BR112015021189B1 - método não centrífugo para produzir um banco de células de mamífero congeladas de alta densidade - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE BANCO DE CÉLULAS DE ALTA DENSIDADE. A presente invenção refere-se a um método para a criação de um banco de células criopreservadas de alta densidade usando técnicas de cultura em perfusão e concentração não centrífuga de células. Os métodos de produção usando este banco de células criopreservadas de alta densidade também são providos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade de um Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. 61/793,021, depositado em 15 de março de 2013, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade para todas as finalidades.

ANTECEDENTE

[0002] O banco de células convencional é amplamente usado para manter os estoques de células caracterizadas congeladas que podem ser descongeladas para uso em várias aplicações, incluindo a produção de proteínas terapeuticamente relevantes. Tipicamente, os estoques criopreservados são mantidos em densidades menores ou são centrifugados para criar alíquotas de densidade mais alta para armazenamento. Estoques de menor densidade não permitem inoculação eficiente de culturas de grande volume enquanto que os métodos de concentração com base em centrifugação podem ser muito prejudiciais às células (as quais se tornarão ainda mais frágeis durante o processo de criopreservação). Consequentemente, existe uma necessidade por métodos de banco de células melhorados.

SUMÁRIO

[0003] A revelação atual provê métodos melhorados para a criação de um banco de células. Em certos aspectos, o processo de banco de células da invenção emprega as técnicas de cultura em perfusão e concentração não centrífuga de células para permitir a criopreservação em densidades celulares inesperadamente altas enquanto se retém excelente viabilidade celular para uso posterior na produção de cultura celular.

[0004] Consequentemente, em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar as células em um biorreator de perfusão, em que tal biorreator está acoplado a um sistema de retenção celular; b) concentrar de forma não centrífuga tais células para produzir uma população celular concentrada; e c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade.

[0005] Em uma modalidade, o sistema de retenção celular compreende um sistema de filtração de fluxo alternante tangencial que compreende um filtro. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de pelo menos 0,3 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,7 a cerca de 0,8 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 2,0 a cerca de 3,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 4 a cerca de 5 m2.

[0006] Em uma modalidade, o filtro tem um tamanho de poro de cerca de 0,2 μm.

[0007] Em uma modalidade, a população celular concentrada tem uma densidade celular de pelo menos cerca de 1 x 108 células/mL.

[0008] Em uma modalidade, a população celular concentrada tem uma densidade celular de cerca de 1 x 108 células/mL.

[0009] Em uma modalidade, a criopreservação compreende adicionar DMSO à população celular concentrada até uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol. Em uma outra modalidade, a criopreservação compreende o congelamento de pelo menos uma parte da população celular concentrada em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.

[00010] Em uma modalidade, o recipiente é um frasco. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de pelo menos 2 mL. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de cerca de 5 mL.

[00011] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade compreende cerca de 4,5 x 108 células.

[00012] Em uma modalidade, o recipiente é uma bolsa criogênica. Em uma outra modalidade, a bolsa criogênica tem um volume de cerca de 5 a cerca de 150 mL.

[00013] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 1 x 108 células/mL.

[00014] Em uma modalidade, a taxa de perfusão no biorreator de perfusão é de pelo menos de cerca de 0,2 nL/célula/dia.

[00015] Em uma modalidade, a cultura celular em biorreator de perfusão tem um pH de cerca de 7 e uma concentração de oxigênio dissolvido de pelo menos de cerca de 40%.

[00016] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de bolsa flexível. Em uma outra modalidade, o biorreator de bolsa flexível tem um volume de 10L. Em uma outra modalidade, o biorreator de bolsa flexível tem um volume de pelo menos 20L. Em uma outra modalidade, o biorreator de bolsa flexível ainda compreende pelo menos um tubo de imersão.

[00017] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade de pós-descongelamento de pelo menos 60%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós- descongelamento de pelo menos 90%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade de pós-descongelamento de pelo menos 95%.

[00018] Em uma modalidade, as células são células de mamíferos. Em uma outra modalidade, as células de mamíferos são selecionadas do grupo que consiste de: células CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4, e células de hibridoma.

[00019] Em uma modalidade, as células são células transfectadas.

[00020] Em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar as células em um biorreator de perfusão acoplado a um sistema de filtração de fluxo alternante tangencial, em que o biorreator compreende um biorreator de bolsa flexível e em que o filtro tem uma área de superfície de filtro de pelo menos 0,3 m2 e um filtro com um tamanho de MWCO de pelo menos 50 kDa; b) concentrar de forma não centrífuga as células que usam um sistema de filtração de fluxo alternante tangencial para produzir uma população celular concentrada tendo uma densidade de cerca de 1x108 células/mL; e c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, em que a criopreservação compreende a adição de DMSO à população celular concentrada até uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol; e em que o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 10A8 células/mL.

[00021] Em uma modalidade, o pH e o DO da cultura são controlados por métodos automáticos.

[00022] Em uma modalidade, o pH e o DO da cultura são controlados por métodos não automáticos. Em uma outra modalidade, o pH e o DO são controlados através de qualquer um ou mais do seguinte: o ajuste da mistura de gases que são introduzidos na cultura, o ajuste da taxa de agitação do biorreator ou o ajuste do ângulo de agitação do biorreator.

[00023] Em uma modalidade, o biorreator é agitado a 15 rpm com um ângulo de agitação de 8 °.

[00024] Consequentemente, em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar células em um biorreator de perfusão, em que tal biorreator é acoplado a um sistema de retenção celular; b) concentrar de forma não centrífuga tais células para produzir uma população celular concentrada; e c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade.

[00025] Em uma modalidade, o sistema de retenção celular compreende um sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo que compreende um filtro. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de pelo menos 0,3 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,7 a cerca de 0,8 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 2,0 a cerca de 3,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 4 a cerca de 5 m2.

[00026] Em uma modalidade, o filtro tem um tamanho de poro de cerca de 0,2 μm.

[00027] Em uma modalidade, a população celular concentrada tem uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,1 x 108 células/mL.

[00028] Em uma modalidade, a população celular concentrada tem uma densidade celular de cerca de 1,1 x 108 células/mL.

[00029] Em uma modalidade, a criopreservação compreende adicionar DMSO a uma população celular concentrada em uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol. Em uma outra modalidade, a criopreservação compreende congelamento de pelo menos uma porção de uma população celular concentrada em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.

[00030] Em uma modalidade, o recipiente é um frasco. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de pelo menos 2 mL. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de cerca de 5 mL.

[00031] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade compreende cerca de 4,5 x 108 células.

[00032] Em uma modalidade, o recipiente é uma bolsa criogênica. Em uma outra modalidade, a bolsa criogênica tem um volume de cerca de 5 a cerca de 150 mL.

[00033] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 1 x 108 células/mL.

[00034] Em uma modalidade, a taxa de perfusão no reator de perfusão é de pelo menos cerca de 0,2 nL/célula/dia.

[00035] Em uma modalidade, a cultura celular do biorreator de perfusão tem um pH de cerca de 7 e uma concentração de oxigênio dissolvido de pelo menos cerca de 40%.

[00036] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de saco flexível. Em uma outra modalidade, o biorreator de saco flexível tem um volume de 10L. Em uma outra modalidade, o biorreator de saco flexível tem um volume de pelo menos 20L. Em uma outra modalidade, o biorreator de saco flexível ainda compreende pelo menos um tubo de imersão.

[00037] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de pelo menos 60%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós- descongelamento de pelo menos 90%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de pelo menos 95%.

[00038] Em uma modalidade, as células são células de mamíferos. Em uma outra modalidade, as células de mamíferos são selecionadas a partir do grupo que consiste em: células CHO, CHO-DBX11, CHO- DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Ag14 e células de hibridoma.

[00039] Em uma modalidade, as células são células transfectadas.

[00040] Em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar células em um biorreator de perfusão acoplado a um sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo, em que o biorreator compreende um biorreator de saco flexível e em que o filtro tem uma área de superfície de filtro de pelo menos 0,3 m2 e um filtro com um tamanho MWCO de pelo menos 50 kDa; b) concentrar de forma não centrífuga as células usando o sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo para produzir uma população de células concentradas que tem uma densidade de cerca de 1,1 x 108 células/mL; c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, em que a criopreservação compreende adicionar DMSO a uma população celular concentrada até uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol; e em que o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 108 células/mL.

[00041] Em uma modalidade, o pH e DO da cultura são controlados por métodos automáticos.

[00042] Em uma modalidade, o pH e DO da cultura são controlados por métodos não automáticos. Em uma outra modalidade, o pH e DO são controlados através de qualquer um ou mais de um dos seguintes: ajuste da mistura de gases que são introduzidos na cultura, ajuste da taxa de agitação do biorreator ou ajuste do ângulo de agitação do biorreator.

[00043] Em uma modalidade, o biorreator é agitado a 15 rpm com um ângulo de agitação de 8°.

[00044] Em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar as células em um biorreator de perfusão, em que tal biorreator é agitado para mistura eficiente e troca gasosa, em que tal biorreator é acoplado a um sistema de retenção celular; b) concentrar de forma não centrífuga tais células para produzir uma população celular concentrada; e c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade.

[00045] Em uma modalidade, o sistema de retenção celular compreende um sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo que compreende um filtro. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de pelo menos 0,3 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 0,7 a cerca de 0,8 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 2,0 a cerca de 3,0 m2. Em uma outra modalidade, o filtro tem uma área de superfície de cerca de 4 a cerca de 5 m2.

[00046] Em uma modalidade, o filtro tem um tamanho de poro selecionado a partir do grupo que consiste de 0,2 μm, 0,4 μm e 0,65 μm.

[00047] Em uma modalidade, a população celular concentrada tem uma densidade celular selecionada a partir do gupo que consiste de 1,0 x 108 células/mL, 1,1 x 108 células/mL,1,2 x 108 células/mL, 1,3 x 108 células/mL, 1,5 x 108 células/mL, 1,7 x 108 células/mL e 2,0 x 108 células/mL.

[00048] Em uma modalidade, a criopreservação compreende adicionar DMSO a uma população celular concentrada em uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol. Em uma outra modalidade, a criopreservação compreende congelamento de pelo menos uma porção de uma população celular concentrada em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.

[00049] Em uma modalidade, o recipiente é um frasco. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de pelo menos 2 mL. Em uma modalidade, o recipiente tem um volume de cerca de 5 mL.

[00050] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade compreende cerca de 4,5 x 108 células.

[00051] Em uma modalidade, o recipiente é uma bolsa criogênica. Em uma outra modalidade, a bolsa criogênica tem um volume de cerca de 5 a cerca de 150 mL.

[00052] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 1 x 108 células/mL.

[00053] Em uma modalidade, a taxa de perfusão no reator de perfusão está entre cerca de 0,02 nL/célula/dia a cerca de 0,5 nL/célula/dia.

[00054] Em uma modalidade, a cultura celular no biorreator de perfusão tem um pH de entre cerca de 6,8 e cerca de 7,2.

[00055] Em uma modalidade, a cultura celular do biorreator de perfusão tem uma concentração de oxigênio dissolvido de pelo menos cerca de 30%.

[00056] Em uma modalidade, o biorreator é um biorreator de saco flexível. Em uma outra modalidade, o biorreator de saco flexível tem um volume de 10L. Em uma outra modalidade, o biorreator de saco flexível tem um volume de pelo menos 20L. Em uma outra modalidade, o biorreator de bolsa flexível ainda compreende pelo menos um tubo de imersão.

[00057] Em uma modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de pelo menos 60%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós- descongelamento de pelo menos 90%. Em uma outra modalidade, o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de pelo menos 95%.

[00058] Em uma modalidade, as células são células de mamíferos. Em uma outra modalidade, as células de mamíferos são selecionadas a partir do grupo que consiste de: células CHO, CHO-DBX11, CHO- DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Ag14 e células de hibridoma.

[00059] Em uma modalidade, as células são células transfectadas.

[00060] Em um aspecto, a invenção provê um método não centrífugo para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, o método que compreende: a) cultivar células em um biorreator de perfusão acoplado a um sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo, em que o biorreator compreende um biorreator de saco flexível e em que o filtro tem uma área de superfície de filtro de pelo menos 0,3 m2 e um filtro com um tamanho MWCO de pelo menos 50 kDa; b) concentrar de forma não centrífuga as células usando o sistema de filtração de fluxo tangencial alternativo para produzir uma população de células concentradas que tem uma densidade maior do que cerca de 1,0 x 108 células/mL; c) criopreservar a população celular concentrada para produzir um banco de células congeladas de alta densidade, em que a criopreservação compreende adicionar DMSO a uma população celular concentrada até uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol; e em que o banco de células congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de cerca de 108 células.

[00061] Em uma modalidade, o pH e DO da cultura são controlados por métodos automáticos.

[00062] Em uma modalidade, o pH e DO da cultura são controlados por métodos não automáticos. Em uma outra modalidade, o pH e DO são controlados através de qualquer um ou mais de um dos seguintes: ajuste da mistura de gases que são introduzidos à cultura, ajuste da taxa de agitação do biorreator ou ajuste do ângulo de agitação do biorreator.

[00063] Em uma modalidade, o biorreator é agitado a uma taxa de pelo menos 15 rpm com um ângulo de agitação de pelo menos 8°.

[00064] Em uma modalidade, o biorreator é agitado a uma taxa de 15 rpm com um ângulo de agitação de 8°.

[00065] Em uma modalidade, o biorreator é agitado a 22 rpm com um ângulo de agitação de 10°.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00066] Figura 1: é um desenho de um processo de criobanco de células de alta densidade.

[00067] Figura 2: é um gráfico que retrata os perfis de crescimento celular de culturas de perfusão WAVE® usando diferentes métodos de retenção celular.

[00068] Figura 3: é um gráfico do desempenho do pós-banco (densidade celular viável (Xv), viabilidade) de mini-bancos feitos usando culturas colhidas em múltiplos momentos durante o crescimento.

[00069] Figura 4: é um gráfico do desempenho de pós-banco (apoptose tardia) de mini-bancos feitos usando culturas colhidas em múltiplos momentos durante o crescimento.

[00070] Figura 5: é um gráfico que mostra o crescimento celular com e sem os controles de retroalimentação de pH e DO automáticos.

[00071] Figura 6: é um gráfico que mostra os perfis de pH e DO com ou sem os controles de retroalimentação de pH e DO automáticos.

[00072] Figura 7A-B: é um gráfico da densidade celular viável (A) e a apoptose tardia (B) de células em estágios diferentes: pré- concentração, pós-concentração e após 0 a 120min de exposição a DMSO.

[00073] Figura 8A-B: é um gráfico do desempenho de pós-banco do banco de alta densidade (A) e de apoptose tardia (B) de linhagem celular 1 de rCHO quando comparado a um banco de densidade normal.

[00074] Figura 9A-B : é um gráfico do desempenho de pós-banco do banco de alta densidade (A) e de apoptose tardia (B) de linhagem celular 2 de rCHO quando comparado a um banco de densidade normal.

[00075] Figura 10A-B : é um gráfico do desempenho de pós-banco do banco de alta densidade (A) e de apoptose tardia (B) de linhagem celular 3 de rCHO quando comparado a um banco de densidade normal.

[00076] Figura 11: é um gráfico que indica a concentração de culturas ao longo do tempo usando um sistema de retenção celular diferente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00077] A revelação atual provê um método de criobanco de células de alta densidade que compreende o uso de um sistema de cultura em perfusão ligado a um dispositivo de retenção celular não centrífugo.

I. DEFINIÇÕES

[00078] Como usado no presente documento, o termo “cultura em batelada” se refere a uma técnica de cultura celular na qual uma quantidade de meio de cultura fresco é inoculada com células que entram rapidamente em uma fase de crescimento logarítmico e na qual o meio de crescimento da cultura não é removido de forma contínua e substituído com meio fresco.

[00079] Como usado no presente documento, o termo “cultura de batelada alimentada” se refere a uma técnica de cultura celular na qual uma quantidade de meio de cultura fresco é inoculada inicialmente com células e os nutrientes de cultura adicionais são alimentados (de forma contínua ou em incrementos discretos) à cultura durante o processo de cultura com ou sem colheita de produto e/ou célula periódica antes do término da cultura.

[00080] Como usado no presente documento, o termo “cultura em perfusão” se refere a uma técnica de cultura celular na qual uma quantidade de meio fresco é inoculada com células que rapidamente entram em uma fase de crescimento logarítmico (como acima) e na qual o meio de crescimento é continuamente removido de uma cultura e substituído com meio fresco.

[00081] Como usado no presente documento, o termo “biorreator” deve se referir a um recipiente para cultivar células.

[00082] Em uma modalidade, o biorreator é um “biorreator de bolsa flexível”. Um “biorreator de bolsa flexível” é uma câmara estéril capaz de receber um meio líquido e a qual adicionalmente compreende conectores, portas, adaptadores e tubulação flexível. Em uma modalidade, a câmara é feita de plástico. Em uma modalidade específica, a câmara é feita de plástico claro laminado em multicamadas. Em ainda uma outra modalidade específica, a câmara é feita de plástico claro laminado em multicamadas e tem camada de contato de fluido feita de copolímero de etileno vinil acetato/polietileno de baixa densidade USP de Classe VI enquanto a camada externa é feita de polietileno de baixa densidade.

[00083] De forma adicional, os conectores, portas e adaptadores podem ser feitos de qualquer tipo de plástico incluindo, porém, não limitado a: polietileno, polipropileno e policarbonato enquanto que a tubulação pode ser construída a partir de qualquer tipo de plástico que inclui, porém, não limitado a: elastômero termoplástico ou silicone (por exemplo, silicone curado com platina).

[00084] As câmaras apropriadas de “biorreator de bolsa flexível” podem ser encontradas na técnica e incluem, porém, não estão limitadas àquelas descritas na Patente Norte-Americana N°. 6.544.788, as quais são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00085] A câmara de “biorreator de bolsa flexível” pode ser parcialmente preenchida com meio de cultura e depois inflado para rigidez. Ela pode ser então colocada em uma plataforma de agitação (tal como unidade de agitação BASE20/50EHT da GE Life Sciences) que se move em ambas as direções através de um ângulo de agitação predefinido e taxa de agitação predefinida. Este movimento de agitação induz movimentos do tipo onda no meio de cultura, promovendo a agitação e a transferência de oxigênio de modo a melhorar o desempenho da cultura celular. O ângulo de agitação predefinido pode ser de pelo menos cerca de 4 graus, por exemplo, cerca de 4 graus, 5 graus, 6 graus, 7 graus, 8 graus, 9 graus ou 10 graus. Além disso, a taxa de agitação predefinida pode ser ajustada em taxa de agitação por minuto (rpm) que é de pelo menos cerca de 6 rpm, por exemplo, cerca de 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm ou 40 rpm. Em uma modalidade específica, a taxa de agitação por minuto é de cerca de 8 rpm. Em uma modalidade específica, a taxa de agitação por minuto é de cerca de 15 rpm. Em uma modalidade específica, a taxa de agitação por minuto é de cerca de 22 rpm.

[00086] Como usado no presente documento, o termo “sistema de retenção celular” se refere a todos os dispositivos com a capacidade de separar as células do meio e os resíduos dos mesmos pelo uso de um filtro. Os filtros podem incluir filtros de membrana, cerâmica ou de metal em qualquer formato que incluem em espiral, tubular ou em lâmina. Os filtros podem ser de áreas de superfície diferentes. Por exemplo, a área de superfície do filtro pode ser de cerca de 0,3 m2 a cerca de 5 m2, por exemplo, cerca de 0,3 m2, 0,4 m2, 0,5 m2, 0,6 m2, 0,7 m2, 0,77 m2, 0,8 m2, 0,9 m2, 1,0 m2, 1,1 m2, 1,2 m2, 1,3 m2, 1,4 m2, I.5 m2, 1,6 m2, 1,7 m2, 1,8 m2, 1,9 m2, 2,0 m2, 2,1 m2, 2,2 m2, 2,3 m2, 2,4 m2, 2,5 m2, 2,6 m2, 2,7 m2, 2,8 m2, 2,9 m2, 3,0 m2, 3,1 m2, 3,2 m2, 3,3 m2, 3,4 m2, 3,5 m2, 3,6 m2, 3,7 m2, 3,8 m2, 3,9 m2, 4,0 m2, 4,1 m2, 4,2 m2, 4,3 m2, 4,4 m2, 4,5 m2, 4,6 m2, 4,7 m2, 4,8 m2, 4,9 m2 ou cerca de 5 m2. Em certas modalidades, o módulo de filtro tem um tamanho de massa molecular de corte (MWCO) de cerca de 10 quilodaltons (kDa) a cerca de 100 kDa, por exemplo, ele é de cerca de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa ou 100 kDa. Em outras modalidades, o módulo de filtro tem um tamanho de malha de cerca de 0,1 μm a cerca de 3 μm, por exemplo de cerca de 0,1 μm, 0,2 μm, 0,3 μm, 0,4 μm, 0,5 μm, 0,6 μm, 0,7 μm, 0,8 μm, 0,9 μm, 1,0 μm, 1,1 μm, 1,2 μm, 1,3 μm, 1,4 μm, 1,5 μm, 1,6 μm, 1,7 μm, I.8 μm, 1,9 μm, 2,0 μm, 2,1 μm, 2,2 μm, 2,3 μm, 2,4 μm, 2,5 μm, 2,6 μm, 2,7 μm, 2,8 μm, 2,9 μm ou cerca de 3,0 μm.

[00087] Como usado no presente documento, o termo “criopreservação” se refere a um processo pelo qual as células, tecidos ou quaisquer outras substâncias suscetíveis ao dano causado pelo tempo ou por atividade química ou enzimática são preservados por resfriamento e armazenamento destes em temperaturas sub-zero.

[00088] Como usado no presente documento, o termo “criobanco” se refere a uma técnica pela qual as células são misturadas com um crioprotetor (por exemplo, DMSO com ou sem amido de hidroxietila (HES)) e colocadas em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação. Esses recipientes são então congelados usando técnicas bem conhecidas na técnica e armazenados em baixas temperaturas, tipicamente entre cerca de - 130 C e cerca de -195 C. A coleção de células obtidas pelo processo é um banco de células.

[00089] Em uma modalidade, o banco de células é um banco de células de alta densidade. Como usado no presente documento, o termo “banco de células de alta densidade” deve se referir a alíquotas em criobanco que foram congeladas em uma alta densidade, em que a densidade é de pelo menos cerca de 7 x 107 células viáveis/mL, por exemplo, ela é de cerca de 7 x 107 células viáveis/mL, 8 x 107 células viáveis/mL, 9 x 107 células viáveis/mL, 1 x 108 células viáveis/mL, 2 x 108 células viáveis/mL ou 3 x 108 células viáveis/mL. As células podem ser congeladas de acordo com qualquer método disponível na técnica e em qualquer recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.

[00090] Em uma outra modalidade, o banco de células é um banco de células principal. Como usado no presente documento, o termo “banco de células principal” deve se referir a uma cultura de células (por exemplo, células totalmente caracterizadas) que cresceram de um único clone, dispensado em recipientes de armazenamento (por exemplo, dispensados nos recipientes em uma única operação) e armazenada sob condições de criopreservação como descrito acima. Em certas modalidades, as células são adequadas para uso posterior em uma cultura celular de produção e uma colheita adicional das proteínas terapeuticamente relevantes produzidas com isso.

[00091] Em uma outra modalidade, o banco de células é um banco de células pequeno. Como usado no presente documento, o termo “banco pequeno” deve se referir a alíquotas de células que foram criopreservadas de acordo com os procedimentos de “criobanco” (como descritos acima), porém são compostas de poucas amostras do que seriam normalmente usadas para criar um banco de células. Este tipo de banco pode ser geralmente usado para otimizar as condições que estão sendo consideradas para a criopreservação de uma linhagem celular antes dos bancos de células tais como um “banco de células principal” serem criados. Como um exemplo, um “banco pequeno” é usado para determinar a densidade celular mais adequada para o procedimento de células de alta densidade descrito nesta revelação.

[00092] Como usado no presente documento, o termo “recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação” inclui qualquer recipiente que pode ser usado sob condições apropriadas para armazenamento celular entre cerca de -130 C e cerca de -195 C. Esses recipientes incluem, porém não estão limitados a frascos que são feitos de materiais adequados para a criopreservação. Esses materiais incluem polímeros (por exemplo, politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno ou polipropileno). Além disso, os tratamentos de superfície podem ser aplicados a uma superfície do frasco de criopreservação de modo a melhorar as condições de criopreservação (por exemplo, revestimentos hidrofílicos que reduzem a adsorção e a desnaturação). Em modalidades de exemplo, o frasco pode ter um volume de mais do que cerca de 0,1 mL, por exemplo, o frasco pode ter um volume de cerca de 0,1 mL, cerca de 0,5 mL, cerca de 0,75 mL, cerca de 1 mL, cerca de 2 mL, cerca de 2,5 mL, cerca de 5 mL, cerca de 10 mL, cerca de 15 mL, cerca de 20 mL, cerca de 25 mL ou cerca de 50 mL. O recipiente também pode ser uma bolsa criogênica.

[00093] Como usado no presente documento, o termo “bolsa criogênica” é uma câmara estéril que é capaz de receber um meio líquido, é apropriado para armazenamento celular entre cerca de - 130 C e cerca de -195 C, e pode adicionalmente compreender conectores, portas, adaptadores e tubulação flexível. A bolsa criogênica pode ser construída de qualquer material apropriado que inclui, porém não está limitado a polímeros tais como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, Etileno Propileno Fluorado (FEP) e etileno vinil acetato (EVA). As bolsas criogênicas exemplares incluem, porém não estão limitados a: bolsas de criopreservação KryoSure®, Sacos PermaLife™ (Origen Pharmaceutical), sacos para congelamento CryoStore, biorrecipientes Freeze-PakTM.

[00094] Como usado no presente documento, o termo “frasco de agitação” deve se referir a um recipiente como um frasco de cultura no qual o meio é constantemente agitado durante a incubação.

[00095] Como usado no presente documento, o termo “sequência de sementes do frasco de agitação” deve se referir a um método de expansão celular no qual uma alíquota de células é primeiro cultivada (disseminada) em um frasco de agitação e cultivada no mesmo. As células são cultivadas de acordo com a sua taxa de crescimento e são geralmente divididas em recipientes maiores e/ou múltiplos durante seu crescimento até que a biomassa tenha alcançado um nível suficiente para inocular um biorreator.

[00096] Como usado no presente documento, o termo “densidade das sementes” deve se referir à densidade celular inicial na qual um frasco ou um é inoculado.

[00097] Como usado no presente documento, o termo “proteína terapeuticamente relevante” deve se referir a qualquer proteína que pode ser usada para criar um tratamento para uma doença ou distúrbio ou para tratar uma doença ou distúrbio em um animal, incluindo mamíferos tais como camundongos, ratos, macacos, primatas e seres humanos. Essas proteínas podem incluir, porém não estão limitadas a polipeptídeos de ligação tais como anticorpos monoclonais, proteínas de fusão Fc, anticoagulantes, fatores sanguíneos, proteínas morfogênicas ósseas, estruturas de proteínas criadas pela engenharia genética, enzimas, fatores de crescimento, hormônios, interferons, interleucinas e trombolíticos.

[00098] Como usado no presente documento, o termo "polipeptídeo de ligação" ou “polipeptídeo de ligação” deve se referir a um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo) que contém pelo menos um sítio de ligação o qual é responsável pela ligação de forma seletiva a um antígeno alvo de interesse (por exemplo, um antígeno humano). Os sítios de ligação exemplares incluem um domínio variável de anticorpo, um sítio de ligação ligante de um receptor, ou um sítio de ligação receptor de um ligante. Em certos aspectos, os polipeptídeos de ligação da invenção compreendem sítios de ligação múltiplos (por exemplo, dois, três, quatro ou mais).

[00099] Como usado no presente documento, o termo "anticorpo" se refere a tais reuniões (por exemplo, moléculas de anticorpo intactas, fragmentos de anticorpo ou variantes dos mesmos) as quais têm uma significante conhecida atividade imunorreativa específica a um antígeno de interesse (por exemplo, um antígeno associado a tumor). Os anticorpos e as imunoglobulinas compreendem cadeias leves e pesadas, com ou sem uma ligação covalente entre as cadeias entre elas. As estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas vertebrados são relativamente bem entendidas.

[000100] O termo genérico "anticorpo" compreende cinco classes distintas de anticorpo que podem ser distinguidas de forma bioquímica. Todas as cinco classes de anticorpos estão claramente dentro do escopo da revelação atual, a discussão a seguir estará geralmente direcionada à classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com relação ao IgG, as imunoglobulinas compreendem duas idênticas cadeias de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons e as duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53.000-70.000. As quatro cadeias são unidas por ligações dissulfeto em uma configuração "Y" em que as cadeias leves incluem as cadeias pesadas na boca da "Y" e continuam através da região variável.

II. CULTURA CELULAR EM PERFUSÃO

[000101] A cultura celular tradicional envolve um processo de cultura “em batelada”. Neste tipo de cultura, uma quantidade de meio fresco é inoculada com as células que entram rapidamente em uma fase de crescimento logarítmico. À medida que essas células crescem e se dividem, elas consumem os nutrientes disponíveis do meio e excretam resíduos prejudiciais. Ao longo do tempo, a cultura entrará em uma fase de crescimento estacionária e finalmente uma fase de decadência. Enquanto as modificações no processo de cultura “em batelada” a tornaram mais eficiente ao longo do tempo, os protocolos de cultura em batelada modificados resultantes ainda resultam em ciclos de crescimento rápido e decadência. Além disso, o processo de cultura “em batelada” tem uma capacidade limitada para alcançar os níveis de densidade celular que são necessários para permitir o banco de células de alta densidade.

[000102] O processo de cultura “em batelada alimentada” se refere a um melhoramento adicional na técnica de cultura celular sobre as técnicas de cultura “em batelada” tradicionais. Enquanto este processo permite um maior crescimento de células de alta densidade, ele ainda é limitado em sua capacidade de permitir um crescimento eficiente de culturas de células de alta densidade e, portanto, gerar de forma eficiente células para o banco de células de alta densidade.

[000103] Em modalidades preferidas, a invenção emprega um processo de cultura em perfusão. A cultura em perfusão é um método para cultivar células no qual uma quantidade de meio fresco é inoculada com as células que entram rapidamente em uma fase de crescimento logarítmico (como acima) e no qual o meio de crescimento é continuamente removido de uma cultura e substituído com meio fresco. Neste modo, a cultura constantemente recebe meio fresco com alto nível de nutrientes, enquanto que o meio que contém os resíduos e com baixos níveis de nutrientes é removido. Este tipo de cultura de células permite a manutenção do crescimento logarítmico de células no qual pelo menos um volume de cultura é trocado por dia e as concentrações celulares podem ser muito maiores do que aquelas alcançadas em cultura em batelada tradicional ou modificada (um aumento de entre 2 a mais do que 10 vezes). Em uma modalidade da presente invenção, a taxa de perfusão celular específica (CSPR) pode estar entre cerca de 0,02 nL célula-1dia-1 e cerca de 0,5 nL célula-1dia-1, por exemplo pode ser de cerca de 0,02 nL célula-1dia-1, 0,05 nL célula-1dia-1, 0,1 nL célula-1dia-1, 0,2 nL célula-1dia-1, 0,3 nL célula-1dia-1, 0,4 nL célula-1dia-1 ou 0,5 nL célula-1dia-1. Em uma modalidade específica, a cultura em perfusão pode ser realizada em um biorreator o mínimo de um tubo de imersão.

[000104] Em certas modalidades, o pH, a temperatura, a concentração de oxigênio dissolvido (DO) e a osmolaridade da cultura podem ser ajustados para maximizar a saúde e a produtividade da cultura. Um método para controlar a DO e o pH de culturas é através de um controlador de retroalimentação automatizado. Este tipo de controlador automatizado opera usando computadores com base em microprocessador para monitorar e ajustar o pH e a DO da cultura e com isso manter as condições mais eficientes para o crescimento celular. No entanto, esses sistemas de controle de retroalimentação automatizado são custosos. Consequentemente, em certas modalidades, um método não automatizado para controlar esses parâmetros pode ser empregado. Em uma modalidade exemplar, qualquer um de: ajuste da mistura de gás que flui sobre a cultura, ajuste da taxa de agitação WAVE® ou ajuste do ângulo de agitação da cultura podem ser usados para controlar os parâmetros selecionados (por exemplo, o pH ou a DO).

[000105] Em uma modalidade, o nível de partida do gás dióxido de carbono é de cerca de 10% e o nível de partida de gás oxigênio é de cerca de 20% com uma taxa de vazão de ar de cerca de 0,2 litro por minuto (lpm). Se o pH não é de mais do que 6,9, o ponto de ajuste de CO2 pode ser reduzido de 10% a 5%. Se o pH não é ainda de mais do que cerca de 6,9 em um momento mais tarde, o ponto de ajuste de CO2 ainda pode ser reduzido de 5% a 0%. Se o pH não é ainda de mais do que cerca de 6,9, a taxa de perfusão pode ser aumentada. Se a DO não é de mais do que cerca de 45%, o ponto de ajuste de O2 deve ser aumentado de 20% a 30%. Se a DO é de mais do que cerca de 45% em um momento mais tarde, o nível de O2 deve ser aumentado de 30% a 40%, a velocidade de agitação deve ser aumentada até cerca de 25 rpm e o ângulo de agitação deve ser mudado até cerca de 12°.

[000106] Em uma modalidade, a taxa de agitação da cultura também pode ser ajustada durante a etapa de concentração final para evitar a inclusão de ar no sistema de retenção celular. i. Meio de Cultura Celular

[000107] Qualquer tipo de meio de cultura celular adequada para a cultura de células pode ser usado nos métodos da presente invenção. As orientações para escolha de um meio celular apropriado são bem conhecidas na técnica e são providas em, por exemplo, Capítulos 8 e 9 de Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss; and in Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Cada uma dessas referências é aqui incorporada em sua totalidade. Existem métodos adicionais na técnica para a preparação e manutenção de culturas celulares sob condições livres de proteínas e livres de componentes derivados de animal (incluindo métodos que compreendem as células CHO) tais como aquelas observadas nos Pedidos de Patente Internacional No. WO97/05240, No. WO 96/26266 e No. WO 00/11102, Patentes Norte-Americanas No. 6.100.061, No. 6.475.725 e 8.084.252. Cada um dos documentos precedentes é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade da presente invenção, o meio livre de componente derivado de animal (ADC) pode ser usado. O meio mínimo sintético convencional pode conter sais inorgânicos, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carboidrato e água. Em uma modalidade específica da presente invenção, o meio que pode ser usado é CD-CHO (GIBCO, Invitrogen Corp.; um meio livre de origem animal que é quimicamente especificado e não contém proteínas, hidrolisados ou componentes de origem desconhecida). De forma adicional, o meio pode ter componentes adicionais que incluem a glutamina e/ou o metotrexato ou outros fatores que podem auxiliar no crescimento ou aderência. Em uma modalidade específica, o componente adicional pode ser GLUTAMAX-1 ou L-glutamina adicionado entre cerca de 2 mM e cerca de 8 mM, por exemplo em cerca de 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM ou cerca de 8 mM. ii. Células Hospedeiras e Vetores de Expressão

[000108] Em certas modalidades, as células empregadas no processo de banco de células da invenção são células hospedeiras que hospedam uma construção de expressão para a expressão de uma proteína terapeuticamente relevante ou outro polipeptídeo de interesse. Qualquer célula que pode ser usada para expressar um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um polipeptídeo de ligação) pode ser usada de acordo com os métodos descritos no presente documento. As células podem conter opcionalmente sequências de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente ou recombinantes, por exemplo, um vetor de expressão que contém um polipeptídeo de interesse. O vetor de expressão pode opcionalmente conter controles transcricionais e translacionais apropriados e podem ser construídos usando tecnologia de RNA recombinante conhecida na técnica. Os vetores de expressão podem ser transferidos a qualquer célula hospedeira por técnicas conhecidas na técnica e as células transformadas podem depois cultivadas de acordo com o método da presente invenção para criar um banco de células de alta densidade. Além disso, o banco de células de alta densidade pode depois descongelado e cultivado de acordo com as técnicas conhecidas na técnica de modo a produzir a proteína codificada de interesse e, quando desejado, esta proteína pode ser subsequentemente purificada.

[000109] Em certas modalidades, uma variedade de sistemas de expressão de hospedeiro pode ser usada para produzir proteínas terapeuticamente relevantes. Além disso, o sistema de expressão de hospedeiro pode ser um sistema celular de mamíferos (por exemplo, células CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NSO, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 e células de hibridoma) que hospedam os construtos de expressão recombinante que contêm os promotores derivados do genoma de células de mamíferos. Os sistemas de expressão com base viral também podem ser utilizados de acordo com as células de mamíferos (veja, por exemplo, Logan e outros, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359, aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade). A eficiência da expressão pode ser melhorada pela inclusão de elementos que incluem (porém não estão limitados a) elementos de melhoramento de transcrição apropriados e finalizadores de transcrição (veja, por exemplo, Bittner e outros, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544, aqui incorporados a título de referência em sua totalidade).

[000110] Em outras modalidades, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida a qual modula a expressão das sequências inseridas ou que modifica e processa o produto do gene na forma específica desejada. As células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós- translacional e a modificação de proteínas e produtos de gene. As linhagens celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e o processamento do polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo de ligação) expressado. Tais células incluem, por exemplo, linhagens celulares de mamíferos estabelecidas e células animais, assim como linhagens celulares de insetos, células de fungos e células de levedura. iii. Biorreatores

[000111] Qualquer biorreator adequado para cultivar células sob condições de cultura em perfusão pode ser empregado nos métodos da invenção. O biorreator pode ser inoculado usando uma alíquota de células em uma densidade de sementes apropriada (tal como um frasco de células ou células a partir de uma cultura iniciadora, por exemplo, um frasco de agitação ou uma sequência de sementes do frasco de agitação que foram cultivadas naquela densidade). A densidade das sementes apropriada para uma cultura depende de vários fatores que incluem o tipo de células usadas e o biorreator que está sendo inoculado. A densidade de sementes apropriada pode ser determinada usando os métodos disponíveis na técnica.

[000112] Em certas modalidades, o biorreator pode ser de uma natureza descartável, por exemplo, o biorreator pode ser um saco flexível ou um frasco plástico que está conectado ao dispositivo de retenção celular através de tubulação flexível. Ele pode ter um volume de cerca de 1L, 2L, 5L, 10L, cerca de 20L, 50L, 75L, 85L, 100L, 150L ou cerca de 400L. Em uma modalidade específica da invenção, o biorreator é um saco flexível de 10L que foi customizado com dois tubos de imersão, isto é, tubos que são usados para remover o meio ou o produto. Os biorreatores descartáveis exemplares são biorreatores de saco celular WAVE® (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) tais como biorreator de 20L WAVE®. Esses são os sistemas de biorreator de perfusão descritos em, dentre outros documentos: Singh,1999, Disposable biorreator for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, p.149-158, aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

[000113] O volume de trabalho do reator é o volume ocupado por cultura. O volume de trabalho por ser, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais da cultura, porém preferencialmente não mais do que 75%.

[000114] De forma alternativa, o biorreator pode ser um de natureza não descartável. Por exemplo, o biorreator pode ser feito de aço inoxidável ou vidro. Os biorreatores alternativos adequados para uso na presente invenção incluem, porém não estão limitados a: frascos de agitação, recipientes de tanque agitados, recipientes do transporte aéreo e sacos descartáveis que podem ser misturados por agitação.

[000115] Em uma modalidade, o biorreator pode ser acoplado a um sistema de retenção celular, incluindo, porém, não limitado a ajustador embutido, sistemas de TFF de cesta giratória e sistemas de ATF. II. Centrifugação não centrífuga

[000116] A cultura em perfusão depende da capacidade de remover o meio sem nutrientes e que contém resíduos da cultura enquanto minimiza o dano às células. Os métodos iniciais de retenção celular, no qual o meio esvaziado é separado das células cultivadas, frequentemente danificava as células através de problemas inerentes tais como a criação de forças de cisalhamento. Isso eventualmente resulta na obstrução dos filtros e na falha dos dispositivos de perfusão, muitos dos quais eram internos ao sistema de cultura. Consequentemente, em um aspecto, a revelação atual provê um método que faz uso de um “sistema de retenção celular” que permite a troca de meios e é então usado para concentrar adicionalmente a cultura celular para o criobanco.

[000117] Em uma modalidade, o tipo de sistema de retenção celular usado no filtro do tipo “embutido” em que o filtro está disposto na câmara do biorreator e está livre para se mover dentro da câmara. O filtro pode ser acoplado a um dos tubos que levam para fora da câmara, com isso permite o meio filtrado a ser tirado da cultura, um exemplo de um filtro do tipo “embutido” pode ser encontrado na Patente Norte-Americana No. 6.544.788, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[000118] Em uma outra modalidade, o sistema de retenção celular usado é um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF). Em um sistema de TFF, o meio de cultura é circulado de um recipiente de cultura através de um módulo de filtração e depois de volta ao recipiente de cultura por meio de uma bomba anexada à tubulação entre o módulo de filtração e o recipiente de cultura, produzindo um fluxo tangencial através do módulo de filtro. Uma segunda bomba é posicionada no lado do filtrado do módulo de filtro e é usada para controlar a taxa na qual o filtrado é removido. O uso de filtros de membrana de fibra vazada é preferido neste sistema já que eles são mais fáceis para se esterilizar e permitem a manutenção de um fluxo uniforme através do filtro de módulo. No entanto, quando os filtros de fibra vazada são empregados neste sistema, eles tendem a ficar obstruídos à medida que o fluxo monodirecional leva à agregação de matéria particulada na entrada do lúmen.

[000119] Em uma modalidade específica, o tipo de sistema de retenção celular usado é um sistema de fluxo tangencial alternativo (ATF). No tipo de sistema de retenção celular de ATF, um compartimento de filtração é conectado a um recipiente de armazenamento em uma extremidade e uma bomba de diafragma na outra. A bomba primeiro move o meio do recipiente através do elemento de filtro à bomba e depois reverte para enviar o meio da bomba através do filtro e de volta ao recipiente, criando um fluxo alternativo ou bidirecional. Isto é referido como um fluxo tangencial alternativo (ATF) como se houvesse um fluxo alternativo tangencial no módulo de filtro, isto é, existe um fluxo na mesma direção das superfícies da membrana do módulo de filtro (tangencial àquela superfície) e que existe um outro fluxo que é substancialmente perpendicular àquelas superfícies. Este tipo de filtração era existente na literatura desde 2000 e resulta em fluxo rápido, de baixo cisalhamento, uniforme. A filtração de ATF pode ser obtida por métodos conhecidos na técnica, tais como são descritos na Patente Norte-Americana N° 6.544.424, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Além disso, os sistemas de fluxo alternante tangencial estão disponíveis comercialmente dos fabricantes tais como Refine Technology e incluem vários modelos tais como sistemas de ATF2, ATF4, ATF6, ATF8 e ATF10.

[000120] Em uma outra modalidade específica da invenção, o filtro é um filtro de membrana tubular e além disso pode ser um filtro de fibra vazada.

[000121] Como indicado acima, os métodos da invenção permitem a concentração não centrífuga de células em altas densidades. Em uma modalidade particular da invenção, a cultura é cultivada até uma densidade de pelo menos 1 x 107 células/mL, por exemplo até cerca de 1 x 107 células/mL, cerca de 2 x 107 células/mL, cerca de 3 x 107 células/mL, cerca de 4 x 107 células/mL, cerca de 5 x 107 células/mL, cerca de 6 x 107 células/mL, cerca de 7 x 107 células/mL ou cerca de 8 x 107 células/mL e ao seguir aquele período de crescimento, existe uma etapa de concentração adicional que é realizada usando métodos não centrífugos. Esta etapa de concentração pode concentrar a cultura até uma densidade de pelo menos 5 x 107 células/mL, por exemplo cerca de 5 x 107 células/mL, 6 x 107 células/mL, 7 x 107 células/mL, 8 x 107 células/mL, 9 x 107 células/mL, 10 x 107 células/mL, 11 x 107 células/mL, 12 x 107 células/mL, 13 x 107 células/mL, 14 x 107 células/mL, 15 x 107 células/mL, 16 x 107 células/mL, ou 17 x 107 células/mL. O método não centrífugo usado para ainda concentrar a cultura pode fazer uso de qualquer sistema de retenção celular conhecido na técnica (por exemplo, um filtro do tipo “embutido”, um sistema de TFF ou um sistema de ATF que inclui aqueles descritos acima). III. Criopreservação e Banco de Células

[000122] A criopreservação se refere a um processo pelo qual as células, tecidos ou quaisquer outras substâncias suscetíveis ao dano causado pelo tempo ou por atividade enzimática ou química são preservados pelo resfriamento e armazenamento delas à temperaturas sub-zero. A importância de criopreservação de linhagens celulares importantes não pode ser subestimada, à medida que (entre outras vantagens importantes) isso permite a manutenção dessas linhagens sem mantê-las em cultura constante, diminui o risco de contaminação e reduz o risco de deriva genética.

[000123] Ao se usar os métodos de criopreservação, é vital alcançar e permanecer nessas baixas temperaturas sem causar dano adicional através da formação de gelo durante o processo de congelamento. Os métodos na técnica usam tradicionalmente as substâncias que diminuem o dano do congelamento às células chamadas crioprotetoras. Os crioprotetores podem ser adicionados ao meio de culturas de células antes do processo de congelamento. Em uma modalidade específica, o crioprotetor usado pode ser um ou mais de: glicerol ou sulfóxido de dimetila (DMSO). De forma adicional, o crioprotetor pode ser adicionado com ou sem amido de hidroxietila (HES). Em uma modalidade específica adicional, o DMSO pode ser adicionado a uma concentração de pelo menos 5%, por exemplo, ele pode ser adicionado em cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, a cerca de 18%, cerca de 19% ou em cerca de 20%.

[000124] A cultura com o crioprotetor adicionado pode ser então dispensada em recipientes apropriados para armazenamento sob condições de criopreservação. Em uma modalidade, este recipiente pode ser um frasco feito de um material, o qual pode incluir (porém não está limitado a) polímeros tais como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno ou polipropileno. Em uma modalidade específica, o frasco pode ter um tratamento de superfície adicional de modo a melhorar as condições de criopreservação (por exemplo, revestimentos hidrofílicos que reduzem a adsorção e a desnaturação). Em modalidades exemplares, o frasco pode ter um volume de mais do que cerca de 0,1 mL, por exemplo o frasco pode ter um volume de cerca de 0,1 mL, cerca de 0,5 mL, cerca de 0,75 mL, cerca de 1 mL, cerca de 2 mL, cerca de 2,5 mL, cerca de 5mL, cerca de 10 mL, cerca de 15 mL, cerca de 20 mL, cerca de 25 mL ou cerca de 50 mL. Em uma outra modalidade, o recipiente também pode ser uma bolsa criogênica. A bolsa criogênica pode ser construída de qualquer material apropriado que inclui, porém não está limitado a polímeros tais como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, Etileno Propileno Fluorado (FEP) e etileno vinil acetato (EVA). Os biorreatores descartáveis exemplares incluem, porém não estão limitados a: bolsas de criopreservação KryoSure®, sacos PermaLife™ (Origen Pharmaceutical), sacos de congelamento CryoStore, biorrecipiente Freeze-PakTM.

[000125] Esses recipientes são então congelados usando técnicas e dispositivos bem conhecidos na técnica antes de serem armazenados em baixas temperaturas, tipicamente entre cerca de -130 C e cerca de -195 C. Em uma modalidade, a técnica de congelamento usada pode ser taxa de controle e congelamento lento (também chamada de congelamento programável lento ou SPF). A coleção de células obtidas pelo processo é um banco de células.

[000126] Em uma modalidade, o banco de células pode ser, porém não está limitado a um banco de células de alta densidade, um banco de células principal ou um banco pequeno. iv. Determinação de viabilidade celular

[000127] Como indicado acima, os métodos da invenção permitem o banco de células em altas densidades enquanto retém a excelente viabilidade celular para uso posterior. Como usado no presente documento, o termo “viabilidade celular” pode ser definido como o número ou porcentagem de células saudáveis em uma dada amostra. A viabilidade de células pode ser determinada usando qualquer método disponível na técnica em qualquer momento no processo de banco de células de alta densidade descrito. Os métodos comumente usados para a determinação de viabilidade celular são baseados amplamente no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem certos corantes, tais como azul de tripano (um corante diazo), eosina ou propídio enquanto que as células mortas não.

[000128] Em uma modalidade, o azul de tripan pode ser usado para manchar uma quantidade de células e com isso indicar a presença de células com membranas intactas (não manchadas) e a presença de células com membranas rompidas (azul). Essas células podem então ser contadas para determinar os números de ambas as células vivas e mortas na cultura e apresentadas como uma porcentagem para indicar a saúde relativa da cultura.

[000129] Em uma modalidade específica, a viabilidade celular pode ser determinada usando uma cultura que foi concentrada, porém ainda não foi congelada (isto é uma cultura pré-descongelamento). Em uma modalidade específica, a viabilidade celular pode ser determinada usando uma cultura que foi concentrada, congelada e depois descongelada (isto é, uma cultura pós-descongelamento).

[000130] Em uma modalidade específica, a viabilidade celular pode ser de mais do que cerca de 60%, por exemplo, cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. Em certas modalidades, a viabilidade pós-descongelamento das células é de mais do que cerca de 80%, por exemplo, mais do que 85%, 90% ou 95% incluindo até 100%.

[000131] A apoptose é a morte celular programada e um curso regulatório ativo de crescimento celular e proliferação. As células respondem a sinais de indução específicos que resultam em mudanças fisiológicas características. Dentre estes está a externalização de fosfatidilserina (PS) à superfície externa da célula durante o curso apoptótico precoce. O Guava Nexin® Assay utiliza Anexina V-PE (uma proteína de ligação ao fosfolipídeo dependente de cálcio com uma alta afinidade para PS) para detectar PS na membrana externa das células apoptóticas. O corante celular impermeável, 7-AAD, também é usado como um indicador de integridade estrutural da membrana celular. 7-AAD é excluído das células vivas, saudáveis assim como das células apoptóticas precoces. Três populações de células podem ser distinguidas neste ensaio: 1) Células não apoptóticas (ou células saudáveis): 2) Anexina V(-) e 7-AAD(-). 3) Células apoptóticas precoces: Anexina V(+) e 7-AAD(-) 4) Células apoptóticas de estágio tardio e células mortas: Anexina V(+) e 7-AAD(+)

[000132] A quantidade de células apoptóticas tardias é uma outra medida de saúde das culturas pós-descongelamento e pode ser monitorada como mostrado nas Figuras 4 e 7B. Em uma modalidade específica, as células apoptóticas tardias pós-descongelamento devem ser menores do que 30 % da população de células viáveis. Em uma outra modalidade, as células apoptóticas tardias pós-descongelamento devem ser menores do que 20 % da população de células viáveis. Em uma outra modalidade, as células apoptóticas tardias pós- descongelamento devem ser menores do que 10 % da população de células viáveis. V. Proteínas terapeuticamente relevantes

[000133] As células derivadas do método de criobanco de células de alta densidade da invenção podem ser empregadas em uma fase de produção posterior para a fabricação de uma proteína. Por exemplo, as células propagadas no biorreator e congeladas em alíquotas de banco de alta densidade de acordo com os métodos da presente invenção podem ser usadas para a produção de substâncias biológicas que incluem as proteínas terapeuticamente relevantes. Essas substâncias biológicas podem incluir, porém não estão limitadas a: vírus (veja por exemplo, WO200138362), polipeptídeos de ligação tais como anticorpos, por exemplo anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos, por exemplo fragmentos fab; proteínas de fusão Fc, anticoagulantes, fatores sanguíneos, proteínas morfogenéticas ósseas, estruturas de proteína produzidas por engenharia genética, enzimas, fatores de crescimento, hormônios, interferons, interleucinas e trombolíticos. Essas substâncias biológicas podem ser colhidas usando qualquer método disponível na técnica. Em uma modalidade, a invenção provê um método para produzir uma substância biológica, o método compreendendo: cultivar células capazes de expressar uma substância biológica, em que as células foram obtidas para a partir de um banco de células congeladas de alta densidade produzidas usando cultura em perfusão e métodos de concentração não centrífuga. A substância biológica pode ser (porém não está limitada a) uma proteína (por exemplo, qualquer proteína terapeuticamente relevante). EXEMPLOS

[000134] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir os quais não devem ser construídos como limitativos. Os conteúdos das figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido estão expressamente incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Exemplo 1: Projeto e implementação de um protocolo de banco de células de alta densidade

[000135] Este protocolo de criobanco de células de alta densidade começa com um frasco principal de banco de células de 2 mL (volume de trabalho 1,5 mL) a uma densidade aproximada de 2,0-2,4 x 107 células viáveis/mL (condição de criopreservação celular normal). As células são então cultivadas em cultura de perfusão e concentradas via fluxo alternante tangencial. Seguindo a adição de DMSO à cultura de células concentradas, esta cultura de células de alta densidade é dispensada em aproximadamente 200 frascos separados de 5 mL (aproximadamente 4,5 mL de volume de trabalho) para o armazenamento como um banco de células de alta densidade (aproximadamente 10 x 107 células/mL). Exemplo 2: Determinação de métodos de retenção celular mais eficiente para o suporte de crescimento celular rápido e velocidade de concentração.

[000136] De modo a determinar o método de retenção celular mais eficiente para uso na criação de um sistema de banco de células de alta densidade (Figura 1), o filtro flutuante embutido no biorreator de perfusão GE padrão, TFF (filtração de fluxo tangencial), ATF2 e ATF4 foram avaliados por sua capacidade de suportar o crescimento celular aumentado e densidade celular viável sob parâmetros definidos (Tabela 1). Tabela 1: Parâmetros experimentais usados para comparação com os métodos de retenção celular

[000137] O sistema de f uxo tangencial alternante ATF4 suportava o crescimento celular mais rápido alcançado usando esses parâmetros junto com uma concentração de 4 vezes rápida final (30 min) sem incrustação do filtro. Outros métodos sob exame resultaram em concentrações mais baixas de células viáveis por mL, demonstraram uma eficiência em concentração menor e/ou resultaram em incrustação durante a cultura e/ou a concentração. Esses resultados podem ser visto a na Figura 2, Figura 11 e Tabela 2. Tabela 2: Resultados da comparação de diferentes métodos de retenção celular

Exemplo 3: Determinação de período mais eficiente para colher células cultivadas para concentração e banco de alta densidade.

[000138] Para determinar o período de tempo de colheita celular mais eficiente para concentração final subsequente e criobanco de células de alta densidade, culturas de linhagem celular 1 rCHO foram cultivadas em um biorreator 10-L WAVE® personalizado (GE Healthcare Life Sciences) sob condições de cultura em perfusão que usaram um sistema de fluxo tangencial alternante. As células foram coletadas em múltiplos períodos de tempo durante a cultura em perfusão para produzir os bancos pequenos em diferentes densidades celulares (14x106, 33xi06, 56xi06 /mL) (Figura 1).

[000139] Esses bancos foram avaliados ao se comparar a qualidade pós-descongelamento das células em termos de taxa de crescimento, viabilidade e morte celular (apoptose). Os parâmetros sob os quais essas células foram cultivadas durante a cultura inicial e a avaliação de pós-banco são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Parâmetros experimentais usados para a determinação do período de tempo para colheita celular mais eficiente

[000140] O desempenho celular pós-banco dos bancos pequenos feitos em diferentes densidades celulares a partir dessas culturas eram comparáveis em termos de sua taxa de crescimento celular, viabilidade (Figura 3) e taxa de apoptose (Figura 4). Esses dados indicam que as células são saudáveis e prontas para a colheita de até aproximadamente 60 x 106 células/mL.

[000141] As densidades de colheita de aproximadamente (30-40) x 106 células/mL foram selecionadas de modo a encurtar o período da cultura e tornar o processo mais praticável. Essas culturas são ainda então concentradas até >11 x 107 células/mL em 30 minutos usando um sistema de fluxo tangencial alternante. Exemplo 4: Determinação de parâmetros mais eficientes de WAVE® durante a cultura de células de alta densidade.

[000142] Para tornar este processo de banco e cultura de células de alta densidade mais forte e implementável em GMP, os parâmetros de operação de WAVE® foram estudados e definidos de modo a estabelecer um sistema no qual esta cultura pudesse ser mantida na ausência de controles de pH e DO automáticos.

[000143] Esses parâmetros de operação de WAVE® foram testados em um sistema de perfusão em cultura combinado com um sistema de fluxo tangencial alternante definido usando os parâmetros observados na Tabela 4. Tabela 4: Parâmetros experimentais usados para a determinação de parâmetros de operação de WAVE® .

[000144] Um estudo de transferência de massa de oxigênio (kLa) mostra que a taxa e o ângulo de agitação WAVE® são parâmetros chave que afetam a transferência de oxigênio. Além disso, a concentração do espaço vazio de tanto o oxigênio quanto o dióxido de carbono podem afetar de forma significativa a DO e o pH.

[000145] A condição da operação do biorreator simplificada que inclui o ajuste de uso de gás e agitação WAVE® (Tabela 5) em combinação com uma alta taxa de perfusão foi aplicada para alcançar níveis de pH e DO padrão sem o controle automático. Tabela 5: WAVE® Parâmetros de operação durante o Crescimento sem o controle de pH e DO

[000146] Quando o pH offline foi medido por BGA, ele era < 6,9, o ponto de ajuste de CO2 foi reduzido de 10% até 5%. Caso o pH offline medisse < 6,9 novamente, o ponto de ajuste de CO2 era reduzido de 5% até 0%. Caso o pH offline fosse ainda < 6,9, a taxa de perfusão era aumentada. Quando a DO fosse medida a < 45%, o ponto de ajuste de O2 era aumentado de 20% até 30%. Caso a DO medisse < 45% novamente, a velocidade de agitação era aumentada até 25 rpm e o ângulo de agitação era mudado até 12°. De forma adicional, o nível de O2 era aumentado de 30% até 40%.

[000147] Este método ainda foi refinado pelo ajuste da taxa de agitação (Tabela 6) durante a etapa de concentração final para evitar a inclusão de ar no sistema ATF4. Tabela 6. WAVE® Parâmetros de operação durante a Concentração

[000148] Um conjunto simplificado de condições de operação do biorreator incluindo o ajuste de uso de gás e agitação WAVE® resultou em desempenho de crescimento celular comparável sem contar com os controles de retroalimentação de pH e DO automáticos. O ajuste de agitação também resultou em inclusão mínima de ar durante a etapa de concentração ATF4. Exemplo 5: Determinação do efeito da etapa de concentração de ATF e a exposição ao DMSO na saúde celular.

[000149] De modo a determinar o efeito da etapa de concentração de ATF4 e a exposição ao DMSO pré-congelamento na qualidade celular, os frascos de agitação foram inoculados com células vivas coletadas em diferentes estágios no procedimento de banco de células de alta densidade para a avaliação de crescimento. As amostras coletadas e examinadas sob as condições mostradas na Tabela 7 eram: pré-concentração, pós-concentração e com uma extensão de exposição ao de 0 a 120 min. Tabela 7: Parâmetros experimentais usados para a determinação de parâmetros de operação WAVE®.

[000150] O crescimento celular (Figura 7A) e a taxa de apoptose (Figura 7B) de células de pré-concentração e células de pós- concentração eram comparáveis como foi a taxa de crescimento celular e apoptose de células com diferentes períodos de exposição ao DMSO. Isso sugere que a concentração de ATF4 de 30 min no recipiente e a distribuição em larga escala de mais do que 200 frascos em 90 min enquanto se mantém a qualidade celular pré-congelamento é possível. Exemplo 6: Determinação de qualidade celular pós-banco e a aplicabilidade da plataforma em múltiplas linhagens celulares

[000151] Para determinar a qualidade celular de pós-banco dos bancos de células de alta densidade, ambos os pré- e pós- congelamento foram cultivados e examinados para determinar suas taxas de crescimento celular relativas, viabilidade e níveis de apoptose. Além disso, três diferentes linhagens celulares (linhagens celulares rCHO 1, 2 e 3) foram empregadas de modo a assegurar que esta plataforma poderia estar prontamente para outras linhagens celulares. As condições experimentais sob as quais essas células foram cultivadas pré- e pós-banco são detalhadas na Tabela 8. Tabela 8: Parâmetros experimentais usados para a qualidade celular pós-banco dos bancos HD para múltiplas linhagens celulares.

[000152] O crescimento celular pós-descongelamento, a viabilidade e os níveis de apoptose foram avaliados em relação à linhagem celular rCHO 1 (Figura 8), linhagem celular rCHO 2 (Figura 9), linhagem celular rCHO 3 (Figura 10) em ambas as amostras de banco em alta densidade (10 x 107 células/mL) e densidade normal (2,0-2,4 x 106 células viáveis/mL). As células mostraram boas taxas de crescimento e viabilidade com baixos níveis de apoptose. As taxas de recuperação variaram dependendo das linhagens celulares sendo examinadas.

Claims (15)

1. Método não centrífugo para produzir um banco de células de mamífero congeladas de alta densidade, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivar as células de mamífero em um biorreator de perfusão a uma primeira densidade celular por remoção contínua do meio de crescimento de uma cultura e substituindo com meio de crescimento fresco, em que o dito biorreator é agitado para mistura e troca de gás eficiente, em que o dito biorreator é acoplado a um sistema de retenção celular compreendendo um sistema de filtração de fluxo alternante tangencial incluindo um filtro; b) concentrar de forma não centrífuga as células cultivadas no biorreator de perfusão acoplado ao sistema de retenção celular, em que as células são concentradas a uma segunda densidade celular superior a primeira densidade celular pela remoção do meio de crescimento da cultura usando o filtro e, dessa forma, reduzindo o volume do meio de crescimento para produzir uma população de células concentradas de 1 x 108 células/mL; e c) criopreservar a população de células concentradas para produzir um banco de células de mamífero congeladas de alta densidade, em que banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de 90% ou mais, em que o pH e DO da cultura são controlados por métodos não automáticos e, em que o biorreator é agitado entre 5 rpm e 22 rpm com ângulo de rocha entre 5° e 10° durante a etapa a) e se a DO da cultura durante a etapa a) for < 45%, então o biorreator é agitado a 25 rpm com um ângulo de rocha de 12°, em que o biorreator é agitado entre 5 rpm e 15 rpm com um ângulo de rocha entre 5° e 8° durante a etapa de concentração b), e em que a primeira densidade celular é concentrada para a segunda densidade celular em 30 minutos ou menos e a primeira densidade celular é concentrada 4 vezes ou mais para atingir a segunda densidade celular.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filtro tem uma área de superfície de 0,3 m2 ou mais, preferivelmente de 0,3 m2 a 0,5 m2, de 0,5 m2 a 1,0 m2, de 0,7 m2 a 0,8 m2, de 1,0 m2 a 2,0 m2, de 2,0 m2 a 3,0 m2, de 3,0 m2 a 4,0 m2 ou 4,0 m2 a 5,0 m2.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o filtro tem um tamanho de poro selecionado do grupo consistindo em 0,2 μm, 0,4 μm e 0,65 μm.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a criopreservação compreende adicionar DMSO à população de células concentradas até uma concentração final de 5% a 10%, vol/vol.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a criopreservação compreende o congelamento de uma porção da população de células concentradas em um recipiente apropriado para armazenamento sob as condições de criopreservação.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um frasco.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o recipiente é uma bolsa criogênica.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a população de células de mamífero concentradas tem uma densidade celular de 1 x 108 células viáveis/mL.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a taxa de perfusão no biorreator de perfusão é entre 0,2 nL/célula/dia a 0,5 nL/célula/dia.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a cultura celular em biorreator de perfusão tem um pH de 6,8 a 7,2.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a cultura celular em biorreator de perfusão tem uma concentração de oxigênio dissolvida de 30% ou mais.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o biorreator é um biorreator de bolsa flexível.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o banco de células de mamíferos congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-congelamento 95% ou mais.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as células são células transfectadas.

15. Método não centrífugo para produzir um banco de células de mamífero congeladas de alta densidade, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivar células de mamífero em um biorreator de perfusão a uma densidade celular inferior a 1 x 108 células/mL por remoção contínua do meio de crescimento de uma cultura e substituir com meio de crescimento fresco, em que o biorreator de perfusão está acoplado a um sistema de filtração de fluxo alternante tangencial possuindo um filtro, em que o biorreator compreende um biorreator de bolsa flexível, e em que o filtro tem uma área de superfície de 0,3 m2 ou mais e um filtro com um tamanho de MWCO de 50 kDa ou mais; b) concentrar as células de forma não centrífuga cultivadas no biorreator de perfusão acoplado ao sistema de retenção de células, em que as células são concentradas removendo o meio de crescimento da cultura e reduzindo o volume do meio de crescimento usando o sistema de filtração de fluxo alternante tangencial para produzir uma população de células concentradas tendo uma densidade de 1 x 108 células/mL; c) criopreservar a população de células concentradas para produzir um banco de células de mamífero de alta densidade, em que a criopreservação compreende adicionar DMSO à população de células concentradas até uma concentração final de 5% a 10%, vol/vol; e em que o banco de células de mamífero congeladas de alta densidade tem uma densidade celular de 108 células/mL; e em que o banco de células congeladas de alta densidade tem uma viabilidade pós-descongelamento de 90% ou mais, em que o pH e DO da cultura são controlados por métodos não automáticos e, em que o biorreator é agitado entre 5 rpm e 22 rpm com ângulo de rocha entre 5° e 10° durante a etapa a) e se a DO da cultura durante a etapa a) for < 45%, então o biorreator é agitado a 25 rpm com um ângulo de rocha de 12°, em que o biorreator é agitado entre 5 rpm e 15 rpm com um ângulo de rocha entre 5° e 8° durante a etapa de concentração b), e em que a primeira densidade celular é concentrada para a segunda densidade celular em 30 minutos ou menos e a primeira densidade celular é concentrada 4 vezes ou mais para atingir a segunda densidade celular.

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