CN102639221B

CN102639221B - 搅拌器系统

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Publication number: CN102639221B
Application number: CN201080033027.0A
Authority: CN
Inventors: A·阿利施; M·詹施; M·波尔沙伊特; J·蒂勒; C·瓦勒留斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2030-07-23
Also published as: EP2456547B2; JP6505592B2; US20180187138A1; KR20120031083A; IL216666A0; EP2456547B1; JP2016073976A; JP5921433B2; JP6827389B2; JP2021007946A; MX2012000730A; BRPI1010068A2; EP2456547A1; US20120135464A1; SG177727A1; JP2014140378A; CA2766836A1; JP2017209676A; JP2012533419A; DE202010018640U1

Abstract

本发明涉及一种用于动物细胞培养的搅拌器系统，所述搅拌器系统由至少一个径向传递搅拌器元件和至少一个轴向传递搅拌器元件的组合组成，其中必须存在至少三个搅拌器元件，并且最上面的搅拌器元件是轴向传递搅拌器元件。这些搅拌器元件被安排在搅拌器轴上，一个在另一个之上一定距离。一特定实施方案是多搅拌器系统，由两个作为径向传递搅拌器元件的盘式搅拌器和一个作为轴向传递搅拌器元件的倾斜叶片搅拌器组成，其中倾斜叶片搅拌器在搅拌器轴上被安排在盘式搅拌器之上。根据本发明的搅拌器系统可以在细胞培养中达到尤其是剪切敏感性哺乳动物细胞的培养物的更温和以及更好的混合。

Description

搅拌器系统

技术领域

本发明公开一种用于动物细胞培养的搅拌器系统，所述搅拌器系统由至少一个径向传递元件(radially-conveying element)和至少一个轴向传递元件(axially-conveying element)组成，其中必须存在至少三个传递元件，并且最上面的元件是轴向传递元件。这些传递元件被安排在轴上，一个位于另一个之上一定的距离。在一特定实施方案中，搅拌器系统由两个作为径向传递元件的盘式搅拌器和一个作为轴向传递元件的倾斜叶片搅拌器组成，其中倾斜叶片搅拌器在轴上被安排在盘式搅拌器之上。根据本发明的搅拌器可以达到例如对用于培养原核和真核细胞的培养基的更温和以及更好的混合。

背景技术

利用原核和真核细胞生产重组蛋白质、疫苗和抗体，在现代药物生产中扮演了重要的角色。为了生产复杂的翻译后修饰蛋白质和抗体，主要使用动物来源的细胞。然而，动物来源的细胞的使用对发酵工艺设置了高要求，原因是这些细胞的特殊特征，诸如，培养基，对于(例如由乳酸，CO₂，铵等引起的)限制和抑制的敏感性，敏感的外膜(剪切应力)，低比速、以及对于培养条件变化(例如，由于局部不均质性，pH变化，pO₂变化等等)的敏感性。在设计生物反应器和工艺控制的时候，这些性质不得不纳入考虑。

近年来，已经开发了各种类型的培养细胞的反应器。不管何种类型，反应器都必须能够实现下面的基本技术功能：充分悬浮和均化，充分的材料和热传递以及对细胞的最小剪切应力。搅拌釜反应器尤其适合用于工业用途。在该反应器中，通过机械搅拌引入实现这些基本功能的必要能量。

从文献中可知，哺乳动物细胞相比于微生物对剪切力敏感得多。这通常归因于细胞壁的缺乏(参见例如Glacken，M.W.，et al.，Trends Biotechnol.1(1983)102-108；van der Pol，L.A.and Tramper，J.Enzyme Microb.Technol.17(1995)401-407；Nienow，A.W.，Cytotechnol.50(2006)9-33；Cervantes，M.I.，et al.，Chem.Eng.Sci.61(2006)8075-8084；Frahm，B.，etal.，Chem.Ing.Tech.79(2007)1052-1058)。剪切敏感是在悬浮培养生物反应器的技术操作中造成相当困难的原因。搅拌釜反应器通常用于生物技术生产工艺中来向细胞供料，这是因为它们可以根据需要的工艺条件而被更加灵活地控制和使用。除了这些系统的几何学和搅拌物的流变学外，上述基本功能主要通过使用的搅拌器系统来实现。

对培养的细胞造成剪切应力的主要原因是例如由搅拌器系统产生的剪切力。这具有强效应，尤其是在搅拌器叶片的区域以及挡扳(baffle)的区域中。根据Kolmogorov理论，通过搅拌器产生的大涡旋通过能量耗散分解而形成小的微涡旋。当它们的尺寸与发酵的细胞的尺寸相同时，细胞会被损坏(Cherry，R.S.and Papoutsakis，E.T.，Biotechnol.Bioeng.32(1988)1001-1014；Papoutsakis，E.T.and Kunas，K.T.，in″Advances in animal cellbiology and technology for bioprocesses″，Spier，R.E.，et al.(Eds)Butterworth，Sevenoaks，Kent，UK(1989)203-211；Kunas，K.T.andPapoutsakis，E.T.，Biotech.Bioeng.36(1990)476-483；Zhang，Z.B.andThomas，C.R.，Gen.Eng.Biotechnol.13(1993)19-29；Nienow，A.W.，Cytotechnol.50(2006)9-33)。

已经推荐在动物悬浮细胞培养中使用搅拌器(参见例如Feder，J.andTolbert，W.R.，Sci.Am.248(1983)24-31；stirrer manufacturers forexample Ekato，Chemineer，Bioengineering，Zeta)，其强调低剪切流的生成作为重要标准。因此，已经开发了很多低剪力搅拌器来减少损坏(例如“象耳叶轮”(Elephant Ear Impeller)，或“最大流量叶轮”(Max Flow Impeller))。

在一网上的文章(“Axial flow down-pumping agitators in biologicalprocesses”，2009年4月，http://www.postmixing.com/mixing％20forum/Micro/Liq-Solid-Gas/down-pumpers.htm)中，证实由不同的搅拌器组成的搅拌器组合能够导致改进的质量传递。关于动物细胞，建议使用三个轴向传送器，以实现细胞培养的最佳效果。Fujasova等人(Chem.Eng.Sci.62(2007)1650-1669)报告了多层搅拌器(multistage stirrer)的传质中的相关性。在生物反应器中使用三层搅拌器系统的气相和液相之间的传质，也被Puthli等人加以报告(Puthli，M.S.，et al.，Biochem.Eng.J.23(2005)25-30)。

在US 5,633,165中报导了用于培养细菌细胞的发酵罐的使用，其带有垂直的转轴，轴上优选连接有两个或者三个的Rushton搅拌器。Nienow，A.W.，(Cytotechnol.50(2006)9-33)推荐了一种用于动物细胞培养的反应器系统，其H/D比为1-1.3，使用两个向下传送的水翼搅拌器(轴向传送装置)以及一个安装在最下面的搅拌器之下的通气装置。

US2004/0234435中报告了一种用于生产芳香羧酸的方法和装置。在US4438074中报告了一种连续聚合反应器。在US2004/0087814中，报告了一种用于烷基苯氧化反应器的搅拌系统。在US5972661报告了一种混合系统。在US6250769中报告了一种带有静态混合器或旋流器装置的搅拌设备。在US5198156中报告了一种搅拌器。在US4779990中报告了一种叶轮装置。

发明概述

本文报告了一种搅拌器系统，其包括至少一个径向传递元件和至少一个轴向传递元件，其中必须存在至少三个传递元件，并且最上面的元件是轴向传递元件。相比通常用于培养剪切敏感的动物细胞的搅拌器，本发明搅拌器系统可以实现培养基的更快速混合(例如以便通过液体表面引入校正试剂，诸如酸或碱)，而不将培养基中的细胞暴露在高剪切应力下。

在一个实施方案中，搅拌器系统是由3至5个传递元件组成。在另一个实施方案中，搅拌器系统是由3或4个传递元件组成。在又一实施方案中，搅拌器系统的传递元件被安排在垂直的轴上，一个在另一个之上一定距离。在又一实施方案中，传递元件被安排在轴上，彼此之间间距相同。在又一个实施方案中，传递元件之间的距离为一个传递元件直径(d)和两个传递元件直径(d)之间。在一个实施方案中，搅拌器系统的传递元件在垂直轴上进行排列，其中最上方的传递元件距离底部传递元件有一确定距离，并且当搅拌器系统在装上培养基的培养容器中工作时，与培养基液面具有足够距离，由此搅拌器系统确保培养基的混合。在一个实施方案中，距培养基表面的该距离与最上方搅拌器元件和次上方搅拌器元件之间的距离相同。在一个实施方案中，全部传递元件具有相同的直径d。

在一个实施方案中，搅拌器系统由两个径向传递元件和一个轴向传递元件组成，其中轴向传递元件在搅拌器轴上被安排在径向传递元件上方。

在一个实施方案中，径向传递元件具有2到8个搅拌器叶片(blade)，轴向传递元件具有2到10个搅拌器叶片。在另一个实施方案中，径向传递元件有3到6个搅拌器叶片，在又一实施方案中，有6个搅拌器叶片。在一个实施方案中，轴向传递元件有2到6个搅拌器叶片，在又一实施方案中，有4个搅拌器叶片。在又一实施方案中，全部径向传递和全部轴向传递元件具有同样数量的搅拌器叶片。在一个实施方案中，全部传递元件具有4或6个搅拌器叶片。在一个实施方案中，径向传递元件是对称的径向传递元件。″对称径向传递元件″是一个沿着元件纵轴线具有对称横截面的元件，即，沿着并且包括该旋转轴线的横截面是点对称的和镜像对称的。

在一个实施方案中，当搅拌器系统被放入培养容器中时，传递元件直径d对培养容器直径D的比率为0.2到0.8，在另一个实施方案中，0.3到0.6，在又一实施方案中，0.31到0.39，或者在又一实施方案中，为约0.34。轴向传递元件的搅拌器叶片的高度h_B对径向传递元件的搅拌器叶片的宽度b的比率为0.2到2.0，在另一实施方案中介于0.3和1.4之间，或者在又一实施方案中，介于0.4和1.0之间。在又一实施方案中，相对于轴的轴心(shaft axis)，轴向传递元件的搅拌器叶片的倾斜度为10°到80°，在另一个实施方案中，为24°到60°，或者在又一实施方案中，为40°到50°。在一个实施方案中，对于全部传递元件，传递元件直径d对培养容器直径D的比率为0.32到0.35。

在一个实施方案中，在雷诺数(Reynolds number)5＊10⁴到5＊10⁵，搅拌器系统的牛顿数(Newton number)为5.5到8.0。在另一个实施方案中，在功率输入为约0.05W/kg时，搅拌器系统的混合时间θ_0.95为约20秒，在功率输入为约0.3W/kg时混合时间为约10秒。

本文在此报导的另一方面是一种设备，其包含在此报导的搅拌器系统和培养容器。在一个实施方案中，该设备另外包括透析模块(dialysismodule)。在另一个实施方案中，该设备用于动物细胞的培养。在另一实施方案中，该设备包括

a)培养容器，其适于接受培养基和待在其中培养的动物细胞，

b)沿着培养容器的垂轴线(vertical axis)的轴(shaft)，

c)附着在轴上的本文报导的搅拌器系统，

d)在培养容器底部的气体进口，和

e)在培养容器的上部高于液面用于添加校正溶液和/或进料溶液的至少一个进口。

本文报导的又一方面是用于生产多肽的方法，其包括如下步骤：

a)在含有本文报导的搅拌器系统的培养容器中或者在本文报导的设备中，培养包含编码多肽的核酸的细胞，

b)从培养基或者细胞中回收多肽，以及

c)纯化多肽，并由此生产多肽。

在一个实施方案中，纯化是多阶段色谱法。在另一个实施方案中，纯化包括亲合色谱，阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。

本文报导的另一个方面是用于培养动物细胞的方法，其特征在于，在包含本文报导的搅拌器系统的培养容器中，培养动物细胞。

在一个实施方案中，培养是半连续培养。在又一实施方案，半连续培养是透析培养。在一个实施方案中，多肽是抗体或抗体衍生物。

本文报导的另一方面是本文报导的搅拌器系统在培养基混合中的应用。在前述方面的一个实施方案中，培养基是水性培养基，其适用于培养原核和真核细胞。在另一个实施方案中，培养基是牛顿液体。在一个实施方案中，搅拌器系统在0.01W/kg到1W/kg的功率输入下进行工作。在另一个实施方案中，搅拌器系统在0.04W/kg到0.5W/kg的功率输入下进行工作。在另一个实施方案中，在培养基中由搅拌器系统诱导的流动是湍流。在另一个实施方案中，培养基具有3mPas＊s或更少的粘度。在另一个实施方案中，粘度是2mPas＊s或更少。

本文报导的另一方面是搅拌器系统用于培养动物细胞或杂交瘤细胞在多肽或抗体的生产中的用途。在一个实施方案中，培养在浸没通气式搅拌釜反应器中进行。在另一个实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞。在又一实施方案中，细胞是CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，COS细胞，PER.C6细胞，Sp2/0细胞，HEK293细胞或杂交瘤细胞。在又一实施方案中，抗体是抗CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD33，CD52，EGFR，G250，GD3，HER2，PSMA，CD56，VEGF，VEGF2，CEA，Lewis Y抗原，IL-6受体，或者IGF-1受体的抗体。

发明详述

本文报道了一种搅拌器系统，所述搅拌器系统由至少一个径向传递元件和至少一个轴向传递元件组成，其中必须存在至少三个传递元件，并且最上方的元件是轴向传递元件。相比于目前用于培养剪切敏感的动物细胞的搅拌器系统，本文报导的搅拌器系统允许更加温和和更加快速地混合培养基。在图1中显示了本文报导的搅拌器系统的一个实例。因此，本文报导的搅拌器系统提供了更短的混合时间，以及对培养细胞施予更少的应力，而不需要复杂的附加部件，诸如挡扳，静态混合器，旋流器，导流管，或者其他在培养容器中引导液流的手段。

术语″元件″或″传递元件″，可互换使用，指的是搅拌器叶片的(功能)单元，这些叶片彼此之间在距离和角度上于固定的空间布局中。径向传递元件指的是一种元件，其中搅拌器叶片相对于轴的轴心没有倾斜度。轴向传递元件指的是一种元件，其中搅拌器叶片相对于轴的轴心具有倾斜度。传递元件的搅拌器叶片，在一个实施方案中，是矩形板状，但也可使用其他几何形状。元件的传递方向是相对于元件的旋转轴线来表示的。传递元件的搅拌器叶片可以不从轴本身延伸出来，而是可以安装在轴上的一个臂上或者同等手段上。每个传递元件由规定数目的搅拌器叶片组成。各叶片或者直接连接到转轴上，或者通过毂(hub)连接到转轴上。独立于传递元件，各搅拌器叶片具有外缘和内缘。每个搅拌器叶片上与轴具有最大距离的部分被称为叶片的尖。每个传递元件具有外径和内径。例如，轴向传递元件的外径是相对的搅拌器叶片的叶尖之间的最大距离，径向传递元件的内径是相对的搅拌器叶片的内缘之间的最小距离。

术语″抗体″指的是由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区域基因以及无数免疫球蛋白可变区域基因。抗体能够以各种形式存在，包括，例如，Fv，Fab，和F(ab)₂，以及单链(scFv)或二体(diabodies)或三体(triabodies)，作为单价，二价，三价，四价，五价和六价的形成，以及单特异性，双特异性，三特异性或四特异性抗体。

″多肽″是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不论是天然生成的或者人工合成的。低于约20个氨基酸残基的多肽可称为″肽″，而由两种或多种多肽组成的分子或者包含超过100个氨基酸残基的一种多肽的分子可称为″蛋白质″。多肽也可包括非氨基酸组分，诸如碳水化合物基团，金属离子，或者羧酸酯。非氨基酸组分可由产生多肽的细胞加入，并且可以根据细胞类型进行变化。多肽在此根据它们的氨基酸主链结构或编码其的核酸进行定义。添加物诸如碳水化合物基团一般不予规定，但可以存在。

浸没通气式培养容器一般用于培养动物细胞，以生产多肽或者抗体。其中使用单层或多层单纯轴向传递或单纯径向传递的搅拌器系统。在这里，术语″轴向传递″指的是传递元件产生朝向离开元件的方向的流动，该流动与轴或者元件的旋转轴线平行。类似地，术语″径向传递″指的是传递元件产生朝向离开搅拌器元件的方向的流动，该流动与轴或者元件的旋转轴线垂直。该观察结果与反应器具有有限的空间尺寸是无关的，并且因此流动在反应器壁处被转向，并且另一方面，与如下事实无关，即，导向搅拌器元件的流动可以是不同的。轴以及该轴的轴心延伸通过使用该传递元件或搅拌器系统的培养容器的纵轴线。元件的旋转速度n被用作特征性速度，元件直径d被用作特征性长度。

在此报导的改进的搅拌器系统通过传递元件的组合来提供，用于哺乳动物细胞的培养。使用在此报导的搅拌器系统，可以达到相当的存活力、细胞密度和产品滴度，同时降低的对培养细胞的剪切应力。已经发现，在此报导的搅拌器系统可以改进培养容器内容物的混合，同时保持可实现的细胞密度，例如相比于由三个轴向传递元件组成的搅拌器系统(诸如三个倾斜叶片搅拌器)。在此报导的搅拌器系统还特别适于在培养基表面或者从培养基表面来掺混液体，例如以便通过液体表面引入校正试剂，诸如酸、碱，营养介质，消泡剂，或者CO₂或O₂，以及适于在培养动物细胞时实现培养基的快速总体混合。

在流体动力学中，雷诺数(Re)描述了流体动力学系统中惯性力对内部摩擦力的比率。从此也可得出该移动介质的湍流度。对于搅拌的液体，搅拌器雷诺数在公式1中定义为

Re = \frac{n \cdot d^{2}}{v} = \frac{n \cdot d^{2} \cdot ρ}{η}

(公式1)

牛顿数(Ne，也称为功率准数)描述阻力对流动力的比率，其由此是在搅拌的材料中搅拌器流动阻力的度量，其在公式2中进行描述：

Ne = \frac{P}{ρ \cdot n^{3} \cdot d^{5}}

(公式2)

对于不同搅拌器系统，在图2中显示了Ne数。

相比于那些具有高牛顿数的传递元件，诸如Rushton涡轮，具有低牛顿数的传递元件，诸如螺旋桨或倾斜叶片搅拌器，更有效地转化功率输入到流体动力学输出中，即流体运动。

在培养工艺中评估搅拌方法的标准是混合时间。非均质的液体-液体混合物的″混合时间″指的是在培养基中需要达到规定的均匀性的时间。影响混合时间的因素是混合程度和观察点。混合度又取决于反应器几何结构，搅拌器几何结构，搅拌器旋转频率，和搅拌材料的物质。对于培养工艺重要的是，尽可能地，全部细胞被最佳地和均一地供给必需底物(诸如营养培养基，O₂)，而且代谢物(诸如溢流产物，CO₂)随之被排出。这意味着，可能在培养容器中在空间上以及在时间上发生的积存(repositories)和下沉(sinks)，必须被避免或者至少最小化，以便避免对细胞的损害。这可通过，例如使用改进的搅拌系统来混合容器内容物来实现。该混合过程可以被分成子过程，微观混合和宏观混合。微观混合被定义为，由于扩散或微湍流而发生的分子浓度调节；与其相反，宏观混合被定义为由于搅拌器导致的对流粗混(参见例如Houcine，I.等人，Chem.Eng.Technol.23(2000)605-613；Zlokarnik，M.，″Rührtechnik Theorie und Praxis″，SpringerPublishers，Berlin Heidelberg，1999)。混合度可根据Henzler(Henzler，H.-J.，″Homogenisieren：Referenz-Rührsysteme und Methoden zur E rfassungder Homogenisierungseigenschaften von Rührsystemen″，GVCFachausschuβ1998)，按照下列的公式3进行定义：

χ_{1} = 1 - \frac{Δa}{\overset{&OverBar;}{a}}

(公式3)。

在该公式中，对应在理论完全混合之后的示踪物的浓度，Δa对应于在时间t时示踪物的局部浓度之间的最大差值。一般地，混合度X₁＝0.95，被认为是充分的(参见Henzler，出处同上)。如公式4所述的混合系数C_H0.95基于该混合度，是混合时间θ_0.95和所使用的搅拌器旋转速度n的乘积。因此，它对应于在加入试剂之后为了实现0.95的混合度所需要的搅拌器旋转数。

C_H0.95＝Θ_0.95·n(公式4)

表1中列出的和图3和4的选录中所示的混合系数，得自使用脱色方法进行的混合时间研究。

表1：各种搅拌器的混合系数

在这些布局(configurations)的比较中，与例如由三个单独倾斜叶片搅拌器(3SBR)或者三个单独标准盘式搅拌器(3SSR)(分别具有65.5和77的平均混合指数)相比，本文所报道的搅拌器在恒定雷诺数下具有大约38的平均混合指数，。因此，在本文所述的设备的一个实施方案中，培养容器的装填高度H对培养容器的直径D的比率为约1.6。术语″约″指的是，其后面的数值不是一个确切值，而仅仅是一个范围的中心值。在一个实施方案中，术语″约″为中心值+/-25％的范围，在另一实施方案中为+/-15％，在又一实施方案中，为+/-10％。

动物细胞培养的另一个工艺参数是在培养基中施加到细胞上的剪切应力。动物细胞培养尤其受到施加到细胞上的机械和流体动力学应力的限制。该应力在一方面由搅拌器本身导致，在另一方面由培养基的鼓泡通气所引起(参见例如，Wollny，S.and Sperling，R.，Chem.Ing.Tec.79(2007)199-208)。对于在搅拌釜容器中占据最主导地位的湍流区域而言，流体动力学应力可以通过雷诺应力法根据公式5而给出(Henzler，H.J.andBiedermann，A.，Chem.Ing.Tec.68(1996)1546-1561)：

τ_turb＝ρ·u′2(公式5)。

根据公式5，主应力可以推导为是由于流体元素的湍流速度脉动u′引起的。

也进行了在非通气状态下对搅拌器系统的剪切应力的表征。在图5和表2中显示了参比片(reference flake)直径d_VF，其描述了对占优势的应力的相对度量。参比片直径越高，流体动力学应力越低。在这种情况下，因为通气并未开启，唯一影响是由搅拌器系统引起的。

表2：各种搅拌器系统在100W/m³功率输入下的参比片直径实例

与带有仅轴向传递元件的搅拌器系统如三个倾斜叶片搅拌器相比，本文所述的搅拌器系统产生显著较少的应力，即，提供具有更大的参比片直径d_VF的片。

图2显示了牛顿数的对比，由其可确定非通气的功率输入。可看出，本文所述的搅拌器系统可产生显著更高的牛顿数，赋予更加温和以及更均匀的能量输入。

在与各种搅拌器系统的直接比较中，本文所述的搅拌器系统显示了在混合方面的显著优势(图3和4，表1)，以及在生成的剪切应力方面的显著优势(图5，表2)。

为了实现高产品滴度和良好的产品质量，除了例如细胞系的开发、培养基的组成和培养容器的尺寸，培养容器的工作模式也扮演了重要角色。可以区分工作模式，批或者分批工艺，补料分批或者补料工艺，有细胞保留或者没有细胞保留的连续工艺(例如灌注或恒化器)，以及半连续工艺，诸如例如内部透析或者外部透析。

在半连续培养工艺中，例如外部或内部透析，底物跨膜供应给培养容器，同时培养细胞的抑制性组分/代谢产物被带走。这种物质的交换是通过扩散进行的。因此，主要的影响因素是主体浓度差，膜材料，膜表面，膜材料内侧相应化合物的扩散系数、和相界面的厚度(其由朝着膜的流动确定)。当在高细胞密度发酵中使用透析时，它是一个类灌注的半连续工艺，其中安装在反应器内的透析模块(中空纤维)提供在培养基和新鲜营养培养基之间的交换区域。营养培养基从贮藏容器中被泵过透析模块，其后又返回到贮藏容器中(示意图参见图13)。该透析模块可位于反应器外部(外部透析)或反应器内部(内部透析)。两种工作方式均适用相同的物理法则。因此，作为一个方面，在此公开一种包含本文所述的搅拌器系统和培养容器和任选的透析模块的设备。

培养容器具有上部，中部和下部，其中容器的纵轴线从上部中间或中心延伸到下部的中间或中心。垂直于纵轴线的视图上，圆柱形培养容器具有基本上圆的截面。培养容器的上部另外可以包括气体排放出口，一个或者多个进口，和/或用于维护和清洁的人孔。培养容器的下部可进一步包括一个或多个液体培养基进口，一个或多个液体培养基出口，和/或气体进口。培养容器中部可进一步包括热交换夹套，安装在培养容器外壁上。搅拌器系统的传递元件通过轴来进入旋转，所述轴偶接到合适的机械装置上来引起其转动。轴沿着培养容器的纵轴线进行延伸，因此轴具有垂直方向的旋转轴线。轴不延伸到容器底部，而是延伸到远高于容器底部的一个点，也远高于任选的培养容器底部的气体喷射器。轴可通过合适的偶联机械装置来操作地偶接到传动轴上。除了偶联轴到传动轴的手段之外，轴另外包含进一步的手段，即至少三个手段，用于分别地偶联传递元件到轴上。搅拌器系统的传递元件偶联到轴上，偶联位置低于/将低于当该搅拌器系统浸没在培养基中时培养容器中的培养基的表面。该表面在培养基处于静态，即未循环时来确定。培养容器不含有导流管。

在一任选的实施方案中，培养容器是带挡扳的容器。在另一个实施方案中，培养容器包括两个或四个挡扳。″挡板″指的是放置于培养容器内部的板，其方向与轴的轴心方向相同，并朝着搅拌器径向地延伸到培养容器中。挡扳一般是矩形的。在一实施方案中，挡扳被放置在距培养容器内壁距离b_d的位置上。在另一个实施方案中，挡扳绕着培养容器内部周长等距离(equidistally)间隔。

在一个实施方案中，设备还包括透析模块。设备的部件以使其能够执行预期功能的方式来设置尺寸，即培养容器可以容纳培养基，搅拌器系统能够混合培养基并分散加入其中的化合物，透析模块能够提供新鲜的培养基并排出培养细胞分泌的代谢化合物。因此，搅拌器系统具有在存在透析模块和不存在透析模块的情况下允许在容器内部无阻碍旋转的直径。使用本文所述设备，可有利地进行灌注培养或透析培养形式的高细胞密度培养。在一个实施方案中，培养是在搅拌器系统的如下转速下进行，所述转速下，可实现对培养基的雷诺数不依赖性恒定功率输入，即在培养过程中在培养容器中提供培养基湍流。相比其他搅拌器系统，使用本文所述的设备可以在搅拌器系统的低转速下但是在相同的功率输入下培养剪切敏感的哺乳动物细胞。

培养容器的形状是不受限的。在一个实施方案中，培养容器是圆柱形容器。在另一个实施方案中，培养容器是搅拌釜反应器。培养容器可具有任何尺寸。在一个实施方案中，培养容器的工作体积为5L到25,000L。

根据浓度差，新鲜营养培养基的组分从透析模块内部通过半透性中空纤维膜扩散进入培养容器，同时培养细胞的代谢物以相反方向从培养容器扩散进入营养培养基。目的是保持在培养容器中抑制性代谢物的绝对浓度处于尽可能低(稀释物)的状态，同时，尽可能长时间地在培养中维持必需营养素的浓度在最佳水平。相比于没有透析的工艺方法，这导致了培养条件的改进，从而允许实现更高的最大细胞密度或产品滴度。

在透析模块中的运输过程可以通过双膜理论，结合第一菲克定律，以等价于在气泡上的传质的方式加以描述。因此，假设基于中空纤维透析模块的交换面积A_H的线性梯度，有效的转移扩散通量Jeff根据公式6为：

J_{eff, i} = - D_{eff, i} \cdot A_{H} \cdot \frac{c_{2, i} - c_{1, i}}{x_{2} - x_{1}} = - D_{eff, i} \cdot A_{H} \cdot \frac{{Δc}_{i}}{z_{eff}}

(公式6)

扩散的驱动力是相对于有效扩散路程Z_eff的透析模块内部与外部之间的浓度差Δ_Ci。该有效扩散路程由穿过在透析模块的中空纤维膜内侧上的内部滞留边界层的单个路径δ_BI，穿过中空纤维膜本身的单个路径δ_M和穿过反应器中的中空纤维膜外侧上的外部滞留边界层的单个路径δ_HI组成。它们一般取决于扩散分子的尺寸和形状，周围介质的性质和温度。

对于各单独区段，可定义单独的传质系数，根据公式7，从它们的倒数之和得出总传质阻力1/k：

\frac{1}{k} = \frac{1}{k_{Hl}} + \frac{1}{k_{M}} + \frac{1}{k_{Bl}}

(公式7)

在中空纤维膜内侧和外侧上的滞留边界层的传递阻力还取决于朝着中空纤维膜的流动。朝向膜的流动越好，即越垂直，滞留边界层变得越窄，相应的传递阻力越低。对于培养容器内的透析模块，存在着外部滞留边界层的传递阻力对尤其是如下因素的直接依赖性：

·搅拌器系统的转速，

·搅拌器系统的类型，

·朝着膜的流动，

·由搅拌器系统产生的主要流动型态(flow profile)。

在中空纤维膜内侧上的滞留边界层阻力可被忽略，这是因为低的内径和伴随的高流速。在本申请中，术语″中空纤维膜内侧″指的是面向贮藏容器的中空纤维膜一侧。在本申请中，术语″中空纤维膜外侧″指的是面向培养容器的中空纤维膜一侧。因此，总传质阻力是一系列阻力，其主要由膜内部的阻力和外部滞留边界层的阻力来贡献(Rehm等人，Biotechnology-volume 3：Bioprocessing，VCH Weinheim，1993)。总传质系数k由总传质阻力的倒数得来，通过与中空纤维透析模块的容积比表面积a相乘(ka值)，可以与表面积相关。下列公式8可用来描述该平衡空间反应器(balancespaces reactor)和贮藏容器的浓度时间过程：

\frac{{dc}_{R}}{dt} = ka \cdot (c^{*} - c_{R})

(公式8)。

一般说来，浸没通气式培养容器用于细胞培养。在这些情况下，主要使用单层或者二层的轴向传递搅拌器系统。这生成基本上与转轴平行的流动型态。因此，在图12显示的布局(带有平行于转轴的透析模块)中，无法实现朝着透析模块的直接流动。这对透析模块的传质具有不利影响(纤维表面上的外部滞留边界层更宽)。

朝向渗析膜的直接切向的或径向的流动具有有利效果，其可以例如通过标准锚式搅拌器来实现。该搅拌器生成直接朝向在反应器中的透析模块或模块们的流动，因此降低了透析模块表面上的滞留边界层。然而，这种简单的径向流动对另一基本技术工艺功能是不利的，特别是关于混合反应器和传质，尤其是在浸没通气式反应器中。气体可通过例如管式喷射器或者环状喷射器，引入到培养容器中。

本文所述的搅拌器系统，相比于其他搅拌器系统，可用来更快速地混合培养基，例如以便通过液面来引入校正试剂，诸如酸或碱，减低泡沫形成，以及在透析方法中减低生物淤积(biofowling)，通过朝着透析模块的直接正交流动来提高传质速率。

在生产抗IGF-1R或CD20或HER2的抗体的动物细胞培养中使用本发明的搅拌器系统被作为实例来显示(参见WO 2004/087756；参见WO 2007/045465，WO 2007/115814和WO 2005/044859；参见WO 99/057134和WO 92/022653)。这不表示对本公开的限制，而仅仅用于举例说明本发明。从图6到11可见，本文所述的搅拌器系统的使用，对活细胞密度、生存力和产物形成，相比于不同的搅拌器系统(诸如三倾斜叶片搅拌器)，显示出相似的时间过程。

本申请中的缩写具有下列意义(同时参见图1a)：

b：径向传递元件的叶片宽度

d：搅拌器总外径

d_w：轴直径

h：径向传递元件的搅拌器叶片的高度

h_B：轴向传递元件的高度

Δh：两个传递元件的高度差

l：轴向传递元件的搅拌器叶片的长度

α：轴向传递元件叶片的叶片倾斜度

z：每搅拌器的搅拌器叶片数目

d_i：径向传递元件的搅拌器叶片之间的内部距离

D：培养容器内径

H：培养容器的装料高度。

在一个实施方案中，两个传递元件的高度差(Δh)对培养容器直径(D)的比率是至少0.75。本文报导的一方面是本文所述的搅拌器系统用于培养细胞在多肽或抗体的生产中的使用。在一个实施方案中，该培养是透析培养。在另一实施方案中，该培养在浸没通气式搅拌釜培养容器中进行。在另一个实施方案中，细胞是真核细胞，在另一个实施方案中，是哺乳动物细胞。在又一实施方案中，该细胞是CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，COS细胞，PER.C6细胞，Sp2/0细胞或者HEK293细胞。在一个实施方案中，该细胞选自原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，BHK细胞，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)，纤维化纤维单胞菌(Cellulomonas cellulans)，百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，CHO细胞，大肠杆菌(E.coli)，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)，多形汉逊酵母(H.polymorpha)，HEK细胞，HeLa细胞，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)，肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，MDCK细胞，Paenebacillus macerans，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)，假单胞菌属物种(Pseudomonas species)，酿酒酵母(S.cerevisiae)，红细菌属物种(Rhodobacter species)，红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，链霉菌属物种(Streptomyces species)，Streptomyces anulatus，吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，Sf-9细胞，和野油菜黄单胞菌(Xantomonascampestris)。在又一实施方案中，抗体是抗CD19，CD20，CD22，HLA-DR，CD33，CD52，EGFR，G250，GD3，HER2，PSMA，CD56，VEGF，VEGF2，CEA，Lewis Y抗原，IL-6受体或者IGF-1受体的抗体。

下列实施例和图被用来举例说明本发明的主题。后附的专利权利要求书定义了保护范围。明确的是，在公开的方法的主题上可以进行修改，而不会偏离本发明的主题。

附图说明

图1a)在反应器中本文所述的搅拌器系统的示意图，其中D＝容器内径，d＝搅拌器系统外径，d_sp＝气体分配器的直径(出口孔)，H＝容器装料水平，H_B＝容器高度，h_sp＝气体分配器安装高度，h_1m＝底部搅拌器元件的安装高度，h_2m＝搅拌器元件1和搅拌器元件2之间的距离，h_3m＝搅拌器元件2和搅拌器元件3之间的距离，d_b＝挡扳距容器壁的距离，w＝挡扳叶片的宽度；b)标准盘式搅拌器的示意图，其中：d＝搅拌器外径，b＝搅拌器叶片宽度，h＝搅拌器叶片高度；c)倾斜叶片搅拌器，其中：α＝搅拌器叶片倾斜度，l＝搅拌器叶片长度，h＝h_SB＝(投影的搅拌器叶片高度)。

图2各种搅拌器系统的功率系数Ne的图示，其为雷诺数的函数；SSR＝标准盘式搅拌器；SBR＝倾斜叶片搅拌器。

图3各种搅拌器系统的混合度95％的混合时间的图示，其为功率输入的函数。

图4各种搅拌器系统的混合系数C_H的对比，其为雷诺数的函数；SSR＝标准盘式搅拌器；SBR＝倾斜叶片搅拌器。

图5参比片直径d_VF对体积-比功率输入和搅拌器系统的依赖性；SSR＝标准盘式搅拌器；SBR＝倾斜叶片搅拌器。

图6活细胞密度(a)和生存力(b)的标准化后的时间过程，其为发酵时间和用于培养抗IGF-1R抗体生产细胞系的搅拌器系统的函数。

图7产品浓度的标准化后的时间过程，其为发酵时间和用于培养抗IGF-1R抗体生产细胞系的搅拌器系统的函数。

图8活细胞密度(a)和生存力(b)的标准化后的时间过程，其为发酵时间的函数，其中使用本文所述的搅拌器系统来培养抗CD20抗体生产细胞系。

图9产品浓度的标准化后的时间过程，其为发酵时间和用于培养抗CD20抗体生产细胞系的搅拌器系统的函数。

图10活细胞密度(a)和生存力(b)的标准化后的时间过程，其为发酵时间的函数，其中使用本文所述的搅拌器系统来培养抗HER2抗体生产细胞系。

图11产品浓度的标准化后的时间过程，其为发酵时间和用于培养抗HER2抗体生产细胞系的搅拌器系统的函数。

图12在透析中的传质系数，其为比功率输入(specific power input)的函数。

图13用于透析培养的设备的示意图。

图14在透析模块的中空纤维上的浓度梯度的示意图。

实施例1

培养设备

全部研究均在300L型容器(下文中称为DN640)中进行，或者在生产反应器本身中进行。透析研究在100L型容器(下文中称为DN440)中进行。

实施例2

功率输入

不同的搅拌器的功率输入通过测量转轴上的扭矩来进行测定。使用数据处理系统型号GMV2与扭矩传感器型号DRFL-II-5-A(两者均来自″ETHMesstechnik″公司，Gschwend，德国)来记录扭矩。对于每个搅拌器系统，根据公式9，首先在未装料状态下记录各种转速下的扭矩(M_empty)，随后通过一式三份测量的方式在装料状态下记录扭矩(M_load)：

M＝M_load-M_empty (公式9)。

然后，针对每个点，计算相应的牛顿数(Ne数)和雷诺数(Re数)。因为在湍流区域搅拌器系统的牛顿数变得恒定，在该区内将计算的牛顿数随后进行平均(Uhl，V.W.and Gray，J.B.，Mixing Theory and Practice，AcademicPress，1966)。这均值表示相应搅拌器的总牛顿数。

实施例3

均化

使用变色方法以及使用电导法来测定均化。

变色方法是基于用碘-碘化钾染色的淀粉溶液通过添加硫代硫酸钠而脱色(I，KI，淀粉，Na₂S₂O₃得自the Carl Roth GmbH&Co KG Company，Karlsruhe，Germany)。一摩尔硫代硫酸钠溶液和一摩尔碘-碘化钾溶液(Lugol溶液)以及10g/l浓度淀粉溶液被用作起始溶液。与导电性实验一致，对每个搅拌器检查至少四个速度等级(每个速度等级进行一式四份测定)，其中每容器装料量进行四个实验的最大值。在各情况下，每次容器进料，添加一次淀粉溶液。对于每个单独测量，相应体积的碘-碘化钾溶液首先加入，随后加入硫代硫酸钠。从加入硫代硫酸钠的时间点起，人工确定混合时间，然后在各情况下减去一秒钟，以便将加入时间纳入考虑。在测量完成之后，容器装料体积用碘-碘化钾进行滴定(中和)，以便抵消过量的之前加入的硫代硫酸钠。

在电导法中，混合时间被定义为，从加入电解质溶液起的时间到测量的电导波动最后一次超过在静态达到的导电值的±5％容许范围的时间。如果使用了数个探针，在各情况下，检测到的最长混合时间被认为代表整个系统。

使用30％(w/v)的NaCl溶液(NaCl晶体，Merck KGaA Company，Darmstadt，Germany)作为电解质溶液来通过电导法测定混合时间。该溶液以脉冲方式被加在搅拌器转轴处液面上，选择每次加入的体积，使得静态达到的导电值的突然变化不超过200mS/cm。

对于各搅拌器，检测至少四个速度等级。每个速度等级，至少测定8次混合时间，将这8个数值进行平均。各搅拌器系统的混合系数作为按速度等级平均的混合系数均值来给出。对于各情况，通过三个4极电导探针(TetraCon，WTW Company，Weilheim)在容器的各径向或者轴向位置测量导电性。通过使用的测量放大器(Cond813，Knick″ElektronischeGmbH&Co，KG″Company，Berlin，Germany)，在线读出电导信号。对于所有探针，通过软件Paraly SW 109(Knick″ElektronischeGmbH&Co，KG″Company，Berlin，Germany)，以5秒钟的采样速度，同时在线存储测量的值。在一系列测量完成之后，对于每个探针单独评估数据。

实施例4

剪切应力

使用模型粒子系统，蓝粘土聚合物片系统，来测定剪切应力。这是模型粒子系统，其由阳离子聚合物(Praestol BC 650)和粘土矿物(蓝粘土)组成，置于容器中。通过添加Praestol BC 650来开始絮凝反应，生成规定尺寸的片。这些片随后被搅拌器系统的机械和流体动力学应力破碎。在鼓泡通气系统的情况下，当气泡形成并破裂时，它们另外地通过能量耗散而被破碎。该模型粒子系统的平均粒径被用作表征剪切应力的测量变量。在这种情况下，粒子尺寸的变化通过Mettler Toledo Company的Focused BeamReflectance Measurement Probe(在下文中称为)来进行原位测量。测定的颗粒尺寸的变化率是在模型系统中占优势的剪切应力的量度。粒子尺寸的变化率梯度在实验期间变得更小，但是不形成平衡状态(颗粒粉碎降至蓝粘土初级颗粒直径≈15μm)。因此原因，根据下列标准(公式10)，确定了对于该蓝粘土聚合物片系统的终点片直径d_P50′：

\frac{d (d_{P 50})}{dt} \leq 0.0055 [μm / s] &RightArrow; d_{P 50} = {d_{P 50}}^{'}

(公式10)

为了确保在不同功率输入下和不同搅拌器之间的终点片直径的可比较性，根据如下来计算了参比片直径(公式11到13)：

d_VF＝m·d_P50′-b (公式11)

m = 1.3 \cdot 10^{- 6} \cdot {(\frac{P}{V})}^{2} + 1.37 \cdot 10^{- 3} \cdot (\frac{P}{V}) + 2.46

(公式12)

b = 8.12 \cdot 10^{- 5} \cdot {(\frac{P}{V})}^{2} + 6.48 \cdot 10^{- 3} \cdot (\frac{P}{V}) + 76.9

(公式13)

表3：用于确定颗粒应力的物质(浓度基于容器装料体积)。

首先，用相应体积(H/D比率)的全软化水(VE水)装入100L模型容器，保持20℃的温度。随后，通过用CaCl₂溶液滴定，调节导电性到1000μS/cm的值。通过4-极电导探针(探针：TetraCon，WTW Co.Weilheim；measuringamplifier：Cond813，Knick″ElektronischeGmbH&Co，KG″Company，Berlin，德国)来测定导电性。然后，以合适量将蓝粘土和NaCl加入到溶液。随后，以最高速度，以至少20分钟的持续时间，进行均化期。在容器中，从上(浸入深度300mm)垂直，在到壁70mm的径向距离上安装探针(D600L，Mettler-Toledo GmbH Co.，Giessen，德国)。随后通过以规定的速度加入Praestol 650BS，开始絮凝反应。通过程序数据捕获控制接口版本6.7.0(Mettler-Toledo GmbH，德国)，在线记录测量值。从测量数据来测定参比片直径。对各搅拌器，测量至少三个功率输入。在每一个情况下，每功率输入进行三次测量。

实施例5

透析(液-液传质)

使用NaCl溶液(NaCl晶体，Merck KGaA Company，Darmstadt，德国)作为示踪物，相对于所使用的搅拌器系统和体积-比功率输入，测定模块(DIADYN-DP 070 F1 OL；MICRODYN-NADIR GmbH Company，Wiesbaden，德国)的浓度半衰期。在每个实验批次开始时，调节贮藏容器中的示踪物到基线导电性1500μS/cm。对于各实验批次，用完全软化水来装入反应器。反应器的装填体积是100L(H/D＝1.6)，贮藏容器的装填体积是400L(H/D＝2.0)，在各实验开始时，两个容器均保持在20℃。通过4-极电导探针(探针：TetraCon，WTW Co.Weilheim，德国；测量放大器：Cond813，Knick″ElektronischeGmbH&Co，KG″Company，Berlin，德国)来测定两个容器的导电性。使用的测量放大器的采样速度是5秒钟，对于所有探针，通过软件Paraly SW 109(Knick″ElektronischeGmbH&Co，KG″Company，Berlin，德国)，同时在线存储测量的值。通过蠕动泵(housing pump 520U，Watson-Marlow GmbH，Company，Rommerskirchen，德国)，以恒流速为2.1升/分在供应容器和透析模块之间循环NaCl溶液。为了评估，将探针1用作反应器的参比探针，探针3用作贮藏容器的参比探针。这两个探针的数据通过常规评估手段进行评估。在各情况下，每搅拌器研究至少六个不同的反应器中功率输入。

为了比较通过NaCl溶液测定的传质特征，用葡萄糖溶液作为示踪物进行了额外的测量。对此不更换实验设置。在贮藏容器中以3g/l的浓度来提供规定的葡萄糖浓度(葡萄糖固体，Merck KGaA Company，Darmstadt，德国)。通过血糖测量仪器(ACCU-Aviva，Roche Diagnostics GmbHCompany，Mannheim，德国)，以10分钟的间隔，对贮藏容器和反应器同时手动测量葡萄糖浓度。

实施例6

抗IGF-1R抗体

根据国际专利申请WO 2004/087756，WO 2007/045465和WO 2007/115814中公开的数据，并且通过一般已知方法，来生产并培养分泌抗IGF-1R抗体的细胞系。

实施例7

抗CD20抗体

根据国际专利申请WO 2005/0044859中公布的数据，并且通过一般已知方法，来生产并培养分泌抗CD20抗体的细胞系。

实施例8

抗HER2抗体

根据国际专利申请WO 92/022653和WO 99/057134公布的数据，并且通过一般已知方法，来生产并培养分泌抗HER2抗体的细胞系。

Claims

1.培养哺乳动物细胞的方法，其特征在于，在设备中培养哺乳动物细胞，其中所述设备包含搅拌器系统和培养容器，

其中，该搅拌器系统由被安排在垂直搅拌器轴上一个在另一个之上的两个径向传递搅拌器元件和一个轴向传递搅拌器元件组成，其中轴向传递搅拌器元件被安排在径向传递搅拌器元件之上。

2.制造多肽的方法，其包括如下步骤：

a)在包含搅拌器系统和培养容器的设备中，培养包含编码多肽的核酸的哺乳动物细胞，

其中，该搅拌器系统由被安排在垂直搅拌器轴上一个在另一个之上的两个径向传递搅拌器元件和一个轴向传递搅拌器元件组成，其中轴向传递搅拌器元件被安排在径向传递搅拌器元件之上，

b)从培养基或者细胞中回收多肽，

c)纯化多肽，并由此产生多肽。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，当在含有培养基的培养容器中使用时，搅拌器系统在雷诺数5*10⁴到5*10⁵下牛顿数为5.5到8.0。

4.权利要求1或2的方法，其特征在于，当在含有培养基的培养容器中使用时，搅拌器系统的混合时间θ_0.95在功率输入约0.05W/kg时为约20秒钟，在功率输入约0.3W/kg时混合时间θ_0.95为约10秒钟。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于，搅拌器系统由作为径向传递搅拌器元件的两个盘式搅拌器或者两个Rushton涡轮和作为轴向传递搅拌器元件的一个倾斜叶片搅拌器组成。

6.权利要求1或2的方法，其特征在于径向传递搅拌器元件具有2到8个搅拌器叶片，轴向传递搅拌器元件具有2到10个搅拌器叶片。

7.权利要求1或2的方法，其特征在于，所有传递元件具有相同直径d。

8.权利要求1或2的方法，其特征在于，搅拌元件的直径d对培养容器的直径D的比率为0.32到0.35。

9.权利要求1或2的方法，其特征在于，轴向传递搅拌器元件的搅拌器叶片的倾斜度为相对于搅拌器轴10°到80°。

10.搅拌器系统在混合哺乳动物细胞培养基中的用途，

11.用于动物细胞培养的设备，其特征在于，所述设备包括：

a)培养容器，

b)沿着培养容器中轴线的垂直轴，

c)搅拌器系统，其由被安排在垂直搅拌器轴上一个在另一个之上的两个径向传递搅拌器元件和一个轴向传递搅拌器元件组成，其中轴向传递搅拌器元件被安排在径向传递搅拌器元件之上，

d)在培养容器底部的气体进口，和

e)在高于液面的区域中用于添加校正溶液和/或进料溶液的至少一个进口。

12.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，当在含有培养基的培养容器中使用时，搅拌器系统在雷诺数5*10⁴到5*10⁵下牛顿数为5.5到8.0。

13.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，当在含有培养基的培养容器中使用时，搅拌器系统的混合时间θ_0.95在功率输入约0.05W/kg时为约20秒钟，在功率输入约0.3W/kg时混合时间θ_0.95为约10秒钟。

14.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，搅拌器系统由作为径向传递搅拌器元件的两个盘式搅拌器或者两个Rushton涡轮和作为轴向传递搅拌器元件的一个倾斜叶片搅拌器组成。

15.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于径向传递搅拌器元件具有2到8个搅拌器叶片，轴向传递搅拌器元件具有2到10个搅拌器叶片。

16.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，所有传递元件具有相同直径d。

17.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，搅拌元件的直径d对培养容器的直径D的比率为0.32到0.35。

18.权利要求10的用途或权利要求11的设备，其特征在于，轴向传递搅拌器元件的搅拌器叶片的倾斜度为相对于搅拌器轴10°到80°。