TW202309087A - 製備spesolimab之方法 - Google Patents

製備spesolimab之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202309087A
TW202309087A TW111116568A TW111116568A TW202309087A TW 202309087 A TW202309087 A TW 202309087A TW 111116568 A TW111116568 A TW 111116568A TW 111116568 A TW111116568 A TW 111116568A TW 202309087 A TW202309087 A TW 202309087A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
spesolimab
cells
antibody
bpg
cell culture
Prior art date
Application number
TW111116568A
Other languages
English (en)
Inventor
湯瑪士 武雀爾芬尼格
瑞可 立普曼
Original Assignee
德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 filed Critical 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
Publication of TW202309087A publication Critical patent/TW202309087A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本發明係關於一種製備抗-IL36R抗體spesolimab之方法。更具體言之，本發明係關於一種在減少銅及增加鐵濃度之存在下，用無血清細胞培養基在饋料批次培養中製備spesolimab之方法。此外，本發明係關於一種包含低含量之spesolimab之鹼性種類及/或低含量之具有高甘露糖結構之spesolimab種類之組合物。

Description

製備SPESOLIMAB之方法
本發明係關於一種製備抗-IL36R抗體spesolimab之方法。更具體言之，本發明係關於一種在存在減少銅及增加鐵濃度下用無血清細胞培養基在饋料批次培養中製備spesolimab之方法。此外，本發明係關於一種包含低含量之spesolimab之鹼性種類及/或低含量之具有高甘露糖結構之spesolimab種類之組合物。
重組單株抗體(mAb)通常在哺乳動物細胞培養中表現。所收成抗體含有在諸如電荷及大小之性質上不同的產物變體，亦稱為產物異質性。異質性之主要來源為於細胞培養期間發生之轉譯後修飾及降解。通常藉由過濾及層析之數個步驟來純化抗體。然而，透過下游處理去除所有異質性並不實用。因此，於細胞培養步驟期間發生之修飾及降解於最終產物品質上具有最顯著影響。由於轉譯後修飾所致之異質性可於單株抗體之產物品質、安全性及功效上具有影響。主要品質屬性包括醣基化、電荷變體(鹼性及酸性種類，諸如氧化、脫醯胺化及C端及N端修飾之種類)、聚集物及低分子量種類(LMW)。上游過程於包括轉譯後修飾及其他修飾之抗體之產物特性上具有強大影響，且此等可在個別抗體與細胞系之間變化。用於生物醫藥製備之最廣泛使用的細胞系最初衍生自中國倉鼠卵巢(CHO細胞)且目前大多數重組單株抗體係在饋料批次培養中產生。
抗-IL-36受體(IL-36R)抗體spesolimab降低或阻斷由IL-36配體介導之信號傳導且可用於治療與此種信號傳導相關之疾病或病狀。
介白素36 (IL-36)為IL-1家族中具有促發炎效應之細胞介素組。IL-36家族有四個成員 - IL-36α (IL-1F6)、IL-36β (IL-1F8)、IL-36γ (IL-1F9)及IL-36Ra (IL-1F5)，其全部結合至IL-36R (先前稱為IL-1Rrp2)從而與IL-1RAcP形成異二聚體。IL-36R配體參與許多疾病病狀且抗-IL-36R抗體spesolimab可有效治療發炎疾病及自體免疫疾病，諸如發炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(Crohn’s disease；CD)、潰瘍性結腸炎(UD)、異位性皮膚炎(AtD)、掌蹠膿疱症(PPP)及廣泛性膿疱型牛皮癬(GPP)。
上游製程及參數於抗體之產品特性上具有強大影響，其包括細胞培養基及處理步驟，諸如溫度及接種密度。細胞培養基必須滿足在技術系統中於懸浮液中培養之哺乳動物細胞對比於其天然來源之複雜營養需求。
細胞培養基主要由能量來源(諸如碳水化合物或胺基酸)、脂質、維生素、微量元素、鹽、生長因子、聚胺及非營養組分(諸如緩衝液、表面活性劑或消泡劑)組成。用於饋料批次培養中之培養基可分為兩個子組：製程培養基(P-培養基)或基礎培養基及饋料培養基(F-培養基)。基礎培養基含有初始濃度之所有必需組分且用於接種。在培養過程期間，饋料培養基主要提供高濃度之營養素。因此，細胞培養基為許多不同化合物之複雜組合物且識別導致改良之生長、生產力或產物品質之化合物係一項挑戰。微量金屬促進CHO細胞培養中為最佳mAb生產力及品質(包括乳酸消耗、能量代謝、生產力及產物品質)所必需的各種細胞內及細胞外功能。在細胞培養基中常用的微量金屬為鐵、銅、鋅及錳，其傳統上與胎牛血清一起添加且批次間變異性(lot-to-lot variability)導致可變結果。在化學定義的培養基中，微量元素及營養素係以限定濃度供應且微量金屬之任何缺少或過量可影響細胞培養性能諸如細胞生長或存活率以及生產力及產物品質。例如，長期已知鋅缺乏誘導哺乳動物細胞之早期死亡。已顯示鎂及鈣缺乏誘導CHO細胞中之凋亡且已顯示銅缺乏影響CHO細胞中之乳酸代謝(Graham R. J.、Bhatia H.、Yoon S.，Biotechnology and Bioengineering，2019，116: 3446-3456)。已進一步報告過量的銅展現mAb生產力之增加，但亦展現鹼性電荷變體之增加。因此，仍需要進一步改良培養條件以改良產物品質而不嚴重影響產率。
在本發明中，吾人提供一種允許抗體spesolimab之高效且有效之製備過程之方法，其產生具有某些產物特性之抗體，諸如低鹼性種類及低含量之具有甘露糖5結構之種類。
因此，本發明提供一種在細胞培養中製備抗體spesolimab之方法，其包括(a)使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培養包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括(i)將該等細胞接種於培養基中，及(ii)將該等細胞於允許在細胞培養中製備抗體spesolimab之條件下於培養基中培養，該細胞培養包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞，其中在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將Cu 2+以0.35至1.2 µM及鐵以1500 µM或更多添加至培養基；(b)收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及(c)視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。較佳地，在步驟(i)中接種之前及/或在接種後1天內將Cu 2+及鐵添加至培養基。在一個實施例中，將Cu 2+及/或鐵以一或多個推注添加(bolus additions)或連續地添加至培養基。該一或多個推注添加包括對基礎培養基提供Cu 2+及/或鐵。在某些實施例中，將編碼抗體spesolimab之核酸穩定整合至CHO基因組中。該方法包括用饋料培養基饋養該等細胞。在某些實施例中，從培養的第0天至第3天開始，較佳從第1天至第3天，更佳從第1天至第2天，甚至更佳在第1天開始，添加饋料培養基。在本發明之方法中，該培養基中之增加之鐵濃度及/或減少之銅濃度導致製備具有減少之鹼性峰群組(BPG)%之抗體spesolimab。在某些較佳實施例中，藉由根據本發明之方法製備的抗體spesolimab具有≤ 7.5% BPG。
該等方法可進一步包括調適接種密度。在某些實施例中，步驟(a)中之接種密度為≥0.7x10 6個細胞/ml，較佳0.7x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，更佳0.8x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，甚至更佳0.9x10 6個細胞/ml至1.3x10 6個細胞/ml。增加之接種密度導致製備具有降低之BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。該方法可進一步包括調適培養溫度及/或溶解氧濃度，其中增加之培養溫度及/或減少之溶解氧(DO)導致製備具有降低之BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。在某些實施例中，在36.0℃至37.5℃下於允許製備抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括用饋料培養基饋養細胞，及/或其中該培養中之溶解氧濃度維持在30至60%之範圍內。在某些實施例中，該抗體spesolimab具有少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，及/或≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG、≤ 7%之BPG，較佳≤ 6%之BPG。
雖然任何CHO細胞可用於根據本發明之方法中，但示例性CHO細胞為CHO-K1及CHO-DG44細胞。
在另一個態樣中，提供一種在細胞培養中製備抗體spesolimab之方法，其包括(a)使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培養包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括(i)將該等細胞以≥0.7x10 6個細胞/ml之細胞密度接種於培養基中，及(ii)將該等細胞於允許在細胞培養中製備抗體spesolimab之條件下於培養基中培養，該細胞培養包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞，其中視需要在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將Cu 2+以0.35至1.2 µM及鐵以1500 µM或更多添加至培養基；(b)收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及(c)視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。
本發明進一步關於一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab具有(a) ≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG；及/或(b)小於5%之Man5結構，較佳小於4%之Man5結構，更佳小於3%之Man5結構；及/或(c)重鏈(HC)及/或離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)之小於3%之離胺酸糖基化變體未經糖基化且在K23 (HC)處之糖基化小於0.3%。
本發明進一步關於一種包含抗體spesolimab之組合物，其中該抗體spesolimab係藉由根據本發明之方法來獲得。
包含抗體spesolimab之組合物可為收成細胞培養流體(HCCF)、親和力捕獲池、藥物物質或藥物產品，較佳為藥物物質或藥物產品。較佳地，該組合物為包含具有小於7.5%之BPG及/或小於5%之Man5結構之抗體spesolimab之藥物產品。在某些實施例中，該組合物中之抗體spesolimab包含重鏈(HC)之≤ 6%之離胺酸糖基化變體及/或離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)未經糖基化且在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。
本發明進一步提供一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab具有重鏈(HC)中之≤ 3%之離胺酸糖基化變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)未經糖基化且在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。
一般實施例「包含(comprising)」或「包含(comprised)」涵蓋更具體實施例「由…組成」。此外，單數及複數形式不以限制性方式使用。
術語「細胞培養基」或「培養基」如本文所用為培養哺乳動物細胞之培養基，其包含含在較佳經緩衝之培養基中之最少量之必需營養素及組分，諸如維生素、微量元素、鹽、塊鹽(bulk salts)、胺基酸、脂質、碳水化合物。通常，哺乳動物細胞之細胞培養基具有約中性pH，諸如約6.5至約7.5，較佳約6.8至約7.3，更佳約7之pH。此類細胞培養基之非限制性實例包括市售培養基，如Ham´s F12 (Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640 (Sigma)、杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium) (DMEM；Sigma)、最低要求培養基(Minimal Essential Medium)(MEM；Sigma)、伊斯科夫氏改良杜北卡培養基(Iscove´s Modified Dulbecco´s Medium) (IMDM；Sigma)、CD-CHO (Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S(Invitrogen)、無血清CHO培養基(Sigma)及無蛋白質CHO培養基(Sigma)等以及來自諸如揭示於WO 2016/156476中之各種來源之專利培養基，該案之全部內容以引用之方式併入本文中。細胞培養基可為基礎細胞培養基。細胞培養基亦可為已添加饋料培養基及/或添加劑之基礎細胞培養基。若將該等細胞在發酵槽或生物反應器中培養，則細胞培養基亦可稱為發酵肉湯。
術語「細胞培育(cell cultivation)」或「細胞培養(cell culture)」包括在所有規模(例如從微量滴定板至大型工業生物反應器，亦即從次mL-規模至＞ 10,000 L規模)上、在所有不同製程模式(例如批次、饋料批次、灌注、連續培育)中、在所有製程控制模式(例如不受控制、完全自動化及受控制(在例如控制pH、溫度、氧含量下)之系統)中、在所有類型之發酵系統(例如單次使用系統、不鏽鋼系統、玻璃器皿系統)中之細胞培育及發酵製程。根據本發明，細胞培養為哺乳動物細胞培養且為饋料批次培養。在一個較佳實施例中，細胞培養為體積＞ 10 L、＞ 1,000 L、＞ 5000 L且更佳＞ 10,000 L之細胞培養。
術語「饋料批次」如本文所用係關於其中細胞連續地或週期性地用含有營養素之饋料培養基饋養之細胞培養。可在第0天開始細胞培養後不久或更通常在開始培養後一天、兩天或三天時開始該饋養。饋養可遵循預設時間表，諸如每天、每兩天、每三天等。或者，可監測該培養之細胞生長、營養素或毒性副產物且可相應地調整饋養。一般而言，經常每天確定以下參數且其涵蓋活細胞濃度、產物濃度(效價)及數種代謝產物，諸如葡萄糖、pH、乳酸鹽、渗透性(鹽含量之量度)及銨(負面影響生長速率且減少活生物質之生長抑制劑)。與批次培養(在無饋養下之培養)相比，在饋料批次模式中可達成更高產物效價。通常，饋料批次培養在某一時候停止且收成細胞及/或培養基並分離及/或純化所關注產物，諸如抗體spesolimab。通常維持饋料批次製程約2至3週，例如約10至24天、約12至21天、約12至18天，較佳約12至16天。
術語「基礎培養基」或「基礎細胞培養基」如本文所用為如下文所定義之用來培養哺乳動物細胞之細胞培養基。其係指其中從細胞培養運行開始培養細胞且不用作另一培養基之添加劑的培養基，儘管可將各種組分添加至該培養基。基礎培養基充當視需要可在培育(亦即產生細胞培養基之細胞培養運行)期間添加其他添加劑(或補充劑)及/或饋料培養基之基質。基礎細胞培養基係從細胞培育製程開始提供。一般而言，基礎細胞培養基提供營養素，諸如碳源、胺基酸、維生素、塊鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)、各種微量元素(例如鐵、銅、鋅及錳)、pH緩衝液、脂質及葡萄糖。通常僅在基礎培養基中提供主要塊鹽且在細胞培養中不可超過約280至350 mOsmo/kg之最終渗透性，使得細胞培養能夠在合理滲透應力下生長且繁殖。
術語「饋料」或「饋料培養基」如本文所用係關於用作哺乳動物細胞之培養中之饋料之營養素之濃縮物/經濃縮營養素組合物。其以「經濃縮饋料培養基」提供以最小化細胞培養之稀釋，通常，基於培養起始體積(CSV，意指第0天之起始體積)計，饋料培養基以10至50 ml/L/天，較佳以15至45 ml/L/天，更佳以20至35 ml/L/天提供於容器中。此對應於培養起始體積之約1至5%，較佳約1.5至4.5%，更佳約2至3%之每日添加。對於使用高密度接種或超高密度接種之培養，更高饋養速率可係有益的，諸如10至50 ml/L/天、15至45 ml/L/天或25至45 ml/L/天。此對應於培養起始體積之約1至5%、約1.5至4.5%、或約2.5至4.5%之每日添加。饋養速率應理解為饋養期內的平均饋養速率。饋料培養基通常具有較高濃度之基礎細胞培養基之大部分(但非全部)組分。通常，饋料培養基取代在細胞培養期間消耗的營養素，諸如胺基酸及碳水化合物，而鹽及緩衝液較不重要且通常以基礎培養基提供。微量元素亦通常主要以基礎培養基提供且可存在於饋料培養基中。饋料培養基通常以饋料批次模式添加至(基礎)細胞培養基/發酵肉湯。經(重複地或連續地)添加至基礎培養基之饋料培養基產生細胞培養基。饋料可以不同模式如連續或推注添加或經由與灌注有關的技術(恆化器(chemostat)或混合-灌注系統)添加。較佳地，饋料培養基係每天添加，但亦可更頻繁地(諸如每天兩次)或更低頻率地(諸如每隔一天)添加。更佳地，連續地添加饋料培養基。營養素之添加通常係在培育期間(亦即在第0天後)進行。與基礎培養基相反，饋料培養基通常由提供除「高渗透性活性化合物」諸如主要塊鹽(例如NaCl、KCl、NaHCO 3、MgSO 4、Ca(NO 3) 2)以外類似於基礎培養基之所有組分之經高度濃縮營養素溶液(例如＞ 6x)組成。通常，6x-倍濃縮物或更高倍之不含或具有減少之塊鹽之基礎培養基維持化合物之良好溶解度及足夠低之滲透性(例如270至1500 mOsmo/kg，較佳310至800 mOsmo/kg)以便將細胞培養中之滲透性維持在約270至550 mOsmo/kg，較佳維持在約280至450 mOsmo/kg，更佳維持在約280至350 mOsmo/kg。饋料培養基可作為一種完全饋料培養基添加或可包含一或多種分開添加至細胞培養之饋料補充劑。由於不同饋養時程，諸如定期饋養及通常針對葡萄糖添加進行之按需饋養，使用一或多種饋料補充劑可能係必要的，其因此通常至少亦以獨立饋料提供。由於某些化合物之低溶解度、某些化合物在不同pH下之溶解度及/或饋料培養基中之化合物在高濃度下之相互作用，故使用一或多種饋料補充劑亦可能係必要的。
術語「饋料補充劑」如本文所用係關於營養素之濃縮物，該濃縮物可在使用之前添加至饋料培養基或可與饋料培養基分開添加至基礎培養基及/或細胞培養基。因此，化合物可與饋料培養基或饋料補充劑一起提供或化合物可與饋料培養基及饋料補充劑一起提供。例如，半胱胺酸可以雙饋料策略(two-feed strategy)與饋料培養基及饋料補充劑一起添加。作為饋料培養基，「饋料補充劑」係以濃縮物提供以便避免稀釋細胞培養物。
細胞培養基(基底培養基及/或饋料培養基)較佳為無血清、化學定義的或化學定義且無蛋白質的。「無血清培養基」如本文所用係指用於活體外細胞培養之細胞培養基，其不含來自動物來源之血清。此係較佳的，因為血清可含有來自該動物之污染物，諸如病毒，且因為血清不明確且各批次之間不同。根據本發明之基礎培養基及饋料培養基為無血清。
術語「化學定義培養基」如本文所用係指適用於活體外細胞培養之細胞培養基，其中所有組分係已知的。更具體言之，其不包含任何補充劑，諸如動物血清或植物、酵母或動物水解產物。僅在已分析所有組分及其確切組成係已知的且可重複製備之情況下，其可包含水解產物。根據本發明之基礎培養基及饋料培養基較佳係化學定義的。化學定義的培養基可進一步包含重組蛋白質，諸如重組生長因子，特別是胰島素或類胰島素生長因子(IGF)。
「無蛋白質培養基」如本文所用係指用於活體外細胞培養之不包含蛋白質(由待培養細胞所產生的蛋白質除外)之細胞培養基，其中蛋白質係指任何長度之多肽，但排除單個胺基酸、二肽或三肽。具體而言，生長因子諸如胰島素及類胰島素生長因子(IGF)不存在於培養基中。較佳地，根據本發明之基礎培養基及饋料培養基為化學定義且無蛋白質的。
如本文所用，術語「培養基平臺(medium platform)」或「培養基平臺(media platform)」係由基礎細胞培養基(其係從細胞培養過程開始時提供)及在培育期間添加至該基礎細胞培養基之饋料培養基組成。視需要，可在細胞培育過程期間添加其他添加劑，諸如葡萄糖。饋料培養基可以任何種類之饋料批次製程模式(例如連續、利用變化之饋料速率或以推注饋料添加)供應。
術語「活力(vitality)」及「存活率(viability)」係同義地使用且係指細胞培養中之活細胞%，如藉由此項技術中已知的方法測定，例如基於自動化顯微鏡細胞計數(Roche Diagnostics，Mannheim)利用Cedex裝置來進行台盼藍(trypan blue)排除。然而，存在用於測定存活率之許多其他方法，諸如用於反映活細胞之能量代謝之螢光(諸如基於碘化丙啶)、量熱或酵素方法，例如使用LDH乳酸-脫氫酶或某些四唑鎓鹽(諸如阿爾瑪藍(alamar blue)、MTT (溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑鎓)或TTC (氯化四唑鎓))之方法。
術語「多肽」或「蛋白質」或「產物」或「產物蛋白質」或「胺基酸殘基序列」可互換使用。此等術語係指任何長度之胺基酸之聚合物，在本發明之背景內容中，較佳係指單株抗體，甚至更佳係指單株抗體spesolimab。此等術語亦包括透過包括(但不限於)醣基化、糖基化、乙醯化、磷酸化、氧化、醯胺化或蛋白質處理之反應轉譯後修飾之蛋白質或抗體。
術語「編碼(encodes)」及「編碼(codes for)」如本文所用廣泛地指其中使用聚合物大分子中之資訊來導引產生不同於第一分子之第二分子之任何過程。該第二分子可具有不同於該第一分子之化學性質之化學結構。例如，在一些態樣中，術語「編碼」描述半保守性DNA複製過程，其中雙股DNA分子之一個股用作模板以藉由DNA依賴性DNA聚合酶編碼新合成的互補姐妹股。在其他態樣中，DNA分子可編碼RNA分子(例如藉由使用DNA依賴性RNA聚合酶酵素之轉錄過程)。此外，RNA分子可編碼多肽，如在轉譯過程中。當用於描述轉譯過程時，術語「編碼」亦延伸至編碼胺基酸之三重密碼子。在一些態樣中，RNA分子可例如藉由併入RNA依賴性DNA聚合酶之逆轉錄過程來編碼DNA分子。在另一個態樣中，DNA分子可編碼多肽，其中應理解，「編碼」如在該情況下所用併入轉錄及轉譯過程。在本發明之背景內容中，術語「編碼抗體spesolimab之核酸」係指編碼具有抗體spesolimab之胺基酸序列(亦即重鏈及輕鏈)之多肽之DNA分子或序列。較佳地，將編碼抗體spesolimab之核酸穩定整合至CHO細胞之基因組中。
術語「spesolimab」如本文所用係指具有INN名稱spesolimab之人源化單株IgG1抗-IL-36R抗體，亦登錄在CAS登錄號2097104-58-8下。Spesolimab具有以下重鏈及輕鏈胺基酸序列： 重鏈(HC)胺基酸序列：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
輕鏈(LC)胺基酸序列：
Figure 02_image005
可變重鏈(VH)胺基酸序列：
Figure 02_image007
可變輕鏈(LC)胺基酸序列：
Figure 02_image009
術語「抗體spesolimab」如本文所用係指較佳藉由本發明之方法在CHO細胞培養中產生之抗體spesolimab，且因此係指具有特定程度之變體異質性之許多抗體分子。因此，熟習此項技術者將理解，其係指各種spesolimab種類(諸如彼等包含各種轉譯後修飾者，包括醣基化變體、電荷變體及糖基化變體或種類)之混合物。
術語「接種(seeding)」如本文所用係指收集哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)之樣本，且將其放置於含有生長所需的營養素之培養基中。通常，將哺乳動物細胞放置於基礎培養基中以用於生長或產生。此步驟亦可稱為接種(inoculating)。哺乳動物細胞可以不同接種密度接種至基礎培養基中。如本文所指，術語「正常接種」係指約0.7 x 10 6個細胞/ml至約1 x 10 6個細胞/ml之標準接種密度，術語「高接種」係指大於1 x 10 6個細胞/ml至約4 x 10 6個細胞/ml之接種密度及術語「超高接種」係指大於4 x 10 6個細胞/ml至約20 x 10 6個細胞/ml或甚至更大，較佳約6 x 10 6個細胞/ml至約15 x 10 6個細胞/ml，更佳8 x 10 6個細胞/ml至約12 x 10 6個細胞/ml之接種密度。根據本發明，CHO細胞較佳以≥ 0.7 x 10 6個細胞/ml接種。在某些實施例中，CHO細胞係以0.7 x 10 6個細胞/ml至約2 x 10 6個細胞/ml，較佳以0.7 x 10 6個細胞/ml至約1.5 x 10 6個細胞/ml，更佳以0.8 x 10 6個細胞/ml至約1.5 x 10 6個細胞/ml，且甚至更佳以0.9 x 10 6個細胞/ml至約1.3 x 10 6個細胞/ml接種。
鐵係哺乳動物細胞培養基中之必需成分，其(i)作為微量元素及(ii)作為運鐵蛋白替代物(例如鐵作為鐵螯合物)。運鐵蛋白通常源自血漿且可以部分鐵飽和的人類運鐵蛋白之凍乾粉末供應。運鐵蛋白為具有同源N端及C端鐵結合域之糖蛋白且與數種其他鐵結合蛋白(包括乳鐵蛋白、黑素運鐵蛋白及卵運鐵蛋白)有關。運鐵蛋白可於市面購得以用於動物細胞培養中(例如購自Sigma-Aldrich，CAS號11096-37-0)。存在用作細胞培養基中之運鐵蛋白替代物之許多鐵化合物。此等化合物以II/III形式、呈各種鹽及呈水合/脫水形式存在。實例為磷酸鐵(III)、焦磷酸鐵(III)、硝酸鐵(III)、硫酸鐵(II)、氯化鐵(III)、乳酸鐵(II)、檸檬酸鐵(III)、檸檬酸銨鐵(III)、鐵-葡聚糖、檸檬酸鐵(III)膽鹼或乙二胺四乙酸鐵鈉鹽，但不限於此。較佳之鐵源為焦磷酸鐵(Fe 4(P 2O 7) 3)、檸檬酸鐵銨((NH 4) 5[Fe(C 6H 4O 7) 2])、檸檬酸鐵(C 6H 5FeO 7)、檸檬酸鐵膽鹼(C 33H 57Fe 2N 3O 24)、硝酸鐵(Fe(NO 3) 3)、磷酸鐵(FePO 4)、硫酸鐵(FeSO 4)及氯化鐵(FeCl 3)。
術語「檸檬酸鐵膽鹼」如本文所用係關於落於CAS No.1336-80-7下的形成檸檬酸鐵膽鹼複合物之化學化合物檸檬酸鐵膽鹼。常用同義詞為，例如，檸檬酸鐵膽鹼(ferrocholinate citrate)、檸檬酸鐵膽鹼(ferric choline citrate)、檸檬酸膽鹼、檸檬酸鐵(III)膽鹼、檸檬酸膽鹼鐵、檸檬酸三膽鹼、檸檬酸膽鹼鐵、2-羥基乙基-三甲基-銨、2-羥基丙烷-1,2,3-三羧酸酯。此化合物可作為鐵載體添加至基礎及饋料培養基。具有2:3:3之鐵:膽鹼:檸檬酸鹽莫耳比之檸檬酸鐵膽鹼(檸檬酸鐵膽鹼，CAS號1336-80-7，歸因於5%結晶水含量之分子量Mw = 991.5 g/mol +/- 49.57 g/mol，具有約10.2至12.4%之鐵含量之鐵複合物，鐵:膽鹼:檸檬酸鹽之分子比為2:3:3，分子式C 33H 57Fe 2N 3O 24)，例如，可從Dr. Paul Lohmann GmbH KG獲得。然而，其他適宜檸檬酸鐵膽鹼結構可以基於鐵濃度計之等莫耳量，例如在1:1:1之比下之鐵:膽鹼:檸檬酸鹽、Mw = 348.11 g/mol之分子量或在(2):3:3之比下之(鐵):膽鹼:檸檬酸鹽、Mw = 501.61 g/mol之分子量、C 21H 47N 3O 10(不含鐵之總式)使用。檸檬酸鐵膽鹼亦可以包含鐵源(諸如氯化鐵)、膽鹼源(諸如氯化膽鹼)及檸檬酸鹽源(諸如檸檬酸鈉)或膽鹼源及檸檬酸鐵的個別組分提供，較佳以如以上述檸檬酸鐵膽鹼提供的比率。
用來培養哺乳動物細胞之細胞培養基包含必需營養素，包括胺基酸及碳水化合物及含在較佳經緩衝之培養基中之組分(諸如維生素、微量元素、鹽、塊鹽及脂質或脂質前驅物)。此外，可將生長因子添加至基礎細胞培養基或饋料培養基，其例如重組類胰島素生長因子(IGF)或重組胰島素。因此，在某些實施例中，除了存在IGF或重組胰島素之外，基礎細胞培養基及/或饋料培養基係經化學定義且無蛋白質的。
術語「胺基酸」如本文所用係指由通用基因代碼編碼的二十種天然胺基酸，通常為L-形式(亦即L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-半胱胺酸、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸及L-纈胺酸)。胺基酸(例如麩醯胺酸及/或酪胺酸)可呈具有增加穩定性及/或溶解度，較佳含有L-丙胺酸(L-ala-x)或L-甘胺酸延伸(L-gly-x)，諸如甘胺醯基-麩醯胺酸及丙胺醯基-麩醯胺酸之二肽提供。此外，半胱胺酸亦可呈L-胱胺酸提供。術語「胺基酸」如本文所用涵蓋其所有不同鹽，諸如L-精胺酸單鹽酸鹽、L-天冬醯胺酸單水合物、L-半胱胺酸鹽酸鹽單水合物、L-胱胺酸二鹽酸鹽、L-組胺酸單鹽酸鹽二水合物、L-離胺酸單鹽酸鹽及羥基L-脯胺酸、L-酪胺酸二鈉脫水物，但不限於此。胺基酸之確切形式對於本發明而言並不重要，除非損及諸如溶解度、滲透性、穩定性、純度之特性。通常且較佳地，L-精胺酸係以L-精胺酸x HCl使用，L-天冬醯胺酸係以L-天冬醯胺酸x H 2O使用，L-半胱胺酸係以L-半胱胺酸x HCl x H 2O使用，L-胱胺酸係以L-胱胺酸x 2 HCl使用，L-組胺酸係以L-組胺酸x HCl x H 2O使用及L-酪胺酸係以L-酪胺酸x 2 Na x 2 H 2O使用，其中各較佳胺基酸形式可彼此獨立地或一起或以其任何組合選擇。亦涵蓋包含相關胺基酸中之一者或二者之二肽。例如，L-麩醯胺酸經常以二肽之形式(諸如L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸)添加至細胞培養基以達成在儲存中或在長期培養期間改良之穩定性及降低之銨積聚。
術語「培養基中之所有胺基酸」或「總胺基酸含量」如本文所用係指如上所定義的「胺基酸」總和，單位為mM。在二肽中，各胺基酸係分別計數，因此1 mM 丙胺醯基-麩醯胺酸經計數為1 mM L-丙胺酸及1 mM L-麩醯胺酸(莫耳比1:1)。同樣地，在L-胱胺酸中，各半胱胺酸係分別計數，因此1 mM L-胱胺酸經計數為2 mM L-半胱胺酸(莫耳比1:2)。通常，與基礎細胞培養基相比，在經濃縮之饋料培養基中，總胺基酸含量高約5至20倍，較佳約7至15倍且更佳約10倍。根據本發明之基礎培養基之總胺基酸含量可為約25至150 mM，較佳約30至130 mM，更佳約35至120 mM且甚至更佳約40至100 mM。饋料培養基之總胺基酸含量可為約100至1000 mM，較佳約200至900 mM，更佳約300至800 mM且甚至更佳約400至700 mM。未由通用基因代碼直接編碼的其他胺基酸(諸如L-鳥胺酸、羥基L-脯胺酸或其代謝產物諸如牛磺酸)可進一步存在於基礎細胞培養基或饋料培養基中，但此等並未被計數在總胺基酸含量中。
適宜維生素之非限制性實例為生物素(B7)、泛酸鈣、氰鈷胺(B12)、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺(B3)、吡哆醛鹽酸鹽、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素(B2)及/或硫胺素(B1)。微量元素之非限制性實例為鉬、釩、銅、鎳、亞硒酸鹽、矽酸鹽及鋅，微量元素之示例性來源為鉬酸銨、釩酸銨、硫酸銅、硫酸鎳、亞硒酸鈉、矽酸鈉、及硫酸鋅及/或氯化鋅。脂質前驅物之非限制性實例為氯化膽鹼、乙醇胺、甘油、肌醇、亞麻油酸、脂肪酸、磷脂或與膽固醇有關的化合物。
此外，鹽可為氯化鈣、硝酸鈣、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀及/或氯化鈉，但不限於此。鹽之一種功能係調整培養基中之滲透性。較佳地，基礎細胞培養基之滲透性不超過通常在280至350 mOsmo/kg之間的最佳範圍。通常，濃縮饋料培養基之滲透性為＜ 2000 mOsmo/kg，較佳＜ 1500 mOsmo/kg，更佳＜ 1000 mOsmo/kg。饋料培養基之渗透性可更高，但不應在添加後使細胞培養中之滲透性增加超過270至550 mOsmo/kg，較佳280至450 mOsmo/kg，更佳280至350 mOsmo/kg之最佳範圍。
較佳地，饋料培養基具有降低或低鹽含量。降低或低鹽含量意指，例如，約100 mM或更低，較佳約50 mM或更低之總鹽濃度(例如，饋料培養基不含氯化鈉、及含降低濃度之氯化鉀)。渗透性之最重要之貢獻者為鈉離子、氯離子及碳酸氫鹽以及葡萄糖及其他碳源(例如胺基酸)。此外，對於常見的饋料批次製程，饋料培養基需經濃縮以最小化培育期間的培養體積。生物反應器之尺寸可實際上導致僅允許培養起始體積之約35% (30至40%)或培養起始體積之約45% (40至50%)之總饋料劑量之饋料限制。
碳水化合物可為(但不限於)葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、蔗糖或葡糖胺等。此等碳水化合物可直接添加至基礎細胞培養基及/或饋料培養基或可分開添加至細胞培養。其他能量來源包括(但不限於)丙酮酸鈉。
哺乳動物細胞應在諸如約pH 6.5至約pH 7.5，較佳約pH 6.6至約pH 7.3之中性pH下，更佳在約7之pH下培養。因此，應將緩衝劑添加至基礎細胞培養基。對於饋料培養基，pH可略微超出該範圍，只要饋料培養基之添加不會使細胞培養之pH超出此範圍即可，乃因饋料培養基係以濃縮物添加。饋料培養基中pH之較佳範圍為約6至約8。適宜緩衝劑包括(但不限於) HEPES、磷酸鹽緩衝液(例如磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀及/或磷酸氫二鈉脫水物及磷酸二氫鈉)、酚紅、碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)及/或碳酸氫鈉(sodium hydrogen carbonate)。
一般而言，饋料培養基包含在細胞培養期間所消耗的營養素，諸如胺基酸及碳水化合物，而鹽及緩衝液較不重要。因此，可從饋料培養基完全省略一些鹽。
基礎細胞培養基及/或饋料培養基應滿足細胞培育時間進程期間哺乳動物細胞培養之細胞特定要求及代謝需求。換言之，其滿足(i)哺乳動物細胞之細胞特定需求，(ii)在細胞培育系統中，(iii)在培育運行之整個生命週期(其為約10至20天)內。培養中之哺乳動物細胞在細胞培養過程之不同階段中具有不同營養要求。
細胞培養可進一步包括在規模放大程序中的接種列車(inoculation train)所需的細胞擴增。例如，培育規模從細胞庫之解凍(mL規模)逐步增加至生產規模(＞10,000L規模)。各N-x階段之生長越好(其中N-階段意指最終生產規模及N-x意指最終生產階段之前通常為分批模式之細胞擴增階段)，每次轉移至下一階段可進行地越快且越好。具體而言， 細胞生長更好且活細胞濃度越高允許N-x培育之進行可以減少運行次數(因此更快)。細胞生長更好且活細胞濃度更高亦導致改良之轉移，從而導致整體改良之性能。例如，當某一N-x階段應接種特定接種細胞密度且活細胞濃度高時，需要將相對低體積之細胞培養從一個階段轉移至下一階段(每一培養起始體積(CSV) 轉移的接種體積即定義為分流比(spit ratio)，通常，1:5至1:20係常見的)。此意指，同時僅將減少體積之「用過」細胞培養基從一個階段轉移至下一階段且可將最大體積之「新」培養基添加至下一階段(恆定整體培育體積)。此亦導致最終N-階段中之改良之整體細胞培養性能(例如增加之產物效價)。
在大多數細胞培養中，可歸因於溢流-代謝來確定針對主要碳之非理想營養素組合物。此意指主要碳源葡萄糖被無效地利用且藉此促成有機酸(例如乳酸)之增加。增加之乳酸含量可促成pH降至低於6.65且此將負面地影響培養基之緩衝容量且因此影響培養存活率。出於此種原因，於指數生長期開始時降低培養氛圍中之CO 2濃度，以使培養基中之酸含量最小化。
在下游過程中，從其他重組蛋白質、宿主細胞蛋白質及污染物中純化抗體spesolimab。在各種純化步驟獲得及/或分析的樣本亦稱為過程中控制(in-process control) (IPC)樣本或過程中間體。收成法通常包括離心及/或過濾，諸如以產生所收成細胞培養流體。其他過程步驟可包括親和層析，特別是蛋白質A管柱層析，以從污染物分離抗體spesolimab。其他過程步驟可包括用於滅活病毒之酸處理，藉由深層過濾澄清產物池(其較佳在酸處理之後，以移除細胞污染物，諸如HCP及DNA)。可依此順序或在個別情況下可能適宜之任何其他順序包括其他過程步驟：離子交換層析，特定而言進一步移除污染細胞組分之陰離子交換層析及/或移除與產物有關的污染物(諸如聚集物)之陽離子交換層析。此外，較佳地，隨後的過程步驟可包括進一步移除病毒之奈米過濾及分別濃縮重組蛋白質及交換緩衝液之超過濾及透濾。
包含在例如蛋白A管柱、酸處理、深層過濾、陰離子交換層析及/或陽離子交換層析之後從所收成細胞培養流體(HCCF)純化的抗體spesolimab之樣本亦可稱為「經純化之抗體產物池」。可進一步純化經純化抗體產物池且可(但不需要)用賦形劑調配。因此，經純化抗體產物池可與藥物物質相同但亦可以不同濃度存在及/或存在於不同緩衝液系統中。
術語「所收成細胞培養流體(HCCF)」如本文所用係指包含所收成重組蛋白質(在本情況下為抗體spesolimab)之流體。通常，將用於生產之宿主細胞工程化以將多肽分泌至細胞培養基中且因此將收成細胞培養上清液。然而，理論上，該等細胞亦可在收成之前進行溶解。收成包括離心及/或過濾以產生所收成細胞培養流體。因此，所收成細胞培養流體亦可稱為經澄清之所收成細胞培養流體。其不包含活細胞且已移除細胞碎片及細胞組分。通常，其係指經澄清之細胞培養上清液，其中經澄清意指離心或過濾，較佳藉由過濾，諸如利用0.1 µm過濾器。該HCCF在一些實施例中為經澄清之HCCF。在另外或替代實施例中，該HCCF包含約1.8 g/L至約5 g/L之抗體spesolimab，較佳約2.0 g/L至約5.0 g/L之抗體spesolimab，更佳約2.5 g/L至約4.5 g/L之抗體spesolimab。根據本發明之方法係一種針對於包含＞ 20 kg、或甚至＞30 kg spesolimab之HCCF及/或針對於來自≥ 2,000 L發酵槽，較佳≥ 12,000 L發酵槽之HCCF之大規模純化方法。
術語「產物池」如本文所用係指在過程步驟結束時包含產物(亦即抗體spesolimab)之溶液。因此，術語「產物池」係與術語「包含抗體之產物池」同義使用。此可為洗脫物(eluate)或流過物(flow through)或濾液，只要其含有產物之主要流份即可。因此，術語「產物池樣本」係指包含抗體spesolimab之溶液之樣本，特別是在根據本發明方法之方法步驟中之一者之後。
抗體spesolimab係大規模地，即以≥ 12,000 L規模於CHO細胞系中產生。HCCF中之效價為約1.8 g/L至約5 g/L。因此，根據本發明之過程提供用於純化之起始材料(HCCF)，其包含＞ 20 kg、或甚至＞30 kg spesolimab。
術語「污染(contaminating)」或「污染(contamination)」如本文所用係指存在非所欲及/或非刻意物質，諸如宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA及/或至少一種具有水解活性之蛋白質或物質。
術語「藥物物質(DS)」係指經賦形劑調配之活性醫藥成分(API)。API在體內具有治療功效，而不是輔助API遞送的賦形劑。在生物治療劑之情況下，具有賦形劑之經調配之API通常意指在用於最終劑型(亦稱為藥物產品)中之至少最高濃度之濃度下之最終調配緩衝液中之API。
術語「藥物產品」 (簡寫為DP)如本文所用係指藥物物質之最終市售劑型(例如錠劑或膠囊)，或在生物製劑之情況下，通常為含在適宜密閉空間(containment)諸如小瓶或注射器中之注射用溶液。藥物產品亦可呈凍乾形式。Spesolimab係呈水性調配物以60 mg/ml含在玻璃小瓶中或以150 mg/mL含在玻璃注射器中提供。
抗體通常攜帶附接至免疫球蛋白重鏈之C H2-域之Asn297 (IgG)之寡醣。大多數此等寡醣具有雙分支結構。此意指其具有核心結構(Man(α1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc→Asn)，其在末端GlcNAc殘基及兩個外臂(Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6)→Man及Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)→Man；末端半乳糖(Gal)殘基係可選的)處具有連接至該核心結構的末端甘露糖的可選Fuc(α1-6)鍵(Man = 甘露糖，GlcNAc = N-乙醯基葡萄糖，Gal = 半乳糖，Fuc = 岩藻糖)。各外臂中之末端半乳糖係可選的，從而產生G(0)、G(1)及G(2)同功異型物，其中該G(2)同功異型物於寡醣結構之各外臂上具有末端半乳糖殘基，該G(1)同功異型物僅於(α1-6)或(α1-3)連接外臂上具有末端半乳糖殘基，及該G(0)同功異型物於兩個外臂上均不具有半乳糖殘基。
術語「Man5結構」或「甘露糖-5糖基結構」在本文中同義地使用且係指連接至包含五個甘露糖殘基及兩個N-乙醯基葡萄糖核心殘基或由其組成之多肽之Asn殘基，從而形成三分支結構之寡甘露糖結構。
將糖基結構引入至多肽(諸如抗體)係一種轉譯後修飾。由於不完全的醣基化，故每個細胞表現多肽(諸如抗體)，其中醣基化型態或概況包含不同糖基結構。全部或個別糖基結構稱為醣基化型態或概況。可藉由用2-胺基吡啶標記所釋放的寡醣及使用親水性相互作用層析(HILIC-HPLC)，較佳親水性相互作用超高效液相層析(HILIC-UPLC)分析來確定經純化之spesolimab或蛋白A池之寡醣。層析概況顯示6個主峰，其中峰3為Man5峰(圖5)，亦稱為(寡聚物譜圖峰3)。術語「Man5結構%」如本文所用係指總和峰面積之相對峰面積%(峰3)。
術語「約」如本文所用係指指定值之10%的變化，例如約50%包括45至55%的變化。
本發明提供一種在細胞培養中製備抗體spesolimab之方法，其包括(a)使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括(i)將該等細胞接種於培養基中，及(ii)將該等細胞於允許在細胞培養中製備抗體spesolimab之條件下於培養基中培養，該細胞培養包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞，其中在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將銅(II) (Cu 2+)以0.35至1.2 µM及鐵以1,500 µM或更多添加至培養基；(b)收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及(c)視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。較佳地，在步驟(i)中接種之前及/或在接種後1天內將Cu 2+及鐵添加至培養基，更佳地，在步驟(i)中接種之前或在接種時(亦即細胞接種之時)將Cu 2+及鐵添加至培養基。在一個實施例中，Cu 2+及/或鐵係以一或多個推注添加或連續地添加至培養基。該一或多個推注添加包括向基礎培養基提供Cu 2+及/或鐵。因此，在某些實施例中，步驟(i)包括將細胞接種於包含0.35至1.2 µM之Cu 2+及1,500 µM或更多之鐵之基礎培養基中。步驟(i)中之培養基亦可稱為基礎培養基。
在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天或1天內將銅以0.35至1.2 µM添加至培養基。熟習此項技術者將理解，將銅添加至培養基之手段係無關的及在步驟(i)中接種細胞之前的添加包括銅存在於根據步驟(i)之培養基中或為其一部分及/或在步驟(i)中接種之前將含銅補充劑添加至準備好之混合培養基。在一個較佳實施例中，在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天(較佳1天)內將Cu 2+以0.4至1.0 µM，更佳以0.5至0.8 µM添加至培養基。銅(II)通常呈其鹽或水合物、適宜鹽(但不受限於此地包括CuSO 4或CuCl 2)提供。較佳地，銅呈CuSO 4提供。
在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天或1天內將鐵以1,500 µM或更多添加至培養基。熟習此項技術者將理解，將鐵添加至培養基之手段係無關的及在步驟(i)中接種細胞之前的添加包括鐵存在於根據步驟(i)之培養基中或為其一部分及/或在步驟(i)中接種之前將含鐵補充劑添加至準備好之混合培養基。在一個較佳實施例中，鐵以2,000 µM或更多，更佳以2,500 µM或以3000或更多添加。可添加高達10,000 µM，較佳5,000 µM之鐵，但通常使用較低濃度，主要歸因於在高鐵濃度存在下培養基組分之溶解度及沉澱，但亦歸因於在極高濃度下之鐵之潛在毒性問題。因此，在某些實施例中，鐵濃度為1,500 µM至10,000 µM、2,000 µM至10,000 µM、2,500 µM至10,000 µM或3,000 µM至10,000 µM，較佳為1,500 µM至5,000 µM、2,000 µM至5,000 µM、2,500 µM至5,000 µM或3,000 µM至5,000 µM。鐵通常呈鹽及/或呈螯合形式提供，適宜鐵源為焦磷酸鐵(Fe 4(P 2O 7) 3)、檸檬酸鐵銨((NH 4) 5[Fe(C 6H 4O 7) 2])、檸檬酸鐵(C 6H 5FeO 7)、檸檬酸鐵膽鹼、硝酸鐵-III、磷酸鐵、硫酸鐵及氯化鐵，但不限於此。較佳之鐵源為檸檬酸鐵、檸檬酸鐵膽鹼及氯化鐵。其他適宜鐵源係此項技術中已知的且熟習此項技術者將知曉，添加某些螯合劑(諸如檸檬酸鹽及/或膽鹼)可增加鐵之細胞吸收，其亦可另外添加至鐵源。
在本發明之背景內容中，重要的是，在生長階段開始時，亦即在接種之前及/或接種後2天或1天內，銅及鐵以指定濃度添加(及/或存在)，而整個培育過程(具體言之生產階段)中之銅及鐵濃度較不重要。特定而言，歸因於銅降低及鐵增加對PBG及Man5含量之協同效應，可達成進一步的降低或可在稍微更高之銅濃度下達成相同降低，由此避免過低銅濃度之負面效應。
在某些實施例中，將編碼抗體spesolimab之核酸穩定地整合至CHO基因組中。用抗體轉染或轉導CHO細胞及選擇產生純系之抗體之方法係此項技術中已知的。
根據本發明之方法包括用饋料培養基饋養細胞。在某些實施例中，從培養的第0天至第3天開始，較佳從第1天至第3天開始，更佳從第1天至第2天開始，甚至更佳在第1天開始，添加饋料培養基。雖然不是必需的，但饋料培養基可進一步包含Cu 2+離子。例如，饋料培養基可每天以小於15 nM、小於12 mM、小於10 nM，較佳每天以7 nM，更佳每天以小於6 nM添加Cu 2+離子。饋料培養基可進一步包含鐵離子。例如，饋料培養基可每天添加高達100 µM鐵，較佳每天高達50 µM、40 µM、30 µM或20 µM鐵。饋料培養基可進一步以指定濃度包含Cu 2+及鐵離子。意欲將用於本發明方法中之饋料培養基添加至於基礎細胞培養基中培養之細胞中，其中(a)該饋料培養基係以基於培養起始體積計約10至50 ml/L/天，較佳20至35 ml/L/天添加，(b)該饋料培養基係在第0天、第1天、第2天或第3天開始添加，及/或(c)該饋料培養基係連續地、或以推注形式每天數次、每天兩次、每天一次、每隔一天或每隔兩天添加。
在本發明之方法中，該培養基中之增加鐵濃度及/或減少銅濃度導致製備具有降低BPG%之抗體spesolimab。術語「降低BPG%」在此背景內容中應理解為係相對於抗體spesolimab藉由使用在根據本發明方法之範圍內的較低鐵及/或較高銅濃度之相同方法或相對於使用低於指定範圍之鐵濃度及/或高於指定主張範圍之銅濃度之相同方法所產生之情況。在某些較佳實施例中，藉由根據本發明之方法產生的抗體spesolimab具有≤ 7.5% BPG，較佳≤ 7% BPG，更佳≤ 6.5% BPG，甚至更佳≤ 6% BPG。根據本發明，增加鐵濃度降低BPG%且因此可補償歸因於其他態樣而無法進一步降低的稍微更高之銅濃度。
因此，本發明亦關於一種降低抗體spesolimab之BPG%之方法，其包括(a)使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括(i)將該等細胞接種於培養基中，及(ii)將該等細胞於允許在細胞培養中製備抗體spesolimab之條件下於培養基中培養，該細胞培養包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞，其中藉由在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內減少提供至培養基之Cu 2+濃度及增加提供至培養基之鐵濃度來減少BPG%，其中該提供至培養基之銅濃度為0.35至1.2 µM及該提供至培養基之鐵濃度為1500 µM或更多；(b)收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及(c)視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。較佳地，在步驟(i)中接種之前及/或在接種後1天內將Cu 2+及鐵添加至培養基，更佳地，在步驟(i)中接種之前或在接種時(亦即細胞接種之時)將Cu 2+及鐵添加至培養基。在一個實施例中，將Cu 2+及/或鐵以一或多個推注添加或連續地添加至培養基。該一或多個推注添加包括向基礎培養基提供Cu 2+及/或鐵。因此，在某些實施例中，步驟(i)包括將細胞接種於包含0.35至1.2 µM之Cu 2+及1500 µM或更多之鐵之基礎培養基中。術語「降低BPG%」在此背景內容中應理解為係相對於抗體spesolimab藉由使用在根據本發明方法之範圍內的較低鐵及/或較高銅濃度之相同方法或相對於使用低於指定範圍之鐵濃度及/或高於指定主張範圍之銅濃度之相同方法所產生之情況。在某些較佳實施例中，藉由根據本發明之方法所產生的抗體spesolimab具有≤ 7.5% BPG，較佳≤ 7% BPG，更佳≤ 6.5% BPG，甚至更佳≤ 6% BPG。
術語「鹼性峰群組(BPG)%」如本文所用係指如藉由陽離子交換層析(CEX)於spesolimab概況之HPLC層析圖中所確定的總和峰面積之相對峰面積%(總抗體之相對%)。術語「BPG」亦可稱為抗體spesolimab之鹼性種類或鹼性變體。
BPG可使用陽離子交換層析(CEX HPLC)來確定。更具體言之，其中該鹼性種類對應於較於spesolimab概況之HPLC層析圖中之主峰更晚洗脫之峰。在一個實施例中，HPLC層析圖係使用10 mM MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸、4-嗎啉丙磺酸) (pH 7.6)之第一流動相及10 mM MOPS、100 mM氯化鉀(pH 7.6)之第二流動相來產生，且其中該HPLC層析圖係使用在280 nm下之偵測來產生。
BPG之含量主要藉由上游製程確定且受下游製程的影響極小。因此，spesolimab之HCCF中之BPG%類似於藥物物質中之BPG%。此與例如高分子量種類(HMW)或低分子量種類(LMW)形成對比，該等種類通常在下游製程中減少。
根據本發明之方法可進一步包括採用接種密度。增加之接種密度導致製備具有降低之BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。因此，在某些實施例中，步驟(a)中之接種密度為≥0.7x10 6個細胞/ml，較佳0.7x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，更佳0.8x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，甚至更佳0.9x10 6個細胞/ml至1.3x10 6個細胞/ml。術語「降低之BPG%及/或Man5結構%」在此背景內容中應理解為係相對於抗體spesolimab藉由使用在根據本發明方法之範圍內的較低接種密度之相同方法或相對於使用低於指定範圍之接種密度之相同方法所產生之情況。
根據本發明之方法可進一步包括採用培養溫度。在某些實施例中，在36.0℃至37.5℃於允許產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括用饋料培養基饋養細胞。較佳地，培養溫度係在36.0℃至37.3℃或36.5℃至37.0℃之範圍內。該方法亦可包括採用溶解氧(DO)濃度。在某些實施例中，該培養中之溶解氧(DO)濃度係維持在30至60%之範圍內，較佳維持在40至50%之範圍內，更佳維持在40至45%之範圍內。增加培養溫度及/或降低溶解氧導致產生具有降低BPG%及/或降低Man5結構%之抗體spesolimab。術語「降低BPG%」及/或「降低Man5結構%」在此背景內容中應理解為係相對於抗體spesolimab藉由使用在根據本發明方法之所主張範圍內的較低培養溫度及/或較高DO濃度之相同方法或相對於使用低於指定範圍之培養溫度或高於指定範圍之溶解氧濃度之相同方法所產生之情況。在某些實施例中，該抗體spesolimab具有少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，及/或≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳6.5%之BPG，且甚至更佳≤ 6%之BPG。培養溫度亦可取決於所使用的細胞系。例如，與具有約36.0至37.5℃，較佳36.5至37.0℃之最佳培養溫度的CHO-DG44相比，CHO-K1細胞傾向於具有在較低溫度(諸如33至36℃)下的最佳培養溫度。
術語「Man5結構%」如本文所用係指相對於所有醣基化峰之總和或總面積之甘露糖-5峰面積(峰3)% (在圖5中)，如藉由親水性相互作用層析(HILIC-HPLC)，較佳親水性相互作用超高效液相層析(HILIC-UPLC)所確定。Man5結構由峰3之峰面積%表示。
可使用親水性相互作用層析(HILIC)，較佳親水性相互作用超高效液相層析(HILIC-UPLC)來確定高甘露糖結構，特別是Man5結構。在一個實施例中，在利用N-糖苷酶F (PNGase F)酵素寡醣釋放及2-胺基苯甲醯胺(2-AB)標記後，使用HILIC-UPLC確定Man5流份。
類似於BPG含量，高甘露糖且特別是Man5結構之含量主要藉由上游過程確定且極少受到下游過程影響。因此，spesolimab之HCCF中之Man5結構%類似於藥物物質中之Man5結構%。此與例如高分子量種類(HMWs)或低分子量種類(LMWs)形成對比，該等種類通常在下游過程中減少。
用於本發明方法中之哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，諸如CHO-K1細胞、CHO-DG44細胞、DuxB11細胞或CHO GS缺陷細胞，較佳地，該細胞為CHO-DG44或CHO-K1細胞。允許有效細胞系發展過程之CHO細胞經代謝工程化，諸如藉由麩醯胺酸合成酶(GS)敲除及/或二氫葉酸還原酶(DHFR)敲除以分別促進用甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)或胺甲喋呤進行選擇。用於根據本發明之方法中之CHO細胞包括CHO-K1、CHO-DXB11 (亦稱為CHO-DUKX或DuxB11)、CHO-DUKX B1、CHO-S、CHO-DG44及CHO麩醯胺酸合成酶(GS)缺陷細胞或任何此類細胞系之衍生物/後代。較佳為CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1、CHO-S及CHO-DG44 GS缺陷細胞系，特佳為CHO-DG44及CHO-K1細胞，且甚至更佳為CHO-DG44細胞。根據本發明，該等CHO細胞經培養為懸浮細胞。可與本發明培養基一起使用的哺乳動物細胞之非限制性實例總結於表1中。 表 1 ：適宜的示例性哺乳動物產生細胞系
細胞系 示例性參考編號/來源
CHO ECACC號8505302
CHO野生型 ECACC 00102307
CHO-DUKX (= CHO duk -、CHO/dhfr -) ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B11 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 Urlaub等人，Cell 33 (2)，405 – 412，1983； Life Technologies A1097101
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
CHO-S Life Technologies A1136401；CHO-S衍生自CHO變體，Tobey等人，1962
CHO-K1 ATCC CCL-61、ECACC 85051005
CHO-K1/SF ECACC 93061607
CHO-K1 GS 衍生自CHO-K1之麩醯胺酸合成酶(GS)缺陷細胞
CHOZN GS 衍生自CHO-K1之GS缺陷細胞(SAFC ECACC 85051005)
該等產生CHO細胞優先在允許細胞增殖之條件下培育。此外，該產生CHO細胞優先在有利於表現抗體spesolimab之條件下培育。然後將抗體spesolimab從細胞及/或細胞培養上清液中分離。較佳地，將抗體spesolimab作為分泌多肽從培養基回收。
在下游過程中，從HCCF、其他重組蛋白質、宿主細胞蛋白質及污染物純化抗體spesolimab。在各種純化步驟下獲得及/或分析的樣本亦稱為過程中控制(IPC)樣本或過程中間體。收成通常包括離心及/或過濾，諸如以產生所收成細胞培養流體。因此，所收成細胞培養流體亦可稱為經澄清之所收成細胞培養流體。其不包含活細胞且已移除細胞碎片以及大多數細胞組分。經澄清通常意指離心或過濾，較佳係過濾。其他過程步驟可包括親和層析，特別是蛋白A管柱層析，以從污染物分離抗體spesolimab。其他過程步驟可包括用以滅活病毒的酸處理，藉由深層過濾澄清產物池(其較佳在酸處理之後，以移除細胞污染物，諸如HCP及DNA)。其他過程步驟可依此種順序或在個別情況下可能適宜之任何其他順序包括：離子交換層析，特定而言進一步移除污染細胞組分之陰離子交換層析及/或移除與產物有關的污染物(諸如聚集物)之陽離子交換層析。此外，較佳地，隨後的過程步驟可包括進一步移除病毒之奈米過濾及分別濃縮重組蛋白質及交換緩衝液之超過濾及透濾。
包含例如在蛋白A管柱、酸處理、深層過濾、陰離子交換層析及/或陽離子交換層析之後從HCCF純化的抗體spesolimab之樣本亦可稱為「經純化之抗體產物池」。可進一步純化經純化之抗體產物池且可(但不需要)用賦形劑調配。因此，經純化之抗體產物池可與藥物物質相同，但亦可以不同濃度存在及/或存在於不同緩衝液系統中。
在另一個態樣中，提供一種在細胞培養中製備抗體spesolimab之方法，其包括(a)使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括(i)將該等細胞以≥0.7x10 6個細胞/ml之細胞密度接種於培養基中，及(ii)將該等細胞於允許在細胞培養中製備抗體spesolimab之條件下於培養基中培養，該細胞培養包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞，其中視需要在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將Cu 2+以0.35至1.2 µM及鐵以1500 µM或更多添加至培養基；(b)收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及(c)視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。增加之接種密度導致製備具有降低BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。在某些實施例中，步驟(a)中之接種密度為0.7x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，更佳0.8x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，甚至更佳0.9x10 6個細胞/ml至1.3x10 6個細胞/ml。術語「降低BPG%及/或Man5結構%」在此背景內容中應理解為係相對於抗體spesolimab藉由使用視需要在根據本發明方法之範圍內的較低接種密度之相同方法或相對於使用低於指定範圍之接種密度之相同方法及視需要相對於使用在根據本發明方法之範圍內的較低鐵及/或較高銅濃度之相同方法或相對於使用低於指定範圍的鐵濃度及/或高於指定主張範圍之銅濃度之相同方法所產生之情況。關於先前態樣之實施例及修改或揭示內容類似地適用於根據此態樣之方法。提高培養溫度可進一步降低BPG及/或Man5結構。確切的培養溫度可取決於所使用的CHO細胞且較佳在36.0℃至37.5℃之間，但對於其他CHO細胞，可在33至36℃之間。此外，減少溶解氧(維持dO 2在30至60%之間)可進一步減少BPG及/或Man5結構。因此，在某些實施例中，提高培養溫度及/或降低溶解氧導致產生具有降低BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。在較佳實施例中，所產生的抗體spesolimab具有少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，及/或≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 6.5%之BPG。
在另一個態樣中，本發明提供一種包含抗體spesolimab之組合物，其中該抗體spesolimab係藉由根據本發明之方法獲得。在某些實施例中，該組合物包含抗體spesolimab，該抗體spesolimab具有(a) ≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG、少於7%之BPG，較佳少於6%之BPG；及/或(b)少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，較佳少於2%之Man5結構。該組合物可為收成細胞培養流體(HCCF)、親和力捕獲池、藥物物質或藥物產品。較佳地，該組合物為藥物物質或藥物產品。
在又另一個態樣中，提供一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab具有(a) ≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG；及/或(b)少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，較佳少於2%之Man5結構。該組合物可為收成細胞培養流體(HCCF)、親和力捕獲池、藥物物質或藥物產品。較佳地，該組合物為藥物物質或藥物產品。
根據本發明之組合物中之抗體spesolimab可進一步以低總體糖基化表徵，其包含且特定而言無在關鍵離胺酸，亦即接近抗體之CDRs之離胺酸，諸如在CDRs之3個胺基酸內的糖基化。因此，在一個實施例中，抗體spesolimab具有≤ 6%之離胺酸糖基化重鏈(HC)變體，較佳≤ 3%之離胺酸糖基化HC變體及/或該重鏈(HC)之離胺酸K38及K67未糖基化及在K23處之糖基化為≤ 0.3%。在某些實施例中，抗體spesolimab進一步具有≤ 2%之離胺酸糖基化輕鏈(LC)變體，較佳≤ 1%之離胺酸糖基化輕鏈(LC)變體。所得LC及去糖基化HC藉由逆相-高效層析(RP-HPLC)分離且藉由ESI Q-TOF MS (Xevo G2 Q-TOF)線上分析。分析蛋白質次單元及相應葡萄糖加成物(M葡萄糖加成 = 162 Da)且使用MaxEnt™演算法解迴旋所獲得的光譜。
術語「離胺酸糖基化重鏈變體%」如本文所用係指總重鏈(糖基化及非糖基化HC)之糖基化重鏈(HC +葡萄糖)之百分比。術語「離胺酸糖基化輕鏈變體%」如本文所用係指總輕鏈(糖基化及非糖基化LC)之糖基化輕鏈(LC +葡萄糖)之百分比。LC及/或HC之離胺酸糖基化及非糖基化變體可經由利用逆相-高效能層析(RP-HPLC)分離經還原且去糖基化(諸如經N-糖苷酶F處理)之LC及HC且藉由ESI Q-TOF MS分析來確定。
可在趨化胰蛋白酶(chemotrypsin)消化肽中在spesolimab之變性及碘乙酸烷基化後藉由逆相液相層析(LC-MS)及ESI-MS分析單一離胺酸之糖基化。基於野生型肽及攜載葡萄糖加成物(+ 162 Da)之肽之提取離子層析圖來定量糖基化肽之相對量。
本文亦提供一種包含抗體spesolimab之組合物，其包含≤ 6%之離胺酸糖基化HC變體，較佳≤ 3%之離胺酸糖基化HC變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)係未糖基化及在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。在某些實施例中，抗體spesolimab進一步具有≤ 2%之離胺酸糖基化輕鏈(LC)變體，較佳≤ 1%之離胺酸糖基化輕鏈(LC)變體。
本文亦提供一種包含抗體spesolimab之組合物，其以少於1%包含APG次流份AP4及以少於4%包含AP3流份，特別是以少於1%包含AP4及以少於1%包含AP3b流份。 有鑑於上述，應明瞭，本發明亦涵蓋以下項： 1. 一種用於在細胞培養中產生抗體spesolimab之方法，其包括 (a) 使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括 (i)  將該等細胞接種於培養基中，及 (ii) 在培養基中於允許在細胞培養中產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞， 其中在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將Cu 2+以0.35至1.2 µM及將鐵以1500 µM或更多添加至培養基； (b) 收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及 (c) 視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。 2. 一種用於降低抗體spesolimab之BPG%之方法，包括 (a) 使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括 (i)  將該等細胞接種於培養基中，及 (ii) 在培養基中於允許在細胞培養中產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞， 其中藉由在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內降低提供至培養基之Cu 2+濃度及增加提供至培養基之鐵濃度來降低BPG%，較佳地，其中提供至培養基之銅濃度為0.35至1.2 µM及提供至培養基之鐵濃度為1500 µM或更大； (b) 收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及 (c) 視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。 3. 如項1或2之方法，其中在步驟(i)中接種之前及/或在接種後1天內將該Cu 2+及該鐵添加至培養基。 4. 如項1至3中任一項之方法，其中該Cu 2+及該鐵係以一或多個推注添加或連續地添加至培養基。 5. 如前述項中任一項之方法，其中該編碼抗體spesolimab之核酸係穩定地整合至CHO基因組中。 6. 如前述項中任一項之方法，其中饋料培養基係從培養的第0天至第3天開始添加。 7. 如前述項中任一項之方法，視需要，其中該饋料培養基每天添加少於15 nM Cu 2+及/或高達100 µM鐵。 8. 如前述項中任一項之方法，其中該培養基中之增加鐵濃度及/或降低銅濃度導致產生具有降低BPG%之抗體spesolimab。 9. 如前述項中任一項之方法，其中該抗體spesolimab具有≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG。 10.   如項8之方法，其中該BPG係使用陽離子交換層析(CEX HPLC)來確定。 11.    如前述項中任一項之方法，其中步驟(a)中之該接種密度為≥0.7x10 6個細胞/ml，較佳0.7x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，更佳0.8x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，甚至更佳0.9x10 6個細胞/ml至1.3x10 6個細胞/ml。 12.   一種用於在細胞培養中產生抗體spesolimab之方法，其包括 (a) 使用饋料批次培養在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括 (i)  將該等細胞以≥0.7x10 6個細胞/ml之細胞密度接種於培養基中，及 (ii) 在培養基中於允許在細胞培養中產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括在細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞， 其中，視需要，在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內將Cu 2+以0.35至1.2 µM及將鐵以1500 µM或更多添加至培養基； (b) 收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及 (c) 視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。 13.   如前述項中任一項之方法，其中增加之接種密度導致產生具有降低BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。 14.   如前述項中任一項之方法，其中該等細胞係在36.0℃至37.5℃下於允許產生抗體spesolimab之條件下培養，包括用饋料培養基饋養該等細胞，及/或其中該培養中之溶解氧(DO)濃度係維持在30至60%之範圍內。 15.   如前述項中任一項之方法，其中增加培養溫度及/或減少溶解氧導致產生具有降低BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。 16.   如前述項中任一項之方法，其中該抗體spesolimab具有少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，及/或≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 6.5%之BPG。 17.   如前述項中任一項之方法，其中該CHO細胞為CHO-K1或CHO-DG44細胞。 18.   一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab具有 (a)    ≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG；及/或 (b)    少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構。 19.   一種包含抗體spesolimab之組合物，其中該抗體spesolimab係藉由根據項1至17中任一項之方法來獲得。 20.   如項18或19之組合物，其中該組合物為收成細胞培養流體(HCCF)、親和力捕獲池、藥物物質或藥物產品，較佳為藥物物質或藥物產品。 21.   如項18至20中任一項之組合物，其中該組合物為包含具有少於7.5%之BPG及/或少於5%之Man5結構之抗體spesolimab之藥物產品。 22.   如項18至21中任一項之組合物，其中該抗體spesolimab包含≤ 6%之離胺酸糖基化重鏈(HC)變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)係未糖基化及在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。 23.   一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab包含≤ 6%之離胺酸糖基化重鏈(HC)變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)係未糖基化及在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。 24.   一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab以少於1%包含APG次流份AP4及以少於4%包含AP3流份，特別是以少於1%包含AP4及以少於1%包含AP3b流份。 實例細胞系
將CHO細胞系(CHO-DG44)調適至無血清培養基條件且進一步用DNA轉染，以產生重組mAb spesolimab。具體而言，使用經獨立地調適至無血清培養基(命名為HEX II)的BI HEX (Boehringer-Ingelheim High Expression) CHO-DG44衍生之CHO細胞系。此等細胞缺乏DHFR (二氫葉酸-還原酶)且使用胺甲喋呤作為選擇標記。 分析方法
藉由使用CEDEX Hires (2.2.3版)自動化細胞分析儀(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)之台盼藍(trypan blue)排除方法來確定細胞濃度及細胞存活率。藉由Konelab 60i (Thermo Scientific，Dreieich，Germany)分析儀，基於光度測定方法來定量培養基中所產生的重組mAb之濃度。Konelab 60i儀器亦用於定量細胞培養上清液中之代謝產物，諸如葡萄糖、乳酸(乳酸鹽)、麩醯胺酸、麩胺酸鹽及銨。藉由osmomat自動裝置(Gonotec GmbH，Berlin，Germany)分析渗透性概況。此方法係基於特定溶液之冰點下降之冷凍點，其與溶解顆粒之量成比例。利用Rapidlab 248/348血液氣體分析儀(Siemens Healthcare Diagnostics GmbH，Eschborn，Germany)每天測定溶解二氧化碳pCO2、溶解氧pO2及pH。此項技術中熟知此等儀器及所需方法且其用於生物醫藥製程開發及製造中之製程監測及控制。 批次及饋料-批次模式
對於抗體之產生，通常在最終生產階段中使用饋料-批次製程，而批次培育主要在最終生產階段之前的細胞擴增階段中進行。一系列的批次培養在細胞擴增期間稱為種子列車(seed train)，意指在各擴增步驟中將細胞轉移至具有較大培育體積之培育容器中。最終生產階段中之批次製程一般不會導致高生產率且因此很少用於製造重組蛋白質。在饋料-批次製程中，在培育期間添加濃縮饋料培養基，以新鮮培養基補償營養素的補給。此等製程達成更高生產率且因此主要用於生產重組蛋白質。與批次模式相反，藉由添加濃縮饋料培養基來補給營養素亦減少因非所欲代謝副產物諸如乳酸鹽或銨而抑制細胞生長。通常，饋料-批次製程係從比攪拌槽之最大容量低得多的體積開始，使得濃縮營養素溶液可在生物反應器培育時間內添加。進行饋料-批次培育14天。 生物反應器培育
在具有最大15 ml體積之受控制48-小型生物反應器(mini-bioreactor)系統(ambr 15 bioreactor system)或在具有250 ml標稱體積之受控制24-小型生物反應器系統(ambr 250 bioreactor system)中使用專利基礎及饋料培養基進行生物反應器實驗。完全受控制之生物反應器係以饋料-批次模式進行。從培育的第1天開始藉由饋料泵連續地添加濃縮饋料溶液，其中饋料速率為33 ml/L/d或在實驗中(基於培養開始體積)如所指示而變化。接種密度設定為1.0 x 10 6個細胞/ml或在實驗中如所指示而變化。溶解氧濃度保持在60%或在實驗中如所指示而變化。於更長時間框架內細胞之擴增遵循細胞生長及培養分割之標準種子列車方案以便確保表型穩定性。此程序確保在不同時間點在不同實驗設定之間的可比較性。標準製程形式由7.10至6.95 (+/- 0.25)之pH範圍及於48-小型生物反應器系統中1000至1150 rpm之恆定攪拌速率及於24-小型生物反應器系統中614 rpm之恆定攪拌速率組成。溫度維持在36.5℃或在實驗中變化。在培育期內，根據需要饋送葡萄糖以維持實際葡萄糖濃度在2至4 g/l之間。使用如上所述的分析方法來確定主要培養參數(諸如細胞計數、細胞存活率及主要碳代謝產物濃度)，以為細胞培養提供理想營養素供應。在生物反應器系統中，線上監測pH及pO2。藉由控制軟體使用用於監測例如pH控制、營養素饋料添加、溫度控制、攪拌及出氣之自動閉環系統(closed-loop system)來完全控制離線製程參數及設定點。此培養過程可經且已經成功擴大規模至2,000及12,000 L。 電荷變體之偵測
陽離子交換層析(CEX HPLC)允許根據其電荷來分離蛋白質及蛋白質群，而在梯度下之鹽含量在恆定pH下增加。歸因於其官能基及其微異質性，蛋白質可攜載正電荷或負電荷。CEX HPLC使用此等pH依賴性電荷以促進不同蛋白質/蛋白質修飾之分離。
製備在流動相A中包含約1 mg/mL之抗體濃度之樣本且使用具有梯度洗脫、溫度受控之自動取樣器及UV偵測器之HPLC系統使用HPLC管柱MAbPac SCX-10，4 x 250 nm，10 µm來分析。使用10 mM MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸、4-嗎啉丙磺酸)之第一流動相(洗脫劑A) (pH 7.6)及10 mM MOPS、100 mM氯化鉀之第二流動相(洗脫劑B) (pH 7.6)產生HPLC層析圖。藉由以0.8 mL/min之流速運行從15%至85%洗脫劑A之40分鐘之線性梯度來進行洗脫。在280 nm波長UV-偵測器下進行偵測。
APG (酸性峰群組)、主峰及BPG (鹼性峰群組)藉由使用連續基線分割來分離。整合範圍在約2分鐘時開始且在約44分鐘時結束。酸性峰群組可進一步分離為按以下順序從主峰洗脫之7個亞種類。在以下滯留時間處的AP1 (a,b,c)、AP2、AP3 (a,b)及AP4 (表2)。藉由使用以下滯留時間來分割單峰之整合，而主峰為參考峰。已根據顯示於圖4A至B中之參考層析圖來進行整合。 表 2：酸性峰之整合及分割設定開始之實例
峰 RT (min)
AP4 16.0至18.7
AP3b 18.7至20.6
AP3a 20.6至22.7
AP2 22.7至24.1
AP1c 24.1至26.0
AP1b 26.0至27.3
AP1a 27.3至28.2
MP 28.2至30.2
BP1 30.2至31.7
BP2 31.7至33.5
BP3 33.5至36.2
醣基化變體之偵測
使用每一樣本0.2 mg蛋白質一式兩份製備分析樣本及參考標準。利用PNGase F (NEB P0704L，根據製造商說明書)從樣本/參考標準酵素釋放寡醣且用2-胺基苯甲醯胺(2-AB (Ludger；LT-KAB-A2)，根據製造商說明書)標記。將純水用作空白對照且與樣本/參考標準平行製備。使用具有HILIC管柱(Glycan BEH醯胺管柱，130Å，1.7 μm，2.1 mm × 150 mm)及螢光偵測器(FLD)之UPLC (例如Nexera, Fa. Shimadzu)))分析經標記寡醣。使用此方法來確定寡醣概況(Oligo Map)及定量spesolimab藥物物質或蛋白A池之寡醣結構。在N-聚醣釋放及2-AB-標記之後，使用胺基丙基匣筒(例如SepPak；Waters；WAT020840)使用真空腔室或自動化固相萃取系統來純化等分試樣。使用蒸發器乾燥經洗脫之流份及再懸浮於80 µl中，然後使用0.7 mL/min之流速及波長FL偵測器(消光波長330 nm；發射波長420 nm)、在以下梯度下之流動相A (0.05 M銨形式，pH 4.5 / 50%乙腈(ACN))及流動相B：乙腈HPLC級(ACN))進行HPLC分析。藉由運行25分鐘從50%至80%洗脫劑A之線性梯度來進行洗脫。
參考標準及樣本之層析圖之整合範圍為約4至20分鐘。滯留時間根據所使用的設備及流動相而略有不同。峰3(圖5，亦稱為(寡聚物譜圖峰3))之相對峰面積係根據下式計算
Figure 02_image011
峰x = 1、2、3、4、5或6 絕對峰面積 = 所有整合峰面積之總和
一次注射的所有峰之相對峰面積稱為峰之總和(絕對峰面積)。峰3包含高甘露糖(Man5)結構。 實例 1 ：鐵及銅對BPG及高甘露糖之影響
在實驗設計(DOE)方法中研究不同濃度之鐵及銅以及其相互作用對細胞培養性能及產物品質參數(包括酸性及鹼性電荷變體(酸性峰群組(APG)及鹼性峰群組(BPG))及高甘露糖種類)之效應。DOE研究係允許改變多個輸入因素並確定其對不同輸出參數之組合及單一效應之資料收集及分析工具。因此，此類研究可藉由在製程中同時改變多個輸入之量值來識別製程中多個因素之相互作用。
利用如上所述的製程條件來進行在完全自動化15 mL小型生物反應器中之24個培育實驗。將細胞以1.0 x 10 6個細胞/ml接種於基礎培養基中。使用檸檬酸鐵膽鹼(Dr. Paul Lohmann GmbH KG)作為鐵源，使基礎培養基中之鐵濃度在1.4至6.0 mM之間變化。在無菌過濾之前將檸檬酸鐵膽鹼(0.7、1.4、2.1及3.0 g/L檸檬酸鐵膽鹼)直接添加至包含5.8 µM鐵(硝酸鐵及硫酸亞鐵)之培養基調配物。銅係呈CuSO 4提供且在0.36至1.71 µM之間變化。在接種之前，在生物反應器中，在直接無菌添加至包含0.139 µM CuSO 4之基礎培養基後，補給另外的銅溶液(CuSO 4)。每天以30 ml/L/天添加包含1.13 mM鐵(呈檸檬酸鐵膽鹼提供；565 µM)及0.43 mM CuSO 4之饋料培養基。
利用統計軟體套件(Design Expert，Stat Ease, Inc.)評估的輸出參數為spesolimab產品效價、整合活細胞密度、第14天存活率及產品品質參數APGs、藉由陽離子交換層析(CEX)測定的BPG及藉由HILIC UHPLC確定的透過甘露糖5結構所代表的高甘露糖種類(表3)。 表 3：實驗設計之綜述
運行 因子 反應
DoE運行編號 1 A Cu [µm] 1 B Fe [µm] 產物濃度 [mg/L] IVC [1e6個活細胞*h/mL] 存活率 [%] HP-SCX APGs [%] HP-SCX BPG [%] HP-SCX主峰 [%]
DoE運行編號1 1.709 6060.2 3275 2716 39.5 38.8499 7.6791 53.471
DoE運行編號2 0.57 1418.5 2489 2574 30.7 42.6608 5.7762 51.563
DoE運行編號3 0.359 1418.5 2570 2548 29.8 41.6469 5.5415 52.8117
DoE運行編號4 0.359 1418.5 2540 2559 30.2 41.8276 5.4723 52.7001
DoE運行編號5 1.709 6060.2 3135 2732 36.4 39.526 7.5707 52.9033
DoE運行編號6 0.359 6060.2 3021 2692 32.1 40.8427 4.9329 54.2244
DoE運行編號7 1.709 4243.9 3359 2845 39.3 38.5471 7.9149 53.538
DoE運行編號8 0.926 6060.2 3430 2750 39.1 38.7951 6.2244 54.9805
DoE運行編號9 0.926 6060.2 3336 2856 38.7 39.5181 6.1785 54.3033
DoE運行編號10 0.926 4243.9 3135 2732 36.4 40.2692 6.2954 53.4354
DoE運行編號11 0.57 2831.2 3015 2665 34.4         
DoE運行編號12 1.709 6060.2 3114 2670 32.5 39.6907 7.5364 52.7728
DoE運行編號13 0.359 6060.2 3368 2972 41.1 40.0037 4.8158​ 55.1805
DoE運行編號14 1.709 1418.5 2733 2646 31.6 40.7905 8.4525 50.757
DoE運行編號15 0.359 4243.9 3090 2822 35.3 40.3784 5.0608 54.5607
DoE運行編號16 0.926 4243.9 3208 2821 36.8 40.7413 6.3177 52.941
DoE運行編號17 0.359 2831.2 3024 2738 33.7 40.3231 5.2703 54.4066
DoE運行編號18 1.709 1418.5 2707 2690 30.7 40.9797 8.5259 50.4944
DoE運行編號19 1.709 1418.5 2770 2472 32.8 40.4689 8.5401 50.991
DoE運行編號20 0.359 6060.2 3126 2813 34 40.1859 5.0883 54.7258
DoE運行編號21 0.926 1418.5 2671 2568 30.5 40.7017 7.7322 51.5662
DoE運行編號22 0.359 1418.5 2506 2434 27.5 41.5386 5.8857 52.5758
DoE運行編號23 1.709 2831.2 3144 2805 34.3 39.2898 8.3987 52.3115
DoE運行編號24 0.926 2831.2 2959 2644 31 40.4996 6.7522 52.7482
顯示於圖1A至F中之結果證實以高鐵濃度及低銅濃度達到最低BPG (圖1A、B及C)。同樣地，較高鐵濃度及較低銅濃度似乎有益於效價(圖1D)、活細胞密度(圖1E)及存活率(圖1F)。 實例 2 ：製程參數對BPG及高甘露糖之影響
在DOE方法中評估細胞培養製程參數接種細胞密度、培育溫度及溶解氧濃度，以研究其對產品品質參數BPG及高甘露糖種類之影響。接種細胞密度從0.5至150萬個細胞/ml，溫度從35℃至38℃變化，生物反應器中之溶解氧濃度從40直至80%變化及饋料速率從基於每天培養起始體積計29.7直至36.3 mL/L變化。在完全自動化24-小型生物反應器系統中以饋料批次模式進行24個平行運行持續14天。如以上所述進行其他培養參數及分析方法。利用統計軟體套件(Design Expert，Stat Ease, Inc.)評估的輸出參數為spesolimab產品效價、整合活細胞密度、第14天存活率及產品品質參數APGs、藉由CEX測定的BPG及藉由HILIC-UHPLC確定的高甘露糖5種類(表4)。 表 4 ：製程參數對BPG及高甘露糖之影響
運行 因子 反應
1 (A) SCD [1e6個細胞/mL] 2 (B) 溫度 [℃] 3 (C) DO [%] 4 (D) 饋料速率[mL/L/d] HP-SCX APG [%] HP-SCX 主峰 [%] HP-SCX BPG [%] 寡聚物譜圖峰3 [%]
DoE運行1 0.5 38 80 36.3 48.4307 41.6024 9.9668 3.3907
DoE運行2 1 36.5 60 33 38.983 55.3915 5.6255 2.5953
DoE運行3 0.5 38 40 33 40.1887 52.4259 7.3854 2.773
DoE運行4 1.5 38 60 36.3 42.8188 51.7155 5.4657 2.4207
DoE運行5 1.5 36.5 40 33 39.4805 55.7712 4.7483 2.2246
DoE運行6 1.5 36.5 80 36.3 38.6954 53.0661 8.2384 2.9646
DoE運行7 0.5 36.5 80 29.7 34.8409 53.5268 11.6322 3.0047
DoE運行8 0.5 35 80 33 33.3687 53.1322 13.4991 3.3424
DoE運行9 0.5 35 40 29.7 30.9043 58.4277 10.668 3.5845
DoE運行10 1.5 35 80 29.7 33.7413 56.7309 9.5278 2.9234
DoE運行11 1.5 35 60 33 33.9172 59.1234 6.9593 2.6479
DoE運行12 1 36.5 60 29.7 37.6827 57.0318 5.2856 2.2165
DoE運行13 1.5 35 40 36.3 34.9144 58.0599 7.0256 2.9119
DoE運行14 1.5 38 40 29.7 44.0231 51.1164 4.8605 2.3038
DoE運行15 0.5 35 60 36.3 31.5503 54.6764 13.7733 3.9877
DoE運行16 1 36.5 60 33 37.4845 56.7758 5.7397 2.4537
DoE運行17 1.5 38 80 29.7 43.9258 47.9145 8.1597 2.6825
DoE運行18 0.5 38 60 29.7 40.3619 50.9505 8.6876 2.7644
DoE運行19 1 38 80 33 43.2368 47.2226 9.5406 2.7673
DoE運行20 1 35 80 36.3 35.7668 52.3688 11.864 3.2503
DoE運行21 1 35 40 29.7 33.1456 59.6815 7.1729 2.7785
DoE運行22 1 36.5 60 33 38.0348 56.1745 5.7907 2.4649
DoE運行23 0.5 36.5 40 36.3 35.486 57.2048 7.3092 3.2644
DoE運行24 1 38 40 36.3 42.8652 51.4559 5.679 2.5289
顯示於圖2A至H中之結果證實利用高接種密度及較高溫度達到最低BPG (圖2A、B及C)及利用高接種密度及低溫類似地達到最低高甘露糖(5Man)結構(圖2D及E)。同樣地，效價(圖2F)及活細胞密度(圖2G)隨著高接種密度及較高培養溫度而增加。利用高接種密度及較高培養溫度，14天培養後的存活率似乎略微減少(圖2H)，但此似乎並不負面影響效價。顯示於圖3 A至D中之結果證實溶解氧之減少亦對BPG (圖3A)、高甘露糖結構(圖3B)、效價(圖3C)及活細胞密度(圖3D)具有有益效應。 實例 3 ：不同異質變體 (APG/BPG) 之 IL36 及 FcRN 結合
為了確定針對於Spesolimab所收集的CEX流份之效力，進行IL36R結合(SPR)及IL36R生物檢定(表5)。
大多數分離的CEX流份顯示與藥物物質源材料之效力相當的效力。觀測到最具酸性的流份AP4之效力降低且在更小程度上觀測到酸性流份AP3b之效力降低(FcRn結合(SPR)亦是如此)。兩種流份且尤其是流份AP4顯示相當不明確的洗脫概況(圖4A及B)，且具有低相對豐度＜ 1% (表5)。
類似地，最具鹼性的流份BP3亦顯示相當不明確的洗脫概況(圖4A及B)，其中低相對豐度小於1.5% (表5)。在IL36R結合(SPR)內，此流份顯示減少之回收，意指對蛋白A/G感測器晶片之結合減少，其符合於顯示於圖4C中之此流份內所觀測到的寡聚物之增加。 表 5：針對於Spesolimab收集的CEX流份之IL36R生物檢定、IL36R結合(SPR)及FcRn結合(SPR)。
CEX IL36R 生物檢定 IL36R 結合 (SPR) FcRn 結合 (SPR)
CEX之總面積之相對量 [%] 效力[%] 回收 (a)[%] 效力 (b)[%] 結合[%]
AP4流份 0.5 60 75 93 69
AP3b流份 0.8 80 87 93 84
AP3a流份 2.8 91 88 98 88
AP2流份 2.4 94 90 99 n.a.
AP1c流份 2.2 102 90 100 90
AP1b流份 7.6 99 92 100 89
AP1a流份 13.6 102 93 99 92
MP流份 62.5 110 95 102 95
BP1流份 3.75 97 93 100 95
BP2流份 2.4 97 84 100 91
BP3流份 1.3 n.a. 70 100 n.a.
CMC2源 N/A 91 93 101 94
n.a. = 未分析(由於缺乏材料) (a)該回收說明結合至固定於感測器晶片上之蛋白A/G之種類之量(SPR檢定之第一步驟)。 (b)效力說明結合至蛋白A/G之種類之IL36R結合活性(SPR檢定之第二步驟)。 BPG種類
鹼性峰群組尤其包括不同N端及C端電荷變體。所觀測到的N端電荷變體為含有N端麩醯胺酸替代N端焦-麩醯胺酸之Spesolimab (主要於流份BP2中之輕鏈的N端上觀測到，但亦於流份BP1中之重鏈的N端處在更小程度上觀測到)。此外，在重鏈的N端處含有另外胺基酸VHS之Spesolimab富集於流份BP3 (N端信號肽之殘留物)中。所觀測到的C端電荷變體為在一個(流份BP1)重鏈或兩個(流份BP3)重鏈的C端處含有另外離胺酸之Spesolimab。此外，富集在一個(流份BP1)重鏈或兩個(流份BP3)重鏈的C端處含有脯胺酸醯胺之Spesolimab (藉由移除C端甘胺酸及相鄰脯胺酸之醯胺化產生)。 APG種類
酸性峰群組尤其包括攜載含有N-乙醯基神經胺糖酸(NANA)之N-聚醣之Spesolimab及/或攜載在N386+N391+N392 (HC)處之去醯胺化之Spesolimab。另外，在更多酸性峰內觀測到推定由缺失一個輕鏈之Spesolimab組成之片段之中度富集。 實例 4 ：離胺酸糖基化變體
糖基化係形成各種類型之共價加合物的結果，其中葡萄糖可與離胺酸殘基或N端之一級胺反應從而導致形成酸性變體。spesolimab之糖基化因葡萄糖包含於培養基中而在上游製造期間發生。可在細胞培養中且在收成時產生糖基化種類，其中該等細胞及spesolimab分子經暴露於更高己醣含量。在下游製造過程中不應用還原糖，但可存在或形成於醫藥調配物(亦即藥物產品)中。
離胺酸殘基對糖基化之易感性係藉由溶劑可及性(三級結構)及其側鏈(一級及二級結構)之化學環境來確定。在IgGs中，大多數糖基化分佈於超過30個離胺酸殘基上(Miller AK、Hambly DM、Kerwin BA、Treuheit MJ、Gadgil HS，Journal of Pharmaceutical Sciences，2011，100(7): 2543-2550)。Spesolimab具有在輕鏈(LC；SEQ ID NO:2)中之11個離胺酸殘基及在重鏈(HC；SEQ ID NO:1)中之33個離胺酸殘基，其可經歷糖基化。因為存在接近重鏈之CDRs之3個離胺酸殘基(潛在關鍵離胺酸：HC -K23、K38、K67；SEQ ID NO: 1)，故糖基化對於抗體之功效/效力而言可能至關重要。 經由利用LC-MS之相對定量之糖基化之總和(還原)
為了利用LC-MS確定減少之總和糖基化之相對定量，其中用1 µL (1U/µL) N-糖苷酶F (Roche PO11365193001或等效物)處理經稀釋至1 mg/mL之Spesolimab 100 µL樣本，以在用1 µL 1 M DTT還原之前移除N-連接的寡醣。在57℃下進行還原20分鐘。所得LC及去糖基化HC藉由逆相-高效層析(RP-HPLC)分離且藉由ESI Q-TOF MS (Xevo G2 Q-TOF)線上分析。分析蛋白質次單元及相應葡萄糖加成物(M葡萄糖加成 = 162 Da)且使用MaxEnt™演算法解迴旋所獲得的光譜(表6)。 表 6：藉由LC-MS之糖基化離胺酸變體
變體 來自藥物物質之代表性相對分布(%)
輕鏈
非糖基化 99
糖基化 1
重鏈
非糖基化 97
糖基化 3
利用LC-MS之相對定量(單一糖基化位點)
為了利用LC-MS確定單一糖基化位點之相對定量，使樣本變性且緩衝液交換至Tris鹽酸胍鎓緩衝液(用7M鹽酸胍鎓/100 mM Tris/HCl稀釋樣本至1 mg/mL，pH 8.3)中，在57℃下用二硫蘇糖醇(DTT，最終濃度：10 mM)還原20分鐘且在室溫下在黑暗中用碘乙酸(IAA，最終濃度：10 mM)烷基化20分鐘。隨後，藉由添加50 mM DTT來淬滅反應。在還原及烷基化之後，再次將樣本緩衝液交換至100 mM碳酸氫銨緩衝液中，且使用胰凝乳蛋白酶在表面活性劑存在下酵素消化。在30分鐘後，在37℃下藉由添加甲酸(1:120，體積:體積)來中止反應。藉由逆相液相層析分離肽且藉由ESI-MS分析。基於野生型肽及攜載葡萄糖加成物(+ 162 Da)之肽之提取離子層析圖來定量經糖基化肽之相對量(表7)。 表 7 ：於分子上之單一離胺酸糖基化分佈
離胺酸殘基 經糖基化離胺酸%
HC K12+K13+K19+ K23 (a),(c),(d) 0.3
K38 (a) n.d.
K67 (a) n.d.
K123+K135 (c)  0.1
K149 (b) 0.4
K207  0.1
K212+K215+K220+K224 (c) 0.2
K248+K250 0.4
K276 0.1
K290 n.d.
K319 0.1
K322+K324+K328+K336 (b), (c) 0.3
K328+K336 (b) 0.2
K336+K340+K342 (c) 0.0
K340+K342 (c) 0.0
K362 n.d.
K372 0.0
K394 0.0
K416 0.0
LC K40 0.0
K104 (b) 0.1
K104+K108 (b), (c) 0.0
K127 0.1
K146 0.0
K150+K170 (b), (c) 0.3
K184 0.2
K184+K189+K191 (b), (c) 1.4
K208 n.d.
(a)接近CDR， (b)於高葡萄糖應力條件(例如0.5 M葡萄糖)下之糖基化增加， (c)離胺酸在相同肽內且僅在未區分殘基下一起分析， (d)於高葡萄糖應力條件(例如0.5 M葡萄糖)下之一些糖基化
重鏈及輕鏈之經糖基化離胺酸變體分別處於≤ 3%及≤ 1%之低含量，但可偵測(表6)且處於通常在文獻中針對重組IgGs所見之5至15%之較低範圍內(Eon-Duval A等人，J Pharm Sci，2012，101(10)：3604-3618)。進一步令人驚訝地發現，關鍵殘基上之糖基化低於偵測限度或對於K23而言低於0.3% (表7，關鍵殘基以粗體突顯)。
儘管已描述本發明之某些態樣及實施例，但此等態樣及實施例僅經由實例呈現，且不意欲限制本發明之範疇。實際上，在不脫離本發明之精神下，本文所述的新穎方法及系統可以各種其他形式來體現。隨附申請專利範圍及其等效物意欲涵蓋將落入本發明之範疇及精神內之此類形式或修改。
本揭示內容中引用的所有專利及/或公開案(包括期刊文章)均以引用之方式明確併入本文中。
圖 1顯示如DoE方法之實例中所描述，各種Fe濃度(µM)及各種Cu 2+濃度(µM)對產物品質之效應。(A)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)針對Cu 2+及針對鐵所測定，各種鐵及銅濃度對BPG (%)之效應的等高線圖。(B)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，各種銅濃度對BPG (%)之效應的單因子圖。(C)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，各種鐵濃度對BPG (%)之效應的單因子圖。單因子圖中之虛線表示95%置信區間。進一步顯示各種鐵及銅濃度對(D)產物濃度(mg/L)、(E) IVC (1e6個細胞*h/mL)及(F)存活率(%)之效應的等高線圖。
圖 2顯示如DoE (實驗設計)方法之實例中所描述，各種接種密度(1e6個細胞/ml，因子1)、培養溫度(℃，因子2)、溶解氧(DO%，因子3)及饋料速率(mL/L/天，因子4)對產物品質之效應。(A)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，不同培養溫度及接種密度對BPG (%)之效應的等高線圖。(B)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，各種接種密度對BPG (%)之效應的單因子圖。(C)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，各種培養溫度對BPG (%)之效應的單因子圖。(D)顯示不同接種細胞密度對Man5結構(寡聚物譜圖峰(Oligo Map Peak) 3 (%))之效應的單因子圖。(E)顯示不同培養溫度對Man5結構(寡聚物譜圖峰 3 (%))之效應的單因子圖。單因子圖中之虛線表示95%置信區間。進一步顯示各種溫度及接種密度對(F)產物濃度(效價，mg/L)、(G) IVC (1e6個細胞*h/mL)及(H)存活率(%)之效應的等高線圖。
圖 3顯示如DoE方法之實例中所描述，各種接種密度(1e6個細胞/ml，因子1)、培養溫度(℃，因子2)、溶解氧(DO%，因子3)及饋料速率(ml/L/天，因子4)之效應。(A)顯示如藉由強陽離子交換層析HPLC (HP-SCX)所測定，各種DO濃度對BPG (%)之效應的單因子圖。(B)顯示各種DO濃度對Man5結構(寡聚物譜圖峰3 (%))之效應的單因子圖。(C)顯示各種DO濃度對產物濃度(效價，mg/L)之效應的單因子圖。(D)顯示各種DO濃度對IVC (1e6個細胞*h/mL)之效應的單因子圖。單因子圖中之虛線表示95%置信區間。
圖 4顯示使用陽離子交換層析(CEX)之spesolimab異質性圖譜。(A)顯示具有酸性峰及鹼性峰之註解之陽離子交換層析(CEX)層析圖譜。(B)顯示在放大比例下與(A)中相同的陽離子交換層析(CEX)層析圖譜。(C)顯示從不同單一酸性峰流份收集之CEX層析圖的重疊圖。
圖 5顯示使用利用螢光偵測之HILIC-UHPLC之Spesolimab之代表性寡醣形式。其顯示經峰1至6標記之主要寡聚物譜圖峰；峰1 = A1FG0 (唾液酸化-非半乳糖化核-岩藻糖基化單分支)，峰2 = A2FG0 (唾液酸化-非半乳糖化核-岩藻糖基化雙分支)，峰3 = Man5五甘露糖核，峰4 = A2FG1 (唾液酸化-單半乳糖基化核-岩藻糖基化雙分支)，峰5 = A2FG1 (唾液酸化-單半乳糖基化核-岩藻糖基化雙分支)，峰6) = A2FG2 (唾液酸化-二半乳糖基化核-岩藻糖基化雙分支)。x-軸顯示層析圖之整合範圍(單位為分鐘)及y-軸顯示作為電壓信號之螢光。 
<![CDATA[<110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司(Boehringer Ingelheim International GmbH)]]>
          <![CDATA[<120> 製備SPESOLIMAB之方法]]>
          <![CDATA[<130> 117008P1140PC]]>
          <![CDATA[<150> EP2117181.2]]>
          <![CDATA[<151> 2021-05-03]]>
          <![CDATA[<160> 4]]>
          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3.6]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 449]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> Spesolimab重鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                  115                 120                 125             
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
                          165                 170                 175     
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
              210                 215                 220                 
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                  435                 440                 445             
          Lys 
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 215]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> Spesolimab輕鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215 
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 119]]>
          <![CDATA[<212]]>> PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人造序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt; ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; Spesolimab可變重鏈胺基酸序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 3]]&gt;
          <br/><![CDATA[Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Trp Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Val Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Val Phe Tyr Gly Glu Pro Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 108]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人造序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> Spesolimab可變輕鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Arg Thr Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Phe His Arg Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (16)

  1. 一種在細胞培養中產生抗體spesolimab之方法，其包括 (a) 使用饋料批次培養，在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括 (i)  將該等細胞接種於培養基中，及 (ii) 在培養基中，於允許在細胞培養中產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括在該細胞培養中使用饋料培養基饋養該等細胞， 其中在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內，添加0.35至1.2 µM之Cu 2+及1500 µM或更多之鐵至培養基中； (b) 收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及 (c) 視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。
  2. 如請求項1之方法，其中在步驟(i)中接種之前及/或在接種後1天內，添加該Cu 2+及該鐵至培養基中。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該培養基中之增加鐵濃度及/或減少銅濃度導致產生具有減少鹼性峰群組% (BPG%)之抗體spesolimab。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該抗體spesolimab具有≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG。
  5. 如請求項1或2之方法，其中步驟(a)中之該接種密度為≥0.7x10 6個細胞/ml，較佳0.7x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，更佳0.8x10 6個細胞/ml至1.5x10 6個細胞/ml，甚至更佳0.9x10 6個細胞/ml至1.3x10 6個細胞/ml。
  6. 一種在細胞培養中產生抗體spesolimab之方法，其包括 (a) 使用饋料批次培養，在無血清細胞培養基中培育包含編碼抗體spesolimab之核酸之CHO細胞，包括 (i)  將該等細胞以≥0.7x10 6個細胞/ml之細胞密度接種於培養基中，及 (ii) 在培養基中，於允許在細胞培養中產生抗體spesolimab之條件下培養該等細胞，包括在該細胞培養中用饋料培養基饋養該等細胞， 其中，視需要，在步驟(i)中接種細胞之前及/或在接種後2天內，添加0.35至1.2 µM之Cu 2+及1500 µM或更多之鐵至培養基中； (b) 收成包含抗體spesolimab之細胞培養上清液；及 (c) 視需要從該細胞培養上清液純化抗體spesolimab。
  7. 如請求項1、2及6中任一項之方法，其中增加之接種密度導致產生具有減少鹼性峰群組% (BPG%)及/或Man5結構%之抗體spesolimab。
  8. 如請求項1、2及6中任一項之方法，其中該等細胞係在36.0℃至37.5℃下，於允許產生抗體spesolimab之條件下培養，包括使用饋料培養基饋養該等細胞，及/或其中該培養中之溶解氧(DO)濃度係維持在30至60%之範圍內。
  9. 如請求項1、2及6中任一項之方法，其中提高培養溫度及/或減少溶解氧導致產生具有降低BPG%及/或Man5結構%之抗體spesolimab。
  10. 如請求項1、2及6中任一項之方法，其中該抗體spesolimab具有少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構，及/或≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 6.5%之BPG。
  11. 一種包含抗體spesolimab之組合物，該抗體spesolimab具有 (a)    ≤ 7.5%之BPG，較佳≤ 7%之BPG，更佳≤ 6.5%之BPG，甚至更佳≤ 6%之BPG；及/或 (b)    少於5%之Man5結構，較佳少於4%之Man5結構，更佳少於3%之Man5結構。
  12. 一種包含抗體spesolimab之組合物，其中該抗體spesolimab係藉由如請求項1至10中任一項之方法來獲得。
  13. 如請求項11或12之組合物，其中該組合物為包含具有少於7.5%之BPG及/或少於5%之Man5結構之抗體spesolimab之藥物產物。
  14. 如請求項11或12之组合物，其中該抗體spesolimab包含≤ 6%之離胺酸糖基化重鏈(HC)變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)係未糖基化及在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。
  15. 一種包含抗體spesolimab之組合物，其包含≤ 6%之離胺酸糖基化重鏈(HC)變體及/或其中離胺酸K38 (HC)及K67 (HC)係未糖基化及在K23 (HC)處之糖基化為≤ 0.3%。
  16. 一種包含抗體spesolimab之組合物，其包含少於1%之酸性峰群組(APG)次流份AP4及少於4%之AP3流份，特別是少於1%之AP4及少於1%之AP3b流份。
TW111116568A 2021-05-03 2022-05-02 製備spesolimab之方法 TW202309087A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21171881.2 2021-05-03
EP21171881 2021-05-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202309087A true TW202309087A (zh) 2023-03-01

Family

ID=75787012

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111116568A TW202309087A (zh) 2021-05-03 2022-05-02 製備spesolimab之方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220356258A1 (zh)
EP (1) EP4334356A1 (zh)
JP (1) JP2024517784A (zh)
KR (1) KR20240004718A (zh)
CN (1) CN117222668A (zh)
AU (1) AU2022269799A1 (zh)
BR (1) BR112023017717A2 (zh)
CA (1) CA3218684A1 (zh)
CL (1) CL2023002841A1 (zh)
MX (1) MX2023012903A (zh)
TW (1) TW202309087A (zh)
WO (1) WO2022233770A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023534955A (ja) * 2020-07-17 2023-08-15 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 好中球性皮膚症の処置のための抗ｉｌ－３６ｒ抗体

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060115901A1 (en) * 2004-10-22 2006-06-01 Bahram Valamehr Method and media for single cell serum-free culture of CHO cells
US8911964B2 (en) * 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
CN107007833B (zh) * 2011-11-16 2020-12-11 勃林格殷格翰国际有限公司 抗il-36r抗体
AR095348A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-07 Genentech Inc Medios de cultivo celular y métodos de producción de anticuerpos
EP3083933A1 (en) * 2013-12-20 2016-10-26 Biogen MA Inc. Use of perfusion seed cultures to improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality
CN107429227B (zh) 2015-04-01 2022-03-01 勃林格殷格翰国际公司 细胞培养基
KR20210119407A (ko) * 2018-12-27 2021-10-05 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 수장 족저 농포증 치료용 항-il-36r 항체

Also Published As

Publication number Publication date
CA3218684A1 (en) 2022-11-10
BR112023017717A2 (pt) 2024-01-09
AU2022269799A1 (en) 2023-09-14
CN117222668A (zh) 2023-12-12
MX2023012903A (es) 2023-11-08
KR20240004718A (ko) 2024-01-11
CL2023002841A1 (es) 2024-03-22
JP2024517784A (ja) 2024-04-23
US20220356258A1 (en) 2022-11-10
EP4334356A1 (en) 2024-03-13
WO2022233770A1 (en) 2022-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102671089B1 (ko) 세포 배양 배지
AU2018202612B2 (en) Cell culture medium comprising small peptides
EP2563904B1 (en) Improved cell culture medium
US5096816A (en) In vitro management of ammonia&#39;s effect on glycosylation of cell products through pH control
EP2563903B1 (en) Improved cell culture medium
KR102280638B1 (ko) 재조합 당단백질 제조에서의 세포 성장 및 글리코실화의 조절
WO2010050448A1 (ja) ペプチド含有動物細胞培養用培地
CN105567627A (zh) 使用含高浓度氨基酸的培养基的细胞培养方法
TW202309087A (zh) 製備spesolimab之方法
RU2798069C2 (ru) Улучшенная среда для культивирования клеток