 ATF 농축 단계 및 DMSO 노출의 효과의 결정.
세포 품질에 대한 ATF4 농축 단계 및 동결 전 DMSO 노출의 효과를 결정하기 위해, 성장 평가를 위한 고-밀도 세포 뱅킹 절차의 다양한 단계에서 수거된 살아 있는 세포를 진탕 플라스크에 접종시켰다. 표 7에 제시된 조건 하에서 수거되고 시험된 샘플은 농축 전, 농축 후, 및 0 내지 120분의 DMSO 노출 기간을 갖는 샘플이었다.
표 7: WAVE ® 작업 파라미터의 결정을 위해 사용된 실험 파라미터.
Figure pat00007
농축 전 세포 및 농축 후 세포의 세포 성장(도 7a) 및 아폽토시스 속도(도 7b)는 DMSO에 대해 다양한 길이로 노출된 세포의 세포 성장 및 아폽토시스 속도에서와 같이 동등하였다. 이는 동결 전 세포 품질을 유지하면서 용기 내 30분의 ATF4 농축 및 90분 동안의 200개가 넘는 바이얼의 충분한 규모의 분배가 실행 가능함을 암시한다.
실시예 6: 다수의 세포주에 대한 뱅킹 후 세포 품질 및 플랫폼 적응성의 결정
고-밀도 세포 뱅크의 뱅킹 후 세포 품질을 결정하기 위해, 해동 후 세포를 배양하고, 이들의 상대 세포 성장 속도, 생활력, 및 아폽토시스의 수준을 결정하기 위해 시험하였다. 또한, 상기 플랫폼이 다른 세포주에 용이하게 적용될 수 있는 것을 보장하기 위해 3개의 상이한 세포주(rCHO 세포주 1, 2, 및 3)를 이용하였다. 이들 세포가 뱅킹 전 및 뱅킹 후에 성장된 실험 조건은 표 8에 상술되어 있다.
표 8: 다수의 세포주에 대한 HD 뱅크의 뱅킹 후 세포 품질에 사용된 실험 파라미터.
Figure pat00008
해동 후 세포 성장, 생활력, 및 아폽토시스의 수준을 고-밀도(10 x 10^7 세포/㎖) 및 정상-밀도(2.0 내지 2.4 x 10^6개의 살아 있는 세포/㎖) 뱅킹된 샘플 둘 모두에서 rCHO 세포주 1(도 8a 및 도 8b), rCHO 세포주 2(도 9a 및 도 9b), 및 rCHO 세포주 3(도 10a 및 도 10b)에 대해 평가하였다. 세포는 낮은 수준의 아폽토시스와 함께 우수한 성장 속도 및 생활력을 나타내었다. 회수율은 시험되는 세포주에 따라 다양하였다.

Claims (1)

  1. 고-밀도의 동결된 세포 뱅크의 용도.
KR1020217023366A 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법 KR20210095233A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361793021P 2013-03-15 2013-03-15
US61/793,021 2013-03-15
PCT/US2014/027757 WO2014143691A1 (en) 2013-03-15 2014-03-14 High-density cell banking methods
KR1020157027627A KR102282939B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157027627A Division KR102282939B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210095233A true KR20210095233A (ko) 2021-07-30

Family

ID=50687645

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217023366A KR20210095233A (ko) 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법
KR1020157027627A KR102282939B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157027627A KR102282939B1 (ko) 2013-03-15 2014-03-14 고-밀도 세포 뱅킹 방법

Country Status (20)

Country Link
US (2) US10188099B2 (ko)
EP (2) EP2970843B1 (ko)
JP (1) JP6742902B2 (ko)
KR (2) KR20210095233A (ko)
CN (2) CN105102605A (ko)
AR (1) AR095354A1 (ko)
AU (1) AU2014228275B2 (ko)
BR (1) BR112015021189B1 (ko)
CA (1) CA2906600A1 (ko)
CY (1) CY1125278T1 (ko)
DK (1) DK2970843T3 (ko)
ES (1) ES2894633T3 (ko)
HK (1) HK1213284A1 (ko)
HU (1) HUE056073T2 (ko)
IL (2) IL241339B (ko)
MX (1) MX369521B (ko)
RU (1) RU2668796C2 (ko)
SG (2) SG11201506344TA (ko)
TW (1) TWI656839B (ko)
WO (1) WO2014143691A1 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201506343QA (en) 2013-02-22 2015-09-29 Genzyme Corp Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof
EP2958989B1 (en) 2013-02-22 2018-12-26 Genzyme Corporation Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof
SG11201506344TA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Genzyme Corp High-density cell banking methods
TWI743024B (zh) 2014-06-06 2021-10-21 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
TWI776235B (zh) 2014-06-09 2022-09-01 美商健臻公司 種子罐培養法(seed train processes)及其用途
EP3369316B1 (en) 2014-08-14 2020-07-22 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Use of a high capacity, closed, cryopreservation cell-banking system and method for thawing and dispensing banked cells
KR20240005197A (ko) * 2014-09-18 2024-01-11 젠자임 코포레이션 초고밀도 세포 뱅킹 방법
WO2016106192A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Genzyme Corporation Methods of culturing a mammalian cell
RU2672318C1 (ru) * 2017-09-19 2018-11-13 Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" Способ получения моноклональных антител терапевтического назначения с помощью непрерывного культивирования клеток сно
TW202003832A (zh) * 2018-05-04 2020-01-16 美商健臻公司 具有過濾系統的灌注式生物反應器
CN111334427B (zh) * 2019-03-12 2023-05-05 华道(上海)生物医药有限公司 全封闭细胞培养系统
EP3795672A1 (en) * 2019-09-18 2021-03-24 Sartorius Stedim Biotech GmbH System and method for the generation of high cell density seed culture
WO2023285444A1 (en) * 2021-07-13 2023-01-19 Novo Nordisk A/S Method for large-scale banking of human pluripotent stem cells and products derived thereof
WO2023287707A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Bidirectional tangential flow filtration (tff) perfusion system

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU703484B2 (en) 1995-02-23 1999-03-25 Quest International Services B.V. Peptides for tissue and cell culture media
AUPN442295A0 (en) 1995-07-26 1995-08-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulated autocrine growth of mammalian cells
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US6391257B1 (en) 1998-08-19 2002-05-21 Prestone Products Corporation Antifreeze compositions comprising carboxylic acid and cyclohexenoic acid
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6544788B2 (en) 2001-02-15 2003-04-08 Vijay Singh Disposable perfusion bioreactor for cell culture
US20030054331A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Stemsource, Inc. Preservation of non embryonic cells from non hematopoietic tissues
US8206981B2 (en) * 2004-03-05 2012-06-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
US20060166364A1 (en) * 2004-12-22 2006-07-27 Introgen, Inc. Use of flexible bag containers for viral production
KR101368035B1 (ko) * 2005-04-08 2014-02-26 아르고스 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 수지상 세포 조성물 및 방법
EA016451B1 (ru) * 2006-07-14 2012-05-30 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Способ суспензионного культивирования клеток
CA2766902C (en) * 2009-07-06 2021-07-06 Genentech, Inc. Method of culturing eukaryotic cells
SG182611A1 (en) * 2010-01-22 2012-08-30 Lonza Walkersville Inc High yield method and apparatus for volume reduction and washing of therapeutic cells using tangential flow filtration
US10575515B2 (en) 2010-05-04 2020-03-03 The General Hospital Corporation Methods and compositions for preserving tissues and organs
US9550969B2 (en) * 2011-03-18 2017-01-24 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Flexible bag for cultivation of cells
WO2013006461A1 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Biogen Idec Ma Inc. Cholesterol-based media supplementals for cell culture
SG11201506344TA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Genzyme Corp High-density cell banking methods
KR20240005197A (ko) 2014-09-18 2024-01-11 젠자임 코포레이션 초고밀도 세포 뱅킹 방법

Also Published As

Publication number Publication date
IL241339A0 (en) 2015-11-30
US10188099B2 (en) 2019-01-29
IL267468A (en) 2019-08-29
CN105102605A (zh) 2015-11-25
EP2970843A1 (en) 2016-01-20
MX369521B (es) 2019-11-11
CN112410279A (zh) 2021-02-26
JP6742902B2 (ja) 2020-08-19
TWI656839B (zh) 2019-04-21
EP2970843B1 (en) 2021-09-01
KR20150130366A (ko) 2015-11-23
SG10201707554WA (en) 2017-11-29
AU2014228275A1 (en) 2015-10-01
BR112015021189A2 (pt) 2017-07-18
US20190223433A1 (en) 2019-07-25
RU2668796C2 (ru) 2018-10-02
EP4008768A1 (en) 2022-06-08
TW201524352A (zh) 2015-07-01
HUE056073T2 (hu) 2022-01-28
RU2015143439A (ru) 2017-04-26
ES2894633T3 (es) 2022-02-15
BR112015021189B1 (pt) 2021-05-04
HK1213284A1 (zh) 2016-06-30
DK2970843T3 (da) 2021-11-22
JP2016512684A (ja) 2016-05-09
WO2014143691A1 (en) 2014-09-18
KR102282939B1 (ko) 2021-07-28
CA2906600A1 (en) 2014-09-18
SG11201506344TA (en) 2015-09-29
AU2014228275B2 (en) 2019-03-14
US20140273206A1 (en) 2014-09-18
MX2015011965A (es) 2016-03-17
IL241339B (en) 2019-07-31
CY1125278T1 (el) 2023-03-24
AR095354A1 (es) 2015-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102282939B1 (ko) 고-밀도 세포 뱅킹 방법
JP7487263B2 (ja) 超高密度細胞バンキング方法

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application