KR102280638B1 - 재조합 당단백질 제조에서의 세포 성장 및 글리코실화의 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 성장 또는 바이오매스 발생을 향상시키는 조건과 발효 배양 조건 하에서 진핵 세포에 의해 생성되는 발현된 당단백질의 N-글리코실화 성숙도에 영향을 주는 조건 사이를 선택하기 위한 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 당단백질 생성 세포를 원하는 최종 결과에 맞춰지는 배지에서 배양한다. 본 발명은 또한 배지 및 이의 용도를 포함한다.

Description

재조합 당단백질 제조에서의 세포 성장 및 글리코실화의 조절 {MODULATION OF CELL GROWTH AND GLYCOSYLATION IN RECOMBINANT GLYCOPROTEIN PRODUCTION}

본 출원은 미량 원소가 재조합 당단백질의 발효에 의한 생성에서 세포 성장 및 단백질 글리코실화에서 작용하는 역할에 관한 것이다.

재조합 당단백질은 전형적으로 진핵 발현 시스템을 사용하는 발효 생성 과정에 의해 생성된다. 단백질의 번역-후 글리코실화는 중요한 물리화학적 및 생물학적 특성 및 기능, 예컨대 단백질 용해도, 안정성, 소거율, 면역원성 및 면역 효과기 작용을 수행하는데 필수적이다. 당단백질의 글리코실화 상태는 밀접하게 조절되고 심지어 글리코실화에서의 작은 차이가 큰 영향을 줄 수 있다. 그러나, 다수의 효소가 특히 N-글리코실화에 관여하므로, 경로는 진핵 세포에서 수행되는 가장 복잡한 번역-후 개질이다. 당단백질에서, 당은 아스파라긴의 측쇄 중의 아미드 질소 원자 (N-연결) 또는 세린 또는 트레오닌의 측쇄 중의 산소 원자 (O-연결) 에 부착된다. 글리코실화는 소포체 중의 N-연결의 형성, 소위 "코어 글리코실화" 로 시작된다. 그 다음, 폴리펩티드는 O-연결된 당이 첨가되고 N-연결된 당 사슬이 많은 상이한 방식으로, 예를 들어 만노오스 잔기의 제거, N-아세틸글루코사민, 갈락토오스 및/또는 푸코오스 및/또는 시알산 잔기의 첨가에 의해 개질되는 골지체 (Golgi apparatus) 로 수송된다.

금속 및 이들의 이온은 생물학에서 필수적인 역할을 한다 (Yannone et al., Current Opinion in Biotechnology 23.1 (2013) 89-95). 39 개의 필수적인 생물학적 원소 중에서, 26 개가 금속이라는 것이 보고되어 있다. 게다가, 이들의 생물학적 기능을 충족시키기 위해 필요한 상기 금속의 활성 농도에는 상당한 변화가 있다. 필수 금속은 다량영양소, 예컨대 칼슘, 칼륨 또는 마그네슘, 및 미량원소 예컨대 미량 금속 철, 아연, 망간 또는 구리, 및 초-미량 원소, 예컨대 바나듐 및 텅스텐으로 분류될 수 있다. 상기 필수 금속이 생물학적 항상성에 중요할 지라도, 이들은 이들의 생물학적 기능에 필요한 것을 넘는 농도에서는 독성이 있을 수 있다. 따라서, 전신적 금속 농도의 밀접한 조절은 생물학적 항상성에 필수적이다.

전이 금속 구리, 철, 아연, 및 망간은 이들의 생물학적 활성 농도에 따라 미량 원소로서 분류되고, 세포 항상성에서 핵심 참가자이다. 이들은 Fraga and Fraga (Mol. Aspects Med. 26.4-5 (2005) 235-44) 에 기재되는 바와 같이 많은 효소의 활성 부위에서 발견된다.

현재 수 년 동안, 세포 성장에서 미량 원소의 역할은 동물 급여 및 세포 배양 실험을 사용하여 연구되어 왔다. 성공적인 세포 배양을 위해 필요한 그 미량 원소는 Ham et al 에 의해 제시되고 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53 (1965) 288-93). 또한 단백질 글리코실화에서의 미량 원소의 역할에도 많은 관심이 있지만, 뚜렷한 미량 원소의 구체적인 효소적 기여 및 글리코실화 경로에서의 금속 양이온의 상호작용은 비교적 모르는 채로 남아있다.

일반적으로, 글리코실화 효소의 활성은 2원자가 미량 원소 (예컨대 Zn²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺) 의 이용가능성, pH 환경 및 뉴클레오티드 포스페이트 (UTP, GTP, CTP) 및 상응하는 당 유도체 (UDP-Gal, UDP-GlcNAc, GDP-Fuc, CMP-시알산) 의 이용가능성에 따라 다르다.

Kaminska et al., (Glyconj. J. 15.8 (1998) 783-88) 은 당단백질 6-α-L-푸코실트랜스페라아제의 활성에 대한 2원자가 양이온의 역할을 연구하여, 2원자가 양이온, 예컨대 Mg²⁺ 및 Ca²⁺ 가 상기 효소를 활성화시키는 도중에, Cu²⁺, Zn²⁺ 및 Ni²⁺ 가 상기 효소의 활성을 강하게 억제한다는 것을 밝혔다. Witsell et al., (J. Biol. Chem. 265.26 (1990) 15731-37) 는 고유의 포유동물 골지 (Golgi) 소낭 중의 갈락토실트랜스페라아제의 활성화에서의 특정 2원자가 양이온의 역할을 기재한다. Crowell et al., (Biotechnol. Bioeng. 96.3 (2007) 538-49) 은 미량 원소, 특히 망간이, 다른 배양 인자와, 예컨대 아미노산 이용가능성, 후기 공정 상에서 스트레스를 받은 배양물과 상호작용하여 단백질 글리코실화를 조절한다는 것을 기재한다. Gawlitzek et al., (Biotechnol. Bioeng. 103.6 (2009) 1164-75) 은 세포 배양 조건, 예컨대 망간 및 철 농도, 특이적 생산성 향상제 부티레이트, 갑상선 호르몬 및 배양 pH 가 CHO 세포에서 발현된 재조합 당단백질의 N-글리코실화 위치-점유를 통제할 수 있다는 것을 관찰하였다.

US 2007/0161084 에서 개략되듯이, 글리코실화에 관여되는 다수의 효소는 조-인자로서 상이한 양이온을 이용한다. 상기 출원에서, 발명자들은 당단백질의 시알릴화, 즉, 당단백질 상의 탄수화물 사슬에 대한 말단 시알산 잔기의 부가, 특히 에리트로포이에틴의 시알릴화가, 무-독성 양의 망간을 함유하는 배지에서 당단백질을 발현하는 포유동물 숙주 세포를 성장시킴으로써 개선될 수 있을 것이라는 것을 발견하였다. 망간은 초기 성장 배지에 존재할 수 있거나 또는 빠른 세포 성장 상 후에 첨가될 수 있거나 또는 1 또는 2 회의 수확 사이클 후에 첨가될 수 있다.

세포 성장에서의 망간 및 이의 활성 농도의 역할은 논란의 여지가 있다. 망간이 정상적인 세포 성장 및 발달에 필수적이지만, 동시에 고 농도에서 독성이라는 것이 보고되었다 (Au et al., Neurotoxicology 29.4 (2008) 569-76). 예를 들어, 망간은 세포 표면에 위치하는 인테그린에 결합하여 MAP 키나아제, ERK1 및 2 (둘다 세포 성장에 중요한 스위치임) 를 활성화시키는 것으로 제시되어 있다 (Roth et al., Neurotoxicology 23.2 (2002) 147-57). 한편, Roth et al. 은 또한 망간이 많은 세포사멸 인자의 작동을 킴으로써 세포의 세포 사멸 및 세포자멸사에 연루되어 있고, 이것이 최종적으로 미토콘드리아 기능의 붕괴 및 ATP 의 상실 유도에 의해 세포 사멸을 초래한다는 것을 보여준다. 망간의 독성 효과는 철이 세포 배양 배지로부터 제거될 때 꽤 강한데, 철 및 망간이 동일한 세포 멤브레인 셔틀 DMT1 과 경쟁하기 때문이다 (Roth et al.).

US 2008/0081356 은 10 내지 600 nM 의 망간의 몰 누적 농도 및 약 8 mM 미만의 몰 누적 글루타민 농도를 함유하는 배지를 사용함으로써 상업적 규모 세포 배양물 중의 변형된 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 대규모 생성 방법을 기재한다.

WO 2012/149197 은 생성 배지에 망간 및/또는 갈락토오스를 보충함으로써 CHO 및 NSO 세포주에서, 재조합으로 발현된 단백질, 및 특히 항체의 갈락토실화 프로파일을 조절하기 위한 방법을 기재한다.

β-1,4-갈락토실-트랜스페라아제 활성에 대한 조인자로서 Mn²⁺ 의 중요성은 Ramakrishnan et al. 에 의해 이전에 기재되어 있다 (J. Mol. Biol. 357.5 (2006) 1619-33).

아연은 세포 증식 및 분화, 특히 DNA 합성 및 유사분열의 조절에 필수적인 것으로 보고되어 있다. 아연은 세포 신호 경로로부터의 전사 인자 및 효소, 예컨대 두번째 메신저 대사, 단백질 키나아제 및 단백질 포스파타아제 활성을 포함하는, 다수의 단백질의 구조적 구성성분이다 (Beyersmann et al., Biometals 14.3-4 (2001) 331-41). 따라서, 생물학적이용가능한 아연은 세포 증식과 연관되어 있다.

철은 세포 성장 조절에 핵심 참가자이다. 철, 또는 이의 수송 단백질 트랜스페린의, 화학적으로 규정된 세포 배양 배지에 대한 보충이 바이오매스 발생에 필수적이라는 것이 이전에 보고되었다. 예를 들어, 철은 무-혈청 배지 중의 C6 신경교종 및 L1210 백혈병 세포주의 세포 성장을 촉진하는 것으로 제시되었다 (Basset et al., Carcinogenesis 6.3 (1985) 355-59). 세포 성장에서의 철의 근본적인 역할은 세포 내부의 금속을 결합시킴으로써, 이의 생물학적이용가능성을 제한하는, 원형질 막을 가로지를 수 있는 킬레이터에 의해 추가로 입증된다. 데스페리옥사민 및 데스페리티오신과 같은 작용제는 배양 중 다양한 종양 세포의 성장을 억제하고 (Reddel et al., Exp.Cell Res. 161.2 (1985) 277-84 and Basset et al., supra) T-세포 증식을 크게 감소시킨다 (Polson et al., Immunology 71.2 (1990) 176-81 and Pattanapanyasat et al., Br. J. Haematol. 82.1 (1992) 13-19). 여기서, 가능한 세포 성장 억제 기작은 감소된 리보뉴클레오티드 환원효소 활성 및 감소된 양의 데옥시리보뉴클레오티드와 연관된, 철 박탈이다. 이것은 이어서 S-상에서의 유사분열 저지를 초래한다. 배지에의 철의 첨가는 성장 억제를 반전시킨다 (Lederman et al., Blood 64.3 (1984) 748-53).

WO 98/08934 는 포유류 세포의 고-밀도 성장을 지지하는 현탁 배양에서 아연 및 철 (다른 성분들 중에서도) 이 보충된 배지의 용도를 기재한다.

구리는 세포 항상성에서 필수적인 역할을 하는데, 구리 및 철의 대사 경로가 가깝게 연결되기는 한다 (Arredondo et al., Molecular Aspects of Medicine 26.4 (2005) 313-27). 전신 구리 결핍은 세포 철 결핍을 생성하고, 이것이 표현형으로 유사한 영향, 예컨대 감소된 세포 성장을 야기한다. 게다가, 구리를 킬레이트시킴으로써 생물학적이용가능성을 감소시키는 것은 성장 인자-자극된 수용체 인산화의 감소된 용량 및 최종적으로 세포 배양 연구에서 세포 증식 경로의 억제와 연관된다 (Turski et al., J. Biol. Chem. 284.4 (2009) 717-21). 한편, 구리는 혈관 형성을 자극하고, 식이 또는 구리 킬레이터에 의한 구리 결핍은 혈관형성 반응 (Harris et al., Nutr. Rev. 62.2 (2004) 60-64) 및 암 성장 (Gupte et al., Cancer Treat. Rev. 35.1 (2009) 32-46) 을 지지하기 위한 종양의 능력을 소멸시키는 것으로 입증된다.

US 2009/0068705 는 배양 배지가 구리 및/또는 글루타메이트를 포함하고, 이에 의해 폴리펩티드가 좀더 광범위하거나 좀더 바람직한 글리코실화 패턴을 갖는 세포 배양물 중의 단백질 및/또는 폴리펩티드의 대규모 생산 방법을 기재한다.

이러한 분야에서의 연구가 당효소의 자극에서의 금속 조인자의 활성에 초점을 두고 있음에도 불구하고, 다양한 저자, 예컨대 Kaminska et al., supra 는 또한 동일 또는 상이한 금속 조인자가 또다른 당효소의 활성을 억제할 수 있다는 것을 보여주었다 (예를 들어, Ca²⁺ 는 만노실-올리고당 1,2-α-만노시다아제를 활성화시키고 동시에 α-1,3-만노실-당단백질 2-β-N-아세틸글루코사미닐-트랜스페라아제를 억제한다). 활성화, 또는 단백질의 구조적 배열을 위해 필요한 시험관 내 금속 조인자, 및 글리코실화에 수반되는 다수의 효소의 금속 억제제에 대한 정보는 BRENDA 데이터베이스로부터 입수될 수 있다 (http://www.brenda-enzymes.org). 다양한 금속 조인자의 상기 이중 활성은 당단백질 생성에서 미량 원소 사용의 밀접한 조절에 대한 필요성을 부각시킨다.

당조작공학 (glycoengineering), 즉, 내인성 또는 이종 당효소의 재조합 동시-발현에 의한 단백질-연관 탄수화물의 변화는, 단백질의 약동학적 특성, 예컨대 분자적 안정성, 용해도, 생체 내 생물학적 활성 및 면역원성에 영향을 주는 것으로 입증된다. 항체에서 특히, 갈락토실화의 양의 증가는 항체 효과기 작용, 예컨대 CDC (Raju, Curr. Opin. Immunol. 20.4 (2008) 471-8) 또는 항체-의존적 세포 독성 (ADCC), 예를 들어, 인간 IgG 모노클로날 항-D 의 갈락토실화는 Fc 수용체-매개된 작용 활성에 영향을 주는 것으로 제시되었고 (Kumpel et al., Hum. Antib. Hyb. 5.3-4 (1994) 143-51); 또는 갈락토실화의 양에서의 증가는 IgG 면역 복합체에 의한 보체-매개 염증의 차단을 향상시키는 것으로 보여졌다 (Karsten et al., Nat. Med. 18.9 (2012) 1401-6). 항체 Fc 영역의 N-글리코실화는 Fc 수용체에 대한 결합에 필수적이며, 이것이 항체 효과기 작용에 관여한다. 푸코오스는 많은 항체의 N-글리칸 내의 코어 잔기이나, 비-푸코실화된 형태가 이들에 푸코실화된 대응부에 비해 향상된 ADCC 를 갖는 것으로 제시되었다. 그러므로 비-푸코실화된 단백질의 제조를 증가시키고 및/또는 항체의 푸코실화에 영향을 주기 위한 방법이 또한 바람직하다.

따라서, 세포 성장 및 바이오매스 발생을 개선하고 및/또는 글리코실화 및 그러므로 당단백질의 성숙을 지시하기 위한 것을 포함하는, 세포 배양 전략을 향상시키기 위한 방법에 대한 당업계의 필요성이 남아있다.

본 발명자는 당단백질 및 그러므로 당단백질 성숙에서 세포 배양 성능 및 특히 세포 성장 및 글리칸 형성에 대한 생물활성 미량 원소의 역할을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 세포 성장 또는 바이오매스 발생에 영향을 주는 조건과 세포에 의해 생성된 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주는 조건 사이를 선택하기 위한 방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 방법에서, 당단백질 생성 세포를 원하는 최종 결과에 맞춰지는 배지에서 배양한다.

본 발명은 진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 제조 방법으로서, 바이오매스 발생 및/또는 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주기 위해 배양 동안 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 조정하는 것을 포함하는 방법이다.

본 방법은 바이오매스 발생 및/또는 발현된 당단백질의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주는 철, 구리, 아연 및 망간의 농도를 조정하는 것을 포함한다. 철, 구리, 아연 및 망간의 농도의 조정은 세포 내 조건이 바이오매스 발생을 선호할 것이고 또는 발현된 당단백질의 성숙도에 대한 영향을 가질 것이라는 것을 의미할 것이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "선호" 는 세포의 활성이 동일하지만, 철, 구리, 아연 및 망간의 각각의 농도가 그렇게 조정되지 않은 동일한 조건 하에서 성장한 세포와 비교하여 언급된 방향으로 있을 것이라는 것을 의미한다. 그러므로, 바이오매스 발생이 선호되는 경우, 세포는 당단백질의 생성보다 증식하는 방향으로 갈 것이다. 따라서, 바이오매스 발생의 상승 또는 증가가 있을 것이다. 마찬가지로, 철, 구리, 아연 및 망간, 또는 아연 및 망간 단독의 농도의 조정이 발현된 당단백질의 N-글리칸 성숙도에 영향을 줄 때, 세포는 예를 들어, 바이오매스 발생 또는 기타 당단백질 유형의 생성 방향보다는 이러한 당단백질의 생성으로 향할 것이다. 따라서, 원하는 당단백질 유형의 생성은 상승되거나 증가될 것이다.

본 발명의 방법은 예를 들어 바람직한 성숙도 레벨을 가진 당단백질의 생성을 산출하도록 발현된 당단백질의 N-글리칸 성숙도에 영향을 준다. 따라서, 방법은 성숙 N-글리코실화된 당단백질 및/또는 미성숙 N-글리코실화된 당단백질, 성숙 비-푸코실화된 당단백질 및/또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성에 영향을 준다. 본 발명의 방법에는 발현된 N-글리코실화된 당단백질의 성숙을 증가시키는 것, 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 것, 성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 것 및/또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 것이 포함된다. 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성 증가와 수반하여 성숙 및/또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 종류 및 미성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성 감소가 있을 수 있다. 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성 증가와 수반하여 성숙 비-푸코실화된 당단백질 및/또는 성숙 또는 미성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성 감소가 있을 수 있다.

특정 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 바이오매스 발생을 선호하고, 즉 세포의 성장을 향상시키고, 이에 의해 바이오매스를 증가시키기 위해 배양 배지에서 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 발현된 당단백질의 성숙도를 증가시키기 위해 배양 배지에서 조정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간, 또는 오로지 아연 및 망간의 농도는, 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록, 즉 증가시키도록 배양 배지에서 조정될 수 있다. 또다른 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록, 즉 증가시키도록 조정될 수 있다. 또다른 구현예에서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 먼저 성장을 향상시키고 이에 의해 바이오매스를 증가시킨 다음, 다시 발현된 당단백질에서 성숙도를 증가시키는 것, 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 것 또는 성숙 또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 것인 당단백질 성숙도에 영향을 주도록 조정될 수 있다.

따라서, 본 발명에는 하기가 포함된다:

- 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시킴으로써 바이오매스 발생을 선호하는 것;

- 배양 배지 중의 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시는 것 및, 임의로, 배양 배지 중의 철 및 구리의 농도를 감소시키는 것에 의해 발현된 N-글리코실화된 당단백질 중의 증가된 성숙도를 선호하는 것; 및

- (i) 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 감소시킴, 또는 (ii) 배양 배지 중의 구리 및 철 각각의 농도를 증가시킴 및 배양 배지 중의 아연 및 망간 각각의 농도를 감소시킴에 의해 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하는 것.

하나의 양상에서, 본 발명에는 바이오매스 발생을 선호하기 위해, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 배양 배지 중에서:

- (a) 철 - 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 - 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과

로 조정되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 발현된 N-글리코실화된 당단백질 중의 증가된 성숙도를 선호하기 위해, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 [(i) 에서] 또는 아연 및 망간의 농도 [(ii) 에서] 가, 배양 배지 중에서:

(i)

- (a) 철 - 0 μM 내지 25 μM;

- (b) 구리 - 0 μM 내지 0.1 μM;

- (c) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과; 또는

(ii)

- (a) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (b) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과

로 조정되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하기 위해 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 배양 배지 중에서:

(i)

- (a) 철 - 0 μM 내지 35 μM;

- (b) 구리 - 0 μM 내지 1 μM;

- (c) 아연 - 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 - 0 μM 내지 0.01 μM; 또는

(ii)

(a) 철 - 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 - 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 - 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 - 0 μM 내지 0.01 μM

로 조정되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 당단백질이 진핵 세포에 외인성 또는 내인성이고, 임의로 당단백질이 구조적 당단백질, 호르몬, 항체 또는 효소인 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 당단백질이 항체이고, 임의로 항체가 치료 또는 진단 항체, 임의로 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체인 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 진핵 세포가 포유류 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포인 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 성장 및/또는 생성 배양 상 동안 조정되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 증가가, 세포가 배양되는 배지를 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두로 보충함으로써 및/또는 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두로 보충된 신선한 배지 내에 세포를 스플릿팅함으로써 달성되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 생물학적이용가능한 농도의 감소가 철, 구리, 아연 및 망간을 킬레이터와 복합체화시킴으로써 및/또는 세포를 직전의 배양 상의 배지와 비교하여 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 감소된 농도를 함유하는 신선한 배지 내로 시딩함으로써 달성되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

하나의 양상에서, 본 발명에는 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 각각의 농도가 배양 동안 먼저 바이오매스 발생을 선호하고 이후 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성 또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록 조정되는 상기 기재된 방법이 포함된다.

또한 본원에서 제공되는 것은 진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 제조에 적합한 배지로서, 발현된 당단백질의 바이오매스 발생을 선호하고 및/또는 N-글리칸 성숙도에 영향을 주기 위해 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 포함하는 배지이다.

하나의 양상에서, 배지는 다음과 같은 철, 구리, 아연 및 망간의 농도를 포함한다:

- (a) 철 - 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 - 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과.

진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 생성시 이러한 배지의 용도는 바이오매스 발생을 선호한다.

하나의 양상에서, 배지는 다음과 같은 철, 구리, 아연 및 망간, 또는 아연 및 망간의 농도를 포함한다:

(i)

- (a) 철 - 0 μM 내지 25 μM;

- (b) 구리 - 0 μM 내지 0.1 μM;

- (c) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과; 또는

(ii)

- (a) 아연 - 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (b) 망간 - 0.01 μM 내지 3 μM 초과.

진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 생성시, (i) 또는 (ii) 의 철, 구리, 아연 및 망간 농도 또는 아연 및 망간 각각을 포함하는 배지의 용도는 발현된 N-글리코실화된 당단백질에서 증가된 성숙도를 선호한다.

하나의 양상에서, 배지는 다음과 같은 철, 구리, 아연 및 망간의 농도를 포함한다:

(i)

- (a) 철 - 0 μM 내지 35 μM;

- (b) 구리 - 0 μM 내지 1 μM;

- (c) 아연 - 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 - 0 μM 내지 0.01 μM; 또는

(ii)

- (a) 철 - 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 - 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 - 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 - 0 μM 내지 0.01 μM.

진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 생성시 상기, (i) 또는 (ii) 의 철, 구리, 아연 및 망간 농도를 포함하는 배지의 용도는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호한다.

도 1: 발효 캠페인의 공정 단계. 예를 들어, 주요 종자 은행 (Primary Seed Bank (PSB)) 의 동결 바이알을, 종자 트레인 배지에서 해동시킨다. 여기서, 세포를 대략 3 주 동안 배양하여, 해동 스트레스로부터 회복시켰다 (세포 더블링 (doubling) 시간을 표준화함). 세포를 이어서 배양 팽창 동안 접종 트레인 n-1 및 n-2 로 통과시킨다. 대략 1 주 후에 세포를 2 주의 공급-배치 발효 공정 동안 생성 규모로 이동시킨다.
도 2: 공급-배치 공정은 2 개의 표현형적으로 구별되는 상에 의해 특징화된다. 생성 상은 세포 성장 또는 표적 단백질 생성이 우세한지에 따라 2 개의 분절로 분리된다.
도 3: DoE 실험에 대한 상이한 접근법. 원하는 실험 결과에 의존하여, 상이한 DoE 접근법이 공정 최적화에 대해 사용될 수 있다. 예를 들어, 3 개의 인자의 최적화는 보통 최적화 DoE 를 위해 최소 (-1), 중간 (0), 및 최대 레벨 (+1) 사이에서 가변된다. (사진은 http://www.gmpua.com 으로부터 채택되고 변형됨)
도 4: 클론 독립적인 mAb 갈락토실화에 대한 미량 원소의 영향. 알루미늄, 몰리브덴, 바륨, 크롬, 브롬, 요오드, 구리, 망간, 루비듐, 은, 아연, 주석, 및 지르코늄 염 저장액을 실험 시작 시 전매 세포 배양 플랫폼 A (배지 및 공정) 를 사용하는 클론 1 (n=4) 및 클론 3 (n=3) 의 공급-배치 배양에 보충하였다. 제 7, 12, 및 13 일에, mAb 갈락토실화에 대한 미량 원소의 영향은 존재하는 실험 데이터와 함께 G1 (A, B) 및 G2 (C, D) 레벨을 모델링함으로써 분석하였다. 실제 대 예상되는 그래프 내의 각각의 지점 (A, C) 은 단일 배양 실험을 나타낸다. G1 및 G2 레벨에 대한 각각의 미량 원소의 통계적 유의성은 평균을 중심으로 하였고, G1 (B) 및 G2 (D) 에 대해 범위/2 로 척도로 하였다.
도 5: 망간에 의한 mAb 갈락토실화의 조절 타이밍. 클론 3 (플레이트 5, 6, 및 7) 글리칸 형성의 G1 (A) 및 G2 (B) 에 대한 망간의 상당한 영향을 JMP 소프트웨어의 예측 프로파일러 도구에 의해 분석하였다. G1 및 G2 에 대한 망간의 긍정적인 영향은 초기 (제 7 일) 및 후기 공정 상 (제 13 일) 동안 100% (예측 프로파일러 곡선의 기울기) 까지 상이하다. 실험을 n=3 으로 수행하였다.
도 6: 세포 성장, 갈락토실화된 및 비-푸코실화된 당단백질 종류 상의 조합된 아연, 철, 구리, 및 망간 보충의 상이한 영향. 클론 2 로의 공급-배치 실험을 DoE 실험에서 아연, 철, 구리, 및 망간의 농도를 달리하면서 보충하였다. 그 영향을 최대 생존가능한 세포 밀도 (A-C), 최종 세포 시간 적분 (D-F), G1 종류 (G-I), 및 만노실화된 종류 w/o Fuc 의 합 (J-L) 에 대해 분석하였다. 예측된 모델 (A, D, G, J) 및 분류된 파라미터 추정값 (B, E, H, K) 은 세포 성장 및 글리코실화, 각각에 대한 상당한 인자와 각각의 특이적 모델에 대한 품질 및 미량 원소를 나타낸다. 최적 세포 성장 (C, F), 당단백질의 최적 갈락토실화 (I), 및 고 비-푸코실화된 (아푸코실화된) 당단백질 종류 (L) 에 대해 공급-배치 배양 중의 아연, 철, 구리, 및 망간의 최적 농도 (회색 숫자: 표준화된 농도, 점선의 수평선: 최대 값) 를 JMP 예측 프로파일러에 대한 최대화 도구로 측정하였다. 글리코실화에 대해 미량 금속 아연 및 구리는 반전된 상호작용을 보임을 명시한다.
도 7: 비-푸코실화된 당단백질 종류에 대한 아연 및 구리의 상호작용. JMP 예측 프로파일러 도구를 사용하여 만노실화된 글리칸 종류를 위한 구리의 상관관계에 대한 아연 레벨의 영향을 분석하였다. 중간 레벨의 아연 및 구리 (A), 균형잡힌 아연 및 구리 레벨 (B), 높은 아연 및 중간 구리 레벨 (C), 낮은 아연 및 낮은 구리 레벨 (D), 낮은 아연 및 중간 구리 레벨 (E), 높은 아연 및 낮은 구리 레벨 (F), 중간 아연 및 높은 구리 레벨 (G), 높은 아연 및 높은 구리 레벨 (H), 중간 아연 및 낮은 구리 레벨 (I), 및 높은 구리 농도에서의 아연 레벨 -0.2 (즉, 25.416 μM) (J).
도 8: 세포 성장, 갈락토실화된, 및 비-푸코실화된 당단백질 종류에 대한 아연, 철, 구리, 및 망간에 대한 최적 농도. VCD, CTI, mAb 갈락토실화 및 높은 만노오스 글리칸 (Man5) 의 레벨에 대한 단일 유효 예측 모델을 사용하여 상이한 아연, 철, 구리, 및 망간 변이의 효과를 예증한다.
도 9: 표적화된 미량 원소 농도에 의한 세포 성장의 조정. 세포 성장 및 mAb 글리코실화를 선호하는 예측된 미량 원소 농도를 클론 2 및 전매 배지 및 공정 플랫폼 B (A) 를 사용하는, 3 개의 생물반응기 공급-배치 실험, "아푸코실화" (삼각형), "성장" (사각형), 및 "갈락토실화" (원형) 에서 시험하였다. 생존가능한 세포 밀도 (B), 세포 시간 적분 (C), 및 세포 생존성 (D) 에 대한 영향을 분석하였다. 아푸코실화는 비-푸코실화과 동일하다.
도 10: 구리의 보충에 의한 상이한 세포 대사. "글리코실화" 상 (d6-d14) 에서 "갈락토실화" 공정을 사용하면 최종 암모늄 (A) 을 감소시키고 락테이트 (B) 레벨을 증가시켰다. 용해된 세포에 대한 마커로서 LDH 평가는 대조군 및 "성장" 공정과 비교하여 50% 감소된 레벨을 나타낸다.
도 11: 표적화된 미량 원소 농도에 의한 갈락토실화된 및 비-푸코실화된 종류의 조정. mAb 글리코실화를 선호하는 예측된 미량 원소 농도를 클론 2 및 전매 배지 및 공정 플랫폼 B 를 사용하는, 3 가지 생물반응기 공급-배치 실험, "아푸코실화" (삼각형), "성장" (사각형), 및 "갈락토실화" (원형) 에서 시험하였다. Man5 (A), G0 (B), 및 G1 (C) 종류 뿐 아니라 누적 비-푸코실화된 종류 (D) 의 상대적 존재비에 대한 표적화된 미량 원소 조정의 영향을 분석하였다.
도 12: 클론 1 에 대한 세포 성장 및 갈락토실화/비-푸코실화에 대한 미량 금속의 역할 - 생물반응기 공급-배치 실험 세포 성장 및 mAb 글리코실화 성숙의 조정을 선호하는 예측된 미량 원소 농도를 공급-배치 (상 n) 중에서 접종 트레인 (상 n-2/n-1) 및 mAb 갈락토실화 및 비-푸코실화 (미성숙 글리칸의 형성) 동안 양호한 및 열악한 세포 성장을 조합하는, 3 개의 생물반응기 공급-배치 실험에서 시험하였다. 시험 케이스는 구체적으로는 접종 트레인 및 생성 상 (A) 동안 세포 성장, 단백질 갈락토실화 및 미성숙 글리코실화를 조정해야만 한다. 의도되는 실험 설정에 대한 상이한 미량 원소 농도는 (B) 에 명시된다. 생물반응기 "GG" (다이아몬드형) 는 세포 성장 및 단백질 갈락토실화를 지지하고, 생물반응기 "GA" (사각형) 는 세포 성장 및 mAb 비-푸코실화를 지지하며, 생물반응기 "AA" (삼각형) 는 세포 성장을 억압하고 단백질 비-푸코실화를 촉발한다. 제 6 일 및 14 일에 대한 (E) 생존가능한 세포 밀도 (C), 세포 시간 적분 (D), mAb 성숙 (합 G1 및 G2 종류) 에 대한 영향 및 제 6 일 및 제 14 일에 대한 (F) mAb 미성숙 (합 Man6, Man5 및 G0-GlcNAc) 의 영향을 분석하였다.
도 13: 생물반응기 실험 1 에 대한 철, 아연, 망간 및 구리의 측정된 농도. 세포 배양 상청액의 ICP-MS 분석에 의해 측정된 구리 (A), 철 (B), 망간 (C) 및 아연 (D) 의 실제 농도를 제시한다. 이론적인 아연, 철, 망간 및 구리 농도의 점차적인 증가는 제 3, 5 및 9 일에 일시주입 공급의 결과이다. 제 6 일에 배양을 분할하였다.
도 14: 생물반응기 실험 2 중의 배지 계산을 위한 철, 아연, 망간 및 구리 농도. 세포 배양 상청액의 ICP-MS 분석에 의해 측정된 클론 1, 클론 2, 클론 3, 클론 4 (n>3) 의 상 n-2, n-1, n 을 포함하는 대표적인 공급-배치 배양에 대한 아연 (A), 망간 (B), 철 (C) 및 구리 (D) 의 실제 농도.
도 15: 갈락토실화된 당단백질 종류에 대한 아연 및 망간의 상호작용. JMP 예측 프로파일러 도구를 사용하여, 클론 2 에 대해 갈락토실화된 G1 글리칸 종류에 대한 망간의 상관관계에 대한 아연 레벨의 영향을 분석하였다. 낮은 레벨의 아연 및 높은 레벨의 망간 (A), 낮은 레벨의 아연 및 낮은 레벨의 망간 (B), 높은 레벨의 아연 및 낮은 레벨의 망간 (C), 높은 레벨의 아연 및 높은 레벨의 망간 (D).
도 16: 갈락토실화된 당단백질 종류에 대한 아연 및 망간의 상호작용은 시간 의존적이다. JMP 예측 프로파일러 도구를 사용하여, 클론 1 (n=4) 및 클론 3 (n=3) 에 대해 갈락토실화된 G1 및 G2 글리칸 종류에 대한 망간의 상관관계에 대한 아연 레벨의 영향을 분석하였다. 높은 레벨의 아연 및 높은 레벨의 망간 (A), 높은 레벨의 아연 및 낮은 레벨의 망간 (B), 낮은 레벨의 아연 및 낮은 레벨의 망간 (C), 낮은 레벨의 아연 및 높은 레벨의 망간 (D).

본원에서 사용되는 바와 같은 "조정하기" 는 배양 배지 중의 원소의 농도를 증가 또는 감소시키는 것을 말한다. 원소의 농도에서의 증가 또는 감소는 조정 직전의 배양 상 중의 배지에서의 원소의 농도에 대한 것이다. 예를 들어, 조정이 미량 원소에서의 증가이고 생성 상의 시작 시 필요한 경우, 이것은 직전 성장 상의 배지 중에 포함되는 이들 원소의 농도에 대한 이들 미량 원소의 농도에서의 증가이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "농도 조정" 은 제시된 시점에서 세포를 둘러싸는 배지 중의 원소의 측정된 또는 측정가능한 또는 계산된 또는 계산가능한 실제 농도에서의 변화를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "영향" 은 바이오매스 발생 또는 N-글리칸 성숙도인, 세포의 공정에서의 변화를 산출하는 작용을 말한다. 그로부터 산출되는 영향은 예를 들어, 바이오매스 발생에서의 증가 또는 원하는 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성에서의 증가일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "및/또는" 은 다른 것과 함께 또는 없이 2 개의 구체적인 특징 또는 성분 각각의 특정 설명으로서 받아들여진다. 예를 들어, "A 및/또는 B" 는 각각이 본원에 개별적으로 언급되는 경우와 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 구체적인 설명으로서 받아들여진다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "항체" 는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 예컨대 Fab 또는 F(ab')₂ 단편 (자연적인 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 제조된 것이든 아니든) 을 말한다. 용어 "항체" 는 가장 넓은 견지에서 사용되고, 모노클로날 항체 (면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전체 길이 항체 또는 미손상 모노클로날 항체를 포함함), 폴리에피토프 (polyepitopic) 특이성을 가진 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 다원자가 항체 (전형적으로는 3 개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작됨), 적어도 2 개의 미손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이특이적 항체), 디아바디 및 단일 사슬 분자, 예컨대 scFv 분자 뿐 아니라, 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')₂ 및 Fv) 을 포괄한다. 항체의 정의 내에 포함되는 것은 항체 콘쥬게이트, 예컨대 항체 약물 콘쥬게이트 (ADC) 또는 예를 들어, 라벨링 원소에 콘쥬게이션된 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "바이오매스" 는 배양 배지 중의 배양된 세포의 양 또는 중량을 말한다. 바이오매스는 생존가능한 세포 밀도, 총 세포 밀도, 세포 시간 적분 (생존가능한 및 총 세포 밀도에 대해), 세포 부피 시간 적분 (생존가능한 및 총 세포 밀도에 대해), 팩킹된 세포 부피, 건조 중량 또는 습윤 중량을 측정함으로써 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "생물반응기" 는 포유류 세포 배양물의 성장을 위해 사용되는 임의의 용기를 말한다. 전형적으로는 생물반응기는 적어도 1 리터일 것이고, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 리터 또는 그 이상, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH, 용해된 산소 및 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는 생물반응기의 내부 조건은, 전형적으로는 배양 기간 동안 통제된다. 생물반응기는 유리, 플라스틱 또는 금속을 포함하는 본 발명의 배양 조건 하에서 배지 중에 현택된 포유류 세포 배양물을 유지하기에 적합한 임의의 재료로 구성될 수 있다.

"세포" 및 "세포주" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 모든 이러한 지칭에는 자손도 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "세포 밀도" 는 배지의 제시된 부피에 존재하는 세포의 수를 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "세포 생존성" 은 제시된 세트의 배양 조건 또는 실험적 변화 하에서 생존하도록 하는 배양물 중의 세포의 능력을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어는 또한 그 시간 배양 물 중의, 세포의 총 수 (살아있는 또는 죽은) 에 비한 특정 시간에 살아있는 세포의 부분을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "킬레이터" 는 킬레이트 (chelate) 를 형성함으로써, 즉, 금속 이온을 결합함으로써 화학적 활성을 억제할 수 있는 화합물을 말한다.

미량 원소 철, 구리, 아연 및 망간에 대해 본원에서 사용되는 바와 같은 "농도" 는 배양 배지 내에 포함되는 각각의 미량 원소의 양을 말한다. 농도는 제시된 시점에서 세포를 둘러싸는 배지 중의 원소의 측정된 또는 측정가능한 또는 계산된 또는 계산가능한 실제 농도일 수 있다. 배지 중의 상기 미량 원소의 농도를 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예에는 ICP-MS (Agilent, Boblingen, Germany) 가 포함된다. 농도는 따라서 또한 배양 동안 세포를 둘러싸는 배양 배지 중에 포함된 각각의 미량 원소의 양을 말하고, 그러므로 제시된 시점에서 각각의 미량 원소의 실제 농도이다. 상기 농도는 분석적으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 배양물 내로의 원소의 도입으로부터 (칭량함으로써, 이전-배양물로부터 세포 및 배지를 이동시킴으로써, 불순물의 도입에 의해, 누출에 의해 등), 세포에 의한 방출로부터 (예를 들어, 세포의 사멸에 의해 또는 활성 분비에 의해), 세포 및 다른 인자에 의한 섭취로부터 산출된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "구리" 는 Cu²⁺ 양이온을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "배양물" 또는 "세포 배양물" 은 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하에 배지 중에 현탁된 세포 집단을 말한다. 상기 용어는 또한 배지 및 그 내부에 현탁된 세포 집단의 조합에 적용될 것이다.

"배양 조건" 및 "발효 조건" 은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 성공적인 세포 배양을 달성하도록 만족시켜야만 하는 조건이다. 전형적으로는 이들 조건에는 적합한 배지의 제공 뿐 아니라, 예를 들어, 온도의 조절 (이것은 약 37℃ 이어야 할 뿐 아니라, 또한 배양 동안의 온도 변화 (예를 들어, 37℃ 내지 34℃) 를 포함함) 및 pH (이것은 통상 6.8 내지 7.2 임), 뿐 아니라 산소 및 이산화탄소의 공급이 포함된다. 이러한 조건에는 또한 세포가 배양되는 방식, 예를 들어 진탕기 또는 로봇 배양이 포함된다.

미량 원소 철, 구리, 아연 또는 망간의 농도와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 "감소" 는, 세포가 직전 상 또는 부분적인 상에서 배양되었던 배지 중의 이들의 농도에 비해 배양 배지 중의 이들 미량 원소의 농도에서의 감소를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "선호" 는 언급된 방향으로의 세포의 활성이 동일한 조건 하에서 성장한 세포와 비교하여 향상될 것이나 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도가 본 발명의 방법에 따라 조정되지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 바이오매스 발생이 선호되는 경우, 배지 중의 미량 원소 농도의 조정은 세포 중에서 당단백질의 생성보다 좀더 증폭하는 방향인 결과를 낳을 것이다. 결과로서 바이오매스 발생에서의 증가가 있을 것이다. 본원에서 "선호" 와 동의어는 "증가" 및 "향상" 이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "공급-배치 배양물" 은 배양 공정의 시작에 후속된 시간 또는 시간들에 부가적인 성분이 배양물에 제공되는 세포 배양 방법을 말한다. 공급-배치 배양물은 전형적으로는 일부 지점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분은 수확되고 임의로 정제된다.

당단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 "갈락토실화된" 은, G1 및 G2 당구조를 산출하는, 하나 이상의 갈락토오스 잔기를 포함하는 당단백질을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "유전자" 는 임의의 뉴클레오티드 서열, DNA 또는 RNA, 폴리펩티드를 엔코딩하는 이의 적어도 일부 부분을 말한다. 임의로, 유전자는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 뿐 아니라 또한 발현의 기저 레벨을 조정하는 코딩 서열 전 및/또는 후의 영역 및/또는 코딩 분절 사이의 인트론 또는 엑손을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "당형태 (Glycoform)" 는 상이한 당이 부착된 당단백질의 여러 가지 상이한 형태 중 임의의 것을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "당단백질" 은 하나 이상의 공유 연결된 올리고당 사슬을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드를 말한다. 올리고당 사슬은 단일 당 잔기, 단일 미분지 사슬 또는 당 잔기로 구성될 수 있거나 또는 1 회 이상 분지하는 당 잔기의 사슬로 구성될 수 있다. 올리고당 사슬은 N-연결 또는 O-연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "숙주 세포" 는 당단백질을 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 나타낸다.

미량 원소 철, 구리, 아연 또는 망간의 농도와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 "증가" 는, 직전 상 또는 일부 상에서 세포가 배양되었던 배지 중의 이들의 농도와 비교하여 배양 배지 중의 이들 미량 원소의 농도에서의 증가를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "철" 은 Fe(III) (Fe³⁺) 또는 Fe(II) (Fe²⁺) 양이온을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "망간" 은 Mn²⁺ 양이온을 말한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "성숙도" 및 "당단백질 성숙도" 는 재조합적으로 생성된 당단백질 중의 글리코실화 패턴을 말한다. 모든 N-글리코실화된 단백질은 공통의 오당류 (코어 = GlcNAc₂ Man₃) 을 갖고, 골지 복합체에서 일어나는 말단 글리코실화는, 상기 코어에 첨가되는 올리고당의 상이한 조합으로 인해, 막대한 구조적 다양화를 산출한다. 따라서 당단백질 중의 증가하는 성숙도는 올리고당 단위의 코어에 대한 부가, 및/또는 후속 개질에 관한 것이다. N-글리칸 성숙도에 대한 영향에는 따라서 코어 구조에 대해 또는 직전 탄수화물 구조에 대해 당단백질의 성숙도를 증가시키는 것이 포함된다. 그러므로 당단백질의 성숙도는 코어 구조가 올리고당 단위의 첨가에 의해 또는 예를 들어, 미성숙 혼성 구조로부터의 만노오스 잔기의 제거에 의해 개질되면서 증가된다. 따라서 성숙도에서의 증가는 예를 들어, Man_3-5 구조 또는 코어 구조로부터 예를 들어, G0 구조를 가진 당단백질의 생성을 포괄한다. 완전한 성숙 당단백질 종류는 1 개 또는 2 개의 갈락토오스 잔기를 함유하는 갈락토실화된 종류 또는 1 개 또는 2 개의 시알산 잔기를 함유하는 시알릴화된 종류, 예컨대 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₁, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal-₂, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₁Sia₁, GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₂Sia₁ 및 GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂Gal₂Sia₂ 일 수 있다. 미성숙 당단백질은 4 내지 9 개의 만노오스 잔기를 함유하는 고 만노오스 종류 또는 미성숙 혼성 구조 예컨대 GlcNAc₃Man₅GlcNAc, GlcNAc₃Man₄GlcNAc 및 GlcNAc₃Man₃GlcNAc 일 수 있다. 일부 경우에서, 통상적으로 도입된 당 잔기가 그렇게 도입되지 않는 당단백질을 생성하는 것이 바람직하다. 본원에 포함되는 것은 코어 푸코오스 잔기, 예를 들어, G0-F, G1-F 및 G2-F 가 결핍된 부분적으로 또는 완전히 비-푸코실화된 당단백질이다. 성숙 및 미성숙 당단백질 종류는 비-푸코실화될 수 있다, 즉 이들은 코어 푸코오스 잔기가 결핍될 수 있다.

"배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 포유류 세포의 성장을 지속시키는 영양소를 함유하는 용액을 말한다. 전형적으로는 이러한 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포가 필요로 하는 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 에너지 공급원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 이러한 용액은 또한 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온, 예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트, 완충액, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소, 아미노산, 지질 및/또는 글루코오스 또는 기타 에너지 공급원을 포함하나 이에 제한되지 않는 최소 비율 초과의 성장 및/또는 생존을 향상시키는 보충적 성분을 함유할 수 있다. 배지는 유리하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다. 배지는 감소된 혈청 또는 무혈청 배지일 수 있고, 즉, 배지는 약 1-5% 혈청을 함유하거나 또는 배지에는 임의의 포유동물 혈청 (예를 들어, 우태 혈청) 이 각각 본질적으로 없다. 본질적으로 없다는 것은 배지가 0-5% 혈청, 바람직하게는 약 0-1% 혈청, 가장 바람직하게는 약 0-0.1% 혈청을 포함하는 것을 의미한다. 무-혈청 규정된 배지가 사용될 수 있으며, 배지의 성분 각각의 정체 및 농도는 공지되어 있다. 배지는 단백질-무함유 배지일 수 있다, 즉, 이것은 단백질을 함유하지 않을 것이나, 예를 들어, 식물 가수분해물로부터 미규정된 펩티드를 함유할 것이다. 배지는 인간 혈청 알부민 및 인간 트랜스페린을 포함할 수 있으나, 잠재적으로 동물-유래 인슐린 및 지질, 또는 인간 혈청 알부민, 인간 트랜스페린, 인간 인슐린 및 화학적으로 규정된 지질을 함유하는 제노-프리 (xeno-free) 배지일 수 있다. 대안적으로는, 배지는 모든 성분이 규정되고 규정된 농도로 존재하는 배지인 화학적으로-규정된 배지일 수 있다. 상기 배지는 오로지 재조합 단백질 및/또는 호르몬을 함유할 수 있고 또는 단백질-무함유 화학적으로 규정된 배지, 즉 필요하다면 오로지 저 분자량 구성성분 및 합성 펩티드/호르몬을 함유할 수 있다. 화학적으로 규정된 배지는 또한 어떠한 단백질도 완전히 없을 수 있다.

"비-푸코실화된 당단백질" 은 하나 이상의 코어 N-푸코오스 잔기가 결핍된 성숙 또는 미성숙 당단백질이다. 상기 구조는, 당단백질이 자연적으로 푸코오스 잔기를 함유할 수 없거나, 또는 이들은 당단백질에 존재하는 것으로 자연적으로 예상될 푸코오스 잔기의 부재로 인해 비-푸코실화될 수 있다는 점에서, 단독으로 비-푸코실화될 수 있다. 본 출원에서, 비-푸코실화된 및 아푸코실화된은 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "관류 배양" 은 접종 기본 배지 상에서 성장하는 세포를 포함하고, 세포가 소모된 배지를 신선한 배지로 대체하는 원하는 세포 밀도를 달성하는 세포 배양 방법을 말한다. 관류는 연속 또는 간헐 관류를 포함할 수 있고, 세포 배양물에 적어도 하나의 일시주입 공굽물의 전달을 포함할 수 있다. 관류 배양 후에 공급-배치 배양이 이어질 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "폴리펩티드" 는 펩티드 결합을 통해 함께 연결되는 아미노산의 연속 사슬을 말한다. 이러한 아미노산 사슬에 길이 제한은 없으며, 이것은 2 개 내지 많은 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는, 예컨대 글리코실화에 의해 가공 및/또는 개질될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "단백질" 은 별도의 단위로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩티드를 말한다. 단백질이 오직 하나의 작용하는 폴리펩티드를 함유하는 경우, 용어 폴리펩티드 및 단백질은 상호교환적이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 당단백질" 또는 "재조합적으로 발현된 당단백질" 은 이러한 발현 목적을 위해 조작된 숙주 세포로부터 발현된 당단백질을 말한다. 조작에는 하나 이상의 유전적 개질, 예컨대 발현하고자 하는 당단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 이종 유전자의 도입이 포함된다. 이종 유전자는 세포 내에서 정상적으로 발현되는 또는 숙주 세포에 대해 외래인 당단백질을 엔코딩할 수 있다. 조작은 대안적으로는 하나 이상의 내인성 유전자를 상향 또는 하향 조절할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "스플릿팅 (splitting)" 은 또한 계대 (passaging) 또는 세포의 서브배양 (subculture) 으로도 알려져 있다. 이것은 소수의 세포의 신선한 배지 내로의 이동을 수반하며, 이에 의해 스플릿팅한 세포를 신규 배양에 시딩한다. 현탁 배양물에서, 어느 정도의 세포를 함유하는 소량의 배양물을 더 많은 부피의 신선한 배지 내에 희석한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "적정농도" 는 제시된 양의 배지 부피로 포유류 세포 배양물에 의해 생성된 재조합적으로 발현된 당단백질의 총 양을 말한다. 적정농도는 전형적으로는 배지 밀리리터 당 당단백질 밀리그램의 단위로 표현된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "아연" 은 Zn²⁺ 양이온을 말한다.

하기 약어가 본원에서 사용된다:

Asn 아스파라긴

ADCC 항체 의존적 세포 세포독성

CTI 세포 시간 적분

CDC 보체 의존성 세포독성

CMP 시티딘 모노포스페이트

CTP 시티딘 트리포스페이트

GDP 구아노신 디포스페이트

GTP 구아노신 트리포스페이트

ICP-MS 유도성 결합 플라즈마-질량 분석

LDH 락테이트 데히드로게나아제

UDP 우리딘 디포스페이트

UTP 우리딘 트리포스페이트

mAb 모노클로날 항체

PSB 주요 종자 은행

PSE 허위 가닥-오류

RSME 디자인 가닥-오류

Fuc L-푸코오스

Gal D-갈락토오스

GlcNAc N-아세틸글루코사민

NANA N-아세틸뉴라민산

Man D-만노오스

Man5 GlcNAc₂ Man₅

Man6 GlcNAc₂ Man₆

고 만노오스 GlcNAc₂ Man_5-8

Core GlcNAc₂ Man₃

G0 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂

G0-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂

G1 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal

G1-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal

G2 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal₂

G2 1SA GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal₂ NANA₁

Complex GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal_0-2

Complex-F GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal_0-2

상세한 설명

본 발명은 진핵 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 제조 방법 및 배지로서, 바이오매스 발생 및/또는 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주기 위해 배양 동안 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 조정하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

하나의 양상에서, 본 발명의 방법은 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 조정하여 바이오매스 발생을 선호하는 것을 포함한다. 그 결과, 배양 배지에서 배양된 세포의 양 또는 중량의 증가가 있을 것이다. 바이오매스는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생존가능한 세포 밀도, 총 세포 밀도, 세포 시간 적분 (생존가능한 및 총 세포 밀도에 대한), 세포 부피 시간 적분 (생존가능한 및 총 세포 밀도에 대한), 팩킹된 세포 부피, 건조 중량 또는 습윤 중량을 측정함으로써 측정될 수 있다.

본 발명의 방법은, 하나의 양상에서, 배양 배지에서 철, 구리, 아연 및 망간, 또는 오로지 아연 및 망간 각각의 농도를 조정하여 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주는 것을 포함한다. N-글리칸 성숙도는 당단백질이 모든, 실질적으로 모든 또는 모든 유전적으로 의도된 글리칸 잔기 미만을 함유할, 즉, 내인성 유전적으로 엔코딩된 당효소에 의해 첨가되는 글리칸 잔기인 식으로의, 글리코실화의 패턴을 말한다.

바람직한 구현예에서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간, 또는 오로지 아연 및 망간 각각의 농도의 조정은, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록 할 것이다. 이러한 발현된 당단백질 중의 탄수화물 패턴의 예는 다음과 같다: GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ (G0); GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal (G1) 및 GlcNAc Fuc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal₂ (G2). 또한 여기에 포함되는 것은 성숙 비-푸코실화된 당단백질, 예컨대 GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ (G0-F) 및 GlcNAc GlcNAc Man₃ GlcNAc₂ Gal_0-2 (G1-F, G2-F) 이다. 특히 바람직한 구현예에서, 선호하는 것은 G0, G1 및/또는 G2 탄수화물 구조를 가진 당단백질일 것이다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도의 조정은 미성숙 비-푸코실화된 당단백질인 당단백질의 생성에 영향을 줄 것이다. 이러한 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 중의 글리코실화 패턴의 예는 고 만노오스 당단백질, 즉, Man₅, Man₆ and Man₇, 예컨대: GlcNAc₂ Man_5-8, 예를 들어, GlcNAc₂ Man₅ 및 GlcNAc₂ Man₆ 을 함유하는 것들이다.

본 발명은 재조합 당단백질의 생성을 수반한다. 당단백질이 발효 배양에 의해서 생성되고 진핵 세포에서 발현되기만 한다면 당단백질의 특성에는 제한이 없다. 상기 방법에 의해 생성에 적합한 당단백질에는 예를 들어, 구조적 당단백질, 호르몬, 항체, 효소 등을 포함하는, 진핵 세포에 대해 외인성 또는 내인성일 수 있는 분비된 및 막-결합된 당단백질 및/또는 당단백질이 포함된다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 당단백질은 항체, 전형적으로는 치료 또는 진단 항체이고, 추가의 구현예에서, 항체는 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체이다.

당단백질이 항체인 경우, 항체는 치료학적으로 유효한 항체일 것이고, 안지오포이에틴 계열의 일원, 예컨대 Ang1, Ang2, Ang3 및 Ang4 및 안지오포이에틴 계열의 일원에 2-특이적인 항체 및 예를 들어, VEGF, 예컨대 Ang2/VEGF; HER 수용체 계열의 일원, 예컨대 HER1 (EGFR), HER2, HER3 및 HER4; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD33, CD34, CD38, CD40, CD44 및 CD52; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, VLA04, ICAM-1, VCAM 및 인테그린, 이의 α 또는 β 서브유닛을 포함 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 사이토카인 수용체 예컨대 흉선 기질 림포포이에틴 수용체 (TSLP-R); IgE; 혈액 그룹 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체 및 단백질 C 를 포함하는 임의의 단백질에 결합될 수 있다. 기타 예시적인 단백질에는 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH); 성장 호르몬 방출 인자를 포함하는 성장 호르몬 (GH); 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-항트립신; 인슐린 A 사슬; 인슐린 B 사슬; 프로인슐린, 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자 예컨대 인자 VIIIC; 조직 인자 (TF); 폰빌레브란트인자; 심방 나트륨 이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제 예컨대 유로키나아제 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA), 봄바진, 트롬빈, 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시 조절됨, 정상적으로 T-세포 발현되고 분비됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA); 뮐러-억제 성분; 릴랙신 A-사슬, 릴랙신 B-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; DNase; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP); 암태아 항원 (CEA); 류마토이드 인자; 신경영양적 인자, 예컨대 뼈-유래 신경영양적 인자 (BDNF); 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF) 및 표피 성장 인자 수용체 (EGFR); 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론 (인터페론-α, -β 또는 -γ); 콜로니 자극 인자 (CSF) 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10 및 IL-17; 수퍼옥시드 디스무타아제; T-세포 수용체; BlyS (Br3) 수용체; Br3-Fc 면역어드헤신; Apo-2 수용체; Fc 수용체; 표면 멤브레인 단백질; 부패 가속 인자 (DAF); 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어, AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 (homing) 수용체; 어드레신 (addressin); 조절 단백질; 면역어드헤신 (immunoadhesin); 및 상기 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 분절 또는 변이체가 포함된다. 대안적으로는, 항체는 유방 상피 세포에 대항하여 지시되는 항체 또는 결장 암종 세포에 결합하는 항체, 항-EpCAM 항체, 항-GpIIb/IIIa 항체, 항-RSV 항체, 항-CMV 항체, 항-HIV 항체, 항-간염 항체, 항-CA 125 항체, 항-α_vβ₃ 항체, 항-인간 신장 세포 암종 항체, 항-인간 17-1A 항체, 항-인간 결장직장 종양 항체, GD3 강글리오시드에 대항하여 지시되는 항-인간 흑색종 항체 R24, 항-인간 편평-세포 암종, 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 항-HLA DR 항체일 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 재조합 당단백질은 진핵 세포에서 생성된다. 세포 배양 및 당단백질의 발현에 민감한 임의의 진핵 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 진핵 세포는 바람직하게는 적합한 영양소 및 성장 인자를 함유하는 배지에서 현탁 배양에 두었을 때 성장 및 생존이 가능하고 전형적으로는 배양 배지 내에 관심의 다량의 특정 당단백질을 발현 및 분비할 수 있는 진핵 세포주이다.

바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포이다.

진핵 세포가 포유류 세포인 경우, 이것은 예를 들어, NSO 쥣과 골수종 세포주, SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVI 주 (COS-7, ATCC® CRL 1651); 인간 배아 신장 주 293S (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC® CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23 (1980) 243); 원숭이 신장 세포 (CVI-76, ATCC® CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC® CRL 1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC® CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC® CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC® CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC® CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562, ATCC® CCL 5I); 래트 간암 세포 (HTC, MI.54, Baumann et al., J. Cell Biol., 85 (1980) 1); 및 TR-1 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44), PER.C6 세포주 (Percivia LLC) 및 하이브리도마 세포주일 수 있다.

중국 햄스터 난소 세포 (CHO, Urlaub and Chasin P. N. A. S. 77 (1980) 4216) 또는 PER.C6 이 본 발명의 실시를 위해 바람직한 세포주이다. 본원에서 사용하기에 적합한 공지된 CHO 유도체에는 예를 들어 CHO/-DHFR (Urlab & Chasin, supra), CHOK1SV (Lonza), CHO-K1 DUC B11 (Simonsen and Levinson P. N. A. S. 80 (1983) 2495-2499) 및 DP12 CHO 세포 (EP 307,247) 및 CHO DG44 세포가 포함된다 (Derouazi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 340 (2006) 1069-77).

진핵 세포가 효모 세포인 경우, 이것은 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 일 수 있다.

진핵 세포가 곤충 세포인 경우, 이것은 예를 들어, Sf-9 일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 진핵 세포는 당조작된 세포일 수 있고, 이 세포는 이의 글리코실화 프로파일을 변형하기 위해 조작되었다. 이러한 조작에는 예를 들어, N-글리칸의 합성에 대해 유전자의 녹-아웃 (knocking-out) 또는 녹-인 (knocking-in) 이 포함된다.

본 발명에서, 세포가 CHO 세포, 임의로 당조작된 CHO 세포인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 진핵 세포는 분비되거나 조작되어 재조합 당단백질을 생성한다. 조작에는 하나 이상의 유전적 개질, 예컨대 발현하고자 하는 당단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 이종 유전자의 도입이 포함된다. 이종 유전자는 그 세포에서 정상적으로 발현되는 당단백질 또는 숙주 세포에 대해 외래인 당단백질을 엔코딩할 수 있다. 조작은 부가적으로 또는 대안적으로 하나 이상의 내인성 유전자를 상향 또는 하향 조절하기 위한 것일 수 있다. 종종, 세포는 예를 들어, 당단백질을 엔코딩하는 유전자의 도입에 의해 및/또는 관심의 당단백질을 엔코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 통제 요소의 도입에 의해 재조합 당단백질을 생성하도록 조작된다. 재조합 당단백질 엔코딩 유전자 및/또는 통제 요소는 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있는 반면, 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 다양한 벡터는 공개적으로 이용가능하며 벡터의 정확한 특성은 본 발명에 필수적이지 않다. 전형적으로는 벡터 성분에는 하나 이상의 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터 및 전사 종결 서열이 포함된다. 이러한 성분은 WO 97/25428 에 기재되어 있는 바와 같다.

진핵 세포로부터의 바이오매스 발생 및 당단백질 발현은 발효 조건 하에서 세포의 배양에 의해 본 발명의 방법에 따라 달성된다. 바이오매스 발생을 위한 세포의 성장 및 당단백질의 발현을 용이하게 하는 임의의 발효 세포 배양 방법 또는 시스템이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포를 배치, 공급-배치 또는 스플릿팅-배치 배양에서 성장시킬 수 있으며, 당단백질의 충분한 발현이 일어난 후 배양이 종결되고, 이 후 당단백질이 수확되고, 필요한 경우 정제된다. 공급-배치 배양물이 사용되는 경우, 배양물의 공급은 배양 동안 1 회 또는 1 회 초과로 일어날 수 있다. 복합적인 공급물이 제공되는 경우, 이들은 동일 또는 상이한 공급 용액과 함께일 수 있다. 대안에서, 세포는 관류 배양물에서 성장될 수 있는데, 배양이 종결되고 새로운 영양분 및 성분이 배양물에 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되고, 발현된 당단백질이 주기적으로 또는 연속적으로 제거된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 세포 배양 방법은 공급-배치 또는 스플릿팅-배치 또는 이 둘의 조합이다.

바이오매스 발생 및 당단백질의 생성을 위한 세포의 발효 배양물에 대한 반응기, 온도 및 다른 조건, 예컨대 산소 농도 및 pH 가 당업계에 공지되어 있다. 선택된 진핵 세포의 배양에 적합한 임의의 조건은 당업계에 이용가능한 정보를 사용하여 선택될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 전형적으로는 벌현을 위해 선택된 숙주 세포와 이전에 사용되었던 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다. 원한다면, 온도 및/또는 pH 및/또는 CO₂ 는 수율을 증가시킴 및/또는 원하는 당단백질 품질의 상대적인 양을 증가시키기 위해 배양 동안 변경될 수 있을 것이다.

세포가 배양되고 미량 원소 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 본 발명의 방법에 따라 조정되는 배지는 당업계에 공지된 임의의 매우 다양한 것일 수 있다. 원한다면, 배지는 배지의 성분이 공지되고 조정되는 화학적으로 규정된 배지일 수 있고, 또는 배지는 성분의 모두가 공지 및/또는 조정되지는 않는 복합 배지일 수 있다.

화학적으로 규정된 배지는 포유류 세포의 배양을 위한 그러한 배지를 포함하여, 최근 역사에서 개발되고 공개되어 왔다. 규정된 배지의 모든 성분은 잘 특징화되고, 이러한 배지는 혈청 및 가수분해물과 같은 복합 첨가제를 함유하지 않는다. 전형적으로는 상기 배지에는 규정된 양의 정제된 성장 인자, 단백질, 지단백질 및 다르게는 혈청 또는 추출 보충물에 의해 제공될 수 있는 기타 성분이 포함된다. 이러한 배지는 고도로 생산성인 세포 배양을 지지하려는 단독 목적으로 제조되어 왔다. 특정한 규정된 배지는 저 단백질 배지로 불릴 수 있거나 또는 저 단백질 배지의 전형적인 성분, 인슐린 및 트랜스페린이 포함되지 않는 경우 단백질 무함유일 수 있다. 그렇지 않으면 무혈청 배지가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 배지는 통상 혈청 또는 단백질 부분을 함유하지 않으나, 미규정된 성분을 함유할 수 있다.

시판 이용가능한 배양 배지의 예에는 Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) 및 Life Technologies 에서 판매되는 화학적으로 규정된 배지 및 공급 보충물이 포함된다. 임의의 이러한 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자); 염 (예컨대 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 HEPES); 뉴클레오시드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™), 및 글루코오스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다.

특정 세포주에 대해, 이들의 농축물을 포함하는 배지를 위한 필요한 영양소 및 성장 인자는, 예를 들어, Mammalian Cell Culture, Mather (Plenum Press: NY 1984); Barnes and Sato, Cell 22 (1980) 649 또는 Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach M. Butler (IRL Press, 1991) 에 기재된 바와 같이 경험적으로 및 과도한 실험 없이 결정된다. 적합한 배지는 일부 성분의 개질된 농축물, 예컨대 아미노산, 염, 당 및 비타민, 및 임의로 글리신, 하이포잔틴, 티미딘, 재조합 인간 인슐린, 가수분해된 펩톤을 함유하는 기본 배지 성분, 예컨대 DMEM/HAM F12-기재 제형, 예컨대 PRIMATONE HS™ 또는 PRIMATONE RL™ (Sheffield, England) 또는 등가물, 세포 보호제, 예컨대 PLURONIC F68™ 또는 등가 플루로닉 폴리올 및 GENTAMYCIN™ 을 함유한다.

하기에서, 표 1 은 상이한 시판 이용가능한 세포 배양 배지 중의 미량 원소 철, 구리, 아연 및 망간의 상이한 양을 나타내며, 이 중 임의의 것이 세포 배양에 사용될 수 있다.

표 1: 시판 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 계산된 농도

상기와 같이, 시판 배지 중에서 계산되는 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 상기 배지가 복합체 성분, 예컨대 혈청 또는 펩톤으로 보충되는 경우 변화할 것이다.

본 발명의 방법이 상기 미량 원소를 배지에 첨가함으로써 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도를 조정하는 것을 포함하는 경우, 또는 배지가 조정된 농도의 이들 원소를 포함하는 경우, 미량 원소가 첨가될 수 있거나 금속 염의 형태로 배지에 존재한다. 재조합 당단백질의 제조를 위해 배양 배지 중의 포함에 적합한 임의의 철, 구리, 아연 및 망간 염이 사용될 수 있다. 일반적으로 금속 염이 적합한 금속 술페이트, 할라이드, 옥시드, 니트레이트, 시트레이트, 아세테이트 또는 포스페이트의 형태로, 수화된 또는 무수의 형태로 있거나, 또는 금속 이온이 킬레이터 예컨대 트랜스페린 또는 락토페린에 결합되는 것이 바람직하다.

전형적으로는 본 발명에서 사용하기에 적합한 철 (II) 및 (III) 염에는 Fe(III)-시트레이트, FeSO₄, FeCl₂, FeCl₃, Fe(NO₃)₃ 및 FePO₄ 뿐 아니라 트랜스페린 또는 락토페린에 결합된 철이 포함된다.

전형적으로는 본 발명에서 사용하기에 적합한 구리 (II) 염에는 CuSO₄, CuCl₂, 및 Cu-아세테이트가 포함된다.

전형적으로는 본 발명에서 사용하기에 적합한 아연 (II) 염에는 ZnSO₄ 및 ZnCl₂ 가 포함된다.

전형적으로는 본 발명에서 사용하기에 적합한 망간 염에는 MnSO₄, MnCl₂, MnF₂ 및 MnI₂ 가 포함된다.

본 발명은 발효 배양 조건 하에서의 세포 배양을 제공한다. 이것은 전형적으로는 세포가 다수의 단계 또는 상에서 배양되는 다단계 배양 절차이다. 본 바람직한 절차에 따르면, 예를 들어, 세포의 동결된 바이알로부터의 발효 배양 공정은, 전형적으로는 도 1 에 묘사된 바와 같이, 3 개의 구별되는 상을 포괄한다, 즉:

i) 종자 트레인, 해동 스트레스 후 세포의 회수를 위하고 세포 더블링 시간을 정규화하기 위한 것으로서, 세포 회수 속도 및 제조 규모에 따라, 14 일 내지 예를 들어, 60 일 초과로 지속될 수 있다. 도 1 에서 이것은 지속되는 21 일로서 묘사된다;

ii) 성장 상, 또는 접종 트레인, n-x 상 (n 은 생성 상임) 으로 불리며, x 는 전형적으로는 1 내지 5, 바람직하게는 1 또는 2 이다. 도 1 에서, n-1 및 n-2 상이 예증된다. 상기 상은 또한 성장 상(들) 로서 언급될 수 있는데, 이때 세포는 성장 및 바이오매스 발생을 촉진하기에 적합한 배지 내에 접종된다. 그러므로, n-x 상은 전형적으로는 더 큰 배양 형태 및 선택된 화합물의 세척-제거를 위한 배양 팽창을 위한 것이다. n-x 상이 n-1 및 n-2 상으로 이루어지는 경우, n-1 및 n-2 단계 각각은 예를 들어, 2 내지 7 일 걸리며, 전형적으로는 각각 3 또는 4 일 지속된다; 및

iii) 생성 상, 또는 n-상, 적합한 양 및/또는 품질로의 재조합 당단백질의 생성을 위함. 상기 상의 지속기간은 예를 들어, 재조합 세포의 특성 뿐 아니라 발현된 당단백질의 양 및/또는 품질에 따라 다를 수 있다. 전형적으로는 상기 상은 약 11 내지 약 20 일 지속될 것이다. 도 1 에서, 상기 상은 지속되는 14 일로서 묘사된다.

세포를 예를 들어, 적합한 대로 존재하는 배지에 신선한 배지 또는 영양소 보충의 첨가에 의해, 적합한 시간 기간 동안 종자 트레인 또는 성장 상에 유지할 수 있다.

전형적으로는, 생성 또는 n-상은, 도 2 에 명시된 바와 같이, 2 개의 구별되는 상을 특징으로 한다. 이 중 첫번째는 세포 특이적 단백질 생성을 위한 충분한 생존가능한 바이오매스의 생성을 위한 성장 상이고, 이 중 두번째는 유의한 세포 성장이 없는, 재조합 당단백질의 생성을 위한 것이다.

종자 트레인, 성장 상 및 생성 상 중 임의의 것 또는 모두는 연속적일 수 있고, 또는 1 개 상으로부터의 세포는 다음 상을 접종하는데 사용될 수 있다.

배양 기간 동안 또는 이의 종료시에 (바람직하게는 생성 상) 발현된 당단백질의 회수는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 당단백질은 바람직하게는 배양 배지로부터 분비된 폴리펩티드로서 회수되는데, 이것은 분비 신호 없이 직접적으로 생성되는 경우 숙주 세포 용리물로부터 회수될 수 있기는 하다. 당단백질이 막-결합된 경우, 이것은 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100) 을 사용하여 멤브레인으로부터 방출될 수 있거나 또는 이의 세포외 영역은 효소적 분할에 의해 방출될 수 있다. 발현된 당단백질은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 필요한 대로 단리 및/또는 정제될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 발효 공정의 성장 또는 생성 상 중 임의의 것 또는 모두에서 조정된다. 바람직한 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 성장 상의 시작 시 또는 그 동안 및/또는 생성 상의 시작 시 또는 그 동안 조정된다. 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 성장 상의 시작 시 및 생성 상의 시작 시에 조정되거나, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 성장 상의 시작, 성장 상 동안, 생성 상의 시작 시 및 생성 상 동안 중 임의의 것 또는 모두에서 조정되는 것이 가장 바람직하다.

철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 배양 배지 중의 이들 미량 원소의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 조정된다. 본 발명에서, 상기 요소의 농도가 증가 또는 감소되는 경우, 농도에서의 상기 증가 또는 감소는 직전의 증가 또는 감소하는 배양 상에서의 배지 중의 이들 요소의 농도예 비례한다. 그러므로, 생성 상 시작 시 배지 중에서 예를 들어, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도에서의 증가가 있는 경우, 이것은 직전의 성장 상의 배지 중의 이들 미량 원소의 농도에 대한 이들 미량 원소의 농도의 증가이다. 유사하게는, 생성 상 동안 배지 중의 예를 들어, 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 증가가 있는 경우, 이것은 생성 상의 직전 부분의 배지 중의 이들 원소의 농도에 비해, 이들 미량 원소의 농도에서의 증가이다. 유사하게는, 성장 또는 생성 상의 시작시 또는 이 중 임의의 것 동안 배지 중의 예를 들어, 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 감소가 있는 경우, 이것은 직전의 배양 상의 배지 중의 이들 미량 원소의 농도에 비해, 이들 미량 원소의 농도에서의 감소이다. 유사하게는, 생성 상의 시작 시 또는 그 동안 배지 중의, 예를 들어, 철 및 구리의 농도에서의 감소 및 예를 들어, 아연 및 망간의 농도에서의 증가가 있는 경우, 이것은 직전의 배양 상의 배지 중의 이들 미량 원소의 농도와 비교하여 철 및 구리의 농도에서의 감소 및 아연 및 망간의 농도에서의 증가이다.

일반적으로 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도가 배양 배지 중에서 조정되는 경우, 모든 상기 미량 원소의 농도는 동시에 조정되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 방법에는 또한 철, 구리, 아연 및 망간의 개별적으로, 쌍으로의 조정, 또는 상기 미량 원소 중 3 개를 한꺼번에 및 그 다음 4 번째 것을 조정함으로써, 또는 그 반대로의 조정이 포함된다. 특히, 2 개의 미량 원소의 농도가 증가되고 2 개의 원소의 농도가 감소되는 경우, 증가 및 감소하고자 하는 조정은 동시에 또는 상이한 시간에 일어날 수 있다. 그 경우, 2 개의 미량 원소의 농도를 증가시키는 조정 및 2 개의 원소의 농도를 감소시키는 조정이 시간 상 동일한 지점에서 또는 동일한 배지에서 일어나는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도의 조정은 사용되고 있는 발효 조건에 적합한 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 상기 미량 원소의 농도가 조정되어지는 방법은 본 발명에 필수적인 것은 아니고 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 미량 원소 농도의 조정은 따라서 세포가 배양되는 배지 (미량 원소 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 증가의 경우에) 를 보충함으로써, 또는 세포의 전부 또는 일부를 원하는 농도의 미량 원소를 함유하는 신선한 배지에 이동시킴으로써 (즉, 스플릿팅 (splitting)) 일어날 수 있다. 필요한 경우 상기 2 가지 방법의 조합이 사용될 수 있다.

철, 아연, 구리 및 망간의 농도의 조정은 따라서 배양 기간의 전부 또는 일부에 걸쳐, 연속적일 수 있거나, 또는 예를 들어 배양 배지 중의 미량 원소(들) 의 추정된, 계산된 또는 측정된 농도에 대한 반응으로서 간헐적일 수 있다. 본 발명은 범위 내의 미량 원소의 농도의 조정을 규정한다. 규정된 배양 기간 동안, 예를 들어, 성장 또는 생성 상 동안 미량 원소 각각 또는 모두의 농도의 실제 측정 또는 계산이, 미량 원소 각각 또는 모두의 농도가 본원에 언급된 범위 내에 있는 것을 나타내는 경우, 산출되는 미량 원소의 농도가 언급된 범위 내에 남아있기만 한다면, 그럼에도 불구하고 상기 농도의 조정이 일어날 수 있다.

필요하다면, 공지된 기술은 조정이 이뤄지기 전 배양 배지 중의 미량 원소의 실제 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 여기에는 각각의 미량 원소 농도의 온라인 및 오프라인 분석이 포함된다.

따라서, 배치 발효 조건이 사용되는 경우, 미량 원소의 농도에서의 증가 달성은 예를 들어, 존재하는 배양 배지에 대해 증가된 적합한 미량 원소의 농도를 함유하는 또는 이것이 보충된 신선한 배지 내에 시딩함으로써, 또는 존재하는 배지에 대해 적합한 미량 원소의 증가된 농도를 함유하는 또는 이것이 보충된 배지 내에 세포를 스필릿함으로써 일어날 수 있다. 공급-배치 발효 조건이 사용되는 경우, 미량 원소의 농도에서의 증가 달성은 예를 들어, 증가된 농도의 적합한 미량 원소를 함유하는 또는 이것이 보충된 신선한 배지 내에 시딩하여, 적합한 미량 원소의 하나 이상의 일시주입 또는 연속 공급물을 배양 배지에 제공함으로써; 세포 수에 기반해 또는 공지된 대사 모델, 대사 대리 마커 등에 따라 계산된 공급 속도를 측정함으로써, 또는 배양물을 증가된 농도의 적합한 미량 원소를 함유하는 또는 이것이 보충된 배지 내로 스플릿팅함으로써 일어날 수 있다. 일시주입 또는 연속 공급물이 첨가되는 경우, 이것은 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두에 더해 배양에 필요한 기타 영양소/성분을 함유할 수 있다. 관류 발효 조건이 사용되는 경우, 미량 원소의 농도에서의 증가 달성은 예를 들어, 관류 배양에 첨가되는 기타 영양소/성분과 동시에 또는 개별적으로 반응기에 대한 미량 원소의 연속적 또는 간헐적 첨가에 의해 달성될 수 있다.

철, 아연, 구리 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 감소가 필요한 경우, 이것은 세포를, 미량 원소의 농도가 직전의 배양 상의 배지 중의 이들 미량 원소의 농도와 비교하여 감소되는 신선한 배지 내에 시딩함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, 철, 아연, 구리 또는 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 감소는 예를 들어 금속 이온 킬레이터의 배양물에의 첨가 및 복합체화된 금속 이온의 세척제거에 의한, 금속 이온의 복합체화에 의해 존재하는 또는 신선한 배지에서 달성될 수 있다. 배양 배지 중의 상기 금속 이온의 생물학적이용가능한 농도에서의 감소를 산출하기 위해 적합한 금속 이온의 복합체화가 가능한 임의의 금속 이온 킬레이터가 사용될 수 있다. 철 및 구리에 대한 적합한 이러한 킬레이터에는 예를 들어, 소형 분자 또는 금속 결합 단백질, 예컨대 예를 들어, EDTA, EGTA, 사이드로포어, 예컨대 데스페리옥사민, 데스페리티오신, 테트라사이클린, 퀴놀론, 포스포네이트, 폴리페놀, 단백질 예컨대 트랜스페린 또는 세룰로플라민, 다당류, 유기산, 예컨대 말레에이트, 수프리존, 바토큐프로인 설포네이트, 바토페난트롤린 설포네이트, 및 D-펜실라민이 포함된다. 부가적으로, 미량 원소의 농도의 감소의 영향은 대안적인 미량 원소에 의한 글리코실화 효소의 억제/활성화에 의해, 세포 수송체와의 표적화된 경쟁에 의해 또는 세포 수송체 활성의 표적화된 조정에 의해 모방될 수 있을 것이다.

금속의 감소된 또는 증가된 농도의 특정 값은 배양 배지 중의 금속의 실제적인 측정 또는 세포를 둘러싸는 배양 용액 중의 금속의 농도의 이론적인 농도 또는 계산에 기반한다. 실시자는 예를 들어 불순물 및 침출을 통해 도입되는 미량 원소의 일부 농도가 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이고, 이들을 본 발명에 따른 미량 원소의 감소된 또는 증가된 농도를 계산할 때 고려할 것이다.

본 발명의 방법에서, 미량 원소 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 감소가, 적합한 대로 세포를, 미량 원소의 농도가 직전의 배양 상의 배지 중의 이들 미량 원소의 농도와 비교하여 감소되는 신선한 배지 내에 시딩함으로써 달성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 특정 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 세포의 성장을 선호하고, 이에 의해 바이오매스를 증가시키도록, 배양 배지 중에서 조정될 수 있다. 다른 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도, 또는 오로지 아연 및 망간의 농도는 발현된 N-당단백질에서의 성숙도 및 성숙 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 증가시키도록 배양 배지 중에서 조정될 수 있다. 또다른 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성 증가를 선호하도록 조정될 수 있다. 또다른 구현예에서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도는 먼저 성장을 향상시키고, 그 다음 다시, 발현된 N-글리코실화된 당단백질의 성숙도를 증가시키는 또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키는 당단백질 성숙도에 영향을 주도록 조정될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 성장 및/또는 생성 상 시작 시 또는 그 동안 상이한 미량 원소 농도의 적용은 하기 표 2 에 예증된 바와 같은 바이오매스 발생 및 발현된 당단백질에서의 N-글리코실화 성숙도에 대한 직접적인 영향을 유발할 수 있다. 상기 배양 상 동안의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도의 조정은 바이오매스 발생과 발현된 당단백질에서의 N-글리코실화 성숙도 사이의 전환을 산출한다. 표 2 의 "아푸코실화" 는 비-푸코실화와 동일하다.

표 2: 표적화된 단백질 생성을 위한 공정 전략

본 발명의 방법의 결과로서, 당단백질 생성 세포를 원하는 최종 결과에 따라 맞춰진 배지에서 배양한다. 따라서, 하기 표 3 에 예증된 바와 같이, 성장 배지는 일차적으로 바이오매스 발생을 촉진하고, 갈락토실화 배지는 일차적으로 발현된 N-당단백질의 성숙도 및 성숙 당단백질의 생성에서의 증가를 촉진하고, 비-푸코실화 배지는 일차적으로 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 촉진한다. 다른 결과가 하기에 제시되는 바와 같이 특정 정도에 영향을 줄 수 있으나, 원하는 최종 결과가 선호되는 것인 식으로 각각의 배지의 일부 상호-관련된 영향이 있을 수 있다.

표 3: 맞춰진 배지 및 원하는 결과 사이의 연관성

바람직한 구현예에서, 본 발명은 세포 성장/ 바이오매스 발생을 선호하는 배양 배지 중에서의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도의 증가를 제공한다. 본 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도는 성장 상 시작 시 및/또는 동안 및, 임의로, 또한 생성 상 시작 시 및/또는 동안 증가된다. 본 구현예는 특히, 저 성장 능력을 가진 세포, 바이오매스 및 생산성이 커플링되는 세포주 및 저 레벨의 성숙 갈락토실화된 당단백질이 바람직한 경우에 대해 적합하다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명은 성숙 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성에 적합하게, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키고, 이에 의해 미성숙 비-푸코실화된 당단백질을 포함하는 미성숙 당단백질의 생성을 감소시키기 위한, 배양 배지 중의 아연 및 망간 각각의 농도의 증가 및, 임의로, 철 및 구리의 농도의 감소를 제공한다. 본 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 또는 오로지 아연 및 망간의 농도는 성장 상 시작 시 및/또는 생성 상 시작 시 및/또는 동안 조정된다. 성장 및 생성 상 동안 미량 원소의 농도의 조정에 의한, 당단백질의 증가된 성숙도 및 성숙 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하는 것이 낮은 세포 성장이 바람직한 경우, 및 특히 발현된 당단백질이 많은 예상치못한 부 생성물과의 복합체인 경우 최적이다. 생성 상 시작 시 배지 중의 미량 원소의 농도의 조정에 의한, 당단백질의 증가된 성숙도 및 성숙 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하는 것이 양호한 성장이 성장 상 동안 달성되는 경우 특히 유용하다. 생성 상 동안 배지 중의 미량 원소의 농도의 조정에 의한, 당단백질의 증가된 성숙도 및 성숙 글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하는 것이 미량 원소의 농도가 성장 상 및 생성 상 시작 시에 양호한 바이오매스 발생을 확보하기 위해 성장 상 및 생성 상 시작 시에 조정되는 경우가 특히 적합하다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명은 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도의 감소를 제공한다. 본 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도는 성장 상 시작 시 및/또는 생성 상 시작 시 및/또는 그 동안 조정된다. 성장 및 생성 상의 시작 시 미량 원소의 농도의 조정에 의한 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하는 것이 세포 성장이 양호한 경우에는 최적이다. 생성 상의 시작 시 미량 원소의 농도의 조정에 의한 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하는 것이 양호한 성장이 성장 상 동안 달성되는 경우 특히 유용하다. 생성 상 동안 배지 중의 미량 원소의 농도의 조정에 의한 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하는 것이 미량 원소의 농도가 양호한 바이오매스 발생을 확보하기 위해 성장 상 및 생성 상의 시작 시에 조정되는 경우 특히 적합하다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명은 세포 성장/바이오매스 발생을 선호하기 위해 성장 상의 시작 시 및, 임의로 생성 상의 시작 시에 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시키는 것, 및 부가적으로, 당단백질의 성숙도를 증가시키기 위해, 예를 들어 미성숙 비-푸코실화된 당단백질을 포함하는 미성숙 당단백질의 생성에 비해 성숙 N-글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하도록, 생성 상의 시작 시 또는 그 동안 배양 배지 중의 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시키는 것 및 철 및 구리의 농도를 감소시키는 것을 제공한다. 본 구현예에서, 바이오매스 발생을 선호하도록 생성 상의 시작 시 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 증가되는 경우, 당단백질의 성숙도의 증가, 예를 들어 성숙 N-글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하는 것은 생성 상 동안 이들 미량 원소의 농도의 추가의 조정에 의해 일어난다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 본 발명은 성장 상의 시작 시, 및 임의로 세포 성장/바이오매스 발생을 선호하도록 생성 상의 시작 시 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시키는 것 및 부가적으로 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록 생성 상의 시작 시 또는 그 동안 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 감소시키는 것을 제공한다. 본 구현예에서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 바이오매스 발생을 선호하도록 생성 상의 시작 시 증가되는 경우, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하는 것은 생성 상 동안 상기 미량 원소의 농도의 추가의 조정에 의해 일어난다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오매스 발생을 선호하도록 배양 배지 중의, Fe²⁺ 또는 Fe³⁺ 으로서의 철의 농도가 15 μM 내지 80 μM 초과, 바람직하게는 20 μM 내지 60 μM 초과, 가장 바람직하게는 25 μM 내지 50 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Fe²⁺ 또는 Fe³⁺ 으로서의 철의 농도가 0 μM 내지 25 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 20 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 16 μM 로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Fe²⁺ 또는 Fe³⁺ 으로서의 철의 농도가 0 μM 내지 35 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 30 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 25 μM 또는 15 μM 내지 80 μM 초과, 바람직하게는 20 μM 내지 60 μM 초과, 가장 바람직하게는 25 μM 내지 50 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오매스 발생을 선호하도록 배양 배지 중의 Cu²⁺ 로서의 구리의 농도가 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과, 바람직하게는 0.5 μM 내지 1.5 μM 초과, 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 1 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Cu²⁺ 로서의 구리의 농도가 0 μM 내지 0.1 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 0.08 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 0.06 μM 로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Cu²⁺ 로서의 구리의 농도가 0 μM 내지 1 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 0.5 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 0.3 μM 또는 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과, 바람직하게는 0.5 μM 내지 1.5 μM 초과, 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 1 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오매스 발생을 선호하도록 배양 배지 중의 Zn²⁺ 로서의 아연의 농도가 20 μM 내지 50 μM 초과, 바람직하게는 25 μM 내지 45 μM 초과, 가장 바람직하게는 28 μM 내지 43 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Zn²⁺ 로서의 아연의 농도가 20 μM 내지 50 μM 초과, 바람직하게는 25 μM 내지 45 μM 초과, 가장 바람직하게는 28 μM 내지 43 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Zn²⁺ 로서의 아연의 농도가 0 μM 내지 20 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 15 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 13 μM 로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오매스 발생을 선호하도록 배양 배지 중의 Mn²⁺ 로서의 망간의 농도가 0.01 μM 내지 3 μM 초과, 바람직하게는 0.05 μM 내지 2 μM 초과, 가장 바람직하게는 0.1 μM 내지 1 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Mn²⁺ 로서의 망간의 농도가 0.01 μM 내지 3 μM 초과, 바람직하게는 0.05 μM 내지 2 μM 초과, 가장 바람직하게는 0.1 μM 내지 1 μM 초과로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록 배양 배지 중의 Mn²⁺ 로서의 망간의 농도가 0 μM 내지 0.01 μM, 바람직하게는 0 μM 내지 0.05 μM, 가장 바람직하게는 0 μM 내지 0.07 μM 로 조정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 맞춤 결과를 위한 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 조합의 바람직한 농도는 다음과 같다:

A. 바이오매스 발생을 선호하도록:

- (a) 철 : 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 : 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 : 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 : 0.01 μM 내지 3 μM 초과.

B. 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키도록, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화된 당단백질 종의 생성을 선호하도록:

(i)

- (a) 철 : 0 μM 내지 25 μM;

- (b) 구리 : 0 μM 내지 0.1 μM;

- (c) 아연 : 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (d) 망간 : 0.01 μM 내지 3 μM 초과; 또는

(ii)

- (a) 아연 : 20 μM 내지 50 μM 초과; 및

- (b) 망간 : 0.01 μM 내지 3 μM 초과.

C. 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록:

(i)

- (a) 철 : 0 μM 내지 35 μM;

- (b) 구리 : 0 μM 내지 1 μM;

- (c) 아연 : 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 : 0 μM 내지 0.01 μM; 또는

(ii)

(a) 철 : 15 μM 내지 80 μM 초과;

- (b) 구리 : 0.3 μM 내지 2.5 μM 초과;

- (c) 아연 : 0 μM 내지 20 μM; 및

- (d) 망간 : 0 μM 내지 0.01 μM.

바이오매스 발생, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도 증가, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호하도록 하고, 및/또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호하도록 하는 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도의 특히 바람직한 조합은 하기 표 4 에 제시된 바와 같다.

표 4: 배양 상 중의 미량 원소 농도

본 발명의 방법에 따르면, 재조합 당단백질을 생성하도록 발효 조건 하의 배양 동안 바이오매스 발생을 선호, 촉진 또는 증가시키기 위해 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 레벨을 증가시키는 것은 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 레벨이 조정되지 않는 필적하는 배양에 비해, 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 의 바이오매스에서의 증가를 산출할 것이다. 세포 성장에서의 증가를 측정 및 정량화하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로는 이것은 최대 생존가능한 세포 밀도 및 최종 세포 시간 적분을 분석함으로써 수행될 수 있다.

당업자에게 명백하듯이, 재조합 당단백질의 제조시, 세포 배양물의 하나의 단계 동안의 바이오매스에서의 증가는 세포 배양물의 최종 단계 동안 생성되는 당단백질의 양에서의 증가를 산출할 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키기 위한, 예를 들어, 성숙 N-글리코실화 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호, 촉진 또는 증가시키기 위한 발효 조건 하에서 배양 동안 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의, 또는 오로지 아연 및 망간의 농도 레벨의 표적화된 조정은, 철 및 구리, 및/또는 아연 및 망간의 농도 레벨이 배양 동안 조정되지 않는 필적하는 배양에 비해, 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 의 성숙 N-글리코실화된 당단백질의 생성에서의 증가를 산출할 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, G0, G1 또는 G2 패턴을 가진 당단백질의 생성을 선호, 촉진 또는 증가시키기 위한 발효 조건 하에서 배양 동안 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의, 또는 오로지 아연 및 망간의 농도 레벨의 표적화된 조정은, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 레벨이 배양 동안 조정되지 않는 필적하는 배양에 비해, 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 의 G0, G1 또는 G2 패턴을 가진 당단백질의 생성에서의 증가를 산출할 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 선호, 촉진 또는 증가시키기 위한 발효 조건 하에서 배양 동안 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 레벨의 표적화된 조정은, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도 레벨이 배양 동안 조정되지 않는 필적하는 배양에 비해, 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 의 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성에서의 증가를 산출할 것이다.

하기 실시예는 본 발명을 예증한다.

실시예

재료 및 화학적 성분

세포주

기재된 연구를 위해, 9 개의 사내 제작 (in-house) 생성된 재조합 CHO-K1 세포주를 사용하였다: 클론 1 및 클론 2, 둘 다 동일한 모노클로날 항체를 발현함, 클론 3, 또다른 모노클로날 항체를 발현함 및 클론 A, 클론 B, 클론 C, 클론 D, 클론 E 및 클론 F, 당조직화된 항체를 발현함. 클론 1 에 비해, 클론 2 는 높은 레벨의 고-만노오스 글리칸 종 (Man5) 을 나타냈다. 모든 클론은 전매 화학적으로 규정된 무-단백질 사내 제작 배지 및 공정 플랫폼 (하기에 플랫폼 A 및 플랫폼 B 로서 언급됨) 을 사용하여 배양되었다.

공정 대조군에서 - 세포 성장 및 대사물 분석

세포 성장 및 생존력을 트립판 블루 배제 방법 (Strober, Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (2001)) 및 자동화된 CedexHiRes 장치 (Roche Innovatis, Bielefeld, Germany) 를 사용함으로써 분석하였다. 대사물 락테이트 및 암모늄의 정량화를 위해, 세포 배양액을 개별 세포로 원심분리하였고, Cobas Integra 400 plus 시스템 (Roche, Mannheim, Germany) 을 사용하여 분석하였다. 생성물 적정농도를 Cobas Integra 400 plus 시스템 (Roche, Mannheim, Germany) 에 의해 또는 Zeck et al. 에 의해 기재된 바와 같은 PorosA HPLC 방법 (PLoS. One 7.7 (2012) e40328) 에 의해 정량화하였다.

공정 대조군에서 - 미량 원소

미량 원소 농도를 무-세포 배양 상청액 및 ICP-MS 시스템을 위한 사내 제작 방법 (Agilent, Boblingen, Germany) 을 사용하여 분석하였다.

DoE 실험

DoE (Design of Experiments: 실험 디자인) 에 의해 계획되는 통계 실험은 생물 및 화학 반응 최적화에 특히 강력하고 잘 공지된 기술이고, 많은 인자가 최종 결과에 상호의존적으로 영향을 준다. 예를 들어, DoE 를 세포 배양 배지 (Zhang et al., Cytotechnology 65.3 (2013) 363-78), 발효 공정 (Fu et al., Biotechnology Progress 28.4 (2012) 1095-105), 단백질 정제 공정 (Pezzini et al., J. Chromatogr. A 1218.45 (2011) 8197-208) 및, 세포 배양 조건 (Chen et al., Tissue Eng. Part C. Methods 17.12 (2011) 1211-21) 의 최적화를 위해 성공적으로 사용하였다.

바람직한 결과에 근거하여, 상이한 DoE 접근법이 본 공정에 적용될 수 있다 (도 3). 많은 수의 영향 인자를 가진 시스템에 대해 종종 사용되는 부분 계승 디자인은 공정에서 상당한 원리 조정자의 확인을 가능하게 한다. 한편, 실험 디자인 예컨대 전체 계승 (Full facatorial), Box Behnken, 또는 Central composite 는 임계 조정자를 확인할 뿐 아니라 또한 이의 불연속 최적 농도 또는 설정의 정량화를 가능하게 한다. 이를 위해, 소위 예측 프로파일러 도구는 임계 조정자의 농도 또는 설정이 인 실리코 (in silico) 로 최소 (-1) 및 최대 (1) 상태에서 가변되는 경우, 상호작용적으로 실험 결과를 상정한다. 최적 농도를 계산하기 위해 예측되는 최적 레벨 (-1 내지 +1 사이의 값) 은 사용된 설정 농도와의 곱셈에 의해 측정되는 것이어야만 한다.

본 연구에서 모든 DoE 접근법은 통계적 소프트웨어 도구 JMP (SAS Institute GmbH, Boblingen, Germany) 를 사용하여 계획 및 분석되었다. 실험은 생성 공정-유사 조건을 시뮬레이션하는 공급-배치 배양으로서 디자인하였다. 모든 DoE 공급-배치 실험은 진탕기 또는 로봇 배양 시스템 및 전매 배양 배지 및 공급 플랫폼 A 및 B 를 사용하여 수행하였다. 사용되는 배양 배지는 화학적으로 규정된 무-혈청 및 무-단백질 배지이다.

당 종류 분석

mAb 글리코실화의 분석을 위해 수확된 세포 배양액을 세포 분리를 위해 원심분리하고 0.2 μM 막 여과에 의해 여과하였다. mAb 글리코실화 종류를 Reusch et al. 에 의해 기재된 바와 같이 (Anal. Biochem. 432.2 (2013) 82-89) 그리고 사내 제작 모세관 전기영동 프로토콜에 의해 분석하였다.

실시예 1

망간 및 구리에 의한 갈락토실화의 역 조절

세포 배양 성능에 대한 상기 미량 원소의 일반적인 관련성을 시험하기 위해, 2 가지 상이한 모노클로날 항체를 각각 발현하는 2 가지 사내에서 생성한 재조합 CHO-K1 세포주, 클론 1 및 클론 3 을 사용하였다. 부분 계승 DoE 디자인 (표 5) 을 사용하여 상이한 미량 원소의 통계적 유의성을 (특정 저장 용액으로의 기본 배지의 보충에 의해 실현됨) 분석할 수 있다. 부분 계승 DoE 접근법을 완전히 통제된 로봇 배양 시스템을 사용하여 각각의 클론에 및 반복물로 (클론 1 에 대해 4 회, 클론 3 에 대해 3 회) 적용하였다.

표 5 : 세포 배양 성능에 대한 미량 원소의 부분 계승 DoE 스크리닝. 17 개의 구별되는 공급-배치 실험을 사용하여, 상이한 대칭적인 균형을 이룬 레벨의 알루미늄, 몰리브덴, 바륨, 크롬, 브롬, 요오드, 구리, 망간, 루비듐, 은, 아연, 주석, 및 지르코늄 저장 용액을 기본 배지 (-1: 낮은 레벨, 0: 중간 레벨, +1: 높은 레벨) 에 적용하였다. 실험 디자인을 클론 1 (n=4) 및 클론 3 (n=3) 둘다에 대해 적용하였다. 실험 디자인을 JMP DoE 도구를 사용하여 생성하였다.

그 다음, 이론적인 유효 농도의 알루미늄, 몰리브덴, 바륨, 크롬, 브롬, 요오드, 구리, 망간, 루비듐, 은, 아연, 주석, 및 지르코늄 (c_{TE 효과적}) 을 DoE 공급-배치 실험의 시작 시에 각 조건에 대해 요약하였다 (표 6). 실험 시작 시에 상기 미량 원소에 대해 이론적인 c_{TE 효과적} 를 방정식 1 에 따라 계산하였다:

(방정식 1)

표 6 : 부분 계승 DoE 공급-배치 실험 (실험 1) 의 시작 시에 이론적인 유효 미량 원소 농도 c_{TE 효과적}.

갈락토실화에 대한 알루미늄, 몰리브덴, 바륨, 크롬, 브롬, 요오드, 구리, 망간, 루비듐, 은, 아연, 주석, 및 지르코늄의 추정적 영향은 일반적인, 클론 및 일시적인 독립적인 영향을 확인하기 위해, 두 클론 (클론 1 및 클론 3, 둘 다 상이한 mAb 를 발현함), 및 제 7, 12 및 13 일로부터의 샘플을 조합하는 상대적 G1 및 G2 글리칸 레벨에 의해 분석하였다.

JMP DoE 분석 도구를 사용하여, 양호한 선형 모델이 mAb 갈락토실화에 대한 미량 원소의 영향을 기술하는 것으로 밝혔다. 여기서, 강한 긍정적인 영향이 G1 및 G2 레벨에 대해 망간에서 관찰되었다 (도 4A-D). 게다가, 아연은 상대적 G1 및 G2 존재량 (abundance) 에 대해 긍정적인 영향을 갖는 경향이 있다. 한편, 구리는 G1 글리칸 형성에 대해 통계적으로 유의한 부정적인 영향을 가져 (도 4A-B), 시험관 내 관찰된 억제 효과 (Kaminska J et al., Glycoconj J. 15.8 (1998) 783-8 에 의해 상세화되는 바와 같음) 가 세포 배양 실험에 의해 생체 내에서 확인될 수 있다는 것을 나타낸다.

흥미롭게도, 망간과 조합으로의 아연의 첨가는 갈락토실화된 글리칸 형성에 대한 시너지적 영향을 밝혔고, 그 영향은 공정 시간 의존적인 것 같다. 영향의 정량화를 위해, 고 및 저 농도로의 아연 및 망간 효과기와 함께 G1 및 G2 형성 단독을 모델링하였다 (도 16). 최고 양의 G1 및 G2 종류가 높은 아연 레벨과 조합으로 높은 망간에 대해 예측된다.

스크리닝 실험의 규모 추정을 사용하여 (도 4B, D) 갈락토실화에 대한 최적 농도가 하기와 같이 요약될 수 있다:

망간: > 0.0963 μM, 선형 모델이 최고 농도에서의 가장 양호한 결과를 나타내므로 → 최적 농도에는 아직 도달하지 않음)

구리: < 0.3142 μM, 선형 모델이 최저 농도에서 가장 양호한 결과를 나타내므로 → 최적 농도에는 아직 도달하지 않음).

모델 세포주로서 클론 3 을 사용함에 의해 갈락토실화에 대해 상기 중요한 요소의 효과 타이밍을 추가로 분석하였다. 예측 프로파일러 도구를 사용하여 제 7 일에서 제 13 일로 전환시킴으로써, 초기 및 후기 생성 상에서의 망간의 영향을 정량화하였다. G1 및 G2 모두에 대해 망간의 영향은 후기 공정 상 (제 13 일) 에서 하향하였다. 예측 프로파일러 곡선에서의 기울기 감소는 망간의 생물학적이용가능성이 초기 공정 상 (제 7 일) 에서만큼 양호하지 않다는 것을 나타낸다 (도 5).

실시예 2

세포 성장 및 글리코실화에 대한 구리 및 철의 역 효과

세포 성장 및 글리코실화 조정을 담당하는 단일 미량 원소 및 조합된 영향을 확인하기 위해, 재조합 클론 2 를 사용하는 완전 계승 DoE 실험에 의해 세포 성장 및 mAb 글리코실화에 대해, 고도의 생물활성 미량 원소로서 공지된 아연, 구리, 철 및 망간의 영향을 분석하였다 (표 7). 클론 2 를 고 만노오스 글리칸 구조의 내인성의 상승된 형성 레벨 때문에 리포터 (reporter) 세포주로서 사용하였다.

표 7 : 세포 성장, 갈락토실화된 및 비-푸코실화된 당단백질 종류에 대한 아연, 철, 구리, 및 망간의 완전 계승 DoE 스크리닝. 클론 2 로의 19 개의 구별되는 공급-배치 진탕기 실험을 사용하여, 상이한 대칭적인 균형을 이룬 레벨의 아연, 철, 구리, 및 망간을 기본 배지 (-1: 낮은 레벨, 0: 중간 레벨, +1: 높은 레벨) 에 적용하였다. 3 개의 중심 점 ("0000" - 진탕기 5, 8, 및 11) 을 고유의 실험 변화의 확인을 위해 사용하였다. 실험 디자인을 JMP DoE 도구를 사용하여 생성하였다.

본 예에서, DoE 공급-배치 실험 시작 시 이론적인 유효 아연, 철, 구리, 및 망간 농도 c_{TE 효과적} 를 각각의 조건에 대해 요약하였다 (표 8). 실험 시작 시 아연, 철, 구리, 및 망간에 대한 이론적 c_{TE 효과적} 를 상기 기재된 바와 같이 계산하였다.

표 8 : DoE 공급-배치 실험의 시작 시 이론적인 유효 아연, 철, 구리, 및 망간 농도 c_{TE 효과적} (실시예 2).

최대 생존가능한 세포 밀도 (도 6A-C) 및 최종 세포 시간 적분 (도 6D-F) 에 의해 분석된, 세포 성장에 대해 가장 큰 영향은 철의 보충에 의해 제시되었다. 일반적으로, 실험에서 사용된 높은 농도의 아연, 망간 및 구리가 더 높은 세포 성장 및 바이오매스 발생을 산출하는 경향이 있다 (도 6C, F). 한편, 아연, 구리, 철 및 망간의 표적화된 조합은 갈락토실화된 또는 비-푸코실화된 종류의 양을 조정하엿다. 고 농도의 망간은 G1 에 대해 여기서 제시되는 바와 같이, 갈락토실화를 개선하는 반면 (도 6G-I), 아연 및 구리의 조합된 영향 및 망간의 결핍은 더 많은 양의 미성숙 글리코실화된 mAb 종류를 산출한다 (도 6J-L).

구리 및 아연은 미성숙 글리칸 형성에 대해 강한 상호작용을 나타낸다. 따라서, 추가로 비-푸코실화된 글리칸 종류 (고 만노오스 함량을 가진 당단백질) 에 대한 상기 상호작용을 JMP 예측 프로파일러 도구를 사용하여 상세히 분석하였다. 일반적으로, 중간 레벨 (실험에서 레벨 0) 에서, 아연 (레벨 0 은 28.295 μM 을 의미함) 은 고 만노오스 글리칸의 양에 대해 음성을 나타내고, 구리 (레벨 0 은 0.330 μM 을 의미함) 는 양의 상관관계를 나타낸다 (도 7A). 이것은 -0.2 의 음의 아연 레벨 (25.416 μM 을 의미함) 및 0.6 의 양의 구리 레벨 (0.349 μM 을 의미함) 이 더이상 만노실화된 글리칸 종의 합에 대한 영향을 나타내지 않는다는 사실에 의해 확인된다 (도 7B). 하기에서, 고 만노오스 글리칸 종류에 대한 중요한 조정자 아연, 구리 및 망간의 상이한 시나리오를 시뮬레이션하였다:

중간 및 높은 레벨 (-0.2 내지 1 은 25.416 μM 내지 43.301 μM 을 의미함) 의 아연은 구리의 긍정적인 영향을 유도한다 (도 7C, F, G, H, I)

낮은 레벨 (-1 내지 -0.2 는 13.900 μM 내지 25.416 μM 을 의미함) 의 아연은 구리의 부정적인 영향을 유도한다 (도 7D, E)

중간 레벨 (-0.2 는 25.416 μM 을 의미함) 의 아연은 구리의 영향을 전멸시킨다 (도 7B, J)

망간의 부정적인 영향은 아연 및 구리 레벨에 독립적이다

세포 성장 및 mAb 글리칸 형성의 조합된 최적화를 위한 아연, 구리, 철 및 망간의 최적 농도를 측정하기 위해 JMP 의 예측 프로파일러 도구를 사용하였다. 여기서, 모든 미량 원소 파라미터를 고려하는 하나의 유효한 모델을 사용하였다 (철의 2 차 효과).

예측 프로파일러에 따르면 가장 높은 농도의 아연, 구리, 및 망간 및 > 0.42 (즉, > 36.704 μM) 레벨의 철은 세포 성장을 개선할 것이다 (도 8A, C). 고 농도의 아연, 철, 및 망간 및 저 농도의 구리를 사용하면 갈락토실화된 mAb 종의 양을 증가시킬 것이다 (도 8D). 한편, 저 농도, 레벨 -1 의 망간 (즉, 0.071 μM), 구리 (즉, 0.312 μM) 및 아연 (즉, 13.900 μM) 및 -0.3 의 레벨 (즉, 11.288 μM) 의 철은 동시에 비-푸코실화된 mAb 종의 양을 증가시킨다 (도 8F).

VCD 및 CTI 에 대한 최소값은 높은 레벨의 아연 및 구리, 및 철 및 망간에 대해 낮은 레벨을 선택하는 경우 실현된다 (도 8B). 저 갈락토실화된 글리칸 종은 저 농도의 모든 4 개의 원소를 선택함으로써 생성된다 (도 8D). 만노실화된 글리칸의 최소 레벨은 높은 아연 및 망간 레벨 및 낮은 철 및 구리 레벨에 대해 생성된다 (도 8G).

또다시, 데이터의 JMP 모델링에 의해 갈락토실화된 글리칸 형성을 증가시키기 위해 망간 단독과의 조합으로의 아연의 첨가에 대한 옵션을 또한 시험하였다. 이전에 제시된 바와 같이, 아연 및 망간은 갈락토실화된 글리칸 형성에 시너지 효과를 갖는다. 상기 효과의 정량화를 위해, 고 및 저 농도로의 아연 및 망간 효과기와 함께 G1 형성을 모델링하였다 (도 15). 높은 레벨의 아연의 높은 레벨의 망간과의 첨가는 G1 종류를 17% 증가시킬 수 있다 (도 15A, D).

글리칸 종류 성숙도의 정도를 조정하기 위한, 최적 미량 원소 레벨은 G1 및 고 만노오스 예측의 조합이다 (도 8D-G).

성숙 글리칸의 경우: 고 G1 및 저 Man5 에 대한 최적 레벨

미성숙 글리칸의 경우: 고 Man5 및 저 G1 에 대한 최적 레벨.

실시예 3

구리, 철, 아연, 및 망간의 조정에 의한 갈락토실화된 및 비-푸코실화된 글리칸 종의 표적화된 생성 : 생물반응기 실험 1

CHO-K1 클론 2 를 14 일 동안 전매 배지 및 일시주입 공급 공정 플랫폼 B 를 사용하는 통제된 2L Quad 발효 시스템 (Sartorius, Gottingen, Germany) 에서 성장시켰다. 농축된 영양소 공급물을 배양 시작 부피의 10% 로 제 3, 6, 및 9 일에 보충하였다. 표적화된 미량 원소 조정을 제 6 일에 mAb 글리코실화를 선호하는 특정 배지의 보충에 의해 수행하였다.

이전 실험에서 확인된 아연, 구리, 철 및 망간의 비 및 표적화된 농도를 표 9 에 요약한다. 아연, 구리, 철 및 망간의 상기 농도 및 비를 내인성의 높은 레벨의 Man5 글리칸 종류를 가진 클론 2 를 사용하는 생물반응기 공급-배치 입증 실험에서 시험하였다. 첫번째 공급-배치 상 (d0-d5) 에서 세포 성장을 지지하고 두번째 공급-배치 상 (d6-d14) 에서 mAb 글리코실화 성숙을 가능하게 하는 배양 스플릿팅 전략 및 표적화된 보충을 사용하는 미량 원소 비를, 표 9A 및 표 9B 각각에 기재된 바와 같이 "바이오매스" 및 "글리코실화" 상에 대해 2 가지 상이한 배양 배지를 사용함으로써, 조정하였다.

표 9A : d0-d5 로부터 성장 상을 위해 생물반응기 실험에서 사용되는 "바이오매스" 배지.

표 9B : d6-d14 로부터 글리코실화 상을 위해 생물반응기 실험에서 사용되는 "글리코실화" 배지.

미성숙 글리칸 형성, 소위 "비-푸코실화" 를 선호하는 설정과, 전체 공정에 대한 아연, 구리, 철 및 망간의 일정한 농도를 비교하여, 하기에서 "성장" 및 "갈락토실화" 로 불리는 2 가지 레벨 사이에서 단지 구리 농도를 변화시킴으로써 지시된 세포 성장 및 mAb 글리코실화 성숙에 대한 예측되는 미량 원소 농도를 시험하였다 (도 9A). 구리가 최대의 생존가능한 세포 밀도에 대한 것보다 글리코실화에 대해 더욱 강한 효과를 갖는 것으로 보이므로, 그렇게 결정하였다 (도 8).

하기 표 (표 10) 는 생물반응기 실험 1 에 대해 사용되는 이론적인 표적 농도를 나타낸다.

표 10 : 세포 성장, mAb 갈락토실화, 및 비-푸코실화를 조정하는 표적 이론적 미량 원소 농도. 생물반응기 실험 1 에서 사용되는 구리, 망간, 철, 및 아연의 농도는 도 9A 의 설정을 참고한다.

상기 설정을 사용하여, 제 6 일까지 세포 성장 용량이 "성장" 다음, "비-푸코실화" 및 "갈락토실화" 공정에 대해, 가장 높은 생존가능한 세포 밀도 및 CTI 를 보여주는 균형잡힌 미량 원소에 의해 조정될 수 있다는 것을 입증하였다 (도 9B, C). 글리코실화를 선호하는 조건 및 제 6 일로부터 감소된 세포 성장까지 후속적인 전환이 생존가능한 세포 밀도 및 세포 시간 적분에 대해 "갈락토실화" 공정에 대해 명확하게 입증되었다. 흥미롭게도, 미량 원소 비의 조정은 후기 공정 상에서 세포 생존성에 대한 강한 영향을 보여준다 (도 9D). 구리 감소는 최종 생존가능한 세포 밀도를 "성장" 공정과 비교하여 거의 30% 생존력 ("갈락토실화" 공정에 대해) 까지 증가시키는 경향이 있다. 감소된 구리 농도에 의한 증가된 세포 생존성의 영향은 또한 LDH 방출 분석에 의해 확인될 수 있을 것이다 (도 10C).

한편, 구리는 후기 공정 상에서 락테이트 재대사화 (remetabolization) 에 긍정적으로 영향을 주는 것으로 제시되었다 (Luo et al., Biotechnol. Bioeng. 109.1 (2012) 146-56). 상기 기재된 입증 실험에서 락테이트 재대사화에 대한 구리의 적절성을 확인하였는데, "갈락토실화" 가 "비-푸코실화" 및 "성장" 과 비교하면 후기 공정 상에서 증가되었으나 무비판적인 (→ 고 세포 생존성) 락테이트 농도를 나타내었기 때문이고, 이때 제 14 일까지 거의 모든 락테이트가 소모된다 (도 10B). 높은 레벨의 락테이트는 암모늄의 해독을 선호할 수 있다고 공지되어 있으므로 (Li et al., Biotechnol. Bioeng. 109.5 (2012) 1173-86), "갈락토실화" 공정에 대해 락테이트 축적 및 암모늄 제-동화의 역의 상관관계를 확인할 수 있었다 (도 10A).

mAb 글리코실화 동역학에 대한 미량 원소 조정의 영향을 연구하기 위해 생물반응기의 공정 샘플에서 비-푸코실화된 및 갈락토실화된 종류에 대한 실행을 분석하였다. 고 만노오스 종류 Man5 (도 11A) 뿐 아니라, 누적 비-푸코실화된 종류 (도 11D) 는 구리 농도 의존적 방식으로 (구리 농도: "비-푸코실화" > "성장" > "갈락토실화"), 예측된 미량 원소 조정에 의해 감소될 수 있다 (Man5 에 대해 30% 까지). 미량 원소의 조정은, 일단 공정이 성장에서 글리코실화 조건 (도 11A-C) 으로 전환되면, 고 만노오스 종류 G0 (30% 까지) 에서 후속적으로 G1 종류로 (제 13 일에 30% 까지) 전환을 산출한다. 제 14 일에 "갈락토실화" 설정에서의 G1 종류의 하강은 후기 공정 상에서의 생물학적이용가능한 Mn²⁺ 및 Zn²⁺ 의 제한에 의해 야기될 수 있다.

실시예 4

철, 구리, 아연 및 망간에 의한 세포 성장 및 mAb 글리코실화의 표적화된 조정 : 생물반응기 실험 2

CHO-K1 클론 2 를 배양 팽창을 위해 진탕 플라스크에서 그리고, 세포 성장 및 단백질 글리코실화를 위한 철, 구리, 아연 및 망간의 영향을 평가하기 위해, 생성 공급-배치 배양에 대해 통제된 2L Quad 발효 시스템 (Sartorius, Gottingen, Germany) 에서 14 일 성장시켰다. 전매 배지 및 공정 플랫폼 B 를 사용하였다. 농축된 영양소 공급물을 1 일 당, 초기 배양 시작 부피의 2.73% (v/v) 로 연속적으로 공급하였다. 표적화된 미량 원소 조정을 배양 배지 및 연속 공급물 중에 특정 금속 농도를 사용하고 (표 11-13) 접종 트레인 동안 배양물의 스플릿팅에 의해 수행하고 (상 n-2 및 n-1), 생성 규모 (상 n) 로 옮겼다. 철, 아연, 구리 및 망간의 각각의 농도를 특정 세포 및 배양 시스템 소모 속도에 기반하고 (도 13 및 14), 스플릿팅 및 배양 동안 균형을 이룬 부피를 고려하여 (예를 들어, 교정제 (correction agent), 예컨대 글루코오스 저장물, 소포제, 염기의 보충) 계산하였다. 철, 아연, 구리 및 망간의 실제 농도는 ICP-MS (Agilent, Boblingen, Germany) 에 의해 측정할 수 있다.

시험 케이스를 세포 배양 팽창 동안의 세포 성장, 공급-배치 중의 초기 바이오매스 발생 및 공급-배치 동안 생성 상 중의 단백질 갈락토실화를 지지하기 위해 (제 6-14 일), 또는 세포 배양 팽창 동안의 세포 성장, 공급-배치 중의 초기 바이오매스 발생 및 공급-배치 동안 생성 상 중의 단백질 비-푸코실화를 지지하기 위해 (제 6-14 일), 또는 세포 배양 팽창 동안 세포 성장, 공급-배치 중의 초기 바이오매스 발생을 간섭하고 공급-배치 동안 생성 상 중의 단백질 비-푸코실화를 지지하기 위해 (제 6-14 일) 디자인하였다 (도 12A).

표 11 : 세포 성장 및 mAb 글리코실화의 조정을 위한 각 배양 상의 시작 시 표적 이론적 미량 원소 농도 - "성장/성장" (GG). 생물반응기 입증 실험 2 에서 사용되는 구리, 망간, 철, 및 아연의 농도는 도 12A 의 설정을 참고한다.

표 12 : 세포 성장 및 mAb 글리코실화의 조정을 위한 각 배양 상의 시작 시 표적 이론적 미량 원소 농도 - "성장/비-푸코실화" (GA). 생물반응기 입증 실험 2 에서 사용되는 구리, 망간, 철, 및 아연의 농도는 도 12A 의 설정을 참고한다.

표 13 : 세포 성장 및 mAb 글리코실화의 조정을 위한 각 배양 상의 시작 시 표적 이론적 미량 원소 농도 - "비-푸코실화/비-푸코실화" (AA). 생물반응기 입증 실험 2 에서 사용되는 구리, 망간, 철, 및 아연의 농도는, 도 12A 의 설정을 참고한다.

의도되는 바와 같이, 시험 케이스 "AA" 는 명백하게 상 n 에서 생존가능한 세포 밀도 및 세포 시간 적분에 의해 제시되는 바와 같이 접종 트레인 및 생성 상 동안 세포 성장을 간섭한다 (도 12 C-D). 한편, 바이오매스 발생에의 차이가 공급-배치 중의 세포 배양 팽창 및 세포 성장 상 동안 시험 케이스 "GG" 및 "GA" 에 대해 관찰되지 않았다. mAb 성숙에 대한 영향을 글리칸 존재량 측정에 의해 분석하였다. 성숙 및 미성숙 mAb 글리코실화 종에 대해, G1 및 G2 또는 Man6, Man5 및 G0-GlcNAc 를 모집하였다. 의도되는 바와 같이, 시험 케이스 "GG" 는 성숙 글리칸 종의 형성을 선호하고 ("AA" 및 "GA" 에 비해 1.4-7 배 증가) (도 12E), 시험 케이스 "GA" 및 "AA" 는 미성숙 글리칸 형성을 지지한다 ("GG" 에 비해 2-3 배 증가) (도 12F).

요약하면, 기재된 절차는 생물공학적 제조 방법을 사용하는 표적화된 미량 원소 균형화에 의해 당단백질의 조정, 및 특히 mAb 글리코실화 성숙을 가능하게 한다. 아연, 구리, 철 및 망간 농도 및 비에 대한 조정 전략을 사용하여 "바이오매스" 를 "글리코실화" 조건으로 전환함으로써, 방법은 경제적인 높은 적정농도 공정에 대한 필요요건을 충족한다.

Claims (25)

1. CHO 세포에서의 발효 배양 조건 하에 재조합 당단백질의 제조 방법으로서, 바이오매스 발생을 증가시키기 위해 및/또는 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도에 영향을 주기 위해 배양 동안 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 조정하는 것을 포함하고, 상기 조정이:
   - 바이오매스를 증가시키도록, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시키는 것으로서, 증가 후 배양 배지 중의 농도가 하기와 같고:
   (a) 철 - 적어도 15 μM 내지 80 μM;
   (b) 구리 - 적어도 0.3 μM 내지 2.5 μM;
   (c) 아연 - 적어도 20 μM 내지 50 μM; 및
   (d) 망간 - 적어도 0.01 μM 내지 3 μM;
   이에 의해 배양 배지에서 발생된 바이오매스가 배양 동안 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도가 증가되지 않은 발효 공정과 비교하여 적어도 5% 증가하는 것; 및/또는
   - 발현된 당단백질 중의 N-글리칸 성숙도를 증가시키기 위해, 아연 및 망간 각각의 농도를 증가시키는 것 및, 임의로, 철 및 구리 각각의 농도를 감소시키는 것으로서, 발현된 당단백질의 탄수화물 부분이 G0, G1 또는 G2 구조를 갖고, 아연 및 망간의 농도 증가 후, 배양 배지 중의 농도가 하기와 같고;
   (a) 아연 - 적어도 20 μM 내지 50 μM; 및
   (b) 망간 - 적어도 0.01 μM 내지 3 μM;
   철 및 구리 농도의 임의 감소 후, 배양 배지 중 농도가 하기와 같고:
   (c) 철 - 25 μM 미만;
   (d) 구리 - 0.1 μM 미만;
   이에 의해 발현된 당단백질의 G0, G1 또는 G2 당형태의 양이, 배양 동안 배양 배지 중의 아연 및 망간 각각의 농도가 증가되지 않고, 임의로 철 및 구리 각각의 농도가 감소되지 않은 발효 공정과 비교하여 적어도 5% 증가하는 것;
   또는
   - (i) 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키기 위해, 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도를 감소시키는 것, 또는 (ii) 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키기 위해, 구리 및 철 각각의 농도를 증가시키는 것 및 아연 및 망간 각각의 농도를 감소시키는 것으로서,
   (i) 에서, 철, 구리, 아연 및 망간 농도의 감소 후, 배양 배지 중의 농도가 하기와 같고:
   (a) 철 - 35 μM 미만;
   (b) 구리 - 1 μM 미만;
   (c) 아연 - 20 μM 미만; 및
   (d) 망간 - 0.075 μM 이하; 또는
   (ii) 에서, 철과 구리 농도의 증가 및 아연과 망간 농도의 감소 후, 배양 배지 중의 농도가 하기와 같고:
   (a) 철 - 적어도 15 μM 내지 80 μM;
   (b) 구리 - 적어도 0.3 μM 내지 2.5 μM;
   (c) 아연 - 20 μM 미만; 및
   (d) 망간 - 0.075 μM 이하;
   이에 의해 발현된 비-푸코실화된 당단백질의 양이, 배양 동안, 옵션 (i) 에 따라, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 각각의 농도가 감소되지 않거나, 또는, 옵션 (ii) 에 따라, 배양 배지 중의 철 및 구리의 농도가 증가하지 않고 아연과 망간의 농도가 감소하지 않은 발효 공정과 비교하여 적어도 5% 증가하는 것이고;
   배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 감소가 철, 구리, 아연 및 망간을 킬레이터와 복합체화시킴으로써 및/또는 세포를 직전의 배양 상의 배지와 비교하여 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 감소된 농도를 함유하는 신선한 배지 내로 시딩함으로써 달성되는 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 발현된 당단백질이 성숙 N-글리코실화된 당단백질, 성숙 비-푸코실화된 당단백질 또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질인 제조 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 당단백질이 진핵 세포에 대해 외인성 또는 내인성이고, 임의로 당단백질이 구조적 당단백질, 호르몬, 항체 또는 효소인 제조 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 당단백질이 항체이고, 임의로 항체가 치료 또는 진단 항체, 임의로 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체인 제조 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 철, 구리, 아연 및 망간의 농도가 성장 및/또는 생성 배양 상 동안 조정되는 제조 방법.
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두의 농도에서의 증가가, 세포가 배양되는 배지를 보충함으로써 및/또는 철, 구리, 아연 및 망간 중 임의의 것 또는 모두로 보충된 신선한 배지 내에 세포를 스플릿팅함으로써 달성되는 제조 방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 중의 철, 구리, 아연 및 망간의 각각의 농도가 배양 동안 먼저 바이오매스 발생을 선호하고 이후 발현된 N-당단백질 중의 성숙도를 증가시키거나, 또는 미성숙 비-푸코실화된 당단백질의 생성을 증가시키도록 조정되는 제조 방법.
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