MX2012000730A - Sistema de agitadores. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un sistema de agitadores para el cultivo de células animales que contiene una combinación de por lo menos un elemento de agitador de transporte radial y por lo menos un elemento de agitador de transporte axial, en donde por lo menos tres elementos de agitador deben estar presentes y el elemento de agitador más superior es un elemento de agitador de transporte axial. Los elementos de agitador se disponen a cierta distancia uno por arriba del otro sobre un eje de agitador. Una modalidad particular es un sistema de agitadores múltiple que consiste de dos agitadores de disco como elementos de agitador de transporte radial y un agitador de paletas inclinadas como un elemento de agitador de transporte axial en donde el agitador de paletas inclinadas se dispone por arriba del agitador de disco sobre el eje de agitador. El sistema de agitadores de conformidad con la invención logra entre otras cosas un mejor entremezclado en las células de mamíferos sensibles al esfuerzo cortante en cultivos celulares.

Description

SISTEMA DE AGITADORES Campo de la Invención En la presente se reporta un sistema de agitadores para el cultivo de células animales que consiste de una combinación de por lo menos un elemento de transporte radial y por lo menos un elemento de transporte axial, en donde deben estar presentes por lo menos tres elementos de transporte y el elemento más superior es un elemento de transporte axial. Los elementos de transporte están dispuestos sobre un eje con cierto espaciamiento uno por arriba del otro. En una modalidad particular el sistema de agitadores consiste de dos agitadores de disco como elementos de transporte radial y un agitador de paletas inclinadas como un elemento de transporte axial en donde el agitador de paletas inclinadas está dispuesto por arriba del agitador de disco sobre el eje. El agitador de conformidad con la invención logra entre otras cosas un mezclado más suave y mejor del medio de cultivo para el cultivo de células procarióticas y eucarióticas .

Antecedentes de la Invención La producción de proteínas recombinantes , vacunas y anticuerpos con la ayuda de células procarióticas y eucarióticas juega un papel esencial en la producción farmacéutica moderna. Para producir proteínas complejas Ref.: 225751 postraslacionalmente modificadas y anticuerpos se utilizan principalmente células derivadas de animales. Sin embargo, el uso de células derivadas de animales establece altas demandas para el proceso de fermentación debido a las características específicas de estas células como por ejemplo, el medio de cultivo, la sensibilidad hacia la limitación e inhibiciones (por ejemplo por lactato, C02, amonio, etc.), la membrana externa sensible (esfuerzo cortante) , las bajas velocidades específicas y la sensibilidad hacia variaciones en las condiciones de cultivo (por ejemplo, debido a no homogeneidades locales, variaciones de pH, variaciones de p02, etc.) . Estas propiedades tienen que tomarse en consideración cuando se diseñan biorreactores y para control de procesos.

En años recientes se han desarrollado varios tipos de reactores para el cultivo de células. Independientemente del tipo, el reactor debe ser capaz de cumplir con las siguientes funciones técnicas básicas: adecuada suspensión así como homogeneización, transporte adecuado de materia y dé calor así como un esfuerzo cortante mínimo en las células. El reactor de tanque agitado es especialmente adecuado para uso industrial. En este reactor se introduce la energía necesaria para cumplir con las funciones básicas por medio de agitación mecánica .

Se sabe de la literatura que las células de mamíferos son mucho más sensibles a los esfuerzos cortantes que los microorganismos. Esto se atribuye usualmente a la falta de una pared celular (véase por ejemplo, Glacken, M.W. , y colaboradores, Trends Biotechnol . 1 (1983) 102-108; van der Pol, L.A. y Tramper, J. Enzyme Microb. Technol . 17 (1995) 401-407; Nienow, A.W. , Cytotechnol . 50 (2006) 9-33; Cervantes, M.I., y colaboradores, Chem. Eng. Sci . 61 (2006) 8075-8084; Frahm, B. , y colaboradores, Chem. Ing. Tech. 79 (2007) 1052-1058) . La sensibilidad al esfuerzo cortante es la razón de considerables dificultades en el manejo técnico de biorreactores de cultivo en suspensión. Los reactores de tanque agitado se utilizan usualmente en procesos de producción biotecnológica para alimentar las células porque éstas pueden controlarse de manera más flexible y usarse con respecto a las condiciones de proceso requeridas. Además de la geometría de los sistemas y de la reología del material agitado, las funciones básicas antes mencionadas se cumplen principalmente por medio de los sistemas de agitadores que se utilizan .

Las razones principales para el esfuerzo cortante en las células que se cultivarán son entre otras, las fuerzas cortantes generadas por el sistema de agitadores. Éstas tienen un efecto intenso especialmente en la región de las paletas del agitador así como en la de los deflectores. De acuerdo con la teoría de Kolmogorov los macrovórtices generados por los agitadores se descomponen por disipación de energía para formar pequeños microvórtices . Cuando su tamaño se hace igual al tamaño de las células que van a fermentarse, las células pueden dañarse (Cherry, R.S. y Papoutsakis, E.T., Biotechnol. Bioeng. 32 (1988) 1001-1014; Papoutsakis, E.T. y Kunas, K.T., en "Advances in animal cell biology and technology for bioprocesses" , Spier, R.E., y colaboradores (Eds.) Butterworth, Sevenoaks, Kent, Reino Unido (1989) 203-211; Kunas, K.T. y Papoutsakis, E.T., Biotech. Bioeng. 36 (1990) 476-483; Zhang, Z.B. y Thomas, C.R., Gen. Eng. Biotechnol. 13 (1993) 19-29; Nienow, A.W. , Cytotechnol. 50 (2006) 9-33).

Se han hecho recomendaciones para usar agitadores en cultivos de células de animales (véase, por ejemplo, Feder, J. y Tolbert, W.R., Sci. Am. 248 (1983) 24-31; fabricantes de agitadores por ejemplo Ekato, Chemineer, Bioengineerong, Zeta) que enfatiza la generación de flujos de bajo esfuerzo cortante como criterio importante. Por lo tanto se han desarrollado un gran número de agitadores de bajo esfuerzo cortante para reducir el daño (por ejemplo "Impulsor de Oreja de Elefante", o Impulsor de Flujo Máximo") .

En un artículo online ("Agitadores axiales de bombeo de flujo descendente en procesos biológicos", de abril de 2009, http : //www. postmixing . com/mixing%20forum/Micro/Liq-Solid-Gas/down-pumpers . htm) se muestra que una combinación de agitadores que consiste de diferentes agitadores da como resultado une transferencia de masa mejorada. Con respecto a las células de animales, se recomienda el uso de tres transportadores axiales para lograr los mejores resultados en el cultivo celular. Fujasova, M. , y colaboradores, (Chem. Eng. Sci. 62 (2007) 1650-1669) reporta correlaciones en la transferencia de masa para agitadores de etapas múltiples. La transferencia de masa entre la fase gas y la fase líquida utilizando sistemas de agitadores de tres etapas en un biorreactor lo reporta Puthli y colaboradores (Puthli, M.S., y colaboradores, Biochem. Eng. J. 23 (2005) 25-30) .

El uso de un termentador para cultivar células bacterianas con un eje rotatorio vertical al cual se unen preferentemente dos o tres agitadores Rushton se reporta en US 5,633,165. Nienow, A.W., (Cytotechnol . 50 (2006) 9-33) recomienda un sistema de reacción para el cultivo de células animales con una relación H/D de 1 a 1.3 y el uso de dos agitadores de aletas hidrodinámicas de transporte descendente (transportadores axiales) con un aireador que se monta debajo del agitador más inferior.

En US 2004/0234435 se reporta un aparato y método para la producción de ácidos carboxílicos aromáticos. Se reporta un reactor de polimerización continua en US 4,438,074. En US 2004/0087814 se reporta un sistema de agitación para reactores de oxidación de alquil benceno. En US 5,972,661 se reporta un sistema de mezclado. En US 6,250,769 se reporta un aparato de agitación con mezclador estático o turbulenciador. Se reportan agitadores en US 5,198,156. En US 4,779,990 se reporta un aparato propulsor.

Breve Descripción de la Invención En la presente se reporta un sistema de agitadores que comprende por lo menos un elemento de transporte radial y por lo menos un elemento de transporte axial en donde deben estar presentes por lo menos tres elementos de transporte y el elemento de transporta más superior es un elemento de transporte axial. En comparación con los agitadores que usualmente se emplean para cultivar células animales sensibles al esfuerzo cortante, el sistema de agitadores como se reporta en la presente puede lograr un mezclado más rápido del medio de cultivo (por ejemplo con el fin de introducir agentes de corrección como ácidos o bases vía la superficie del líquido) sin exponer las células en el medio de cultivo a alto esfuerzo cortante .

En una modalidad, el sistema de agitadores consiste de 3 a 5 elementos de transporte. En otra modalidad el sistema de agitadores consiste de 3 ó 4 elementos de transporte. En una modalidad adicional los elementos de transporte del sistema de agitadores están dispuestos a cierta distancia uno arriba del otro sobre un eje vertical. En aún otra modalidad los elementos de transporte están dispuestos sobre el eje con la misma distancia entre sí. En aún otra modalidad la distancia entre los elementos de transporte es de entre uno y dos diámetros del elemento de transporte d. En una modalidad los elementos de transporte del sistema de agitadores están dispuestos sobre un eje vertical mediante el cual el elemento de transporte más superior está a una distancia definida del elemento de transporte del fondo y está a una distancia suficiente de la superficie del líquido del medio de cultivo cuando el sistema de agitadores se opera en un recipiente de cultivo lleno con medio de cultivo mediante lo cual el sistema de agitadores asegura el mezclado del medio de cultivo. En una modalidad la distancia desde la superficie del medio de cultivo es la misma que la distancia entre el elemento de agitador más superior y el segundo elemento de agitador desde la parte superior. En una modalidad todos los elementos de transporte tienen el mismo diámetro d.

En una modalidad el sistema de agitadores consiste de dos elementos de transporte radial y un elemento de transporte axial, en donde el elemento de transporte axial está dispuesto sobre el eje de agitador por arriba de los elementos de transporte radial .

En una modalidad, los elementos de transporte radial tienen entre 2 y 8 paletas de agitador y el elemento de transporte axial tiene entre 2 y 10 paletas de agitador. En otra modalidad los elementos de transporte radial tienen de 3 a .6 paletas de agitador, y en una modalidad adicional 6 paletas de agitador. En una modalidad, el elemento de transporte axial tiene de 2 a 6 paletas de agitador, y en una modalidad adicional 4 paletas de agitador. En una modalidad adicional todos los elementos de transporte radial y todos los de transporte axial tienen el mismo número de paletas de agitador. En una modalidad todos los elementos de transporte tienen 4 ó 6 paletas de agitador. En una modalidad el elemento de transporte radial es un elemento de transporte radial simétrico. Un "elemento de transporte radial simétrico" es un elemento que tiene una sección transversal simétrica a lo largo del eje longitudinal del elemento, es decir, la sección transversal a lo largo y que incluye el eje de rotación tiene simetría puntual y simetría especular.

En una modalidad, la relación del diámetro del elemento de transporte d al diámetro del recipiente de cultivo D cuando el sistema de agitadores se coloca en el recipiente de cultivo está en el intervalo entre 0.2 y 0.8, en otra modalidad en el intervalo entre 0.3 y 0.6, en una modalidad adicional en el intervalo entre 0.31 y 0.39, o también en una modalidad de aproximadamente 0.34. La relación de la altura de la paleta de agitador del elemento de transporte axial hB a la anchura de las paletas de agitador del elemento de transporte radial b está en el intervalo de entre 0.2 y 2.0, en otra modalidad en el intervalo entre 0.3 y 1.4, o en una modalidad adicional en el intervalo entre 0.4 y 1.0. En una modalidad adicional el : aso de las paletas de agitador del elemento de transporte axial está entre 10° y 80°, en otra modalidad entre 24° y 60°, o en una modalidad adicional entre 40° y 50° en relación con el eje geométrico del eje mecánico. En una modalidad todos los elementos de transporte tienen una relación del diámetro del elemento de transporte d al diámetro del recipiente de cultivo D de 0.32 a 0.35.

En una modalidad, el sistema de agitadores tiene un número de Newton de 5.5 a 8.0 a un número de Reynolds de 5 x 104 a 5 x 105. En otra modalidad el sistema de agitadores tiene un tiempo de mezclado T0.95 de aproximadamente 20 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.05 W/kg y de aproximadamente 10 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.3 W/kg.

Otro aspecto como se reporta en la presente es un dispositivo que comprende un sistema de agitadores como se reporta en la presente y un recipiente de cultivo. En una modalidad el dispositivo comprende adicionalmente un módulo de diálisis. En otra modalidad el dispositivo es para el cultivo de células animales. En aún otra modalidad el dispositivo comprende : a) un recipiente de cultivo que es adecuado para recibir un medio de cultivo y células animales que se cultivarán ahí, b) un eje a lo largo del eje vertical geométrico del recipiente de cultivo, c) un sistema de agitadores como se reporta en la presente unido al eje, d) una entrada de gas en el fondo del recipiente de cultivo, y e) por lo menos una entrada en la porción superior del recipiente de cultivo por arriba de la superficie del líquido para añadir soluciones de corrección y/o de alimentación.

También un aspecto como se reporta en la presente es un método para producir un polipéptido que comprende las siguientes etapas : a) cultivar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido en un recipiente de cultivo que comprende un sistema de agitadores como se reporta en la presente o un dispositivo como se reporta en la presente, b) recuperar el polipéptido del medio de cultivo o las células, y c) purificar el polipéptido y de esta manera producir el polipéptido.

En una modalidad, la purificación es un proceso cromatográfico de etapas múltiples. En otra modalidad, la purificación comprende cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico.

Otro aspecto como se reporta en la presente es un ; método para cultivar células animales, caracterizado porque las células animales se cultivan en un recipiente de cultivo que comprende un sistema de agitadores como se reporta en la presente.

En una modalidad, el cultivo es un cultivo semicontinuo. En una modalidad adicional el cultivo semicontinuo es una diálisis. En una modalidad el polipéptido es un anticuerpo o derivado de anticuerpo.

Un aspecto adicional como se reporta en la presente es el uso de un sistema de agitadores como se reporta en la presente para el mezclado de un medio de cultivo. En una modalidad de los aspectos anteriores el medio de cultivo es un medio acuoso el cual es adecuado para el cultivo de células procarióticas y eucarióticas . En otra modalidad el medio de cultivo es un líquido Newtoniano. En una modalidad el sistema de agitadores se opera a una potencia de entrada de 0.01 W/kg a 1 W/kg. En una modalidad adicional el sistema de agitadores se opera a una potencia de entrada de 0.04 W/kg a 0.5 W/kg. En aún otra modalidad el flujo inducido por el sistema de agitadores en el medio de cultivo es un flujo turbulento. En aún otra modalidad el medio de cultivo tiene una viscosidad de 3 mPas*s o menos. En otra modalidad la viscosidad es de 2 mPas*s o menos.

Un aspecto adicional como se reporta en la presente es el uso del sistema de agitadores para cultivar células animales o células hibridomas para la producción de polipéptidos o anticuerpos. En una modalidad el cultivo se lleva a cabo en un reactor de tanque agitado sumergido gasificado. En otra modalidad la célula animal es una célula de mamífero. En aún una modalidad adicional la célula es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula COS, una célula PER.C6, una célula Sp2/0, una célula HEK 293 ó una célula hibridoma. En aún una modalidad adicional el anticuerpo es un anticuerpo contra CD19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3 , HER2 , PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, antígeno Lewis Y, receptor de IL-6, o receptor de IGF-I.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras la-lf muestran un diagrama del sistema de agitadores como se reporta en la presente en un reactor en el cual D = diámetro interno del recipiente, d = diámetro externo de sistema de agitadores, dsp = diámetro del distribuidor de gas (aberturas externas) , H = nivel de llenado del recipiente, HB = altura del recipiente, hsp = altura de instalación del distribuidor de gas, him = altura de instalación del elemento de agitador inferior, h2m = distancia entre el elemento de agitador 1 y el elemento de agitador 2, h3m = distancia entre el elemento de agitador 2 y el elemento de agitador 3, bd = distancia del deflector desde la pared del recipiente, w = anchura de la paleta del deflector; b) diagrama de un agitador de disco estándar en el cual: d = diámetro externo del agitador, b = anchura de la paleta de agitador, h = altura de la paleta de agitador; c) diagrama de un agitador de paletas inclinadas en el cual: a = paso de la paleta de agitador, 1 = longitud de la paleta de agitador, h = hSB = (altura proyectada de la paleta de agitador) .

La figura 2 es un diagrama de coeficiente de potencia Ne de varios sistemas de agitadores como función del número de Reynolds; SSR = agitador de disco estándar; SBR = agitador de paletas inclinadas.

La Figura 3 es un diagrama del tiempo de mezclado para un grado de 95 % como función de la potencia de entrada para varios sistemas de agitadores.

La figura 4 es una comparación de los coeficientes de mezclado CH para varios sistemas de agitadores como función del número de Reynolds; SSR = agitador de disco estándar; SBR = agitador de paletas inclinadas.

La figura 5 es la dependencia del diámetro de hojuela de referencia dVF en el volumen-potencia de entrada específica y el sistema de agitadores; SSR = agitador de disco estándar; SBR = agitador de paletas inclinadas.

Las figuras 6a-6b muestran el transcurso del tiempo estandarizado de la densidad de células vivas (Fig. 6a) y la viabilidad (Fig. 6b) como función del tiempo de fermentación y el sistema de agitadores utilizado para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti-IGF-lR.

La figura 7 es el transcurso del tiempo estandarizado de la concentración de producto como función del tiempo de fermentación y del sistema de agitadores utilizado para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti-IGF- IR.

Las figuras 8a-8b muestran el transcurso del tiempo estandarizado de la densidad de células vivas (Fig. 8a) y la viabilidad (Fig. 8b) como función del tiempo de fermentación utilizando un sistema de agitadores como se reporta en la presente para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti-CD20.

La figura 9 es el transcurso del tiempo estandarizado de la concentración de producto como función del tiempo de fermentación y del sistema de agitadores utilizado para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti-CD20.

Las figuras 10a-10b muestran el transcurso del tiempo estandarizado de la densidad de células vivas (Fig. 10a) y la viabilidad (Fig. 10b) como función del tiempo de fermentación utilizando un sistema de agitadores como se reporta en la presente para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti-HER2.

La figura 11 es el transcurso del tiempo estandarizado de la concentración de producto como función del tiempo de fermentación y del sistema de agitadores utilizado para cultivar una línea de células que producen anticuerpos anti- HER2 La figura 12 es un coeficiente de transferencia de masa en la diálisis como función de la potencia de entrada específica.

La figura 13 es un diagrama esquemático de un dispositivo para cultivo por diálisis.

La figura 14 es un diagrama esquemático de los gradientes de concentración sobre las fibras huecas del módulo de diálisis.

Descripción Detallada de la Invención Se reporta en la presente un sistema de agitadores que consiste de por lo menos un elemento de transporte radial y por lo menos un elemento de transporte axial, en donde deben estar presentes por lo menos tres elementos de transporte y con lo cual el elemento más superior es un elemento de transporte axial. En comparación con los sistemas de agitadores que actualmente se utilizan para cultivar células animales sensibles al esfuerzo cortante, el sistema de agitadores como se reporta en la presente permite un mezclado más suave y más rápido del medio de cultivo. Un ejemplo de un sistema de agitadores como se reporta en la presente se muestra en la figura 1. Por lo tanto, el sistéma de agitadores como se reporta en la presente proporciona tiempos de mezclado más cortos y también menos tensión impartida a las células cultivadas sin necesidad de componentes complejos adicionales tales como deflectores, mezcladores estáticos, turbulenciadores , tubos de aspiración, u otro medio para dirigir el flujo al interior del recipiente de cultivo.

Los términos "elemento" o "elemento de transporte" , que pueden usarse de manera intercambiable, se refieren a una unidad (funcional) de paletas de agitador que están en una configuración espacial fija uno en relación con el otro con respecto a la distancia y el ángulo. Un elemento de transporte radial denota un elemento en el cual las paletas de agitador no tienen un paso con respecto al eje geométrico del eje. Un elemento de transporte axial denota un elemento en el cual las paletas de agitador tienen un paso con respecto al eje geométrico del eje. Las paletas de agitador de los elementos de transporte son en una modalidad placas rectangulares aunque pueden usarse otras formas geométricas. La dirección de transporte de un elemento se denota con respecto al eje de rotación del elemento. Las paletas de agitador de los elementos de transporte pueden no extenderse desde el eje sino estar montados sobre un brazo o un medio equivalente sobre el eje. Cada uno de los elementos de transporte consiste de un número definido de paletas de agitador. Cada paleta se conecta directamente al eje rotatorio o se conecta al eje rotatorio por medio de un cubo. Cada paleta de agitador independiente del elemento de transporte tiene un borde externo y un borde interno. La parte de cada paleta de agitador que tiene la distancia máxima al eje se conoce como la punta de la paleta,. Cada elemento de transporte tiene un diámetro externo y un diámetro interno. Por ejemplo, el diámetro externo de un elemento de transporte axial es la distancia máxima entre las puntas de paletas de agitador opuestas y el diámetro interno de un elemento de transporte radial es la distancia mínima entre los bordes internos de paletas de agitador opuestas .

El término "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina . Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los diferentes genes de región constante así como la gran cantidad de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab, y F(ab)2 así como cadenas simples (scFv) o diacuerpos o triacuerpos, como formas monovalentes, divalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes y hexavalentes , así como anticuerpos monoespecífieos, biespecíficos , triespecíficos o tetraespecíficos .

Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sean producidos en forma natural o sintética. Los polipéptidos con menos de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos pueden denominarse "péptidos", mientras que las moléculas que consisten de dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos de aminoácidos pueden denominarse "proteínas" . Un polipéptido puede comprender también componentes no aminoácidos, tales como grupos carbohidrato, iones metálicos, o ésteres de ácido carboxílico. Los componentes no aminoácidos pueden añadirse por medio de la célula, en la cual se produce el polipéptido, y puede variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen aquí en términos de su estructura principal de aminoácido o el ácido nucleico que codifica para el mismo. Las adiciones tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican, pero sin embargo pueden estar presentes.

Los recipientes de cultivos sumergidos gasificados se usan generalmente para cultivar células animales para la producción de polipéptidos o anticuerpos. En éstos se utilizan sistemas de agitadores puramente de transporté axial o puramente de transporte radial de una etapa o de etapas múltiples. Aquí el término "transporte axial" significa que el elemento de transporte genera un flujo paralelo al eje o al eje de rotación del elemento que se dirige fuera el elemento. De forma análoga, el término "transporte radial" significa que el elemento de transporte genera un flujo que es dirigido fuera del elemento de agitador y que es perpendicular al eje o al eje de rotación del elemento. Esta observación es independiente del hecho de que el reactor tiene una dimensión espacial limitada, por lo tanto, el flujo se desvía en las paredes del reactor y, por otro lado, independientemente del hecho de que el flujo que va al elemento de agitador puede ser diferente. El eje y también el eje geométrico del eje se extienden a través del eje longitudinal del recipiente de cultivo en el cual se utilizan los elementos de transporte o el sistema de agitadores. La velocidad rotatoria n del elemento se usa como una velocidad característica y el diámetro del elemento d se usa como una longitud característica.

Se puede proporcionar un sistema de agitadores mejorado como se reporta en la presente usando una combinación de elementos de transporte para uso en el cultivo de células de mamíferos. Con el sistema de agitadores como se reporta en la o presente pueden obtenerse viabilidades comparables, densidades de células y titulaciones de producto, al mismos tiempo con esfuerzos cortantes reducidos para las células cultivadas. Se encontró que el sistema de agitadores como se reporta en la presente puede mejorar el mezclado del contenido del recipiente de cultivo y al mismos tiempo retener la densidad de células alcanzable, por ejemplo, en comparación con un sistema de agitadores que consiste de tres elementos de transporte axial (tales como tres agitadores de paletas inclinadas) . El sistema de agitadores como se reporta en la presente es también particularmente adecuado para mezclar líquidos en o de la superficie del medio de cultivo, por ejemplo con el fin de introducir agentes de corrección tales como, por ejemplo, ácidos, bases, medios nutrientes, desespumantes o también C02 o 02 vía la superficie del líquido, y para el rápido mezclado total del medio de cultivo cuando se cultivan células animales.

En fluidos dinámicos el número de Reynolds (Re) describe la relación de la fuerza inercial a la fuerza friccional en un sistema hidrodinámico. A partir de esto también pueden hacerse afirmaciones acerca del grado de turbulencia del medio que se mueve. Para líquidos agitados, el número de Reynolds para agitador se define en la Ecuación 1 como: „ n<f n cf p Re = = — V 77 ' (Ecuación 1) El número de Newton .(Ne, también conocido como número de potencia) describe la relación de la fuerza de resistencia a la fuerza del flujo y por lo tanto es una medida para la resistencia al flujo de un agitador en un material agitado y se describe en la ecuación 2 : /Ve= (Ecuación 2] Los números de Ne para diferentes sistemas de agitadores se muestran en la figura 2.

Los elementos de transporte con un número de Newton bajo, tal como un propulsor o agitadores de paletas inclinadas, convierten la potencia de entrada más eficientemente en salida hidrodinámica, es decir, movimiento de fluido, que aquellos con un número de Newton alto, tales como las turbinas Rushton.

Un criterio para evaluar los procesos de agitación en procesos de cultivo es el tiempo de mezclado. El "tiempo de mezclado" de una mezcla líquido-líquido no homogénea se refiere al tiempo que se requiere para alcanzar una homogeneidad definida en el medio de cultivo. Los factores que influyen en el tiempo de mezclado son el grado de mezclado y el sitio de observación. El grado de mezclado a su vez depende de la geometría del reactor, la geometría el agitador, la frecuencia de rotación del agitador, y las sustancias de los materiales agitados. Es importante para los procesos de cultivo que, en la medida de los posible, todas las células se provean dé forma óptima y uniforme con los sustratos necesarios (tales como medio de nutrientes, 02) y que los metabolitos (tales como productos de flujos en exceso, C02) concomitantemente sean extraídos. Esto significa que los depósitos y colectores que pueden estar presentes tanto espacialmente como temporalmente en el recipiente de cultivo tienen que evitarse o por lo menos minimizarse con el fin de evitar daños a las células. Esto puede lograrse, por ejemplo, usando un sistema de agitadores mejorado para mezclar el contenido del recipiente . Los procesos de mezclado pueden dividirse en los subprocesos de micromezclado y macromezclado. El micromezclado se define como el ajuste de la concentración molecular debido a la difusión o a microturbulencias; en contraste, el macromezclado se define como el mezclado grueso convectivo ocasionado por el agitador (véase, por ejemplo, Houcine, I., y colaboradores, Chem. Eng. Technol. 23 (2000) 605-613; Zlokarnik, M.( "Ruhrtechnik Theorie und Praxis", Springer Publishers, Berlín Heidelberg, 1999). El grado de mezclado puede definirse de acuerdo con Henzler (Henzler, H. J. , "Homogenisieren: Referenz-Rührsysteme und Methoden zur Erfassung der Homogenisierungseigenschaften von Rührsystemen" , GVC Fachaussctu^ Mischvorgánge, 1998) de la siguiente manera en la ecuación 3 : *;=i-— (Ecuación 3) . En esta ecuación ? corresponde a la concentración de la sustancia trazadora después de un mezclado teóricamente completo y Aa corresponde a la diferencia máxima entre las concentraciones locales de la sustancia trazadora en un tiempo t. En general un grado de mezclado de Xi = 0.95 se considera como suficiente (véase Henzler, arriba) . El coeficiente de mezclado CH o.95 como se describe en la Ecuación 4 se basa en este grado de mezclado y es el producto del tiempo de mezclado T0.95 y la velocidad rotatoria del agitador n que se utilizó. Por lo tanto, corresponde al número de revoluciones del agitador que se requieren después de añadir un agente con el fin de alcanzar un grado de intermezclado de 0.95.

C ^H0.95 =fi W0.95 "n (Ecuación 4) Los coeficientes de mezclado mostrados en la Tabla 1 y los extractos en las figuras 3 y 4 fueron el resultado de las investigaciones de los tiempos de mezclado utilizando el método de decoloración.

Tabla 1: Coeficientes de Mezclado de varios agitadores Agitador H/D d/D CH(Re) Sistema de agitadores con dos agitadores 1.6 0.34 78 de disco estándar separados (2SSR) Sistema de agitadores con dos agitadores 1.6 0.34 95 de paletas inclinadas separados (2SBR) Sistema de agitadores con tres agitadores 1.6 0.33 77 de disco estándar separados (3SSR) Sistema de agitadores con tres agitadores 1.6 0.33 65.5 de paletas inclinadas separados (3SBR) Sistema de agitadores con un agitador de 1.6 0.34 38 paletas inclinadas y dos agitadores de disco estándar (1SBR + 2SSR) Sistema de agitadores con dos agitadores 1.6 0.34 39 de paletas inclinadas y un agitador de disco estándar (2SBR + 1SSR) En comparación con las configuraciones, el sistema de agitadores como se reporta en la presente tiene un índice de mezclado promedio de aproximadamente 38 a un número de Reynolds constante en comparación, por ejemplo, con un agitador que consiste de tres agitadores de paletas inclinadas separados (3SBR) o de tres agitadores de disco estándar (3SSR) con un índice de mezclado promedio de 65.5 y 77, respectivamente. Por lo tanto, en una modalidad del dispositivo como se reporta en la presente la relación de la altura de llenado del recipiente de cultivo H con respecto al diámetro del recipiente de cultivo D es de aproximadamente 1.6. El término "aproximadamente" indica que posteriormente el siguiente valor no es un valor exacto sino simplemente el valor central de un intervalo. En una modalidad indica el término de aproximadamente un intervalo de +/- 25 % alrededor del valor central, en una modalidad adicional de +/- 15 %, y en aún otra modalidad de +/- 10%.

Otro parámetro de proceso para el cultivo de células animales es el esfuerzo cortante aplicado a la célula en el medio de cultivo. Los cultivos de células animales, entre otras cosas, están limitados por el esfuerzo mecánico e hidrodinámico aplicado a las células. El esfuerzo es, por un lado, provocada por el agitador y, por otro lado, por la aireación del medio de cultivo (véase por ejemplo, Wollny, S. Y Sperling, R. , Chem. Ing. Tec . 79 (2007) 199-208) . Para regiones de flujo turbulento que son mayormente predominantes en recipientes de tanque agitado, el esfuerzo hidrodinámico está dado por el enfoque del esfuerzo de Reynolds de acuerdo con la fórmula 5 (Henzler, H.J. y Biedermann, A., Chem. Ing. Tec. 68 (1996) 1546-1561) : Tturb = p-U (Ecuación 5) De acuerdo con la ecuación 5 se puede deducir que el esfuerzo principal se debe a la fluctuación de la velocidad turbulenta u' de los elementos del fluido.

La caracterización del esfuerzo cortante se llevó a cabo para sistemas de agitadores en el estado no gasificado. Los diámetros de hojuelas de referencia dVF describen una medida relativa para la tensión prevaleciente y se muestran en la figura 5 y en la tabla 2. Cuanto mayor sea el diámetro de la hojuela de referencia, menor es el esfuerzo hidrodinámico. En este caso la sola influencia se debe al sistema de agitadores porque la aireación no está encendida.

Tabla 2: Ejemplos de diámetros de hojuelas de referencia de varios sistemas de agitadores a una potencia de entrada de 100 /m3.

Agitador H/D d/D dw(100 W/m3) [µp?] Sistema de agitadores con tres 1.6 0.33 65 agitadores de disco estándar separados (3SSR) Sistema de agitadores con tres 1.6 0.33 65 agitadores de paletas inclinadas separados (3SBR) Sistema de agitadores con un agitador 1.6 0.34 75 de paletas inclinadas y dos agitadores de disco estándar (1SBR + 2SSR) Sistema de agitadores con dos 1.6 0.34 75 agitadores de paletas inclinadas y un Agitador H/D d/D dvp(100 W/m3) [µp?] agitador de disco estándar (2SBR + 1SSR) En comparación con los sistemas de agitadores con solo elementos de transporte axial, tales como por ejemplo, tres agitadores de paletas inclinadas, el sistema de agitadores como se reporta en la presente ocasiona un esfuerzo considerablemente menor, es decir proporciona hojuelas con un diámetro de hojuela de referencia dVF más grande.

La figura 2 muestra una comparación de los números de Newton de los cuales pueden determinarse las entradas de energía no gasificadas. Puede observarse que el sistema de agitadores como se reporta en la presente genera un número de Newton considerablemente mayor que confiere una potencia de entrada más suave y más uniforme.

En una comparación directa con varios sistemas de agitadores el sistema de agitadores como se reporta en la presente muestra ventajas considerables en el mezclado (figuras 3 y 4, tabla 1) así como en el esfuerzo cortante generado (figura 5, tabla 2) .

Con el fin de lograr una titulación de producto elevada y una buena calidad de producto el modo de operación del recipiente de cultivo tiene un papel importante además, por ejemplo, para el desarrollo de líneas celulares, la composición de medios y el dimensionamiento del recipiente de cultivo. Puede hacerse una distinción entre los lotes de modos de operación o procesos por lotes, lote alimentado o procesos de alimentación, procesos continuos con o sin retención de células (por ejemplo perfusión o quimiostato) así como procesos semicontinuos tales como, por ejemplo diálisis interna o externa.

En procesos de cultivo semicontinuo, tales como por ejemplo, diálisis externa o interna, los sustratos se alimentan al recipiente de cultivo a través de una membrana y al mismo tiempo se eliminan componentes/productos metabólicos de las células cultivadas. Este intercambio de material es por difusión. Por lo tanto los principales factores influyentes son la diferencia en concentración prevaleciente, el material de la membrana, la superficie de la membrana, los coeficientes de difusión de los compuestos respectivos dentro del material de la membrana y el espesor de la interfase de fases que está determinada por el flujo contra la membrana. Cuando se emplea diálisis en fermentación de alta dénsidad celular es un proceso semicontinuo semejante a la perfusión en el cual un módulo de diálisis (de fibra hueca) unida en el reactor proporciona el área de intercambio entre el medio de cultivo y el medio de nutrientes fresco. El medio de nutrientes se bombea desde un recipiente de almacenamiento a través del módulo de diálisis y posteriormente se regresa de nuevo al recipiente de almacenamiento (para un diagrama esquemático véase la figura 13) . El módulo de diálisis puede localizarse fuera del reactor (diálisis externa) o dentro del reactor (diálisis interna) . La misma ley física aplica a ambos modos de operación. Por lo tanto, en la presente se reporta como un aspecto un dispositivo que comprende un sistema de agitadores como se reporta en la presente y un recipiente de cultivo y opcionalmente un módulo de diálisis.

El recipiente de cultivo tiene una porción superior, una porción intermedia y una porción inferior, en donde el eje longitudinal del recipiente se extiende desde la mitad o el centro de la porción superior hasta la mitad o el centro de la porción inferior. El recipiente de cultivo cilindrico tiene una sección transversal sustancialmente circular cuando se lo ve perpendicular al eje longitudinal. La porción más superior del recipiente de cultivo puede comprender además un medio de salida de descarga de gas, uno o más medios de entrada, y/o un orificio hombre para mantenimiento y limpieza. La porción inferior del recipiente de cultivo puede comprender además uno o más medios de entrada de líquido, uno o más medios de salida de líquido, y/o un medio de entrada de gas. La porción intermedia del recipiente de cultivo puede comprender además una chaqueta de intercambio de calor montada a la pared externa del recipiente de cultivo. Los elementos de transporte del sistema de agitadores se ponen a girar por medio de un eje que está acoplado a un mecanismo adecuado para inducir una rotación del mismo. El eje se extiende a lo largo del eje longitudinal del recipiente de cultivo y, por lo tanto, el eje tiene un eje de rotación orientado verticalmente . El eje no se extiende hasta el fondo del recipiente sino hasta un punto muy por arriba del fondo del recipiente y también muy por arriba del aspersor de gas opcional en el fondo del recipiente de cultivo. El eje está acoplado en forma operable a un eje de impulsión por medio de un mecanismo de acoplamiento adecuado. Además de un medio para acoplar el eje al eje de impulsión el eje comprende además medios adicionales, es decir, por lo menos tres medios, para acoplar individualmente los elementos de transporte al eje. Los elementos de transporte del sistema de agitadores están acoplados al eje en una posición que está/estará por abajo de la superficie del medio de cultivo en el recipiente de cultivo una vez que el sistema de agitadores se sumerge en el medio de cultivo. La superficie se determina cuando el medio de cultivo está estático, es decir, no está en circulación. El recipiente de cultivo no contiene un tubo de aspiración.

En una modalidad opcional el recipiente de cultivo es un recipiente con deflectores. En otra modalidad el recipiente de cultivo comprende dos o cuatro deflectores. Un "deflector" denota una placa colocada dentro de un recipiente de cultivo en la misma dirección que el eje geométrico del eje y se extiende radialmente dentro de recipiente de cultivo hacia el agitador. El deflector es generalmente de forma rectangular. En una modalidad, el deflector se coloca a una distancia bd de la pared interna del recipiente de cultivo. En otra modalidad los deflectores están espaciados equidistantemente alrededor de la circunferencia del interior del recipiente de cultivo .

En una modalidad el dispositivo también comprende un módulo de diálisis. Los componentes del dispositivo están dimensionados en una forma en la que pueden ejercer su función pretendida, es decir, el recipiente de cultivo puede contener el medio de cultivo, el sistema de agitadores puede mezclar el medio y dispersar un compuesto añadido en el mismo y el módulo de diálisis puede proporcionar un medio fresco y extraer compuestos metabólicos secretados por la célula cultivada. Por lo tanto, el sistema de agitadores tiene un diámetro que permite una rotación ininterrumpida dentro del recipiente en presencia y ausencia del módulo de diálisis. Con el dispositivo como se reporta en la presente un cultivo de alta densidad celular como cultivo de perfusión o como cultivo de diálisis puede llevarse a cabo de manera ventajosa. El cultivo se lleva a cabo en una modalidad a una velocidad de rotación del sistema de agitadores a la cual puede lograrse una potencia de entrada constante al medio de cultivo independiente del Número de Reynolds, es decir, durante el cultivo se proporciona un flujo de medio de cultivo turbulento en el recipiente de cultivo. Es posible con un dispositivo como se reporta en la presente cultivar células de mamíferos sensibles al esfuerzo cortante a una baja velocidad de rotación del sistema de agitadores pero a la misma potencia de entrada en comparación con otros sistemas de agitadores.

La forma del recipiente de cultivo no está limitada. En una modalidad el recipiente de cultivo es un recipiente cilindrico. En otra modalidad el recipiente de cultivo es un reactor de tanque agitado. El recipiente de cultivo puede tener cualquier dimensión. En una modalidad el recipiente de cultivo tiene un volumen de trabajo de 5 litros a 25,000 litros .

Los componentes del medio de nutrientes fresco se difunden desde el interior del módulo de diálisis a través de la membrana de fibra hueca semipermeable hacia el medio de cultivo y al mismo tiempo los metabolitos de las células cultivadas se difunden en la dirección opuesta del recipiente de cultivo hacia el medio de nutrientes de acuerdo con la diferencia en concentración. El objetivo es mantener la concentración absoluta de inhibición de metabolitos en el recipiente de cultivo tan baja como sea posible (dilución) y al mismo tiempo mantener la concentración de nutrientes esenciales tanto como sea posible a un nivel óptimo en el cultivo. Esto da como resultado condiciones de cultivo mejoradas en comparación con procesos sin diálisis que permiten alcanzar mayor densidad máxima de células o titulación de producto.

El proceso de transporte en el módulo de diálisis puede describirse en una forma equivalente a la transferencia de masa en una burbuja de gas por la teoría de dos películas junto con la primera Ley de Fick. Por lo tanto, suponiendo gradientes lineales con base en el área AH del módulo de diálisis de fibra hueca, el flujo de difusión transferido efectivo Jeff es de acuerdo con la Ecuación 6 : J /elf - ~-Deff,i A H . Z^L- ~- uneff,i A H -^L ¾ ¾r (Ecuación 6) La fuerza fuerza directriz de la difusión es la diferencia de concentraciones Ci entre el interior y el exterior del módulo de diálisis en relación con la trayectoria de difusión efectiva zeff . Esta trayectoria de difusión efectiva está compuesta de las trayectorias individuales a través de la capa límite laminar interna del lado interno de la membrana de fibra hueca del módulo de diálisis d??, a través de la propia membrana de fibra hueca d? y a través de la capa límite laminar externa del lado externo de la membrana de fibra hueca en el reactor d?? · Generalmente dependen del tamaño y la forma de la molécula que se difunde, las propiedades del medio circundante y la temperatura.

Pueden definirse coeficientes de transferencia de masa separados para las respectivas secciones individuales y de la suma de sus recíprocos la resistencia a la transferencia de masa total 1/k está dada de acuerdo con la ecuación 7: I-_L—+— k kHi kM kBi (Ecuación 7) Las resistencias de transporte en las capas límite laminares en el lado interno y externo de la membrana de fibra hueca también dependen del flujo contra la membrana de fibra hueca. Cuánto mejor sea el flujo, es decir más perpendicular, hacia la membrana, más estrechas se hacen las capas límite laminares y más bajas son las resistencia de transporte correspondientes. Para un módulo de diálisis en un recipiente de cultivo existe una dependencia directa de la resistencia al transporte de la capa límite laminar de, entre otros, los siguientes factores: - la velocidad de rotación del sistema de agitadores, - el tipo de sistema de agitadores, - el flujo contra las membranas, - el perfil de flujo principal generado por el sistema de agitadores .

La resistencia de la capa límite laminar en el lado interno de la membrana de fibra hueca puede despreciarse debido al poco diámetro interno y las altas velocidades de flujo concomitantes. En la presente solicitud el término "lado interno de la membrana de fibra hueca" se refiere al lado de la membrana de fibra hueca que se orienta hacia el recipiente de almacenamiento. El término "lado externo de la membrana de fibra hueca" se refiere al lado de la membrana de fibra hueca que se orienta hacia el recipiente de cultivo. La resistencia a la transferencia de masa total es por ló tanto una resistencia en serie a la cual contribuye principalmente la resistencia dentro de la membrana y la resistencia de la capa límite laminar externa (Rehm, y colaboradores, Biotechnology - volumen 3: Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993) . El coeficiente de transferencia de masa total k resulta de la resistencia a la transferencia de masa total recíproca y puede relacionarse con el área superficial multiplicando por la superficie de volumen específico del módulo de diálisis de fibra hueca (valor ka) . La siguiente ecuación 8 se puede usar para describir la concentración con respecto al tiempo para los espacios de balance del reactor y recipiente de almacenamiento. - i = ka (c-cfí) (Ecuación 8) En general se usan recipientes de cultivo gasificados sumergidos en el cultivo celular. En estos casos se usa principalmente un sistema de agitadores de transporte axial de una etapa o de etapas múltiples. Esto genera un perfil de flujo que es esencialmente paralelo al eje rotatorio. Por lo tanto, en la disposición mostrada en la figura 12 con el módulo de diálisis paralelo al eje rotatorio no se alcanza un flujo directo contra el módulo de diálisis. Esto tiene un efecto desventajoso en el transporte de masa en el módulo de diálisis (capa límite laminar externa más amplia sobre la superficie de la fibra) .

Un flujo tangencial o radial directo contra la membrana de diálisis tiene un efecto ventajoso que puede, por ejemplo, lograrse por medio de un propulsor de anclaje estándar. Este propulsor genera un flujo que es dirigido directamente sobre el módulo o los módulos de diálisis en el reactor y por lo tanto reduce la capa límite laminar sobre la superficie de los módulos de diálisis. Este flujo radial simple es, sin embargo, desventajoso para las otras funciones de proceso técnicas básicas en particular con respecto al mezclado del reactor y la transferencia de masa especialmente en reactores gasificados sumergidos. El gas puede introducirse en el recipiente de cultivo, por ejemplo, a través de un aspersor de tubo o un aspersor anular.

El sistema de agitadores como se reporta en la presente puede, en comparación con otros sistemas de agitadores, usarse para mezclar con más rapidez el medio de cultivo por ejemplo con el fin de introducir agentes de corrección tales como ácidos o bases a través de la superficie de líquido, para reducir la formación de espuma y en los métodos de diálisis para reducir las bioincrustaciones y aumentar la velocidad de transferencia de masa por medio del flujo ortogonal directo contra el módulo de diálisis.

El uso del sistema de agitadores de conformidad con la invención en el cultivo de células animales que produce un anticuerpo contra IGF- IR o CD20 ó HER2 se mostró como un ejemplo (véase WO 2004/087756; véase O 2007/045465, WO 2007/115814 y WO 2005/044859; véase WO 99/057134 y WO 92/022653). Esto no representa una limitación de descripción sino más bien solo sirve para ilustrar la invención. Como puede verse de las figuras 6 a 11 el uso de un sistema de agitadores como se reporta en la presente muestra cursos de tiempo similares para densidad de células vivas, viabilidad y formación de producto cuando se compara con un sistema de agitadores diferente (tal como por ejemplo, tres agitadores de paletas inclinadas) .

Las abreviaturas utilizadas en la presente solicitud tienen los siguientes significados (véase también la figura la) : b: anchura de las paletas del elemento de transporte radial d: diámetro externo total del agitador dw: diámetro del eje h: altura de las paletas de agitador del elemento de transporte radial hB: altura de un elemento de transporte axial ??: diferencia de altura de dos elementos de transporte 1 : longitud de las paletas de agitador de un elemento de transporte axial a: paso de las paletas de un elemento de transporte axial z : número de paletas de agitador por agitador di: distancia interna entre la paletas de agitador del elemento de transporte radial .

D: diámetro interno del recipiente de cultivo H: altura de llenado del recipiente de cultivo.

En una modalidad la relación de la diferencia de altura (Ah) de dos elementos de transporte al diámetro del recipiente de cultivo (D) es de por lo menos 0.75. En la presente se reporta como un aspecto el uso del sistema de agitadores como se reporta en la presente para el cultivo de células para la producción de polipéptidos o anticuerpos. En una modalidad el cultivo es una diálisis. En una modalidad adicional el cultivo se lleva a cabo en un recipiente de cultivo de tanque agitado gasificado sumergido. En otra modalidad la célula es una célula eucariótica, en otra modalidad una célula de mamífero. En aún una modalidad adicional la célula es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula COS, una célula PER.C6, una célula Sp2/0 ó una célula HEK 293. En una modalidad la célula se selecciona de Arthrobacter protophormiae, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus subtilis, células BHK, Candida boidinii, Cellulomonas cellulans, Corynebacterium lilium, Corynebacterium glutamicum, células CHO, E. coli, Geobacillus stearothermophilus , H. polymorpha, células HEK, células HeLa, Lactobacillus delbruekii, Leuconostoc mesenteroides, Micrococcus luteus, células MDCK, Paenebacillus macerans, P. pastoris, especie Pseudomonas, S. cerevisiae, especie Rhodobacter, Rhodococcus erythropolis, especie Streptomyces , Streptomyces anulatus, Streptomyces hygroscopicus , células Sf-9, y Xantomonas campestris. En aún una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo contra CD 19, CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3 , HER2 , PSMA, CD56, VEGF, VEGF2 , CEA, antígeno Lewis Y, receptor de IL-6 ó receptor de IGF-I.

El siguiente ejemplo y las figuras se proveen para ilustrar el objeto de la invención. El alcance de protección está definido por las reivindicaciones de patente anexas. Está claro que pueden hacerse modificaciones al objeto de los métodos descritos sin alejarse del objeto de la invención.

Ejemplo 1 Dispositivos de Cultivo Todas las investigaciones se llevaron a cabo en un recipiente modelo de Plexiglás® de 300 litros (citado como DN649 a continuación) o en los propios reactores de producción. Las investigaciones de diálisis se llevaron a cabo en un recipiente modelo de Plexiglás® de 100 litros (citado como DN 440 a continuación) .

Ejemplo 2 Potencia de Entrada Se determinó la potencia de entrada de diferentes agitadores midiendo . el momento de torsión en el eje rotatorio. Se utilizó un sistema de procesamiento de datos modelo GMV2 junto con el sensor de momento de torsión modelo DRFL-II-5-A (ambos de "ETH Messtechnik" Company, Gschwend, Alemania) para registrar el momento de torsión. Para cada sistema de agitadores se registró primero el momento de torsión a varias velocidades de revoluciones en el estado no llenado (MvaC£0) y enseguida por medio de una determinación por triplicado en el estado lleno ( carga) de acuerdo con la Ecuación 9: M = Mcarga - Mvacío (Ecuación 9) Posteriormente se calcularon los correspondientes números de Newton (número de Ne) y el número de Reynolds (número de Re) para cada punto. Dado que los números de Newton para un sistema de agitadores se hace constante en la región de flujo turbulento, los números de Newton calculados se promediaron después en esta región (Uhl, V.W. y Gray, J.B., Mixing Theory and Practice, Academic Press, 1966). Esta media representa el número de Newton total del agitador respectivo.

Ejemplo 3 Homogeneización La homogeneización se determinó usando el método del cambio de color así como el método de conductividad.

El método de cambio de color se basa en la decoloración de una solución de almidón tintada con yodo-yoduro de potasio mediante la adición de tiosulfato de sodio (I, KI, almidón, Na2S203 obtenido de Cari Roth GmbH & Co KG Company, Karlsruhe, Alemania) . Como soluciones de partida se utilizaron una solución de tiosulfato de sodio uno molar y una solución de yodo-yoduro de potasio uno molare (solución de Lugol) así como una solución de almidón a una concentración de 10 g/1. En correspondencia con los experimentos de conductividad, se examinaron por lo menos cuatro etapas de velocidad por agitador (determinaciones por cuadruplicado por cada etapa de velocidad) en donde se llevó a cabo un máximo de cuatro experimentos por cantidad de llenado de recipiente. En cada caso la solución de almidón se añadió una vez por llenado del recipiente. Para cada medición individual primero se añadió el volumen correspondiente de la solución de yodo-yoduro de potasio y después se añadió el tiosulfato de sodio. El tiempo de mezclado se ha determinado manualmente a partir del punto en el tiempo en el cual se añadió el tiosulfato de sodio y a un segundo se extrajo en cada caso con el fin de tomar en cuenta el tiempo de adición. Después de completar la medición se tituló el volumen de llenado del recipiente (neutralizó) con yodo-yoduro de potasio con el fin de compensar el exceso del tiosulfato de sodio previamente añadido.

En el método de conductividad, el tiempo de mezclado se define como el tiempo desde la adición de una solución electrolítica hasta el tiempo en el cual las fluctuaciones de conductividad medidas por última vez excede un intervalo de tolerancia de ± 5 % alrededor de los valores de conductividad que se alcanzan en un estado estacionario. Si se usan varias sondas, el tiempo de mezclado más largo detectado se considera como representativo para todo el sistema.

Se utilizó una solución de NaCl al 30% (peso/volumen) (NaCl cristalino, Merck KGaA Company, Darmstadt, Alemania) como una solución electrolítica para determinar el tiempo de mezclado por el método de conductividad. Esto se añadió por pulsos sobre la superficie del líquido en el eje rotatorio del agitador y el volumen por adición se seleccionó de tal manera que los saltos en conductividad que dieron como resultado un estado estacionario no excedieran 200 mS/cm.

Para cada agitador se examinaron por lo menos cuatro etapas de velocidad. El tiempo de mezclado se determinó por lo menos ocho veces por etapa de velocidad y estos ocho valores se promediaron. El coeficiente de mezclado de los sistemas de agitadores respectivos está dado por la media de los coeficientes de mezclado promediados por cada etapa de velocidad. En cada caso la conductividad se midió por medio de tres sondas de conductividad de 4 polos (TetraCon, WTW Company, Weilheim) en varias posiciones radiales o axiales en el recipiente. Las señales de conductividad se leyeron en línea por medio del amplificador de medición que se utilizó (Cond813, Knick "Elektronische essgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlín, Alemania) . Los valores medidos se almacenaron en línea y simultáneamente para todas las sondas por medio del software Paraly SW 109 (Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlín, Alemania) a una tasa de muestreo de 5 segundos. Después de que completó la serie de mediciones los datos se evaluaron por separado para cada sonda .

Ejemplo 4 Esfuerzo Cortante Se utilizó un sistema de partículas modelo, el sistema de hojuelas de polímero de arcilla azul, para determinar el esfuerzo cortante.. Este es un sistema de partículas modelo que consiste de un polímero catiónico (Praestol BC 650 y un mineral de arcilla (arcilla azul) el cual se coloca en el recipiente. Se inició una reacción de floculación mediante la adición de Praestol BC 650 el cual genera hojuelas de un tamaño definido. Estas hojuelas se rompen subsiguientemente por la tensión mecánica e hidrodinámica del sistema de agitadores. En el caso de sistemas gasificados de burbuja éstas se rompen por la disipación de energía cuando las burbujas se forman y estallan. El diámetro de partícula promedio del sistema de partículas modelo se usó como una variable medida para caracterizar el esfuerzo cortante. En este caso el cambio en el tamaño de partícula se midió in situ por medio de una Sonda de Medición de Reflectancia de Haces Enfocados de la Mettler Toledo Company (citada de aquí en adelante como FBRM®) . Las velocidades de cambio en el tamaño de las partículas que se determinaron son una medida para el esfuerzo cortante que prevalece en el sistema modelo. El gradiente de la velocidad de cambio del tamaño de partícula se hace más pequeño durante el curso del experimento pero no se forma ningún estado de equilibrio (pulverización de partículas hasta un diámetro , de las partículas primarias de arcilla azul de « 15 m) . Por esta razón se determinó un diámetro de hojuela final dP50' para el sistema de hojuelas de polímero de arcilla azul de acuerdo con el siguiente criterio (Ecuación 10) : = 0.0055[ m/ s]? dP50 = dP50 ' (Ecuación 10) Con el fin de asegurar la comparación de los diámetros de hojuelas finales a diferentes potencias de entrada y entre diferentes agitadores, se calculó el diámetro de la hojuela de la siguiente manera (Ecuaciones 11 a 13) : (Ecuación 11) dVF = mdP5Q'-b f pV fp) m= 1.3 - 10" + 1.37 - 10-3 · + 2.46 (Ecuación 12) (Ecuación 13) b= 8.12 - 10" + 6.48 - 10" + 76.9 Tabla 3: Sustancias utilizadas para determinar la tensión de las partículas (las concentraciones se basan en el volumen de llenado del recipiente) Ingrediente Concentración Fabricante Arcilla azul 5 g/1 Braun Tonbergbau Co . , Wittschlicker Alemania Praestol 650 BC 5 ml/1 Stockhaus GmbH & Co.^ KG, (solución 2 g/1) Krefeld, Alemania NaCl i g/i Merck KGaA, Darmstadt, Alemania CaCl2 (solución Cari Roth GmbH & Co. KG, 30 g/1) Karlsruhe, Alemania En primer lugar el recipiente modelo de 100 litros se llenó con un volumen correspondiente (relación H/D) de agua completamente desmineralizada (agua VE) y se mantuvo a una temperatura de 20 °C. Enseguida se ajustó la conductividad a un valor de 1000 pS/cm por titulación con una solución de CaCl2. La conductividad se midió por medio de una sonda de conductividad de 4 polos (sonda: TetraCon, WT Co., Weilheim; amplificador de medición: Cond813, Knick "Elektronische Messger te GmbH & Co, KG" Company, Berlín, Alemania) . Posteriormente se añadieron a la solución la arcilla azul y el NaCl en cantidades apropiadas. Enseguida tuvo lugar una fase de homogeneización a la velocidad más elevada con una duración de por lo menos 20 minutos. La sonda FBR ® (FBRM® Lasentec® D600L, Mettler-Toledo GmbH Co . , Giessen, Alemania) se montó en el recipiente perpendicular desde arriba (profundidad de inmersión 300 mm) a una distancia radial de 70 mm de la pared. Después se inició la reacción de floculación añadiendo Praestol 650 BS a una velocidad definida. Los valores medidos se registraron en línea por medio de la interfaz de control de adquisición de datos de programa versión 6.7.0 (Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Alemania) . El diámetro de hojuela de referencia se determinó de los datos de medición. Se midieron por lo menos tres potencias de entrada para cada agitador. En cada caso se llevaron a cabo tres mediciones por potencia de entrada.

Ejemplo 5 Diálisis (transferencia de masa líquido-líquido) Se utilizó una solución de NaCl (NaCl cristalino, Merck GaA Company, Darmstadt, Alemania) como una sustancia trazadora para determinar la vida media de la concentración del módulo (DIADYN-DP 070 Fl OL; MICROD YN-N ADIR GmbH Company, Wiesbaden, Alemania) en relación con el sistema de agitadores que se utilizó y el volumen-potencia de entrada específica. La sustancia trazadora se ajustó en el recipiente de almacenamiento al principio de cada prueba experimental a una conductividad de referencia de 1500 pS/cm. El reactor se llenó con agua completamente desmineralizada para cada prueba experimental. El volumen de llenado del reactor fue de 100 litros (H/D = 1.6) y el del recipiente de almacenamiento fue de 400 litros (H/D = 2.0) y ambos recipientes se mantuvieron a una temperatura de 20 °C al principio de cada experimento. La conductividad en ambos recipientes se midió por medio de una sonda de conductividad de 4 polos (sonda: TetraCon, WTW Co., Weilheim; amplificador de medición: Cond813, Knick "Elektronische Messgeráte GmbH & Co, KG" Company, Berlín, Alemania) . La tasa de muestreo de los amplificadores de medición que se utilizó fue de 5 segundos y los valores de medición se almacenaron en línea y simultáneamente para todas las sondas por medio del software Paraly SW 109 (Knick "Elektronische Messgeráte GmbH & Co, KG" Company, Berlín, Alemania) . La solución de NaCl se circuló por medió de una bomba peristáltica entre el recipiente de suministro y el módulo de diálisis (bomba de alojamiento 520 U, Watson-Marlow GmbH, Company, Rommerskirehén, Alemania) a una velocidad de flujo constante de 2.1 1/min. Para la evaluación, se utilizó la sonda 1 como una sonda de referencia para el reactor y la sonda 3 como sonda de referencia para el recipiente de almacenamiento. Los datos de estas dos sondas se evaluaron por una rutina de evaluación. En cada caso se investigaron por lo menos seis potencias de entrada diferentes en el reactor por cada agitador.

Con el fin de comparar las características de transferencia de masa determinadas por medio de la solución de NaCl, las mediciones adicionales se llevaron a cabo con una solución de glucosa como sustancia trazadora. Para esto no cambió la configuración experimental. Se proporcionó una concentración de glucosa definida glucosa sólida, Merck KGaA Company, Darmstadt, Alemania) a una concentración de 3 g/1 en el recipiente de almacenamiento. Se determinó manualmente la concentración de glucosa y simultáneamente para el recipiente de almacenamiento y el reactor a un intervalo de tiempo de 10 minutos por medio de un instrumento de medición de azúcar en la sangre (ACCU-CHEK® Aviva, Roche Diagnostics GmbH Company, Mannheim, Alemania) .

Ejemplo 6 Anticuerpo anti-IGF-lR Se produjo y cultivó la línea de células que secreta anticuerpos anti-IGF-lR de acuerdo con los datos publicados en las Solicitudes de Patente Internacional WO 2004/087756, WO 2007/045465 y WO 2007/115814 y por medio de métodos generalmente conocidos.

Ejemplo 7 Anticuerpo anti-CD20 Se produjo y cultivó la línea de células que secreta anticuerpos anti-CD20 de acuerdo con los datos publicados en la Solicitud de Patente Internacional WO 2005/004485? y por medio de métodos generalmente conocidos.

Ejemplo 8 Anticuerpo anti-HER2 Se produjo y cultivó la línea de células que secreta anticuerpos anti-HER2 de acuerdo con los datos publicados en las Solicitudes de Patente Internacional WO 92/022653 y WO 99/057134 y por medio de métodos generalmente conocidos.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un sistema de agitadores que consiste de dos elementos de agitador de transporte radial y un elemento de agitador de transporte axial dispuestos uno por arriba del otro sobre un eje de agitador vertical, caracterizado porque el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por arriba de los elementos de agitador de transporte radial .

2. El sistema de agitadores de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de agitadores tiene, cuando se utiliza en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, un número de Newton de 5.5 a 8.0 a un número de Reynolds de 5 x 104 a 5 x 105.

3. El sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema de agitadores, cuando se utiliza en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, tiene un tiempo de mezclado de aproximadamente 20 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.05 /kg y de aproximadamente 10 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.3 W/kg.

. El sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema de agitadores consiste de dos agitadores de disco o dos turbinas Rushton como elementos de agitador de transporte radial y un agitador de paletas inclinadas como elemento de agitador de transporte axial .

5. El sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los elementos de agitador de transporte radial tienen entre 2 y 8 paletas de agitador y el elemento de agitador de transporte axial tiene entre 2 y 10 paletas de agitador.

6. El sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todos los elementos de transporte tienen el mismo diámetro.

7. El sistema de agitadores de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la relación del diámetro de los elementos de agitador al diámetro del recipiente de cultivo está en el intervalo de 0.32 a 0.35.

8. El sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso de las paletas de agitador del elemento de agitador de transporte axial está entre 10° y 80° en relación con el eje de agitador.

9. Un dispositivo caracterizado porque comprende un sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un recipiente de cultivo.

10. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sistema de agitadores cuando se utiliza en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, tiene un número de Newton de 5.5 a 8.0 a un número de Reynolds de 5 x 104 a 5 x 105.

11. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque el sistema de agitadores, cuando se utiliza en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, tiene un tiempo de mezclado de aproximadamente 20 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.05 W/kg y de aproximadamente 10 segundos a una potencia de entrada de aproximadamente 0.3 W/kg.

12. Un método para cultivar células animales, caracterizado porque las células animales se cultivan en un dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Un método para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivar una célula que comprende un ácido nucleico que codifica para el polipéptido en un dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, b) recuperar el polipéptido del medio de cultivo o de las células, c) purificar el polipéptido y de esta manera producir el polipéptido .

14. El uso de un sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para mezclar un medio de cultivo de células animales.

15. Un dispositivo para cultivar células animales, caracterizado porque comprende: a) un recipiente de cultivo, b) un eje vertical a lo largo del eje intermedio del recipiente de cultivo, c) un sistema de agitadores de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, d) una alimentación de gas en el fondo del recipiente de cultivo, y e) por lo menos una entrada en el área por arriba de la superficie del líquido para añadir soluciones de corrección y/o de alimentación.