CN111406112A - 用于培养哺乳动物细胞的工艺 - Google Patents
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Abstract
提供了用于培养哺乳动物细胞和用于生产由哺乳动物细胞表达的重组产物的工艺,其牵涉pH上移。该工艺特别适合于产业规模细胞培养和生成治疗性产品的细胞的培养。该工艺包含于第一pH进行的第一培养阶段和于比第一pH要高的第二pH进行的第二培养阶段。
Description
本申请要求2017年11月30日提交的EP申请17204794.6的优先权,通过援引将其内容和要件收入本文用于所有目的。
发明领域
本发明涉及哺乳动物细胞培养。特别是,本发明涉及用于生产产品,诸如治疗性产品的哺乳动物细胞培养工艺。
发明背景
重组表达的生物治疗剂(包括单克隆抗体,抗原和其它专门化的蛋白质模态)越来越多地用于治疗诸如肿瘤,免疫遏制,自身免疫疾病,和炎性病症等领域中的疾病(Leaderet al.,2008；Aggarwal,2011)。由于许多这些治疗剂或“生物治疗剂”最近已经批准用于以高剂量治疗癌症和自身免疫疾病,因此需要以产业规模生产这些生物治疗剂以满足日益增长的临床需求。
重组哺乳动物细胞(尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在制药和生物技术行业中广泛用于制造重组治疗剂。在改善哺乳动物细胞培养工艺方面已经取得进展以实现更高的体积产物产量及最佳产物质量(Omasa et al.,2010；Kim et al.,2012；Zhu,2012)。然而,治疗剂在哺乳动物细胞中的产业规模生产仍然具有挑战性。
许多重组治疗剂生产工艺使用补料-分批培养,其产生高细胞密度和高最终产物浓度。在典型的补料-分批培养条件下,细胞消耗过量的葡萄糖和氨基酸以生成生物质和产物。这经常导致大量的抑制性代谢物(诸如乳酸盐和铵)生成和在培养培养中积累。培养培养基中高浓度的这些抑制性代谢物的存在不利地影响细胞生长且能导致低细胞浓度和低产物滴度(Zhou et al.,1995；Ozturk et al.,1992；Lao and Toth,1997)。过量水平的乳酸盐和/或铵的积累还可导致更高的培养培养基渗透摩尔浓度,其能变成细胞生长的关键限制因素。高浓度的溶解二氧化碳也能负面影响细胞生长。
积累的乳酸盐可酸化细胞培养物并影响细胞生长,细胞生产力和最终产物质量。即使在受控pH条件下,积累的乳酸盐在足够高的浓度对哺乳动物细胞可能是有毒的且可在细胞培养工艺的中后期期间抑制细胞生长和蛋白质生成。当细胞密度高时特别是这样。
为了改善哺乳动物细胞培养物的总体生产力,细胞生长和代谢活性的有效控制是重要的。已经做出巨大努力以控制细胞糖酵解过程/三羧酸(TCA)循环和降低培养的细胞中的乳酸盐积累。为此,已经采取多种策略,如下:
1.使用有限量的葡萄糖,或在细胞培养过程期间维持葡萄糖于低水平以改善糖酵解/TCA循环效率和蛋白质生成(Xie and Wang,1993；Altamirano et al.,2001；Zhang etal.,2004；Maranga and Goochee,2006)。然而,Yeo等人(2006)报告低葡萄糖水平能容易地导致葡萄糖耗竭,凋亡,和过早细胞死亡。
2.使用备选的糖,诸如果糖,半乳糖,和/或其它葡萄糖类似物,试图降低过量的乳酸盐积累(Altamirano et al.,2000；Altamirano et al.,2004；Altamirano et al.,2006；Walschin and Hu,2007)。然而,这种策略还可导致更低的细胞生长速率或降低的细胞生产力。
3.调节糖酵解活性的代谢工程办法。Paredes等人(1999)描述了杂交瘤细胞系的遗传修饰以降低由细胞生成的氨和乳酸盐的量。然而,这种办法的一个主要缺点是转化细胞不稳定。
4.通过经由同源重组或siRNA技术敲低乳酸脱氢酶(LDH)表达或经由使用LDH竞争性抑制剂诸如草氨酸来调控细胞乳酸脱氢酶活性(Chen et al.,2001；Kim and Lee,2007a；Zhou et al.,2011)。
5.过表达丙酮酸脱羧酶或使用丙酮酸脱氢酶(PDH)活化剂来改善进入TCA循环的通量(Irani et al.,1999；Fogolin et al.,2004；Kim and Lee,2007b)。这些办法常常是费时的且可导致CHO细胞培养物中的不稳定细胞系。
6.添加二价过渡金属盐(例如铜,锌)以降低乳酸盐积累。可以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中使用铜以自净乳酸盐生成转变至净乳酸盐消耗,并实现更高的细胞生长和生产力(Yuk et al.,2014)。US20140051124描述了使用二价过渡金属盐在细胞培养中降低乳酸盐生成的此类方法。
7.使用外源乳酸盐:US8470552描述了一种用于在足够浓度的外源乳酸盐存在下培养动物细胞以降低乳酸盐生成的方法。
8.控制培养条件,诸如温度和pH。培养pH是已知对哺乳动物细胞生长和靶蛋白质生成具有显著影响的关键生理参数之一(Borys et al.,1993；Yoon et al.,2005)。Oguchi等人(2006)描述了降低的pH条件对细胞寿命的影响,还报告了pH对mRNA稳定性没有影响–诱导细胞寿命和改善mRNA稳定性要求更低的pH和更低的温度的组合。Trummer等人(2006)报告了温度降低时细胞代谢的可控减慢且报告了降低的pH值能显著改善CHO分批细胞培养中的体积生产力,不影响分泌产物的质量。
US8765413描述了一种类似的办法,其中组合pH下移和温度下移来减慢细胞代谢,由此在CHO细胞培养中降低乳酸盐形成和改善体积生产力。US8765413报告了CHO细胞一般在更低pH(例如pH 6.8)生成比在更高的值(例如pH 7.0)要少的乳酸盐,而且还提示将培养pH转变成更低的值会降低细胞外氨的浓度。
WO 2008/033517描述了用于生产重组蛋白质(特别是抗TNFα或抗白介素-12抗体)的方法和组合物,包括使用线性pH升降,自约7.1至7.2的pH开始并在24,48,或72小时里降低至约6.9的最终pH。这种方法据报告导致升高的细胞生长和生产力。
在温度和pH对THIOMAB 3LC形成的影响一项调查中,Gomez等人(2010)报告了高温度和高pH条件提高乳酸盐积累,其与低细胞存活力有关。
总之,先前的研究已经显示pH下移与温度下移组合正面影响哺乳动物细胞培养物中的细胞存活力,细胞生产力,和/或最终产物质量。
在乳酸盐以外,还知道高水平的氨的积累负面影响哺乳动物细胞培养物中的细胞生长,产物滴度,和产物的翻译后修饰(Hassell et al.,1991；Ozturk et al.,1992)。
细胞培养培养基中溶解的氨在依赖于pH培养培养基的反应
中转变成铵。在讨论它们作为抑制性代谢物在细胞培养工艺中的作用时,术语“氨”和“铵”一般可互换使用。
积累至超过14mM的氨已经显示对培养物生长是有害的(Hayter et al.,1991；Laoand Toth,1997),而且高铵浓度也已经显示不利地影响重组蛋白的糖基化样式,降低半乳糖基化和唾液酸化二者(Andersen and Goochee,1995；Borys et al.,1994；Gawlitzek etal.,2000)。
Yang和Butler(2000)报告了细胞密度在5mM氨时降低10％,而且糖基化样式在CHO细胞培养物中在10mM氨时改变。
尽管如此,很少有已发表的研究试图解决补料-分批生产工艺中氨积累的问题。
升高的溶解二氧化碳水平也已知影响哺乳动物细胞培养物中的细胞生长和蛋白质生成。对于生物反应器中的补料-分批工艺,pCO2水平能升高至显著高于正常生理值。此类高水平的溶解CO2能降低细胞生长和代谢,降低生产力,和最终引发对糖基化的不利影响(Mostafa and Gu,2003；Kimura and Miller,1997；deZengotita et al.,2002；Schmelzerand Miller,2002；Zhu et al.,2005)。
在补料-分批工艺中,高pCO2浓度正常情况下源自细胞代谢和使用NaHCO3/Na2CO3作为培养培养基中的缓冲剂二者。另外,常常添加别的NaHCO3作为碱以中和由细胞生成的乳酸盐。
一种降低高pCO2水平的办法是使用碳酸氢盐减少的或无碳酸氢盐的缓冲液。Goudar等人(2007)在灌注工艺中使用无碳酸氢盐的缓冲液并实现pCO2水平降低70％,以及随后对细胞生长和比生产力的正面影响。尽管如此,升高的pCO2的负面影响仍然是显著的。
另一种自细胞培养物去除CO2的办法是气体汽提,然而,鉴于CO2的相对较高溶解度和较低亨利定律常数,这一般在生物反应器中具有有限影响。在正常细胞培养操作条件下,需要充足的气体分散和通气以去除高水平的CO2。然而,随着气泡停留时间随规模而延长,用于CO2去除的平均驱动力快速降低。因此,高得多的气体流速是充足的CO2汽提有效所必须的。然而,鉴于对细胞具有有害影响,鼓气速率有上限(Michaels et al.,1995a,b)。
在细胞培养过程期间扩大规模和不同制造设施之间的转移也想要匹配pCO2水平和概况。这里的一个关键问题是如何在不同规模间实现相同或相似的pCO2概况。正常情况下,由于发酵罐流体静力压,混合,和CO2汽提特征的差异,更大的规模显示更高的pCO2水平(Li et al.,2006；Mostafa and Gu,2003)。有可能的是,具有高pCO2水平的工艺在规模放大时会更具挑战性,因为进一步扩大pCO2会将工艺推向破坏性条件。因此,也显然需要改善各规模间pCO2概况的可比性以增加对pCO2的工艺水平的理解及使未来的规模缩小模型受益。
解决哺乳动物细胞生物反应器中的pCO2控制的少数研究主要聚焦于减少CO2添加和去除CO2。需要备选的更加有效的办法。
渗透摩尔浓度是哺乳动物细胞培养期间的另一项重要工艺变量。当升高至高水平时,已经发现渗透摩尔浓度对哺乳动物细胞培养物是有害的(Kim and Lee,2002；deZengotita et al.,2002；Cherlet and Marc,1999)。
由于补料-分批培养期间的生物反应器pH控制于预先限定的设定点,因此高pCO2导致伴随的培养基渗透摩尔浓度升高,这是由于提高作为碱添加以控制pH的HCO3浓度的结果(Zanghi et al.,1999；Schmelzer et al.,2000)。当渗透摩尔浓度和pCO2均高时,细胞死亡率显著升高(deZengotita et al.,1998),而且可导致总体生产力显著降低。
鉴于上述,继续需要有效的细胞培养工艺来克服这些缺陷。本发明试图解决这种需要。
发明概述
本发明涉及用于培养细胞,特别哺乳动物细胞的工艺。特别是,本发明涉及一种用于培养哺乳动物细胞的工艺,其中该工艺包含pH上移。
在第一个方面,本发明提供一种用于培养哺乳动物细胞的补料-分批工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
本文中公开的工艺有利地避免不想要的代谢物的积累。此类不想要的代谢物包括乳酸盐,铵和CO2。本发明的工艺可导致更高的细胞存活力,更高的细胞浓度和/或更高的产物滴度。
该工艺包含于第一pH的第一培养阶段和于第二pH的第二培养阶段,其中第二pH比第一pH要高。第二pH可以比第一pH要高至少0.10个pH单位。第二pH可以比第一pH要高约0.1至0.5,0.1至0.4,或0.1至0.3个pH单位。第二pH可以比第一pH要高约0.2个pH单位。第一pH可以是约7.0。第一pH可以是约7.0且第二pH可以是约7.2。
第一pH可以是具有第一下限和第一上限的范围。第二pH可以是具有第二下限和第二上限的范围,其中第二下限等于或高于第一上限,或其中第二下限高于第一上限。
该工艺可包含使用设定点控制pH。在此语境中,设定点可变化。如此,该工艺可包含使用pH设定点控制pH。该工艺可进一步包含使用死区控制pH,死区可以是相对于pH设定点±0.05个pH单位。
本发明的工艺包含pH上移。该工艺包含于第一pH的第一培养阶段和于第二pH的第二培养阶段,其中第二pH比第一pH要高。第一培养阶段可包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基。pH上移阶段在第一培养阶段和第二培养阶段之间。pH上移是pH自第一pH升高至第二pH。这可以是逐渐升高,其可以是连续升高,或者其可包含离散步骤或增量。该工艺可以是不包含pH下移的工艺。
该工艺可以是补料-分批工艺。补料-分批工艺是其中在培养过程期间将一种或多种营养物添加至培养容器。细胞贯穿细胞培养工艺维持在培养容器中。在该工艺结束时收获细胞和/或细胞的产物。
该工艺可包含将哺乳动物细胞接种入培养培养基。该工艺于第一pH进行的第一培养阶段可包含将细胞接种入于第一pH的培养培养基。将细胞接种入培养培养基指将一个或多个细胞(其可以是一群细胞)添加入无菌培养培养基。接种也可以称作播种。哺乳动物细胞可以是CHO细胞。
该工艺的温度可维持于实质性恒定的值。其中温度维持于实质性恒定的值的工艺不包含显著的第一培养阶段和第二培养阶段之间的温度移变。实质性恒定的温度值可以在±0.5℃内。实质性恒定的温度值可以是约37℃。实质性恒定的温度值可以是约36.5℃。实质性恒定的温度值可以是36.0-37.0℃。
本发明的工艺可包含培养能够表达抗体的哺乳动物细胞。细胞可以是重组细胞。抗体可以是重组抗体。细胞可包含在启动子控制下编码抗体的核酸,启动子可以是诱导型启动子。
在第二个方面,本发明提供一种用于培养哺乳动物细胞的工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于第二pH培养细胞,其中第二pH比第一pH要高且其中该工艺的温度维持于实质性恒定的值。
在第三个方面,本发明提供一种用于培养能够表达抗体的哺乳动物细胞的工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
附图简述
图1显示一种用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的概览,其中pH在14天运行时间的持续时间维持于7.00±0.05。
在图2A-G,3A-G,4A-G,5A-G,6A-G,7A-G,8A-G,9A-G,10A-F(图2至10,B至G系列)每一幅中,灰色菱形指示该工艺维持于7.00±0.05,而黑色方形指示该工艺牵涉pH上移,如下文更为详细汇总的。图2B,3B,4B,5B,6B,7B,8B,9B,10B(B系列)每一幅显示平均细胞存活力(以％计)；图2C,3C,4C,5C,6C,7C,8C,9C,10C(C系列)每一幅显示乳酸盐浓度(以％计)；图2D,3D,4D,5D,6D,7D,8D,9D,10D(D系列)每一幅显示铵浓度(以％计)；图2E,3E,4E,5E,6E,7E,8E,9E,10E(E系列)每一幅显示产物滴度(以％计)；图2F,3F,4F,5F,6F,7F,8F,9F(F系列)每一幅显示pCO2浓度(以％计)；而图2G,3G,4G,5G,6G,7G,8G,9G,10F(G系列)每一幅显示渗透摩尔浓度(mOsm/kg)。图2B-G,3B-G,4B-G,5B-G,6B-G,7B-G,8B-G,9B-G(图2至9,B至G系列每一个)每一幅描绘相同条件下的两个2L生物反应器的平均值。
图2A-2G显示pH上移(Δ0.20pH升降(ramp))对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图2A显示该工艺的概览；该工艺始于7.00±0.05的pH设定点,其在144小时至192小时的时段里以线性升降升高至7.20±0.05。此后,pH设定点在14天运行时间的剩余时间维持于7.20±0.05。
图3A-G显示pH上移(Δ0.20pH升降)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图3A显示该工艺的概览；该工艺始于7.00±0.05的pH设定点,其在156小时至208小时的时段里以线性升降升高至7.20±0.05。此后,pH在14天运行时间的剩余时间维持于7.20±0.05。
图4A-G显示pH上移(Δ0.30pH升降)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图4A显示该工艺的概览；该工艺始于维持于7.00±0.05的设定点的pH,其在192小时至240小时的时段里以线性升降升高至7.30±0.05。此后,pH在14天运行时间的剩余时间维持于7.30±0.05。
图5A-G显示pH上移(Δ0.10pH升降)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图5A显示该工艺的概览；该工艺始于7.00±0.05的pH设定点,其在192小时至240小时的时段里以线性升降升高至7.10±0.05。此后,pH在14天运行时间的剩余时间维持于7.10±0.05。
图6A-G显示即刻pH上移(Δ0.20)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图6A显示该工艺的概览；该工艺始于7.00±0.05的pH设定点。在144小时,pH设定点即刻(以单个步骤)升高至7.20±0.05并在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。
图7A-G显示pH上移(Δ0.20死区加宽)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图7A显示该工艺的概览。该工艺始于7.00±0.05的pH设定点。在144小时,pH死区自0.05加宽至0.25。在192小时,pH设定点升高至pH7.20且pH死区恢复至0.05。pH设定点在14天运行时间的剩余时间维持于7.20±0.05。
图8A-G显示pH上移(Δ0.20,以0.05的增量式设定点升高,自7.00至7.20)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图8A显示该工艺的概览。该工艺始于7.00±0.05的pH设定点。在156小时,pH设定点升高至pH7.05±0.05并维持12小时。在168小时,pH设定点升高至pH 7.10±0.05并维持12小时。在180小时,pH设定点升高至pH 7.15±0.05并维持12小时。最后,在192小时,pH设定点升高至pH 7.20±0.05,并在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。
图9A-G显示pH上移(Δ0.20,以0.05的增量式死区加宽,自0.05至0.25)对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图9A显示该工艺的概览。该工艺始于7.00±0.05的pH设定点。在152小时,pH死区加宽至±0.10并维持12小时。在164小时,pH死区加宽至±0.15并维持12小时。在176小时,pH死区加宽至±0.20并维持12小时。在188小时,pH死区加宽至±0.25并维持12小时。最后,在200小时,pH设定点升高至pH 7.20及±0.05的死区,并在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。
图10A-F显示不同pH设定点和死区设置对用于生成抗CSF-1R抗体的工艺的影响。图10A显示两种工艺的概览。工艺#1始于7.00±0.05的pH设定点,其在144小时至192小时的时段里以线性升降升高至7.20±0.05,且随后在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。工艺#2始于7.00±0.05的pH设定点,其在48小时即刻降低至6.80±0.05并维持192小时。始于240小时,pH设定点在240小时至288小时的时段里以线性升降自6.80±0.05升高至7.00±0.05,并随后在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。图10B显示平均细胞存活力(以％计)；图10C显示乳酸盐浓度(以％计)；图10D显示铵浓度(以％计)；图10E显示产物滴度(以％计)；图10F显示渗透摩尔浓度(mOsm/kg)。图10B至10F每一幅描绘一个生物反应器的值。
图11A-11G显示温度下移对用于生成抗Ang2/VEGF双特异性抗体的工艺的影响。图11A显示该工艺的概览。在工艺A中,在整个14天运行时间温度维持于36.5℃且pH设定点维持于7.00±0.05。工艺B始于维持于36.5℃的温度。在6/7天后温度降低至34.0℃并随后在14天运行时间的剩余时间维持于此水平。pH始终维持于7.00±0.05的恒定设定点。图11B是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的平均细胞存活力(以％计)。图11C是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的乳酸盐浓度(以％计)的时间过程概况。图11D是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的铵浓度(以％计)的时间过程概况。图11E是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的产物滴度(以％计)的时间过程概况。图11F是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的pCO2浓度(以％计)的时间过程概况。图11G是一幅线图,显示工艺A(灰色菱形)和工艺B(黑色方形)的渗透摩尔浓度的时间过程概况。在图11B至11F中每一幅图是相同条件下的两个2L生物反应器的平均值。
图12显示本文中公开的工艺中生成的蛋白质的相关糖基化结构。
发明详述
本发明提供用于培养哺乳动物细胞的工艺。本发明的工艺牵涉pH上移。特别是,本发明的工艺牵涉持续的pH上移。这降低不想要的代谢物,诸如乳酸盐和铵的积累。本文中公开的工艺可改善适度pCO2水平和/或更低培养物渗透摩尔浓度的维持。因而,该工艺可导致更高的细胞存活力,更高的细胞浓度,更高的细胞生产力,更高的产物滴度,和/或改善的产物质量。
包含pH上移的工艺相对于其中pH贯穿工艺相同(第一和第二培养阶段中相同的pH设定点)的对照工艺可能是改良的。这些改良在附图2A-G至9A-G中图示,其显示细胞存活力(B系列图),乳酸盐水平(C图),铵水平(D图),产物滴度(E图),pCO2概况(F图)和渗透摩尔浓度(G图)的改良。本文中公开的工艺可有利地避免过量的乳酸盐积累,尤其是在工艺的晚期和工艺结束时。该工艺可有利地降低氨生成,和/或降低过量的氨积累,尤其是在工艺的晚期和工艺结束时。
该工艺特别适合于产业规模细胞培养和生成治疗性产物的细胞的培养。用于此类细胞培养的培养容器可称作生物反应器。产业规模工艺可以是其中培养培养基的体积是至少约50L,100L,500L,1000L,或10000L的工艺。产业规模工艺可以是其中培养培养基的体积是至少约20L,30L或40L的工艺。产业规模工艺可以是其中培养培养基的体积是约20-100L,20-500L,20-1000L,50-100L,50-500L,50-1000L,50-5000L,50-10000L,50-20000L,100-1000L,100-5000L,100-10000L,100-20000L,500-5000L,500-10000L,或500-20000L的工艺。
本发明的工艺牵涉pH上移。更加具体地,本发明的工艺包含于第一pH的第一培养阶段和于第二pH的第二培养阶段,其中第二pH比第一pH要高。第一培养阶段可包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基。第一培养阶段可开始于工艺的第0天。第一培养阶段是初始培养阶段。第一培养阶段可以是其中发生细胞播种和延滞期生长的阶段。第一培养阶段可直接继以pH上移,其直接继以第二培养阶段。第二培养阶段可包含收获细胞和/或由细胞生成的产物。该工艺可终止于第二培养阶段的终止。
该工艺特别适合于产业规模细胞培养和生成治疗性产物的细胞的培养。该工艺包含于第一pH进行的第一培养阶段和于比第一pH要高的第二pH进行的第二培养阶段。
本文中公开的是一种用于培养哺乳动物细胞的补料-分批工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
本文中公开的是一种用于培养表达抗体,诸如凡努昔珠单抗的CHO细胞的补料-分批工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞,其中第一pH是约7.0且其中第二pH比第一pH要高约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,或0.1-0.5个单位。
第一pH可以是范围6.5-7.5,6.6-7.4,6.7-7.3,6.8-7.2,或6.9-7.1中的值。第一pH可以是约7.0。第一pH可以是约7.0且第二pH可以是约7.2。
第一pH可具有约pH 6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,或7.5的值。第二pH可具有约pH 6.6,6.7,6.8,6.9,7.0,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,或7.6的值。第一pH可具有约pH 6.5至7.5的值。第二pH可具有约pH 6.6至7.6的值,其中第二pH比第一pH要高。
第一pH可具有pH 6.5±0.05,6.6±0.05,6.7±0.05,6.8±0.05,6.9±0.05,7.0±0.05,7.1±0.05,7.2±0.05,7.3±0.05,7.4±0.05,或7.5±0.05的值。第二pH可具有pH6.6±0.05,6.7±0.05,6.8±0.05,6.9±0.05,7.0±0.05,7.1±0.05,7.2±0.05,7.3±0.05,7.4±0.05,7.5±0.05,或7.6±0.05的值。第一pH可具有pH 6.5±0.05至7.5±0.05的值。第二pH可具有pH 6.6±0.05至7.6±0.05的值,其中第二pH比第一pH要高。第二pH可以比第一pH要高约0.1个pH单位,或至少约0.1个pH单位。比第一pH要高约0.1个pH单位的第二pH可以在本文中称作pHΔ0.1。第二pH可以比第一pH要高约0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,或1.0个pH单位,或至少约0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9或1.0个pH单位。第二pH可以比第一pH要高约0.1-0.5个pH单位,比第一pH要高约0.1-0.4个单位,或比第一pH要高约0.1-0.3个pH单位。第一pH可以是约7.0。第二pH可以是约7.1-7.4,7.1-7.5,7.2-7.4或约7.2-7.5。
第一pH可以是范围6.50-7.50,6.60-7.40,6.70-7.30,6.80-7.20,或6.90-7.10中的值。第一pH可以是约7.00。第一pH可以是约7.00且第二pH可以是约7.20。
第一pH可具有约pH 6.50,6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,或7.50的值。第二pH可具有约pH 6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,7.50,或7.60的值。第一pH可具有约pH 6.5至7.5的值。第二pH可具有约pH 6.6至7.6的值,其中第二pH比第一pH要高。
第二pH可以比第一pH要高约0.10个pH单位,或至少约0.10个pH单位。比第一pH要高约0.10个pH单位的第二pH在本文中可称作pHΔ0.10。第二pH可以比第一pH要高约0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位,或至少约0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位。第二pH可以比第一pH要高约0.10-0.50个pH单位,比第一pH要高约0.10-0.40个单位,或比第一pH要高约0.10-0.30个pH单位。第一pH可以是约7.00。第二pH可以是约7.10-7.40,7.10-7.50,7.20-7.40或约7.20-7.50。
本文中公开的工艺可包含使用pH设定点控制pH。设定点是期望或目标pH值。该工艺可以在生物反应器或可编程以使用pH设定点调节pH的其它受控培养设施中。在此语境中,生物反应器含有至少一个pH探针以监测培养物pH。培养物pH自它的设定点的偏离可触发pH纠正动作(或pH调节动作)以使pH更加接近设定点。pH纠正动作可包含添加降低pH的药剂(诸如CO2,HCl或任何其它合适的酸)或添加提高pH的药剂(诸如NaOH或任何其它合适的碱)。pH纠正动作可包含去除降低pH的药剂(例如去除CO2,称作CO2汽提)。pH纠正动作可包含减弱添加降低或提高pH的药剂,从而分别提高或降低pH,例如减弱添加CO2至维持相对较高pH。
该工艺可包含使用死区控制pH。死区定义其中不触发pH纠正动作的区。只有当pH漂移到由死区定义的区以外时触发pH纠正动作。pH设定点可具有死区。死区可以是±0.05,即,死区可以是相对于pH设定点±0.05个pH单位。
本文中公开的工艺可包含使用pH设定点控制pH,其中在第一培养阶段中设定点设置为第一pH,且在第二培养阶段中设定点设置为第二pH。在第一培养阶段中设定点可维持于第一pH。在第二培养阶段中设定点可维持于第二pH。在第一培养阶段中设定点可维持于第一pH且在第二培养阶段中设定点可维持于第二pH。第一和第二培养阶段中设定点的维持可具有如下文分别关于第一和第二培养阶段的持续时间列出的持续时间。第一培养阶段,或第二培养阶段,或二者的设定点可维持至少2,4,6,8,12,或18小时；或3至10天,4至10天,4至8天或4至6天；或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天。在第一培养阶段中设定点可设置成pH 6.50,6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,或7.50。在第二培养阶段中设定点可设置成pH 6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,7.50,或7.60,其中第二培养阶段的pH设定点比第一培养阶段的pH设定点要高。第二培养阶段的pH设定点可以比第一培养阶段的pH设定点要高约0.10个pH单位,或至少约0.10个pH单位。比第一pH要高约0.10个pH单位的第二pH在本文中可称作pHΔ0.10。第二pH设定点可以比第一pH设定点要高约0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位,或至少约0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位。第二pH设定点可以比第一pH设定点要高约0.10-0.50个pH单位,比第一pH设定点要高约0.10-0.40个单位,或比第一pH设定点要高约0.10-0.30个pH单位。第一pH设定点可以是约7.00。第一pH设定点可以是范围6.50-7.50,6.60-7.40,6.70-7.30,6.80-7.20,或6.90-7.10中的值。pH设定点可具有贯穿该工艺相同的死区,即,死区可具有恒定的值。第一培养阶段中的pH设定点可具有与第二培养阶段中的pH设定点的死区相同的死区。或者,第一培养阶段中的pH设定点和第二培养阶段中的pH设定点可具有彼此不同的死区。
第一培养阶段和/或第二培养阶段中的pH设定点可具有±0.50的死区,±0.25的死区,±0.10的死区,±0.05的死区,±0.01的死区,或±0.005个pH单位的死区。
第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05。第二培养阶段中的pH设定点可以是自7.10±0.05至7.40±0.05。第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05且第二培养阶段中的pH设定点可以是7.10±0.05至7.40±0.05。第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05且第二培养阶段中的pH设定点可以是7.10±0.05。第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05且第二培养阶段中的pH设定点可以是7.20±0.05。第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05且第二培养阶段中的pH设定点可以是7.30±0.05。第一培养阶段中的pH设定点可以是7.00±0.05且第二培养阶段中的pH设定点可以是7.40±0.05。
第一pH可以是具有第一下限和第一上限的范围。第二pH可以是具有第二下限和第二上限的范围。第二下限可以等于或高于(≥)第一pH的第一上限,或高于(>)第一pH的第一上限。在本发明的工艺中,第一培养阶段包含在具有第一下限和第一上限的范围内培养细胞,且第二培养阶段包含在具有第二下限和第二上限的范围内培养细胞。
第二下限可以等于第一pH的第一上限。例如,第一pH可以是具有第一下限6.95和第一上限7.05的范围。例如,第二pH可以是具有第二下限7.05和第二上限7.15的范围。第二下限可以比第一pH的第一上限要大。例如,第一pH可以是具有第一下限6.95和第一上限7.05的范围。例如,第二pH可以是具有比7.05要高的第二下限和比7.15要高的第二上限的范围。
第二下限可以比第一上限要高至少0.10个pH单位。例如,第一pH可以是具有第一下限6.95和第一上限7.05的范围,且第二pH可以是具有第二下限7.15和第二上限7.25的范围。
第二下限可以比第一上限要高至少0.20个pH单位。例如,第一pH可以是具有第一下限6.95和第一上限7.05的范围,且第二pH可以是具有第二下限7.25和第二上限7.35的范围。
第二下限可以比第一上限要高0.10个pH单位,或至少0.10个pH单位。第二下限可以比第一上限要高0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位,或至少0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位。
第一pH和/或第二pH可以是具有1.00,0.50,0.20,0.10,0.02或0.01个pH单位的宽度的范围。第一pH可以是具有pH 6.50,6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,或7.50的中点值的范围。第二pH可以是具有pH 6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,7.50,或7.60的中点值的范围。例如,第一pH可以是具有pH 7.00的中点值和0.10的宽度的范围,其是pH 6.95至7.05的范围。第二pH可以是具有pH 7.20的中点值和0.10的宽度的范围,其是pH7.15至7.25的范围。
该工艺可以是不包含pH下移(负面移变)的工艺。即,该工艺可以是不包含任何显著的pH降低的工艺。显著的pH降低可以是降低至少0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70,0.80,0.90或1.00个pH单位,其可持续至少1,5,或30分钟。该工艺可以是不包含于比第一pH要低的任何pH培养细胞的工艺。
本发明的工艺包含pH上移。pH上移在第一和第二培养阶段之间。pH上移是正面移变或碱性移变,即,pH上移是pH升高。pH上移是pH自第一pH升高至第二pH。
pH上移可以是逐渐的。即,pH上移可包含一段时间里的pH逐渐升高。pH可逐渐自第一pH升高至第二pH,例如在24-72小时的时间段里。时间段可以是24-72小时,36-60小时,或约48小时。时间段可以是6,12,24,36或48小时,或至少6,12,24,36或48小时。pH逐渐升高可将pH升高约0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,或0.05个pH单位每小时,或小于约0.001,0.002,0.003,0.004,0.005,0.006,0.007,0.008,0.009,0.01,或0.05个pH单位每小时。pH逐渐升高可将pH升高约0.001至0.05,0.001至0.01,0.001至0.005或0.002至0.008个pH单位每小时。
或者,pH上移可以是“非逐渐”的。此类pH上移可具有小于2小时,或小于1小时,或小于30,20,10,9,8,7,6,5,4,3,2,或1分钟的持续时间。pH非逐渐升高可将pH升高约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5,2.0,2.5或3.0个pH单位每小时,或至少约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.5,2.0,2.5或3.0个pH单位每小时。
逐渐提高pH可有利地最小化对哺乳动物细胞的有害影响。有害影响可以与培养培养基的pH的即刻或突然升高有关,该影响通过pH逐渐升高来避免。本发明的其中pH逐渐升高的工艺可具有与其中pH非逐渐升高,或其中如下文讨论的pH设定点以单个步骤升高的工艺相比改善的产物滴度和/或产物质量。
本发明的包含使用pH设定点控制pH的工艺可包含pH上移,其中设定点或是(a)逐渐或是(b)即刻自第一pH升高至第二pH。
当pH设定点逐渐升高时,这可包含设定点在一段时间里自第一pH连续升高至第二pH。或者,这可包含设定点在一段时间里自第一pH分步升高至第二pH。这段时间可以是24-72小时,36-60小时或约48小时。这段时间可以是至少6,12,24,36或48小时。
pH设定点逐渐连续升高可称作pH升降,或pH线性升降。如此,本发明的工艺可包含作为pH升降的pH上移,其中设定点自第一pH连续升高至第二pH。
pH设定点逐渐分步升高可包含离散步骤或增量。这可称作逐渐升高。每个离散步骤可将pH设定点升高至少约0.05个pH单位。每个离散步骤可将pH设定点升高至少约0.01,0.05,0.10,0.15,0.20,或0.25个pH单位。每个离散步骤可维持至少约12小时的时段。每个离散步骤可维持至少约1,2,4,6,8,12,18,24或36小时,或至少约1-24或6-18小时的时段。
pH设定点逐渐分步升高可通过重复提高pH设定点直至pH设定点达到第二pH来进行。分步升高可以以一系列离散步骤,或增量重复提高pH设定点。
例如,pH设定点逐渐分步升高可如下进行:
a)将pH设定点自第一pH增量式提高至中间pH设定点并将培养物维持于这个中间pH设定点一段时间；
b)将pH设定点增量式提高至更高的中间pH设定点并将培养物维持于这个更高的中间pH设定点一段时间；和
c)重复步骤b)直至pH设定点达到第二pH。
增量式提高pH设定点可包含将pH设定点提高0.05个pH单位或至少0.05个pH单位的增量。增量可以是约0.01,0.05,0.10,0.15,0.20,或0.25个pH单位或至少约0.01,0.05,0.10,0.15,0.20,或0.25个pH单位。中间pH设定点可维持至少约12小时的时段。每个离散步骤或增量可维持至少约1,2,4,6,8,12,18,24或36小时,或至少1-24或6-18小时的时段。每个离散步骤可以是维持约12小时的约0.05个pH单位。
作为分步pH设定点升高的pH设定点逐渐升高在一些情况中可能是优选的。例如,当技术限制意味着不能编程生物反应器来以连续升高逐渐提高pH设定点时。
可即刻提高pH设定点。pH设定点即刻变化可包含pH设定点以单个步骤自第一pH升高至第二pH。以这种方式,pH设定点自第一pH直接变化至第二pH,没有设置成任何中间值。当pH设定点即刻自第一pH升高至第二pH时,可以以非逐渐方式提高发酵的pH。发酵的pH自第一pH变化至第二pH花费的时间的量可取决于发酵的体积和/或搅拌速率。例如,下文实施例6牵涉pH设定点即刻升高,而且发酵自第一pH升高至第二pH花费的时间是2L发酵的约10分钟和1000L发酵的1-2小时。
死区可贯穿该工艺维持于恒定的值。例如,死区可贯穿该工艺是围绕设定点±0.05个pH单位。在其中pH设定点逐渐升高的实施方案中,死区可在第一培养阶段,pH上移,和第二培养阶段中维持于恒定的值。其中死区维持于恒定的值的工艺的实施方案显示于图2A,3A,4A,5A,6A,8A,和10A。
或者,死区可加宽。特别是,pH上移可包含死区加宽。死区可即刻加宽,即,死区可以以单个步骤加宽。其中死区以单个步骤加宽的工艺的一个实施方案显示于图7A。或者,死区可逐渐加宽,例如,死区可以以一系列离散步骤或增量加宽。其中死区以一系列增量加宽的工艺的一个实施方案显示于图9A。
pH上移可包含以单个步骤,或即刻加宽死区。pH上移可包含以单个步骤将死区自围绕设置为第一pH的设定点的初始值加宽至围绕设置为第一pH的设定点的更宽值,使得它涵盖第二pH,然后将pH设定点提高至第二pH。与pH设定点提高至第二pH同时,死区可恢复至它的围绕pH设定点的初始值。或者,死区可恢复至与它的初始值不同的值。死区可恢复至不涵盖第一pH的值。
例如,该工艺可包含于pH 7.00的第一培养阶段和于pH 7.20的第二培养阶段；第一培养阶段和第二培养阶段中的pH设定点可具有±0.05的死区；pH上移可包含以单个步骤将围绕设置为第一pH的设定点的死区自±0.05加宽至±0.25(自pH 7.00±0.05至pH 7.00±0.25),使得它涵盖第二pH,然后将pH设定点提高至第二pH。与pH设定点提高至第二pH同时,死区可恢复至围绕设置为第二pH的pH设定点±0.05(pH 7.20±0.05)。图7A显示依照这个实施方案的工艺。
pH上移可包含以单个步骤将死区自±0.05加宽至±0.25。pH上移可包含以单个步骤将死区自±0.01加宽至±0.05,自±0.05加宽至±0.25,自±0.05加宽至±0.50,或自±0.10加宽至±0.50。
死区可以以单个步骤加宽且加宽的死区可以维持约12,18,24,36,48,60或72小时或至少12,18,24,36,48,60或72小时。加宽的死区可维持36-60,40-56或44-52小时,或约48小时。加宽的死区可维持直至pH达到第二pH。
pH上移可包含逐渐加宽死区。pH上移可包含以一系列离散步骤或增量重复加宽死区。pH上移可包含以一系列离散步骤或增量自围绕设置为第一pH的pH设定点的初始值重复加宽死区直至死区涵盖第二pH,然后提高pH设定点至第二pH。与pH设定点提高至第二pH同时,死区可恢复至它的围绕设置为第二pH的设定点的初始值。或者,死区可恢复至与它的初始值不同的值。死区可恢复至不涵盖第一pH的值。
例如,该工艺可包含于pH 7.00的第一培养阶段和于pH 7.20的第二培养阶段；第一培养阶段和第二培养阶段中的pH设定点可具有±0.05的死区；pH上移可包含以一系列增量,例如四个增量将围绕设置为第一pH的设定点的死区自±0.05增量式加宽至涵盖pH7.20的值。然后与pH升高至第二pH同时死区可恢复至围绕设置为第二pH的pH设定点±0.05(pH 7.20±0.05)。图9A显示依照这个实施方案的工艺。
pH上移可包含以一系列增量或离散步骤加宽死区。增量可以是0.05个pH单位。增量或离散步骤可以是0.01,0.02,0.03,0.04,或0.05个pH单位或小于0.01,0.02,0.03,0.04,或0.05个pH单位。可以有至少两个,三个,四个或五个增量。增量可以是彼此相同的大小或不同的大小。例如,±0.05的死区可以以一系列四个0.05个pH单位的增量加宽至±0.25,如下:加宽至±0.10,±0.15,±0.20,±0.25。
死区可以以一系列增量或离散步骤加宽,而且每个增量或离散步骤可以维持约12小时或至少12小时。每个增量或离散步骤可以维持约2,4,6,8,12,18,或24小时或至少2,4,6,8,12,18,或24小时。增量可具有彼此相同的持续时间,或不同的持续时间。
pH上移可包含在一段时间里连续逐渐加宽死区。pH上移可包含自围绕设置为第一pH的pH设定点的初始值连续加宽死区直至死区涵盖第二pH,然后提高pH设定点至第二pH。与pH设定点提高至第二pH同时,死区可恢复至它的围绕设置为第二pH的设定点的初始值。或者,死区可恢复至与它的初始值不同的值。死区可恢复至不涵盖第一pH的值。
例如,该工艺可包含于pH 7.00的第一培养阶段和于pH 7.20的第二培养阶段；第一培养阶段和第二培养阶段中的pH设定点可具有±0.05的死区；pH上移可包含将围绕设置为第一pH的设定点的死区自±0.05连续加宽至涵盖pH7.20的值。然后与pH升高至第二pH同时死区可恢复至围绕设置为第二pH的pH设定点±0.05(pH 7.20±0.05)。
死区连续加宽的时间段可以是24-72小时,36-60小时或约48小时。这个时间段可以是至少6,12,24,36或48小时。
死区增量式升高在一些情况中可能是优选的。例如,当技术限制意味着不能编程生物反应器来以连续升高逐渐提高pH设定点时或当技术限制意味着不能编程生物反应器来连续加宽死区时。
pH上移可包含上述任何可操作组合的设定点的升高和死区的加宽。在一些情况中,图2A至9A中显示的实施方案的组合可能是优选的,例如用于最小化pH中的波动(pH扰动)。
pH可在线或离线测量。本文中讨论的pH值指在线值,除非另有说明。pH可以于37.0±1.0℃测量。pH可以于36.5±1.0℃测量。pH可以于生物反应器中用于生产发酵的温度测量。对于在线测量,通过生物反应器中的探针测量pH。对于在线测量合适的pH探针包括Mettler-Toledo InPro pH传感器。对于离线测量,在来自生物反应器的样品中通过探针测量pH,例如在温度受控样品容器中。对于离线测量合适的设备包括Knick Portavo 907 pH计,pH 3310 WTW,和Mettler-Toledo InPro Semi-Micro pH电极。合适的采样装置包括
9mL(Sarstedt)。
用于离线pH测量的规程可以如下:通过浸入处于测量温度的水浴或铝块将台式pH电极预温热至测量温度(例如37.0±1.0℃)；然后将样品加热至测量温度(例如37.0±1.0℃)并样品一达到测量温度就测量pH(例如在3分钟后)；然后等待直至达到稳定的pH值(例如小于1分钟)；使用稳定的pH值作为离线测量。可使用校准缓冲液来校准pH测量设备,例如Duracal缓冲液(Hamilton)。
如果它显著偏离离线测量的话,可以重新校准在线测量。例如,如果在线测量相差大于0.05个pH单位的话。重新校准规程可包含如果第一样品测量为具有与在线值相差大于0.05个pH单位的离线pH值的话,自生物反应器取得第二样品。如果第二样品也测量为具有与在线值相差大于0.05个pH单位的离线pH值的话,通过设置为由离线(外部)pH探针测定的pH值来重新校准在线(内部)pH探针。
本发明的工艺可包含将pH上移补料培养基添加至培养培养基。pH上移补料培养基可相对于培养培养基具有碱性pH。或者/另外,pH上移补料培养基可含有当由细胞代谢时提高培养培养基的pH的因子,诸如营养物。例如,某些氨基酸,诸如谷氨酸盐,天冬氨酸盐和丙氨酸由细胞代谢而生成铵。pH上移补料培养基可含有谷氨酸盐,天冬氨酸盐和/或丙氨酸。
或者/另外,pH上移可包含将碱性药剂(碱),诸如NaOH,Na2CO3,或NaHCO3添加至培养培养基。碱性药剂可称作碱和碱盐。
或者/另外,pH上移可包含容许细胞培养物积累提高培养培养基的pH的细胞代谢物。
或者/另外,pH上移可包含自培养培养基去除溶解CO2,例如通过自生物反应器汽提CO2。自生物反应器汽提CO2引起溶解CO2离开培养培养基。由于培养培养基的pH取决于溶解CO2和碳酸氢盐(HCO3 -)的平衡,因此自培养培养基去除溶解CO2会改变培养培养基的pH。
在包含添加pH上移补料培养基和/或容许细胞培养物积累提高培养培养基的pH的代谢物的一些实施方案中,该工艺不包含比0.15,0.20,0.25,或0.5个pH单位每24小时要快的速率的pH升高。
在包含添加pH上移补料培养基和/或容许细胞培养物积累提高培养培养基的pH的代谢物的一些实施方案中,该工艺也不包含将碱性试剂(碱),诸如NaOH,Na2CO3,NaHCO3的浓缩溶液添加至培养培养基。碱性试剂(碱)的浓缩溶液是那些具有高于例如0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,或1.0M的浓度的。其中pH上移不牵涉添加碱的浓缩溶液的工艺可有利地最小化培养物渗透摩尔浓度的升高。
添加pH上移补料培养基对于本发明的补料-分批工艺是有利的,因为它以单个工艺步骤有效实现补料细胞培养物和提高细胞培养物的pH二者。在一段时间里添加pH上移补料培养基还推动在一段时间里pH逐渐升高,这可能是有利地,如上文讨论的。
本发明的工艺包含将细胞接种入培养培养基。将细胞接种入培养培养基指将一个或多个细胞,或一群细胞添加入无菌培养培养基。接种也可称作播种。在培养工艺持续时间和时机的语境中,将细胞接种入培养培养基定义该工艺的第0天。
本发明的工艺可以是补料-分批工艺(Whitford,2006)。补料-分批工艺是如下的细胞培养工艺或发酵工艺,其中在培养容器或生物反应器中培养细胞,在培养过程期间将细胞生长或产物形成所必需的一种或多种营养物添加至生物反应器。可以或是连续地或是间歇地将营养物添加至培养容器。可以以补料培养基的形式添加营养物。营养物包括糖和氨基酸,以及维生素,核苷,有机化学化合物,和无机金属盐。补料培养基可包含糖(单或二糖),氨基酸,维生素,核苷,有机化学化合物,和无机金属盐。细胞贯穿细胞培养工艺保持在生物反应器中,直至收获细胞和或细胞产物。
与之对比,分批工艺是如下的细胞培养工艺,其中在发酵工艺开始时将细胞和所有必需培养培养基成分添加至培养容器且随后没有将营养物添加至培养容器。与补料-分批工艺不同,在分批工艺中没有将补料培养基添加至培养物。例如,在分批工艺中没有添加糖(例如葡萄糖)和/或没有添加氨基酸。
本发明的补料-分批工艺不是分批工艺。本发明的补料-分批工艺可包含将糖添加至培养培养基。本发明的补料-分批工艺可包含将补料培养基添加至培养培养基。
将细胞接种入培养培养基。培养培养基可以是商品化培养基。培养培养基可以是化学限定的,而且无蛋白质和血清的,例如CD CHO AGTTM培养基(Thermo FisherScientific,配方号A15649)。
在本发明的补料-分批工艺中将补料培养基(“补料1”)添加至培养培养基。在此语境中,初始培养培养基可称作基础培养基,其在补料-分批培养过程期间补充补料培养基。基础培养基可以是化学限定的,而且无蛋白质和血清的,例如CD CHO AGTTM培养基(ThermoFisher Scientific,配方号A15649)。基础培养基可以是任何合适的商品化培养基,包括定制的培养基,依照供应商或制造商的说明书使用。
补料培养基可包含另外的甲硫氨酸,苏氨酸,丝氨酸,酪氨酸和甘氨酸。补料培养基可包含处于约0.5g/l至约1.5g/l的范围中的相应浓度的另外的甲硫氨酸,苏氨酸,丝氨酸,酪氨酸和甘氨酸。
可以将约2.0至约3.0wt％的初始培养物重量每天的范围中的补料培养基添加至培养培养基。
补料培养基可以是例如含有补料基础5培养基(Thermo Fisher Scientific,目录号074-91011DW),补料基础2培养基(Thermo Fisher Scientific,目录号074-91007MV),补料基础6培养基(Thermo Fisher Scientific,目录号074-91012MW),极限必需培养基维生素(MEM 100x,Thermo Fisher Scientific,目录号074-91008BX),CD CHO AGTTM培养基(Thermo Fisher Scientific,配方号A15649),和SPE(Lonza Verviers Sprl,目录号BESP531F)的补料培养基。补料培养基可以是含有特定比率的补料基础5培养基,补料基础2培养基,补料基础6培养基,极限必需培养基维生素,SPE和CD CHO AGT培养基的培养基。补料培养基可以通过组合补料基础5培养基,补料基础2培养基,和补料基础6培养基以提供补料培养基来制备,补料培养基中还可以包括任何极限必需培养基维生素,SPE和CD CHO AGT培养基。补料培养基可以是任何合适的商品化培养基,包括定制的培养基,依照供应商或制造商的说明书使用。
本发明的补料-分批工艺可进一步包含添加pH上移补料培养基(“补料2”)。pH上移补料培养基可包含当由细胞代谢时提高pH的营养物。pH上移补料培养基可包含相对于补料培养基升高水平的谷氨酸盐,天冬氨酸盐和/或丙氨酸。pH上移补料培养基可包含另外的赖氨酸,苏氨酸,丝氨酸,缬氨酸,亮氨酸和色氨酸。pH上移补料培养基可包含处于约0.5g/l至约6.0g/l的范围中的相应浓度的另外的赖氨酸,苏氨酸,丝氨酸,缬氨酸,亮氨酸和色氨酸。
pH上移补料培养基可以是例如含有补料基础8培养基(Thermo FisherScientific,目录号074-91013RW)和补料基础9培养基(Thermo Fisher Scientific,目录号074-91014EW)的补料培养基。pH上移补料培养基可以通过组合补料基础8培养基和补料基础9培养基以提供pH上移培养基来制备。pH上移培养基可具有约10-11的pH。可以调节补料基础8培养基和补料基础9培养基的相对比例并使用常规技术测试在任何细胞培养物中实现期望的pH上移的有效性,例如在实验工艺的制备性设计中。
pH上移补料培养基可具有相对于培养培养基碱性的pH。pH上移补料培养基可具有10.0以上的pH。pH上移培养基可具有8.0,9.0或10.0以上的pH。pH上移培养基可具有约8.0-12.0,约10.0-11.0,或约10-11的pH。pH上移补料培养基可具有约10.0,10.5或11.0的pH。pH上移补料培养基可具有约10或约11的pH。
可以将约0.5至约1.5wt％的初始培养物重量每天的范围中的上移补料培养基添加至培养培养基。
本发明的补料-分批工艺可包含在第一培养阶段期间将补料培养基添加至培养培养基,继以将pH上移培养基添加至培养培养基。如下文讨论的,可以在某个数目的天数后用pH上移培养基替代补料培养基。如下文讨论的,添加pH上移培养基至培养物可以在pH上移之前数天。
可以将另外的葡萄糖补料溶液添加至培养物以维持适宜的葡萄糖浓度,例如≥3g/l。
下文的实验实施例证明是pH上移自身在依照本发明进行的工艺中引起有利的作用(而非pH上移培养基的成分)。这是因为比较每个依照本发明的工艺的实施例与对照工艺,其中将pH上移培养基添加至发酵但通过添加CO2来抵抗任何pH升高(见例如实施例1中描述的方案)。这意味着在实施例2至9和实施例10工艺#1中观察到的有利的作用直接归于依照本发明的工艺的pH上移。依照本发明的工艺的pH上移可使用任何适宜培养培养基来进行。
实施例10还证明依照本发明的pH上移(工艺#1,其中pH上移继以于比第一培养阶段要高的pH的第二培养阶段)与其中有pH上移但没有于比第一培养阶段(其中将细胞接种入培养基的培养阶段或始于第0天的培养阶段)要高的pH的培养阶段的工艺(工艺#2)相比是有利的。
在培养工艺持续时间和时机的语境中,将细胞接种入培养培养基定义该工艺的第0天。
本发明的工艺可包含具有3,4,5或6天或至少3,4,5或6天的持续时间的第一培养阶段。第一培养阶段可具有1,2,4,6,8,12,或18小时或至少1,2,4,6,8,12,或18小时的持续时间。第一培养阶段可具有3至10天,4至10天,4至8天或4至6天的持续时间。第一培养阶段可具有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天的持续时间。第一培养阶段可始于将细胞接种入细胞培养培养基。当哺乳动物细胞是CHO细胞时,第一培养阶段可具有6,7,8或9天的持续时间。提到具有某个持续时间的第一培养阶段可具体意味着培养物处于或维持于第一pH达该持续时间。在此语境中,“维持于”可意味着“连续维持于”。即,本发明的工艺可包含第一培养阶段,包含于第一pH培养细胞,或维持第一pH,或维持设置为第一pH的设定点达1,2,4,6,8,12,或18小时或至少1,2,4,6,8,12,或18小时；或3至10天,4至10天,4至8天或4至6天；或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天。
本发明的工艺牵涉持续的pH上移。持续的pH上移是维持某个持续时间的pH上移。例如,持续的pH上移可以是维持至少1小时或本文中作为第一和/或第二培养阶段的持续时间公开的持续时间的pH上移。本发明的工艺可包含具有4,5,或6天或至少4,5,或6天的持续时间的第二培养阶段。第二培养阶段可具有1,2,4,6,8,12,或18小时或至少1,2,4,6,8,12,或18小时的持续时间。第二培养阶段可具有3至10天,4至10天,4至8天或4至6天的持续时间。该第二培养阶段可具有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天的持续时间。第二培养阶段可继续直至工艺结束。第二培养阶段可终止于收获细胞和/或由细胞表达的产物。当哺乳动物细胞是CHO细胞时,第二培养阶段可具有6,7,8或9天的持续时间。提到具有某个持续时间的第二培养阶段可具体意味着培养处于或维持于第二pH达该持续时间。在此语境中,“维持于”可意味着“连续维持于”。即,本发明的工艺可包含第二培养阶段,包含于第二pH培养细胞,或维持第二pH,或维持设置为第二pH的设定点达1,2,4,6,8,12,或18小时或至少1,2,4,6,8,12,或18小时；或3至10天,4至10天,4至8天或4至6天；或1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天或至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天。
本发明的工艺可以是用于培养哺乳动物细胞的工艺,该工艺包含第一培养阶段和第二培养阶段,其中第一培养阶段处于或维持于第一pH,且第二培养阶段处于或维持于比第一pH要高的第二pH。第一培养阶段可包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基。该工艺可以是补料-分批工艺。该工艺可以是其中温度维持于实质性恒定的值的工艺。该工艺可以是其中哺乳动物细胞能够表达抗体的工艺。
本发明的工艺可包含使用pH设定点控制pH,该工艺包含第一培养阶段,其中设定点设置为第一pH,和第二培养阶段,其中设定点设置为第二pH。第一培养阶段可包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基。第一培养阶段可具有如上文列出的特定持续时间,其中设定点维持于第一pH达该持续时间。第二培养阶段可具有如上文列出的特定持续时间,其中设定点维持于第二pH达该持续时间。
在本公开的语境中,“培养细胞”可以指于特定pH培养细胞达特定持续时间。这可以更加具体地指于维持特定持续时间的特定pH培养细胞。这可以指使用特定pH设定点培养细胞达特定持续时间。例如,提到包含“于第二pH培养细胞”的第二培养阶段可以指使用设置为第二pH的设定点于第二pH培养细胞达特定持续时间。
本发明的工艺可包含于或始于第6-8天(144-192小时)的pH上移。本发明的工艺可包含于第5-9天或第4-10天的pH上移。该工艺可包含于第4,5,6,7,8,9或10天,或在第4,5,6,7,8,9或10天后的pH上移。当哺乳动物细胞是CHO细胞时,该工艺可包含于第6天(144小时),156小时,第7天(168小时),或第8天(192小时)的pH上移。
可以以一系列制备性,实验设计,工艺确定pH上移的最佳时机。例如,可选择pH上移的时机以最大化最终产物滴度同时保持关键产物质量参数在期望范围内(例如保持关键质量属性在由FDA或EMEA在它的治疗性产物的批件中规定的特定范围内,见下文)。pH上移的时机可以通过以一系列制备性,实验设计,工艺测量最终产物滴度以确定产生最大产物滴度及适合于临床应用产物质量概况的pH上移时机来确定。在此类情况中,可以以一系列制备性工艺(其可以是缩小版本的工艺)测量产物滴度和质量,其中改变pH上移的时机,并选择pH上移的时机在确定为提供产生最大产物滴度和适合于临床应用的产物质量概况的工艺的那天发生。可以通过测量糖基化,IEC样式,电泳样式,质谱术,层析,或测径器数据来测定产物质量概况。
适合于临床应用的产物质量概况可以是那些得到FDA或EMEA关于特定治疗性产物批准的。例如,批准的产物可能要求具有就任何或所有下述而言的某些属性:大小相关变体,电荷相关变体,三硫化物含量,Fc糖基化,微异质性,糖化,动作模式相关生物功能,序列变体,细胞年龄相关产物修饰和工艺相关杂质。在细胞水平治疗性产物的具体动作模式(MoA)通常有充分描述。基于MoA,任何具体药物的非临床安全性数据,临床研究注册和早期临床研究结果,一套质量参数可能有明确定义。对于后期原料药生产,原料药应当维持相似或相当的质量以实现期望的治疗效果。关键的原料药质量参数可能彼此不同。这些质量参数通常包括:糖基化,糖化,氨基酸错掺,C端赖氨酸去除,C端酰胺化,添加半胱氨酸,不正确二硫化物配对,三硫化物形成,脱酰胺,琥珀酰亚胺形成,硫酸化,磷酸化,Met/Trp氧化,γ-羧化,β-羟基化,等。
某些属性可能有潜力影响产物安全性或功效并由此归类为在生产和贮存期间应当控制的关键质量属性(CQA)。制造治疗性蛋白质,诸如治疗性抗体设计成控制期望水平的CQA在限定限度内以提供一致的产品质量。
在本文中公开的工艺中,可以通过最大最终产物滴度及对于临床应用可接受的产物质量概况的标准来确定诸如pH上移的时机,适宜的总工艺持续时间,或收获时间等变量。
本发明的补料-分批工艺可包含将补料培养基添加至培养物。可以在第1-3天添加补料培养基。可以在第1-3,1-4,1-5或1-6天添加补料培养基。在图中补料培养基称作“补料1”。
本发明的补料-分批工艺可包含将pH上移补料培养基添加至培养物。可以在第4-14天添加pH上移补料培养基。可以在工艺的第4,5,6,或7天及在随后每一天添加pH上移补料培养基。可以自工艺的第4,5,6,或7天起用pH上移补料培养基替代补料培养基。在图中pH上移补料培养基称作“补料2”。pH上移补料培养基可防止细胞培养培养基的pH下移,例如通过中和由细胞生成的酸性代谢物。或者,pH上移补料培养基可提高细胞培养培养基的pH。
本发明的补料-分批工艺可包含在将pH上移培养基添加至培养物的日子对培养物补充葡萄糖溶液以维持适宜的葡萄糖浓度。
本发明的工艺可具有至少6天,或至少7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17或18天的持续时间。总持续时间可以是自接种日(第0天)至收获细胞和/或由细胞表达的产物的日子的持续时间。当哺乳动物细胞是CHO细胞时,该工艺可具有14天的持续时间。该工艺的总天数还可称作“运行时间”。可以为最大产物滴度,或最大产物滴度及恒定的产物质量概况选择该工艺的运行时间。可以为了临床应用预先限定产物质量概况。可以通过测量糖基化和/或离子交换层析(IEC)样式来测定产物质量概况。
第一培养阶段可具有1-5,1-4或1-3天的持续时间。pH上移可具有约10或30分钟,或约1,2,3,4,5,6,7,8,12,24,36,48,52,或60小时的持续时间,或可具有约2-72,2-60,2-52,2-48,8-52,12-52,12-48,24-52或24-48小时的持续时间。pH上移可具有至少约10或30分钟,或至少约1,2,3,4,5,6,7,8,12,24,36,48,52,或60小时的持续时间,或可具有至少约2-72,2-60,2-52,2-48,8-52,12-52,12-48,24-52或24-48小时的持续时间。第二培养阶段可具有约4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,或14天,或约4-14,5-14,6-14,7-14,或8-14天的持续时间。
该工艺可包含收获步骤。在收获步骤中收获细胞和/或产物。收获步骤终止该工艺。收获步骤可以在第10-18天,例如在第14天。
可以通过每天测量细胞存活力来确定收获步骤的时机。可以在该工艺中其中细胞存活力低于85％,80％,75％或70％的第一天进行收获步骤。
可以通过测量对照工艺中的乳酸盐积累来确定本发明的工艺中收获步骤的时机。对照工艺与本发明的工艺相同,只是贯穿该工艺(贯穿第一和第二培养阶段二者)维持第一pH。在对照工艺中每天测量乳酸盐。可以在与对照工艺的第二培养阶段中之后测量到至少4个,至少5个,或至少6个连续每日乳酸盐升高的第一天对应的天数进行收获步骤。可以应用另外的标准,使得仅仅可以在相对于先前的日子在本发明的工艺中没有测量到乳酸盐升高的日子进行收获步骤。
可以通过测量产物滴度来确定收获步骤的时机。可以通过以一系列制备性,实验设计,工艺测量最终产物滴度以确定产生最大产物滴度及适合于临床应用的产物质量概况的时机来确定收获步骤的时机。在此类情况中,可以每天以制备性工艺(其可以是缩小版本的本发明的工艺,或者可以与本发明的工艺相同)测量产物滴度和质量,并选择收获步骤在具有最高产物滴度及适合于临床应用的产物质量概况的那天发生。
可以通过测量产物质量来确定收获步骤的时机。可以就糖基化(例如半乳糖基化,高甘露糖结构)而言或就具有产物在超出之后就不是最佳的阈值的体外或体内活性而言测量产物质量。在此类情况中,可以每天以制备性工艺(其可以是缩小版本的本发明的工艺,或者可以与本发明的工艺相同)测量产物质量,而且收获步骤在制备性工艺中确定产物质量不是最佳的那天之前的那天发生。
本发明的工艺的温度可维持于实质性恒定的值。
当温度维持于实质性恒定的值时,没有显著的温度移变。显著的温度移变可定义为约0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,或5.0℃或更多的移变。实质性恒定的值可以在目标值的±0.1℃,±0.2℃,±0.3℃,±0.4℃,±0.5℃,±1.0℃,±1.5℃,或±2.0℃内。目标值可以是35.0,35.5,36.0,36.5,37.0,或37.5℃。
实质性恒定的值的温度可以是36.0-37.0℃。即,温度可维持在36.0℃和37.0℃的值之间。类似地,实质性恒定的值的温度可以是36.4-36.6℃。实质性恒定的值的温度可以是36.5℃。可以使用生物反应器中的在线温度传感器来测量温度。
维持该工艺的温度于实质性恒定的值可有利地避免由在该工艺期间的显著的温度移变引起的问题。降低用于生产重组蛋白质的细胞培养工艺中的温度可引起不想要的产物质量的变化(例如糖基化的变化),或者可引起细胞生产力的损失。降低温度可能降低积分可存活细胞密度,其是细胞生产力的一项指标且因此一般与最终产物滴度有关。
哺乳动物细胞可以是重组细胞。重组细胞可包含编码异源蛋白质的核酸序列。哺乳动物细胞可以是CHO细胞,更加具体地是重组CHO细胞。哺乳动物细胞可以是CHO K1。哺乳动物细胞可以是CHO K1SV。哺乳动物细胞可以是BHK细胞,更加具体地是重组BHK细胞。哺乳动物细胞可以是BHK-21细胞。哺乳动物细胞可以是PER.C6细胞。哺乳动物细胞可来自骨髓瘤细胞系。哺乳动物细胞可以是人细胞系,诸如HEK293和它的衍生物和PER.C6。哺乳动物细胞可能能够表达抗体。哺乳动物细胞可包含编码抗体的核酸。编码抗体的核酸可以可操作连接至组成性启动子或诱导型启动子。抗体可以是多特异性抗体,抗体片段,具有多特异性功能的抗体片段,融合抗体,或融合抗体片段。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是治疗性抗体。抗体可以是双特异性抗体。抗体可以是人源化抗体。抗体可以是抗Ang2/VEGF-CrossMab(Schaefer 2011；Fenn 2013)。
该工艺可以是用于生产产物的工艺,其中由哺乳动物细胞表达产物。
可改造哺乳动物细胞以表达产物。用于遗传工程化细胞以表达感兴趣蛋白质的表达系统,方法,和载体是本领域技术人员公知的；例如,各种技术描述于Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3ed.(2001)。可改造哺乳动物细胞以使用GS基因表达系统表达产物(Lonza Biologics plc,Slough UK)。
产物可以是重组蛋白质。产物可以是抗体。抗体可以是多特异性抗体,抗体片段,具有多特异性功能的抗体片段,融合抗体,或融合抗体片段。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是治疗性抗体。抗体可以是双特异性抗体。抗体可以是二价双特异性抗体,诸如CrossMAb抗体(Schaefer et al.,2011；Fenn et al.,2013)。抗体可以是抗体的生物学功能性片段。抗体片段包括Fab,Fab’,F(ab’)2,scFv,dAb,互补决定区(CDR)片段,线性抗体,单链抗体分子,微型抗体(minibody),双抗体(diabody)和自抗体片段形成的多特异性抗体。
产物可以是结合Ang2和VEGF的二价双特异性抗体。产物可以是结合Ang2和VEGF的二价双特异性CrossMab抗体。产物可以是抗Ang2/VEGF-CrossMab抗体(Schaefer et al.,2011；Fenn et al.,2013)。产物可以是凡努昔珠单抗,即,产物可以是具有INN凡努昔珠单抗(vanucizumab)的抗体抗Ang2/VEGF-CrossMab。产物可以是WO 2011/117329中描述的抗Ang2/VEGF-CrossMab抗体,或者可以是具有WO 2011/117329中描述的抗Ang2/VEGF-CrossMab的第一和第二抗原结合位点的重和轻链CDR氨基酸序列,或具有VH和VL域氨基酸序列的抗体,或WO 2011/117329中描述的抗Ang2/VEGF-CrossMab的片段。产物可以是具有凡努昔珠单抗的第一和第二抗原结合位点的重和轻链CDR氨基酸序列,或具有VH和VL域氨基酸序列的抗体,或凡努昔珠单抗的治疗活性片段。产物可以是结合CSF-1R的单克隆抗体。产物可以是具有INN依米妥珠单抗(emactuzumab)的抗CSF-1R抗体。产物可以是WO 2011/070024中描述的抗CSF-1R抗体,或者可以是具有WO2011/070024中描述的抗体(或依米妥珠单抗)的重和轻链CDR序列,或VH和VL域氨基酸序列的抗体,或WO 2011/070024中描述的抗CSF-1R抗体(或依米妥珠单抗)的片段。或者,产物可以是治疗性蛋白质,肽或酶。产物可以是重组人葡糖醛酸糖苷酶,重组人酸α葡萄糖苷酶,或重组人胰岛素。该工艺可以是用于生产不是抗TNFα抗体的抗体的工艺,或者可以是不是用于生产抗TNGα抗体的工艺的工艺。
治疗性抗体包括但不限于抗VEGF抗体；抗Ang2抗体；抗CSF-1R抗体；抗HER2抗体；抗CD20抗体；抗IL-8抗体；抗CD40抗体,抗CD11a抗体；抗CD11b抗体；抗CD11c抗体；抗CD18抗体；抗lgE抗体；抗Apo-2受体抗体；抗Apo2:/TRAIL抗体；抗组织因子(TF)抗体；抗人α4β7整联蛋白抗体；抗EGFR抗体；抗CD3抗体；抗CD25抗体；抗CD4抗体；抗CD52抗体；抗Fc受体抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体；针对乳腺上皮细胞的抗体；结合结肠癌细胞的抗体；抗CD38抗体；抗CD33抗体；抗CD22抗体；抗EpCAM抗体；抗GpIIb/IIIa抗体；抗RSV抗体；抗CMV抗体；抗HIV抗体；抗肝炎抗体；抗CA125抗体；抗αvβ3抗体；抗人肾细胞癌抗体；抗人17-1A抗体；抗人结肠直肠肿瘤抗体；针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌抗体；抗人白细胞抗原(HLA)抗体；抗HLADR抗体；抗IgE抗体；抗HER3抗体；抗HER4抗体；抗DR5抗体；抗ICAM抗体；抗VLA-4抗体；抗VCAM抗体；和抗IL17A抗体。
产物可以是蛋白质,或抗体,其不是Epo-Fc。
本发明的工艺可进一步包含分离产物或纯化产物的步骤。分离或纯化产物的步骤可包含离子交换层析。分离或纯化产物的步骤可包含将包含产物的组合物加载到离子交换层析材料上,任选清洗离子交换层析材料,和自离子交换层析材料洗脱产物。包含产物的组合物可包含来自细胞培养物的培养培养基,和/或可包含哺乳动物细胞,其可以是裂解的哺乳动物细胞。分离或纯化产物的方法可包含制备包含产物的组合物的步骤。制备包含产物的组合物的步骤可包含收获细胞,和/或裂解细胞,和/或收获细胞培养培养基。制备包含产物的组合物的步骤可包含蛋白A层析。制备组合物的步骤可包含冻干产物。制备组合物的步骤可包含在药学可接受载剂(例如生理盐水)中配制产物和/或在包含一种或多种药学赋形剂的溶液中配制产物。
本发明进一步提供通过本发明的工艺生成的产物和组合物。
本发明的工艺可避免不想要的代谢物,诸如乳酸盐和铵的过量积累。本发明的工艺可改善维持适度pCO2水平和/或更低的培养物渗透摩尔浓度。
本发明的工艺可以是具有相对于对照工艺改善的参数的工艺,其中对照工艺与本发明的工艺相同,只是贯穿该工艺(贯穿第一和第二培养阶段二者)维持第一pH。例如,对照工艺可以是其中第一培养阶段中的pH是7.00且第二培养阶段中的pH是7.00的工艺。
可以在收获步骤或在收获步骤的那天测定参数。当哺乳动物细胞是CHO细胞时可以在第14天测定参数。
本发明的工艺可以是其中细胞存活力比对照工艺要高至少10％,15％或20％的工艺。
本发明的工艺可以是其中乳酸盐水平比对照工艺要低至少10％,20％,30％,40％,或50％的工艺。
本发明的工艺可以是其中铵水平比对照工艺要低至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％或80％的工艺。
本发明的工艺可以是其中产物滴度比对照工艺要高至少5％,10％或15％的工艺。
本发明的工艺可以是其中渗透摩尔浓度比对照工艺要低至少5％的工艺。本发明的工艺可以是其中收获步骤时渗透摩尔浓度低于500Osm/kg的工艺。
如通过实施例2至9和附图显示的,本发明的工艺与其中pH贯穿该工艺维持于相同值的工艺(如实施例1中)相比得到改进。
如通过实施例10工艺#1和#2显示的,本发明的工艺与包含pH自初始值下移,继以pH朝着初始值上移的工艺相比也得到改进。包含pH自初始值下移,继以pH朝着初始值上移的工艺公开于US 8,765,413。
本发明进一步提供一种延长哺乳动物细胞培养物的寿命的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种提高哺乳动物细胞培养物中的细胞存活力的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种提高哺乳动物细胞培养物中的积分可存活细胞密度(IVCD)的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种降低哺乳动物细胞培养物中的乳酸盐积累的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种降低哺乳动物细胞培养物中的铵积累的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种改善哺乳动物细胞培养物中的pCO2概况的方法,该方法包含如上文描述的本发明的工艺。本发明提供一种降低哺乳动物细胞培养物中的渗透摩尔浓度的方法,该方法包含如上文公开的本发明的工艺。
本发明进一步提供pH上移补料培养基或pH升高剂(例如碱性剂或碱)用于延长哺乳动物细胞培养物的寿命；提高哺乳动物细胞培养物中的细胞存活力；提高哺乳动物细胞培养物中的IVCD；降低哺乳动物细胞培养物中的乳酸盐积累；降低哺乳动物细胞培养物中的铵积累；改善哺乳动物细胞培养物中的pCO2概况；或降低哺乳动物细胞培养物中的渗透摩尔浓度的用途,其通过实施如上文公开的本发明的方法或工艺。该工艺包含将pH上移培养基或pH升高剂添加至哺乳动物细胞培养物以将pH自第一pH提高至第二pH。即,在本发明是pH上移培养基或pH升高剂用于实现特定目的的用途的情况中,该用途牵涉将pH上移培养基或pH升高剂添加至哺乳动物细胞培养物的培养培养基以实现在第一和第二培养阶段之间发生的pH上移。本发明进一步提供pH上移补料培养基或pH升高剂(例如碱性剂或碱)用于提高哺乳动物细胞培养物中的产物滴度的用途。例如,本发明提供用于提高产物滴度的pH升高剂在本文中公开的用于培养哺乳动物细胞的工艺中的用途,其中产物是由哺乳动物细胞表达的,例如重组蛋白质,诸如抗体。产物滴度的升高是相对于其中不将pH升高剂添加至哺乳动物细胞培养物的哺乳动物细胞培养物。本发明提供用于提高产物滴度的pH升高剂在本文中公开的用于生产产物(诸如重组蛋白质产物)的工艺中的用途。在第二个方面,本发明提供一种用于培养哺乳动物细胞的工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于第二pH培养细胞,其中第二pH比第一pH要高且其中该工艺的温度维持于实质性恒定的值。
在第三个方面,本发明提供一种用于培养能够表达抗体的哺乳动物细胞的工艺,该工艺包含第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞,和第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
本发明的第二个和第三个方面可包括上文关于本发明的第一个方面讨论的本发明的工艺的任何特征。
本文中明确公开上文描述的实施方案的每种和每一种兼容组合,就像单独和明确记载每种和每一种组合,除了明显不允许或明显避免此类组合的情况。
本文中使用的章节标题仅仅用于组织目的,不要解读为限制描述的主题。
鉴于本公开,本发明的各种别的方面和实施方案对于本领域技术人员会是明显的。
除非上下文另有要求,贯穿此说明书,包括所附权利要求书,词语“包含”和诸如“含有”和“包括”等变化会理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤组,但是不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤组。“和/或”在本文中使用时要理解为具体公开两个规定特征或成分中的每一个,有或没有另一个。例如,“A和/或B”要理解为具体公开(i)A,(ii)B和(iii)A和B中的每一项,就像本文中单独列出每一项。
必须注意的是,如说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式“一个”,“一种”,和“该/所述”包括复数指示物,除非上下文另外清楚指明。范围可以在本文中表述为自“约”一个特定值,和/或至“约”另一个特定值。当表述此类范围时,另一个实施方案包括自该一个特定值和/或至该另一个特定值。类似地,当值通过使用在前的“约”表述为近似值时,会理解的是该特定值形成另一个实施方案。例如,约7.2的pH可以是7.2的pH。
“约”某个数值的pH值可以依照表述它的精确度程度来解读。例如,“约7.0”的pH可以指pH 6.95-7.05,而“约10”的pH可以指pH 9.5-10.5。
在pH标度上相对较高的pH值是相对碱性的,而相对较低的pH值是相对酸性的。如此,更高的pH在本公开的语境中指更加碱性的pH。
除非上下文另外指明,上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案且同等适用于描述的所有方面和实施方案。
本发明的某些方面和实施方案现在会通过实施例和参考上文描述的图来例示。实施例不应解读为限制本发明的范围。出于说明目的包括实施例,而且本发明只受权利要求书限制。别的方面和实施方案对于本领域技术人员会是明显的。通过援引将此文中提到的所有文件收入本文。
实施例
下面的实施例(包括进行的实验和实现的结果)仅仅出于例示目的提供且应当解读为包括所有可能的实施方案连同此类权利要求享有的全部等效范围。
细胞系,培养培养基,和培养工艺
在所有下面的实施例中,使用CHO K1SV(一种自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞衍生的细胞系)作为宿主细胞系(The GS Gene Expression System,Lonza Brochures,LonzaBiologics plc,Slough UK)。GS表达载体系统由Lonza Biologics提供。在实施例1-9和11中,改造CHO K1SV细胞以表达以一个臂识别VEGF-A且以另一个臂识别Ang2的双特异性单克隆抗体,抗Ang2/VEGF-CrossMab(抗A2V；凡努昔珠单抗,或RG7221；描述于WO2011/117329)(Schaefer et al.,2011；Fenn et al.,2013)。在实施例10中,改造CHO K1SV细胞以表达抑制CSF-1受体(CSF-1R)活化的人源化单克隆抗体(抗CSF-1R；依米妥珠单抗,或RG7155；描述于WO 2011/070024)(Ries et al.,2014)。集落刺激因子1(CSF-1)和它的受体CSF-1R调节巨噬细胞和它们的前体的迁移,分化,和存活(Hume and MacDonald,2012)。
在所有情况中,使用商品化,无血清,化学成分明确的CD CHO AGTTM培养基基础培养基(Thermo Fisher Scientific,Formula No.A15649)来培养CHO K1SV细胞。在融化后,以3-4天日程表在摇瓶中在50μM甲硫氨酸亚氨砜(MSX；Bedford Laboratories,Bedford,Ohio)存在下在这种培养基中传代细胞。传代条件为36.5℃,7％CO2,和160rpm,125mL和500mL烧瓶,使用Kuhner Shaker X平台(Adolf Kühner AG,Birsfelden,Basel,Switzerland)。
在没有MSX的情况下以约3.0x105个细胞/mL使用培养的细胞来接种N-1步骤。在没有MSX的情况下以约6.0x105个细胞/mL接种生产生物反应器。以预先限定的pH,溶解氧,温度和营养物补料策略在补料-分批培养条件下在生产生物反应器中培养细胞。采用具有1.2L的初始培养体积的2L生物反应器,除非另外注明。
生物反应器中的温度控制于36.5℃,且搅拌器速度设置为约213rpm。提供含有空气,CO2,和O2的气体混合物。一天一次离线测量溶解二氧化碳浓度(dCO2)。在线控制溶解氧浓度(DO)并通过改变气体混合物中的氧分压而调节至25％。pH通过添加CO2或1.0M NaHCO3而维持于限定的设定点,或在限定的死区内,除非另外注明。
补料培养基(在图中称作“补料-1”)和pH上移补料培养基(在图中称作“补料-2”)包括葡萄糖,谷氨酰胺,氨基酸,生长因子,核苷,维生素,痕量元素,和盐的组合。
补料培养基含有补料基础5培养基(目录号074-91011DW),补料基础2培养基(目录号074-91007MV),补料基础6培养基(目录号074-91012MW),极限必需培养基维生素(MEM100x,目录号074-91008BX),CD CHO AGTTM培养基(配方号A15649),和SPE(Lonza VerviersSprl,目录号BESP531F)。
pH上移补料培养基含有补料基础8培养基(目录号074-91013RW)和补料基础9培养基(目录号074-91014EW)。
补料培养基和pH上移培养基的配方自Lonza Verviers Sprl可得。
每天用注射器取得约10ml的样品用于离线分析。生产持续时间典型地持续约14天。
细胞分析和离线测量
使用CEDEX仪器(Roche Diagnostics GmbH,Germany)通过台盼蓝排除法测量细胞浓度和存活力。用COBAS
400plus(Roche Diagnostics GmbH,Germany)对葡萄糖,谷氨酰胺,谷氨酸盐,乳酸盐,铵,和产物浓度实施离线测量。
用Cobas b221分析仪(Roche Diagnostics Ltd.CH-6343Rotkreuz,Switzerland)分析溶解二氧化碳和氧。在Osmomat自动渗透压力计(Gonotec GmbH,Berlin,Germany)上通过凝固点降低测量渗透摩尔浓度。
实施例1:对照工艺-始终相同的pH(恒定的pH设定点)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数大约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和恒定pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。就是说,该工艺开始(第0天)于将大约6.0x105个细胞/mL接种入培养培养基(CD CHO培养基AGTTM培养基),如上文讨论的。
以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
在线pH设定点是7.00±0.05,使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠来维持。如果离线pH测量偏离在线测量达0.05个pH单位或更多的话,重新校准在线pH测量至等于离线pH测量。
每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图1图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。
实施例2:pH升降(144和192小时之间的Δ0.20)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图2A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。始于约144小时,pH设定点设置成在约48小时的时段里以pH升降逐渐自7.00升高至7.20。在约192小时,pH设定点达到pH7.20±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图2B-G图示在具有依照图2A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。图2B显示在14天生产工艺结束时,具有pH升降(144和192小时之间的ΔpH 0.20个单位)的工艺中的细胞存活力比没有此类pH升降的工艺要高。图2C显示在具有pH升降的工艺中乳酸盐水平在第4-5天之间达到约88％的高位,之后下降至约72％并维持在那里直至工艺结束。在工艺结束时与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成更低量的乳酸盐。图2D显示铵水平在大约100小时达到约80％的高位,然后下降至约20％并维持在那里直至工艺结束。与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成低得多量的铵。图2E显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的产物滴度比没有pH升降的工艺要高。图2F显示在具有pH升降的工艺中pCO2水平适度升高但维持在约18％以下直至工艺结束。与之对比,在没有pH升降的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和320小时之间。图2G显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH升降的工艺要低。
实施例3:pH升降(156和208小时之间的Δ0.20)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天期间连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天期间连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图3A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。始于约156小时,pH设定点设置成在约52小时的时段里以pH升降逐渐自7.00升高至7.20。在约208小时,pH设定点达到pH7.20±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图3B-G图示在具有依照图3A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图3B显示在14天生产工艺结束时,具有pH升降(156和208小时之间的ΔpH 0.20个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH升降的工艺要高。图3C显示在具有pH升降的工艺中乳酸盐水平在大约140小时达到约80％的高位,然后下降至约70％并维持在那里直至工艺结束。在工艺结束时与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成更低量的乳酸盐。图3D显示在具有pH升降的工艺中铵水平在大约110小时后达到约100％的高位,然后下降至约20％并维持在那里直至工艺结束。与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成低得多量的铵。图3E显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的产物滴度比没有pH升降的工艺要高。图3F显示在具有pH升降的工艺中pCO2水平适度升高但维持在约19％以下直至工艺结束。与之对比,在没有pH升降的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和320小时之间。图3G显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH升降的工艺要低。
实施例4:pH升降(192和240小时之间的Δ0.30)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图4A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。始于约192小时,pH设定点设置成在约48小时的时段里以pH升降逐渐自7.00升高至7.30。在约240小时,pH设定点达到pH7.30±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图4B-G图示在具有依照图4A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图4B显示在14天生产工艺结束时,具有pH升降(192和240小时之间的ΔpH 0.30个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH升降的工艺要高。图4C显示在具有pH升降的工艺中乳酸盐水平在大约140小时达到约90％的高位,然后下降至约60％,之后逐渐升高至工艺结束时的90％以下。在工艺结束时与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成更低量的乳酸盐。图4D显示在具有pH升降的工艺中铵水平在大约110小时达到约97％的高位,然后迅速下降至约28％,之后继续下降至工艺结束时约15％的低水平。与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成低得多量的铵。图4E显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的产物滴度比没有pH升降的工艺要高。图4F显示在具有pH升降的工艺中pCO2水平在200小时左右适度升高至大约24％,之后到工艺结束降低至少于15％。与之对比,在没有pH升降的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和320小时之间。图4G显示在工艺结束时,具有pH升降(192和240小时之间的ΔpH 0.30个单位)的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH升降的工艺要低。
实施例5:pH升降(192和240小时之间的Δ0.10)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图5A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。始于约192小时,pH设定点设置成在约48小时的时段里以pH升降逐渐自7.00升高至7.10。在约240小时,pH设定点达到pH7.10±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图5B-G图示在具有依照图5A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图5B显示在14天生产工艺结束时,具有pH升降(192和240小时之间的ΔpH 0.10个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH升降的工艺要高。图5C显示在具有pH升降的工艺中乳酸盐水平在大约110小时后达到约90％的高位,之后下降至约55％,然后逐渐升高至工艺结束时的约80％。在工艺结束时与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成更低量的乳酸盐。图5D显示在具有pH升降的工艺中,铵水平在大约110小时后达到约97％的高位,之后迅速下降至约27％,然后逐渐升高至工艺结束时约42％的水平。与没有pH升降的工艺相比pH升降设置生成更低量的铵。图5E显示在工艺结束时,具有pH升降的工艺中的产物滴度略微比没有pH升降的工艺要高。图5F显示在具有pH升降的工艺中pCO2水平在200小时左右适度升高至大约26％,之后到工艺结束降低至少于20％。与之对比,在没有pH升降的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和320小时之间。图5G显示在工艺结束时,具有pH升降(192和240小时之间的ΔpH 0.10个单位)的工艺中的培养物渗透摩尔浓度略微比没有pH升降的工艺要高。
实施例6:即刻pH上移(在144小时Δ0.20)
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图6A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。在约144小时,pH设定点以单个步骤自7.00升高至7.20及pH±0.05的相同死区并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图6B-G图示在具有依照图6A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图6B显示在14天生产工艺结束时,具有即刻pH上移(在144小时ΔpH0.20个单位)工艺中的细胞存活力与没有pH上移工艺中的细胞存活力相当。图6C显示在具有即刻pH上移的工艺中乳酸盐水平在大约200小时后达到约78％的高位,之后逐渐下降至工艺结束时的小于40％。在工艺结束时与没有pH上移的工艺相比即刻pH上移设置生成更低量的乳酸盐。图6D显示在具有即刻pH上移的工艺中,铵水平在大约110小时后达到约90％的高位,然后迅速下降至约20％,之后维持于这个低水平直至工艺结束。与没有pH上移的工艺相比即刻pH上移设置生成更低量的铵。图6E显示在工艺结束时,具有即刻pH上移的工艺中的产物滴度比没有pH上移的工艺要高。图6F显示在具有即刻pH上移的工艺中,pCO2水平到工艺结束逐渐且适度升高至大约26％。与之对比,在没有pH上移的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和320小时之间。图6G显示在工艺结束时,具有即刻pH上移的工艺中的培养物渗透摩尔浓度仅仅略微比没有pH上移的工艺要高。
实施例7:经由加宽pH死区的pH上移
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图7A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。在约144小时,pH设定点保持于7.00并将pH死区自±0.05加宽至±0.25。在约192小时,pH设定点自7.00升高至7.20并将死区恢复至±0.05。pH设定点维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图7B-G图示在具有依照图7A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图7B显示在14天生产工艺结束时,具有pH上移(144和192小时之间经由加宽pH死区的ΔpH 0.20个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH上移的工艺中的细胞存活力要高。图7C显示在具有pH上移的工艺中乳酸盐水平在大约240小时后达到约70％的高位,逐渐下降至工艺结束时的约45％。在工艺结束时与没有pH上移的工艺相比pH上移设置生成更低量的乳酸盐。图7D显示在具有pH上移的工艺中铵水平在大约110小时后达到约90％的高位,之后迅速下降至约22％,然后维持于22-32％直至工艺结束。与没有pH上移的工艺相比pH上移设置生成更低量的铵。图7E显示在工艺结束时,具有pH上移的工艺中的产物滴度比没有pH上移的工艺要高至少10％。图7F显示在具有pH上移的工艺中pCO2水平在140小时左右逐渐升高至大约16％,然后维持于这个水平直至工艺结束。与之对比,在没有pH上移的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和280小时之间。图7G显示在工艺结束时,具有pH上移的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH上移的工艺要低。
实施例8:增量式pH设定点升高
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图8A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。在约156小时,pH设定点升高至pH 7.05±0.05并维持12小时。在约168小时,pH设定点升高至pH 7.10±0.05并维持12小时。在约180小时,pH设定点升高至pH7.15±0.05并维持另一个12小时。最后,在约192小时,pH设定点升高至pH7.20±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图8B-G图示在具有依照图8A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图8B显示在14天工艺结束时,具有pH上移(156和192小时之间经由逐步pH设定点升高的ΔpH 0.20个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH上移的工艺中的细胞存活力要高。图8C显示在具有pH上移的工艺中,乳酸盐水平在大约140小时后达到约70％的高位,之后逐渐下降至工艺结束时的约58％。在工艺结束时与没有pH上移的工艺相比pH上移设置生成更低量的乳酸盐。图8D显示在具有pH上移的工艺中铵水平在大约116小时后达到约90％的高位,在约188小时后迅速下降至约25％,然后维持于21-24％直至工艺结束。与没有pH上移的工艺相比pH上移设置生成更低量的铵。图8E显示在工艺结束时,具有pH上移的工艺中的产物滴度比没有pH上移的工艺要高至少15％。图8F显示在pH上移的工艺中pCO2水平在210小时左右逐渐升高至大约17％,然后维持于这个水平直至工艺结束。与之对比,在没有pH上移的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和280小时之间。图8G显示在工艺结束时,具有pH上移的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH上移的工艺要低。
实施例9:增量式pH死区加宽
抗Ang2/VEGF细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图9A图示培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。在约152小时,pH死区加宽至±0.10并维持12小时。在约164小时,pH死区再次加宽至±0.15并维持12小时。在约176小时,pH死区加宽至±0.20并维持又一个12小时。在约188小时,pH死区加宽至±0.25并维持12小时。最后,在约200小时,pH设定点升高至pH 7.20±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图9B-G图示在具有依照图9A的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图1的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图9B显示在14天工艺结束时,具有pH上移(152和200小时之间经由逐步加宽pH死区的ΔpH 0.20个单位)的工艺中的细胞存活力比没有pH上移的工艺中的细胞存活力要高。图9C显示在具有pH上移的工艺中,乳酸盐水平在大约140小时后达到约80％的高位,逐渐下降至工艺结束时的约42％。与没有pH上移的工艺相比在具有pH上移设置的工艺中生成更低量的乳酸盐,特别是在工艺结束时。图9D显示在具有pH上移的工艺中铵水平在大约116小时后达到约90％的高位,之后在约190小时后迅速下降至约25％,然后维持于21-28％直至工艺结束。与没有pH上移的工艺相比在具有pH上移设置的工艺中生成更低量的铵。图9E显示在14天工艺结束时,具有pH上移的工艺中的产物滴度比没有pH上移的工艺要高约15％。图9F显示在具有pH上移的工艺中,pCO2水平在210小时左右逐渐升高至大约22％,然后维持于22-25％直至工艺结束。与之对比,在没有pH上移的工艺中观察到高得多的pCO2水平,特别是在160和280小时之间。图9G显示在工艺结束时,具有pH上移的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有pH上移的工艺要低。
实施例10:不同pH控制策略
抗CSF-1R细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,36.5℃,和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。采用0.25L生物反应器,初始培养体积0.2L。以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第1-3天连续添加至培养物。以溶液制备pH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第4-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第4-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图10A图示两种不同培养工艺的pH设定点和死区设置和补料日程表。
对于生产工艺#1,在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。始于约144小时,pH设定点设置成在约48小时内逐渐自7.00升高至7.20。在约192小时,pH设定点达到pH 7.20±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。
对于生产工艺#2,在线pH设定点最初使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持于7.00±0.05。在48小时时间点,pH设定点降低至6.80±0.05并维持于这个值直至240小时。始于约240小时,pH设定点设置成在约48小时内逐渐自6.80±0.05升高至7.00±0.05。在约288小时,pH设定点达到pH7.00±0.05并维持于这个值直至生产工艺结束。
每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
图10B-F图示在具有依照图10A工艺#1的pH设置的培养工艺(黑色方形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图10A工艺#2的pH设置的培养工艺(灰色菱形)比较。
图10B图示在两种培养工艺(工艺#1黑色方形；工艺#2灰色菱形)期间细胞存活力的差异。14天后,工艺#1(144和192小时之间的pH升降ΔpH 0.20个单位)中的细胞存活力比工艺#2要高。图10C显示在工艺#1中,乳酸盐水平在14天生产工艺结束时达到约68％。与没有依照本发明的pH上移的工艺相比在具有依照本发明的工艺的pH上移的工艺中生成更低量的乳酸盐。在工艺#2中有pH的升高,但是该工艺不牵涉包含于第一pH接种细胞和于第一pH培养细胞的第一培养阶段,继以其中于比第一pH要高的第二pH培养细胞的第二培养阶段。与工艺#1不同,工艺#2包含pH下移。图10D显示在工艺#1中,铵水平在115小时后达到约90％的高位,并下降至约15％,之后升高至生产工艺结束时的约80％。与没有依照本发明的pH上移的工艺相比在具有依照本发明的pH上移的工艺中生成更低量的铵。图10E显示在14天生产工艺结束时,来自工艺#1的抗CSF-1R产物滴度比工艺#2要高。图10F显示在工艺结束时,具有依照本发明的pH上移的工艺中的培养物渗透摩尔浓度比没有依照本发明的pH上移的工艺要低
实施例11:降低的温度
抗Ang2/VEGF表达性CHO KSV细胞在摇瓶中生长和传代数次。生产发酵运行始于初始细胞计数约6.0x105个细胞/mL,初始温度36.5℃和pH设定点7.00及死区±0.05个pH单位。
以溶液制备补料培养基并以范围为约2.0至约3.0重量％的初始培养物重量每天的量在第3-6天连续添加至培养物。
以溶液制备PH上移补料培养基并以范围为约0.5至约1.5重量％的初始培养物重量每天的量在第7-14天连续添加至培养物。制备另外的葡萄糖补料溶液并在第7-14天期间连续添加至培养物以维持葡萄糖浓度于约≥3g/l。
图11A图示两种不同培养工艺的温度设置,pH设定点和死区设置,和补料日程表。
对于生产工艺A,对于工艺的整个持续时间,在线pH设定点使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持恒定于7.00±0.05。对于工艺的整个持续时间,温度维持恒定于36.5℃。
对于生产工艺B,对于工艺的整个持续时间,在线pH设定点使用二氧化碳气体注入或通过添加1M碳酸钠维持恒定于7.00±0.05。温度最初维持于36.5℃。在约144小时,温度降低至34.0℃,并维持于这个值直至生产工艺结束。
每天自培养物取得工艺样品并分析要求的参数。
使用Cedex HiRes分析仪(Material Number:05650216001,Roche DiagnosticsGmbH,Germany)用台盼蓝染料排除测量可存活细胞密度(VCD)。使用下面的方程计算可存活细胞密度积分(IVCD):
其中t＝培养持续时间且VCD＝可存活细胞密度。
在主要培养生产工艺结束时,经由离心收集细胞培养液。将上清液提交进一步的使用蛋白A的小规模纯化。
使用与具有2AB标记的N-聚糖的ESI-MS偶联的RP-HPLC分析纯化的抗体的糖基化样式(Chen and Flynn,2007)。
图11B-G图示在具有依照图11A工艺A的pH设置的培养工艺(灰色菱形)期间对细胞存活力,乳酸盐浓度,铵浓度,产物滴度,pCO2,和渗透摩尔浓度的影响,与具有依照图11A工艺B的pH设置的培养工艺(黑色方形)比较。
图11B图示在两种培养工艺(工艺A灰色菱形；工艺B黑色方形)期间细胞存活力的差异。14天后,工艺A(恒定的36.5℃温度)中的细胞存活力略微比工艺B(在144小时温度自36.5℃下移至34.0℃)要低。图11C显示在工艺A中乳酸盐水平在14天生产工艺结束时达到约34％,而在相同时间点在工艺B中生成100％的乳酸盐水平。图11D显示在工艺A中铵水平在115小时后达到约97％的高位,并下降至约33％,之后升高至生产工艺结束时的约72％。与之对比,在相同时间点在工艺B中生成高达约85％的铵水平。图11E显示在14天工艺结束时,工艺A中的产物滴度比工艺B要高约20％。图11F显示在工艺A中pCO2水平在200小时左右升高至大于29％,然后维持于这个高水平直至工艺结束。在工艺B中pCO2水平在200小时左右升高至大于29％,维持于这个高水平直至260小时左右,然后降低至工艺结束时的6％左右。图11G显示在工艺结束时,工艺A中的培养物渗透摩尔浓度略微比工艺B要低。
36.5℃至约34.0℃的温度移变改变由细胞生成的抗Ang2/VEGF-CrossMab的质量。例如,G0F抗体的含量提高约3％且G1F结构显示一些变化(图12)。通过维持实质性恒定的温度在本发明的方法中可有利地避免与由温度移变引起的产物质量的变化有关的问题。
36.5℃至约34.0℃的温度移变降低积分可存活细胞密度(IVCD),其是细胞性能的一项指标且一般与最终产物滴度有关。虽然培养温度降低可改善细胞的最终存活力,但是它也引起IVCD降低和产物滴度降低的问题(表1)。通过维持温度于实质性恒定的值在本文中公开的工艺中可有利地避免这些问题。
表1
| 最终存活力 | IVCD(10<sup>5</sup>个细胞/ml/小时) | |
| 工艺A(36.5℃) | 73.6％ | 21942.6 |
| 工艺B(36.5→34.0℃) | 75.4％ | 19081.2 |
表2:实验结果汇总
参考文献
上文引用了多份出版物以更加全面地描述和公开本发明和本发明所属领域的现状。下文提供了这些参考文献的完整引用。将这些参考文献每一篇完整收入本文。
对于标准分子生物学技术,见Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,ALaboratory Manual.3 ed.2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press
Aggarwal 2011 Nature Biotechnology 29:1083-1089
Altamirano et al.,2000 Biotechnol Progr 16:69-75
Altamirano et al.,2001 Biotechnology and Bioengineering 76(4):351-360
Altamirano et al.,2004 J Biotechnology 110(2):171-179
Altamirano C.et al.,2006J Biotechnol 125:547-556
Andersen and Goochee 1995Biotechnol Bioeng 47(1):96-105
Borys et al.,1993 Biotechnology 11:720-724
Borys et al.,1994 Biotechnol Bioeng 43(6):505-514
Chen and Flynn 2007 Analytical biochemistry 370(2):147-161
Chen K.et al.,2001 Biotechnol Bioeng 72:55-61
Cherlet and Marc 1999 Cytotechnology 28:213-227
deZengotita et al.,1998 Cytotechnology 28:213-227
deZengotita et al.,2002 Biotechnol Bioeng 77:369-380
Fenn et al.,2013 PLoS ONE 8(4):e61953
Fogolin et al.,2004 J Biotechnol 109:179-191
Gawlitzek et al.,2000 Biotechnol Bioeng 68(6):637-646
Gomez et al.,2010 Biotechnology Progress 26(5):1438-1445
Goudar et al.,2007 Biotechnol Bioeng 96(6):1107-1117
Hassell et al.,1991 Appl Biochem Biotechnol 30:29-41
Hayter et al.,1991 Appl Microbiol Biotechnol 34(5):559-564
Hume and MacDonald 2012 Blood 119:1810-1820
Irani et al.,1999 Biotechnol Bioeng 66:238-246
Kienast et al.,2013 Clinical Cancer Research 19(24):6730-6740
Kim and Lee 2007a Appl Microbiol Biotechnol 74:152-159
Kim and Lee 2002 J Biotechnol 95(3):237-248
Kim and Lee 2007b Appl Microbiol Biotechnol 76:659-665
Kim et al.,2012 Appl Microbiol Biotechnol 93(3):917-930
Kimura and Miller 1997 Biotechnol Prog 13:311-317
Lao and Toth 1997 Biotechnol Prog 13:688-691
Leader et al.,2008 Nature Reviews Drug Discovery 7:21-39
Li et al.,2006 Biotech Prog 22:696-703
Lonza Biologics plc Slough UK.2009.The GS Gene Expression System,Lonza Brochures,http://www.lonza.com/group/en/products services/custommanufacting/mammalian/geneexpressions.html.
Maranga and Goochee 2006 Biotechnol Bioeng 94:139-150
Michaels et al.,1995a Biotechnol Bioeng 47:407-419
Michaels 1995b Biotechnol Bioeng 47:420-430
Mostafa and Gu 2003 Biotechnol Prog 19(1):45-51
Oguchi et al.,2006 Cytotechnology 52:199-207
Omasa et al.,2010 Pharm Biotechnol 11(3):233-240
Ozturk et al.,1992 Biotechnol Bioeng 39:418-431
Paredes et al.,1999 Cytotechnology 30:85-93
Ries et al.,2014 Cancer Cell 25(6):846-859
Schaefer et al.,2011 Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-11192
Schmelzer et al.,2000 Biotechnol Bioeng 67(2):189-196
Schmelzer and Miller 2002 Biotechnol Prog 18:346-353
Trummer et al.,2006 Biotechnology and Bioengineering 94(6):1045-1052
Whitford 2006 Bioprocess International 30-40,April 2006
Wlaschin and Hu 2007 J Biotechnol 131:168-176
Xie and Wang 1993 Biotechnol Bioeng 43:1175-1189
Yang and Butler 2000 Biotechnol Bioeng 68:370-380
Yeo et al.,2006 Biotechnol Lett 28:1445-1452
Yoon et al.,2005 Biotechnol Bioeng 22:345-356
Yuk et al.,2014 Biotechnology Progress 30(2):429-442
Zanghi et al.,1999 Biotechnol Bioeng 65(2):182-191
Zhang et al.,2004 J Chem Technol Biotechnol 79:171-181
Zhou et al.,1995 Biotechnology and bioengineering 46(6):579-587
Zhou et al.,2011 J Biotechnol 153:27-34
Zhu et al.,2005 Biotechnol Prog 21:70-77
Zhu 2012 Biotechnol Adv 30(5):1158-1170
专利引用
US20140051124,US8470552,US8765413,WO 2008/033517,WO 2011/070024,WO2011/117329
下面的陈述涉及本公开的各个方面,而且形成说明书的一部分。
1.一种用于培养哺乳动物细胞的补料-分批方法,该方法包含
第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基并于第一pH培养细胞；和
第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
2.一种用于培养哺乳动物细胞的补料-分批方法,其包含使用pH设定点控制pH,该方法包含
第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基并于第一pH培养细胞,其中在第一培养阶段中pH设定点维持于第一pH；
和
第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞,其中在第二培养阶段中设定点维持于第二pH；
且其中第二pH比第一pH要高至少0.1个pH单位,且其中第二培养阶段具有至少6小时的持续时间。
3.依照前述陈述任一项的方法,其中第二培养阶段具有至少3天的持续时间。
4.依照前述陈述任一项的方法,其中该方法的温度维持在±0.5℃内。
5.依照前述陈述任一项的方法,其中任选地第一pH是范围6.5-7.5中的值,且其中
a.第二pH比第一pH要高至少0.1个pH单位；
b.第二pH比第一pH要高约0.1至0.5个pH单位；或
c.第二pH比第一pH要高约0.2个pH单位。
6.依照前述陈述任一项的方法,其中
a.第一pH是约7.0；且
b.第二pH是约(i)pH 7.1；(ii)pH 7.2；(iii)pH 7.3；(iv)pH 7.4；(v)pH 7.5；
或(vi)7.1-7.5,
或其中
a.第一pH是7.0±0.05；且
b.第二pH是(i)pH 7.1±0.05；(ii)pH 7.2±0.05；(iii)pH 7.3±0.05；(iv)pH
7.4±0.05；(v)pH 7.5±0.05；或(vi)7.1-7.5±0.05。
7.依照前述陈述任一项的方法,其包含使用pH设定点控制pH,其中
在第一培养阶段中设定点设置为第一pH,且
在第二培养阶段中设定点设置为第二pH。
8.依照陈述7的方法,其中设定点或是(a)逐渐或是(b)即刻自第一pH升高至第二pH。
9.依照陈述8的方法,其中设定点逐渐自第一pH升高至第二pH,且其中或是(a)设定点连续升高或是(b)设定点以一系列离散步骤升高。
10.依照前述陈述任一项的方法,其中pH在约24-72小时的时段里逐渐自第一pH升高至第二pH。
11.依照前述陈述任一项的方法,其包含将pH上移补料培养基添加至培养培养基。
12.依照陈述7至11任一项的方法,其中设定点具有±0.05个pH单位的死区。
13.依照前述陈述任一项的方法,其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
14.依照前述陈述任一项的方法,其是用于生成产物的方法,其中产物是由哺乳动物细胞表达的,其中任选地哺乳动物细胞是重组细胞,且其中产物是重组蛋白。
15.依照陈述14的方法,其中产物是(a)抗体；(b)凡努昔珠单抗；或(c)依米妥珠单抗。
16.依照陈述14至15任一项的方法,其包含分离产物的步骤,和任选地制备包含产物的组合物的步骤。
17.通过陈述16的方法生成的产物或组合物。
18.依照前述陈述任一项的方法,其中在第0天将哺乳动物细胞接种入培养培养基,且其中第10-18天任一包含收获步骤,其包含通过收获细胞和/或产物来终止该方法。
19.依照前述陈述任一项的方法,其包含收获步骤,其中通过收获细胞和/或产物来终止该方法,且在收获步骤时:
a.细胞存活力比对照方法要高至少20％；
b.乳酸盐水平比对照方法要低至少20％；
c.铵水平比对照方法要低至少40％；和/或
d.产物滴度比对照方法要高至少5％；
其中对照方法与该陈述中公开的方法相同,只是第二培养阶段包含于第一pH培养细胞。
20.一种用于培养哺乳动物细胞的方法,该方法包含
第一培养阶段,包含于第一pH培养细胞；和
第二培养阶段,包含于第二pH培养细胞,其中第二pH比第一pH要高,
其中该方法的温度维持于实质性恒定的值。
21.一种用于培养哺乳动物细胞的方法,该哺乳动物细胞能够表达抗体,该方法包含
第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基和于第一pH培养细胞；和
第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞。
22.pH上移补料培养基或pH升高剂用于在如前述陈述任一项中列出的用于培养哺乳动物细胞的方法中
a.提高哺乳动物细胞培养物中的产物滴度,其中产物是在哺乳动物细胞中表达的；
b.提高哺乳动物细胞培养物中的细胞存活力；
c.延长哺乳动物细胞培养物的寿命；
d.降低哺乳动物细胞培养物中的乳酸盐积累；
e.降低哺乳动物细胞培养物中的铵积累；
f.改善哺乳动物细胞培养物中的pCO2概况；
g.降低哺乳动物细胞培养物中的渗透摩尔浓度的用途,其中将pH上移补料培养基或pH升高剂添加至哺乳动物细胞培养物以将pH自第一pH提高至第二pH。
Claims (16)
1.一种用于培养哺乳动物细胞的补料-分批方法,其包含使用pH设定点控制pH,该方法包含
第一培养阶段,包含将哺乳动物细胞接种入于第一pH的培养培养基并于第一pH培养细胞,其中在第一培养阶段中pH设定点维持于第一pH；和
第二培养阶段,包含于比第一pH要高的第二pH培养细胞,其中在第二培养阶段中设定点维持于第二pH；
且其中第二pH比第一pH要高至少0.1个pH单位,且其中第二培养阶段具有至少6小时的持续时间。
2.依照权利要求1的方法,其中第二培养阶段具有至少3天的持续时间。
3.依照权利要求1或权利要求2的方法,其中该方法的温度维持在±0.5℃内。
4.依照前述权利要求任一项的方法,其中第一pH是范围6.5-7.5中的值且:
a.第二pH比第一pH要高0.1至0.5个pH单位；或
b.第二pH比第一pH要高0.2个pH单位。
5.依照前述权利要求任一项的方法,其中
a.第一pH是约7.0；且
b.第二pH是约(i)pH 7.1；(ii)pH 7.2；(iii)pH 7.3；(iv)pH 7.4；(v)pH 7.5；或(vi)7.1-7.5。
6.依照前述权利要求任一项的方法,其中设定点或是(a)逐渐或是(b)即刻自第一pH升高至第二pH。
7.依照前述权利要求任一项的方法,其中设定点逐渐自第一pH升高至第二pH,且其中或是(a)设定点连续升高或是(b)设定点以一系列离散步骤升高。
8.依照前述权利要求任一项的方法,其中pH在约24-72小时的时段里逐渐自第一pH升高至第二pH。
9.依照前述权利要求任一项的方法,其包含将pH上移补料培养基添加至培养培养基。
10.依照前述权利要求任一项的方法,其中设定点具有±0.05个pH单位的死区。
11.依照前述权利要求任一项的方法,其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
12.依照前述权利要求任一项的方法,其是用于生成产物的方法,其中产物是由哺乳动物细胞表达的,其中任选地哺乳动物细胞是重组细胞,且其中产物是重组蛋白。
13.依照权利要求12的方法,其中产物是(a)抗体；(b)凡努昔珠单抗(vanucizumab)；或(c)依米妥珠单抗(emactuzumab)。
14.依照权利要求12至13任一项的方法,其包含分离产物的步骤,和任选地制备包含产物的组合物的步骤。
15.通过权利要求14的方法生成的产物或组合物。
16.pH上移补料培养基或pH升高剂用于在如前述权利要求任一项中列出的用于培养哺乳动物细胞的方法中
a.提高哺乳动物细胞培养物中的产物滴度,其中产物是在哺乳动物细胞中表达的；
b.提高哺乳动物细胞培养物中的细胞存活力；
c.延长哺乳动物细胞培养物的寿命；
d.降低哺乳动物细胞培养物中的乳酸盐积累；
e.降低哺乳动物细胞培养物中的铵积累；
f.改善哺乳动物细胞培养物中的pCO2概况；
g.降低哺乳动物细胞培养物中的渗透摩尔浓度的用途,其中将pH上移补料培养基或pH升高剂添加至哺乳动物细胞培养物以将pH自第一pH提高至第二pH。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5705364A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| WO2002016584A2 (en) * | 2000-08-23 | 2002-02-28 | Pfizer Products Inc. | Process for the preparation of neutrophil inhibitory factor |
| AU2005293578A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for production of a compound in a eukaryotic cell |
| CN101180396A (zh) * | 2004-10-15 | 2008-05-14 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 在真核细胞中生产化合物的方法 |
| CN101663390A (zh) * | 2006-09-13 | 2010-03-03 | 艾博特公司 | 细胞培养改良 |
| WO2013114164A1 (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-08 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content |
| WO2015128785A1 (en) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | Amec Foster Wheeler North America Corp. | Pulse cleaning filter system arrangement |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI384069B (zh) | 2004-08-27 | 2013-02-01 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | 多胜肽之製法 |
| DE102005046225B4 (de) * | 2005-09-28 | 2012-01-05 | Cellca Gmbh | Verbessertes Zellkulturmedium |
| US8178318B2 (en) | 2008-08-06 | 2012-05-15 | Praxair Technology, Inc. | Method for controlling pH, osmolality and dissolved carbon dioxide levels in a mammalian cell culture process to enhance cell viability and biologic product yield |
| US8470552B2 (en) | 2009-10-12 | 2013-06-25 | Keck Graduate Institute | Strategy to reduce lactic acid production and control PH in animal cell culture |
| PE20121398A1 (es) | 2009-12-10 | 2012-10-26 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos ligantes preferentemente al dominio extracelular 4 de csf1r humano |
| AR080794A1 (es) | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2 |
| EP2563906B1 (en) | 2010-04-26 | 2017-11-08 | Novartis AG | Process for cultivation of cho cells |
| GB201106225D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| WO2012147048A2 (en) | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Biocon Research Limited | Methods for reducing accumulation of lactate during culturing and method for producing polypeptide |
| SG11201601681QA (en) | 2013-10-11 | 2016-04-28 | Regeneron Pharma | Metabolically optimized cell culture |
| WO2015128795A1 (en) * | 2014-02-25 | 2015-09-03 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Process for modifying galactosylation and g0f content of a glycoprotein composition by glutamine supplementation |
| WO2017051347A2 (en) | 2015-09-23 | 2017-03-30 | Pfizer Inc. | Cells and method of cell culture |
-
2018
- 2018-11-29 CN CN201880076383.7A patent/CN111406112A/zh active Pending
- 2018-11-29 US US16/763,772 patent/US20200385673A1/en active Pending
- 2018-11-29 EP EP18811260.1A patent/EP3717656B1/en active Active
- 2018-11-29 JP JP2020528927A patent/JP7471220B2/ja active Active
- 2018-11-29 WO PCT/EP2018/083025 patent/WO2019106097A1/en unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5705364A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
| WO2002016584A2 (en) * | 2000-08-23 | 2002-02-28 | Pfizer Products Inc. | Process for the preparation of neutrophil inhibitory factor |
| AU2005293578A1 (en) * | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Method for production of a compound in a eukaryotic cell |
| CN101180396A (zh) * | 2004-10-15 | 2008-05-14 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 在真核细胞中生产化合物的方法 |
| CN101663390A (zh) * | 2006-09-13 | 2010-03-03 | 艾博特公司 | 细胞培养改良 |
| WO2013114164A1 (en) * | 2012-01-30 | 2013-08-08 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content |
| WO2015128785A1 (en) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | Amec Foster Wheeler North America Corp. | Pulse cleaning filter system arrangement |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MATTHISA BRUNNER等: "The impact of pH inhomogeneities on CHO cell physiology and fed-batch process performance – two-compartment scale-down modelling and intracellular pH excursion", 《BIOTECHNOLOGY JOURNAL》, vol. 12, no. 7, pages 1600633, XP055460923, DOI: 10.1002/biot.201600633 * |
| SI-QI QIU等: "Tumor-associated macrophages in breast cancer: Innocent bystander or important player?", 《CANCER TREATMENT REVIEWS》, vol. 70, no. 2018, pages 178 - 189, XP085528408, DOI: 10.1016/j.ctrv.2018.08.010 * |
| W. M. MILLER等: "A Kinetic Analysis of Hybridoma Growth and Metabolism in Batch and Continuous Suspension Culture: Effect of Nutrient Concentration, Dilution Rate, and pH", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》, vol. 32, 31 October 1988 (1988-10-31), pages 947 - 956 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3717656C0 (en) | 2024-03-13 |
| JP7471220B2 (ja) | 2024-04-19 |
| JP2021503916A (ja) | 2021-02-15 |
| EP3717656B1 (en) | 2024-03-13 |
| US20200385673A1 (en) | 2020-12-10 |
| WO2019106097A1 (en) | 2019-06-06 |
| EP3717656A1 (en) | 2020-10-07 |
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