JP2021503916A - 哺乳動物細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は哺乳動物細胞培養に関する。特に、本発明は、治療用産生物などの産生物を産生させるための哺乳動物細胞培養方法に関する。
1.解糖/TCAサイクル効率とタンパク質産生を改善するために、制限された量のグルコースを使用するか、細胞培養プロセス中にグルコースを低レベルに維持する(Xie及びWang,1993;Altamirano等,2001;Zhang等,2004;Maranga及びGoochee,2006)。しかし、Yeo等(2006)は、低いグルコースレベルはグルコース枯渇、アポトーシス、及び早期の細胞死を容易に引き起こしうると報告している。
2.乳酸の過剰な蓄積を減らすために、フルクトース、ガラクトース、及び/又は他のグルコース類似体などの代替糖を使用する(Altamirano等,2000;Altamirano等,2004;Altamirano等,2006;Walschin及びHu,2007)。しかし、この戦略はまた細胞増殖率の低下又は細胞生産性の低下につながる可能性がある。
3.解糖活性を調節するための代謝工学的アプローチ。Paredes等(1999)は、細胞によって産生されるアンモニアと乳酸の量を減らすためのハイブリドーマ細胞株の遺伝子組換えを記載している。しかし、このアプローチの主な欠点は、形質転換細胞が安定していないことである。
4.相同組換え又はsiRNA技術を介した、又はオキサミン酸などのLDH競合阻害剤の使用による、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)発現のノックダウンによる細胞性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の調節。(Chen等,2001;Kim及びLee,2007a;Zhou等,2011)。
5.TCAサイクルへの流入を改善するための、ピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)活性化因子の使用(Irani等,1999;Fogolin等,2004;Kim及びLee,2007b)。これらのアプローチは多くの場合時間がかかり、CHO細胞培養において不安定な細胞株をもたらす可能性がある。
6.乳酸の蓄積を減らすための2価の遷移金属塩(例えば、銅、亜鉛)の添加。銅は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において使用して、正味の乳酸産生から正味の乳酸消費にシフトさせ、より高い細胞増殖と生産性を達成できる(Yuk等,2014)。米国特許出願公開第20140051124号は、二価の遷移金属塩を使用して細胞培養における乳酸産生を減少させるそのような方法を記載している。
7.外因性乳酸の使用:米国特許第8470552号は、十分な濃度の外因性乳酸の存在下で動物細胞を培養して、乳酸産生を低下させる方法を記載している。
8.温度やpHなどの培養条件の制御。培養pHは、哺乳動物細胞の増殖と標的タンパク質の産生に顕著な影響を持つことが知られている重要な生理学的パラメーターの一つである(Borys等,1993;Yoon等,2005)。Oguchi等(2006)は、細胞寿命に対する低下したpH条件の影響について記載しており、pHがmRNAの安定性に影響を及ぼさないことを報告している。より低いpHと低い温度の組み合わせが細胞寿命を誘導し、mRNA安定性を向上させるために必要である。Trummer等(2006)は低下した温度での細胞代謝の制御可能な減速を報告しており、pH値の低下により、分泌産生物の品質に影響を及ぼすことなく、CHOバッチ細胞培養における容量生産性を顕著に改善できることを報告している。
第一の態様では、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階と、第一pHより高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含む方法を提供する。
第一pHは、第一下限と第一上限を有する範囲でありうる。第二pHは、第二下限と第二上限を有する範囲であり得、第二下限は第一上限以上であり、又は第二下限は第一上限よりも高い。
本発明の方法はpHシフトアップを含む。本方法は、第一pHでの第一培養段階と第二pHでの第二培養段階とを含み、第二pHは第一pHよりも高い。第一培養段階は、哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種することを含みうる。pHシフトアップ段階は、第一培養段階と第二培養段階の間にある。pHシフトアップとは、第一pHから第二pHへのpHの上昇である。これは、連続的な上昇である場合もあれば、又は不連続ステップもしくは増分を含む場合もある、徐々の上昇でありうる。本方法は、pHシフトダウンを含まない方法でありうる。
本方法は、哺乳動物細胞を培養培地中に播種することを含みうる。第一pHで実施される本方法の第一培養段階は、第一pHで培養培地中に細胞を播種することを含みうる。細胞を培養培地中に播種するとは、細胞の集団でありうる一又は複数の細胞を、無菌培養培地中に添加することを意味する。播種はまたシーディングとも呼ばれる。哺乳動物細胞はCHO細胞でありうる。
本方法は、工業規模の細胞培養、及び治療用産生物を産生する細胞の培養に特に適している。本方法は、第一pHで実施される第一培養段階と、第一pHより高い第二pHで実施される第二培養段階とを含む。
ここに開示されるのは、バヌシズマブなどの抗体を発現するCHO細胞を培養するための流加法であり、該方法は、哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階と、第一pHよりも高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含み、第一pHは約7.0であり、第二pHは第一pHよりも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、又は0.1〜0.5単位高い。
第一pHは、約pH6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、又は7.5の値を有しうる。第二pHは、約pH6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、又は7.6の値を有しうる。第一pHは、約pH6.5〜7.5の値を有しうる。第二pHは、約pH6.6〜7.6の値を有し得、第二pHは第一pHよりも高い。
第一pHは、約pH6.50、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.10、7.20、7.30、7.40、又は7.50の値を有しうる。第二pHは、約pH6.60、6.70、6.80、6.90、7.00、7.10、7.20、7.30、7.40、7.50、又は7.60の値を有しうる。第一pHは、約pH6.5〜7.5の値を有しうる。第二pHは、約pH6.6〜7.6の値を有し得、ここで、第二pHは第一pHよりも高い。
pH設定点が徐々に上昇される場合、これは、ある期間にわたる第一pHから第二pHへの設定点の連続的な上昇を含みうる。あるいは、これは、ある期間にわたる第一pHから第二pHへの設定点の段階的な上昇を含みうる。この期間は、24〜72時間、36〜60時間、又は約48時間でありうる。この期間は、少なくとも6、12、24、36、又は48時間でありうる。
例えば、pH設定点の徐々の段階的上昇は、
a)第一pHから中間pH設定点までpH設定点を漸進的に上昇させ、この中間pH設定点で所定期間、培養物を維持する;
b)pH設定点をより高い中間pH設定点まで漸進的に上昇させ、所定期間、培養物をこのより高い中間pH設定点に維持する;及び;
c)pH設定点が第二pHに達するまで、工程b)を繰り返す
ことにより、実施されうる。
例えば、本方法は、pH7.00での第一培養段階とpH7.20での第二培養段階を含み得;第一培養段階及び第二培養段階におけるpH設定点は、±0.05の不感帯を有し得;pHシフトアップは、第一pHに設定されている設定点についての不感帯を、それが第二pHを包含するように単一ステップで±0.05〜±0.25拡大させ(pH7.00±0.05〜pH7.00±0.25)、ついでpH設定点を第二pHに上昇させることを含みうる。不感帯は、pH設定点が第二pHに上昇されると同時に、第二pHに設定されたpH設定点について±0.05に復元されうる(pH7.20±0.05)。図7Aは、この実施態様に係る方法を示す。
不感帯は単一ステップで拡大され得、拡大された不感帯は約12、18、24、36、48、60又は72時間、又は少なくとも12、18、24、36、48、60又は72時間、維持されうる。拡大された不感帯は、36〜60、40〜56又は44〜52時間、又は約48時間、維持されうる。拡大された不感帯は、pHが第二pHに達するまで維持されうる。
ある状況では、不感帯の漸進的な上昇が好ましい場合がある。例えば、技術的な制限により、連続的な上昇でpH設定点を徐々に上昇させるようにバイオリアクターをプログラムできない場合や、技術的な制限により、不感帯を連続的に拡大するようにバイオリアクターをプログラムできない場合などである。
あるいは、又は加えて、pHシフトアップは、例えばバイオリアクターからCO2をストリッピングすることにより、培養培地から溶存CO2を除去することを含みうる。バイオリアクターからCO2を取り除くと、溶存CO2が培養培地から排出される。培養培地のpHは溶存CO2と重炭酸塩(HCO3 −)のバランスに依存するため、培養培地からの溶存CO2の除去は、培養培地のpHが変化させうる。
pHシフトアップフィード培地の添加及び/又は細胞培養が培養培地のpHを上昇させる代謝物を蓄積することを可能にすることを含む幾つかの実施態様では、本方法は、また、培養培地へのアルカリ試薬(塩基)、例えばNaOH、Na2CO3、NaHCO3の濃溶液の添加を含まない。アルカリ試薬(塩基)の濃溶液は、例えば、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、又は1.0Mを超える濃度を有するものである。pHシフトアップが塩基の濃溶液の添加を含まない方法は、有利には培養浸透圧の増加を最小限に抑えうる。
本発明の流加法は、バッチ法ではない。本発明の流加法は、培養培地への糖の添加を含みうる。本発明の流加法は、培養培地へのフィード培地の添加を含みうる。
本発明の流加法では、フィード培地(「フィード1」)が培養培地に添加される。この文脈において、初期培養培地は、流加培養法中にフィード培地が補充される基本培地と呼ばれうる。基本培地は、化学的に既知組成であり、タンパク質や血清を含まず、例えばCD CHO AGT(商標)培地(Thermo Fisher Scientific,フォーミュラ番号A15649)でありうる。基本培地は、供給業者又は製造業者の説明書に従って使用される、カスタム培地を含む、任意の適切な市販培地でありうる。
フィード培地は、1日当たりの初期培養重量の約2.0〜約3.0重量%の範囲で培養培地に添加されうる。
シフトアップフィード培地は、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の範囲の初期培養重量で培養培地に添加されうる。
追加のグルコースフィード溶液が、適切なグルコース濃度、例えば≧3g/lを維持するために培養物に添加されうる。
培養工程の期間とタイミングの文脈において、培養培地への細胞の播種は、工程の0日目を定義する。
温度が実質的に一定の値に維持されている場合、有意な温度シフトはない。有意な温度シフトは、約0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、又は5.0℃以上のシフトとして定義されうる。実質的に一定の値は、目標値の±0.1℃、±0.2℃、±0.3℃、±0.4℃、±0.5℃、±1.0℃、±1.5℃、又は±2.0℃以内でありうる。目標値は35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、又は37.5℃でありうる。
産生物は、Epo−Fcではないタンパク質又は抗体でありうる。
本発明の方法は、乳酸及びアンモニウムなどの望ましくない代謝物の過剰な蓄積を回避しうる。本発明の方法は、中程度のpCO2レベル及び/又はより低い培養浸透圧の維持を改善しうる。
本発明の方法は、細胞生存率が対照方法よりも少なくとも10%、15%又は20%高い方法でありうる。
本発明の方法は、乳酸レベルが対照方法よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、又は50%低い方法でありうる。
本発明の方法は、アンモニウムレベルが対照方法よりも少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%又は80%低い方法でありうる。
本発明の方法は、産生物力価が対照方法よりも少なくとも5%、10%又は15%高い方法でありうる。
本発明の方法は、浸透圧が対照方法より少なくとも5%低い方法でありうる。本発明の方法は、浸透圧が収集工程で500Osm/kg未満である方法でありうる。
本発明の方法は、実施例2〜9と添付図によって示されるように、(実施例1におけるように)本方法全体を通してpHが同じ値に維持される方法と比較して改善される。
本発明の第二及び第三の態様は、本発明の第一の態様に関連して上で検討された本発明の方法の特徴の何れも含みうる。
ここで使用されているセクションの見出しは、整理を目的としたものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明の様々な更なる態様及び実施態様は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
「約」所定の数値であるpH値は、それが表される精度の程度に従って解釈されうる。例えば、「約7.0」のpHは、pH6.95〜7.05を意味し得、「約10」のpHは、pH9.5〜10.5を意味しうる。
pHスケールで相対的に高いpH値は相対的にアルカリ性で、相対的に低いpH値は相対的に酸性である。従って、本開示の文脈におけるより高いpHは、よりアルカリ性のpHを指す。
次に、本発明の所定の態様及び実施態様を、実施例によって、上記の図を参照して例証する。実施例は、この発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例は例示の目的で含められており、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。更なる態様及び実施態様は、当業者には明らかであろう。この明細書において言及されている全ての文書は、出典明示によりここに援用される。
次の実施例の全てにおいて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に由来する細胞株であるCHO K1SVを宿主細胞株として使用した(GS遺伝子発現系,Lonza Brochures,Lonza Biologics plc,Slough UK)。GS発現ベクター系はLonza Biologicsから提供された。実施例1〜9及び11において、一方の腕でVEGF−Aを、他方でAng2を認識する(Schaefer等,2011;Fenn等,2013)二重特異性モノクローナル抗体である抗Ang2/VEGF−CrossMab(抗A2V;バヌシズマブ、又はRG7221;国際公開第2011/117329号に記載)を発現するように、CHO K1SV細胞を操作した。実施例10において、CSF−1受容体(CSF−1R)活性化を阻害する(Ries等,2014)ヒト化モノクローナル抗体(抗CSF−1R;エマクツズマブ、又はRG7155;国際公開第2011/070024号に記載)を発現するように、CHO K1SV細胞を操作した。コロニー刺激因子1(CSF−1)とその受容体であるCSF−1Rは、マクロファージとその前駆体の移動、分化、生存を調節する(Hume及びMacDonald,2012)。
オフライン分析のために、約10mlのサンプルをシリンジで毎日採取した。典型的には、製造期間は約14日続いた。
細胞濃度と生存率は、CEDEX機器(Roche Diagnostics GmbH,Germany)を使用してトリパンブルー排除法によって測定した。オフライン測定は、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、アンモニウム、及び産生物濃度について、COBAS INTEGRA(登録商標)400プラス(Roche Diagnostics GmbH,Germany)で実施した。
溶存二酸化炭素及び酸素は、Cobas b221アナライザー(Roche Diagnostics Ltd.CH−6343 Rotkreuz, Switzerland)で分析した。浸透圧は、Osmomat Auto Osmometer(Gonotec GmbH,Berlin,Germany)での凝固点降下によって測定した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00の一定pH設定点で、開始した。つまり、上で検討したように、培養培地(CD CHO培地AGT(商標)培地)に約6.0×105細胞/mLを播種して工程を開始した(0日目)。
図1は、培養方法のpH設定点と不感帯設定、及びフィードスケジュールを示している。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目の間に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗Ang2/VEGF細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
抗CSF−1R細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃、±0.05pH単位の不感帯の7.00のpH設定点で、開始した。0.25Lのバイオリアクターを、0.2Lの初期培養容量で、用いた。フィード培地を溶液で調製し、1〜3日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、4〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、4〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
産生方法#1では、オンラインpH設定点を、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は1Mの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は7.00±0.05に維持した。約144時間から開始して、pH設定点を約48時間以内に7.00から7.20に徐々に上昇するように設定した。約192時間で、pH設定点はpH7.20±0.05に達し、該産生方法の終了までこの値に維持された。
図10B−Fは、図10Aの方法#1(黒い矩形)に係るpH設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、及び浸透圧に対する効果を、図10Aの方法#2(灰色の菱形)に係るpH設定を有する培養方法と比較して、示している。
抗Ang2/VEGF発現CHO KSV細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約6.0×105細胞/mLの初期細胞数で、36.5℃の初期温度、±0.05pH単位の不感帯を持つ7.00のpH設定点で、開始した。
フィード培地を溶液で調製し、3〜6日目に、1日当たり約2.0〜約3.0重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。
pHシフトアップフィード培地を溶液で調製し、7〜14日目に、1日当たり約0.5〜約1.5重量%の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、7〜14日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧3g/lに維持した。
産生方法Bでは、オンラインpH設定点を、工程の全持続期間にわたって、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は1Mの炭酸ナトリウムの添加により、7.00±0.05に一定に維持した。温度は最初は36.5℃に維持した。約144時間で、温度を34.0℃に低下させ、産生方法の終わりまでこの値に維持した。
生細胞密度(VCD)は、Cedex HiResアナライザー(資料番号:05650216001,Roche Diagnostics GmbH,Germany)を使用するトリパンブルー色素排除法で測定した。生細胞密度の積分値(IVCD)は、次の方程式を使用して計算した:
ここで、t=培養期間、VCD=生細胞密度。
主要な培養産生工程の最後に、遠心分離により細胞培養液を収集した。上清をプロテインAを用いた更なる小規模精製に供した。
本発明と本発明が関係する最新技術をより完全に説明し開示するために、多くの刊行物を上で引用している。これら参考文献の完全な引用文献を以下に示す。これら参考文献のそれぞれの全体がここに援用される。
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1. 哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階と;
第一pHより高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階と
を含む、方法。
2. pH設定点を使用してpHを制御することを含む、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階であって、pH設定点が第一pHに維持される第一培養段階と;
第一pHより高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階であって、設定点が第二pHに維持される第二培養段階と
を含み、第二pHが第一pHよりも少なくとも0.1pH単位高く、第二培養段階が少なくとも6時間の持続期間を有する、方法。
3. 第二培養段階が少なくとも3日の持続期間を有する、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
4. 方法の温度が±0.5℃以内に維持される、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
5. 場合によっては第一pHが6.5〜7.5の範囲の値であり、かつ
a.第二pHが第一pHよりも少なくとも0.1pH単位高いか;
b.第二pHが第一pHよりも約0.1〜0.5pH単位高いか;又は
c.第二pHが第一pHよりも約0.2pH単位高い、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
6. a.第一pHが約7.0であり;かつ
b.第二pHが、約(i)pH7.1;(ii)pH7.2;(iii)pH7.3;(iv)pH7.4(v)pH7.5、又は(vi)7.1〜7.5であり、
あるいは、
a.第一pHが約7.0±0.05であり;かつ
b.第二pHが、(i)pH7.1±0.05;(ii)pH7.2±0.05;(iii)pH7.3±0.05;(iv)pH7.4±0.05(v)pH7.5±0.05、又は(vi)7.1〜7.5±0.05である、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
7. pH設定点を使用してpHを制御することを含み、
第一培養段階において設定点が第一pHに設定され、かつ
第二培養段階において設定点が第二pHに設定される、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
8. 設定点を、(a)徐々に又は(b)即時に、第一pHから第二pHに上昇させる、ステートメント7に記載の方法。
9. 設定点を第一pHから第二pHに徐々に上昇させ、(a)設定点を連続的に上昇させるか、又は(b)設定点を一連の不連続ステップで上昇させる、ステートメント8に記載の方法。
10. pHを、約24〜72時間の期間にわたって第一pHから第二pHに徐々に上昇させる、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
11. 培養培地にpHシフトアップフィード培地を添加することを含む、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
12. 設定点が±0.05pH単位の不感帯を有する、ステートメント7から11の何れか一に記載の方法。
13. 哺乳動物細胞がCHO細胞である、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
14. 産生物が哺乳動物細胞によって発現され、場合によっては哺乳動物細胞が組換え細胞であり、産生物が組換えタンパク質である、産生物を産生するための方法である、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
15. 産生物が(a)抗体;(b)バヌシズマブ;又は(c)エマクツズマブである、ステートメント14に記載の方法。
16. 産生物を単離する工程と、場合によっては産生物を含む組成物を調製する工程とを含む、ステートメント14から15の何れか一に記載の方法。
17. ステートメント16の方法により産生された産生物又は組成物。
18. 哺乳動物細胞の培養培地中への播種が0日目であり、10〜18日目の何れか一が、細胞及び/又は産生物を収集することにより方法を終結させることを含む収集工程を含む、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
19. 細胞及び/又は産生物を収集することにより方法が終結される、収集工程を含み、収集工程では、
a.細胞生存率が、対照方法よりも少なくとも20%高く;
b.乳酸レベルが、対照方法よりも少なくとも20%低く;
c.アンモニウムレベルが、対照方法よりも少なくとも40%低く;及び/又は
d.産生物力価が、対照方法よりも少なくとも5%高く;
対照方法は、第二培養段階が細胞を第一pHで培養することを含むことを除いて、ステートメントに開示された方法と同じである、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
20. 哺乳動物細胞を培養するための方法において、
細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階と;
第二pHで細胞を培養することを含み、第二pHが第一pHより高い第二培養段階と
を含み、方法の温度が実質的に一定の値に維持される、方法。
21. 抗体を発現することができる哺乳動物細胞を培養するための方法において、
哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階と;
第一pHより高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階と
を含む、方法。
22. 前記ステートメントの何れか一に記載の哺乳動物細胞を培養するための方法において、
a.産生物が哺乳動物細胞において発現される哺乳動物細胞培養物中において産生物力価を増加させるため;
b.哺乳動物細胞培養物中において細胞生存率を増加させるため;
c.哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばすため;
d.哺乳動物細胞培養物中の乳酸蓄積を減少させるため;
e.哺乳動物細胞培養物中のアンモニウム蓄積を減少させるため;
f.哺乳動物細胞培養においてpCO2プロファイルを改善するため;
g.哺乳動物細胞培養において浸透圧を低下させるための;
pHシフトアップフィード培地又はpH上昇剤の使用であって、pHシフトアップフィード培地又はpH上昇剤を哺乳動物細胞培養物に添加して、pHを第一pHから第二pHに上昇させる、使用。
Claims (16)
- pH設定点を使用してpHを制御することを含む、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一pHで培養培地中に播種し、細胞を第一pHで培養することを含む第一培養段階であって、pH設定点が第一pHに維持される第一培養段階と;
第一pHより高い第二pHで細胞を培養することを含む第二培養段階であって、設定点が第二pHに維持される第二培養段階と
を含み、第二pHが第一pHよりも少なくとも0.1pH単位高く、第二培養段階が少なくとも6時間の持続期間を有する、方法。 - 第二培養段階が少なくとも3日の持続期間を有する、請求項1に記載の方法。
- 方法の温度が±0.5℃以内に維持される、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 第一pHが6.5〜7.5の範囲の値であり、かつ、
a.第二pHが第一pHよりも0.1〜0.5pH単位高いか;又は
b.第二pHが第一pHよりも0.2pH単位高い、
請求項1から3の何れか一項に記載の方法。 - a.第一pHが約7.0であり;かつ
b.第二pHが、約(i)pH7.1;(ii)pH7.2;(iii)pH7.3;(iv)pH7.4(v)pH7.5、又は(vi)7.1〜7.5である、
請求項1から4の何れか一項に記載の方法。 - 設定点を、(a)徐々に又は(b)即時に、第一pHから第二pHに上昇させる、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 設定点を第一pHから第二pHに徐々に上昇させ、(a)設定点を連続的に上昇させるか、又は(b)設定点を一連の不連続ステップで上昇させる、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- pHを、約24〜72時間の期間にわたって第一pHから第二pHに徐々に上昇させる、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 培養培地にpHシフトアップフィード培地を添加することを含む、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- 設定点が±0.05pH単位の不感帯を有する、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 産生物が哺乳動物細胞によって発現され、場合によっては哺乳動物細胞が組換え細胞であり、産生物が組換えタンパク質である、産生物を産生するための方法である、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 産生物が(a)抗体;(b)バヌシズマブ;又は(c)エマクツズマブである、請求項12に記載の方法。
- 産生物を単離する工程と、場合によっては産生物を含む組成物を調製する工程とを含む、請求項12から13の何れか一項に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法により産生された産生物又は組成物。
- 請求項1から15の何れか一項に記載の哺乳動物細胞を培養するための方法において、
a.産生物が哺乳動物細胞において発現される哺乳動物細胞培養物中において産生物力価を増加させるため;
b.哺乳動物細胞培養物中において細胞生存率を増加させるため;
c.哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばすため;
d.哺乳動物細胞培養物中の乳酸蓄積を減少させるため;
e.哺乳動物細胞培養物中のアンモニウム蓄積を減少させるため;
f.哺乳動物細胞培養においてpCO2プロファイルを改善するため;
g.哺乳動物細胞培養において浸透圧を低下させるための;
pHシフトアップフィード培地又はpH上昇剤の使用であって、pHシフトアップフィード培地又はpH上昇剤を哺乳動物細胞培養物に添加して、pHを第一pHから第二pHに上昇させる、使用。
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TOMOHARU HORIGI ET AL., JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 125, no. 2, JPN6022041927, 28 September 2017 (2017-09-28), pages 245 - 250, ISSN: 0004893291 * |
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