CN1239695C - 一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法。该方法包括含有乳酸氧化酶菌株的培养、含有唾液酸醛缩酶的大肠杆菌工程菌株即E.coli HB101(pBV220-ALD)的构建和培养、N-乙酰氨基甘露糖胺的制备、利用分别含乳酸氧化酶和唾液酸醛缩酶的完整细胞以乳酸钠为前体转化合成唾液酸以及通过离子交换分离纯化唾液酸等步骤。本发明的方法具有成本低廉，操作简单，转化条件要求宽泛，能有效解除丙酮酸钠对乳酸氧化酶的产物抑制等特点。为生物转化法大规模生产唾液酸提供了可能。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种利用微生物催化制备唾液酸的方法。具体的说，涉及一种分别含乳酸氧化酶和唾液酸醛缩酶的两种微生物完整细胞，由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法。
(二)背景技术
唾液酸(Sialic acid，SA)，是神经氨酸(Neuraminie acid，NA)及其衍生物的总称，是广泛存在于生物系统中的一类天然糖类化合物，从第一个唾液酸被分离和鉴定开始，人们就对其生物和生理活性进行了大量的研究。人们发现唾液酸类化合物在生命体许多重要的生物、生理过程中发挥着不可或缺的作用，它们直接参与细胞与细胞，细胞与微生物、细胞与毒素、细胞与抗体酶的相互作用。唾液酸及其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症、肿瘤等方面有很重要的应用价值。N-乙酰神经氨酸(5-acetamido-3，5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulosonic acid，Neu5Ac)是其中最有代表性的一族。
目前，唾液酸的工业化生产研究的还不是很多，这与唾液酸的广泛用途不相适应。现在国际市场的价格约50-100美元/克。工业上生产唾液酸的主要方法是化学合成，但是化学合成唾液酸至少要经过十几步反应，形成大量的中间产物，给唾液酸的后分离过程造成很大困难，这也是造成目前唾液酸的价格非常昂贵的原因之一。1991年，Lekh RajJuneja等从禽蛋中的蛋黄膜和系带中大量提取唾液酸，美国也报道了从牛乳乳清和酪蛋白中提取唾液酸，但是由于唾液酸在动物组织中的含量比较低，分离和提纯过程比较复杂，收率较低，因此，难以实施大工业化生产。1957年，Barry和Goebel首先在大肠杆菌K235中发现唾液酸的同聚合体-多聚唾液酸，后来人们相继在其它菌株中发现多聚唾液酸，经酸或酶水解后即可得到唾液酸单体，这为实现多聚唾液酸的微生物工业化生产提供了重要的前提。
1958年，Comb等首次报道了在唾液酸醛缩酶(EC4.1.3.3)的催化作用下唾液酸可以被生物降解为N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸，人们由此想到利用这一生物降解的逆过程，通过唾液酸醛缩酶来催化唾液酸的生物合成。20世纪80年代，Auge、Wong和Whitesides小组分别报道了使用唾液酸醛缩酶做催化剂实现了ManNAc和丙酮酸之间C-C键的形成，由此得到了唾液酸。他们是通过加入大大过量的丙酮酸来促使这个平衡反应向唾液酸合成方向进行的。随着唾液酸醛缩酶基因工程菌的构建，这种方法在唾液酸的大规模生产中越来越重要。
然而，用这种方法生产唾液酸，必须要注意一些问题：(1)ManNAc价格昂贵，需要通过N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的异构化来获得；(2)ManNAc和GlcNAc具有相似的化学性质，分离非常困难；(3)GlcNAc是唾液酸醛缩酶的抑制剂；(4)唾液酸醛缩酶对ManNAc反应的Km值较高(0.7M)；(5)唾液酸醛缩酶主要是催化唾液酸的降解反应，必须加入7-10倍过量的丙酮酸来推动逆反应，这样的做法，一是大大提高了成本，二是大量丙酮酸的存在给唾液酸的分离纯化造成了极大困难。
随着研究的深入发展，这些问题得到了部分解决。Spivak和Roseman报道了在碱性条件下，从GlcNAc得到ManNAc：将反应液调成中性后进行旋转蒸发，会使部分GlcNAc结晶析出，然后用热乙醇回流萃取富集ManNAc。Sugai等在1995年通过在酶反应器中加入丙酮酸酯脱羰基酶将反应体系中过量的丙酮酸降解为乙醛和二氧化碳，从而降低了生物合成唾液酸时产物与丙酮酸分离上的难度。
1991年，Wandrey等采用了完全不同的方法，可以从相对廉价的GlcNAc连续获得唾液酸。他们以GlcNAc和丙酮酸为原料，通过异构化酶和唾液酸醛缩酶两步酶催化反应，在酶膜反应器中合成了唾液酸。虽然这种方法有很高的收率，但是异构化酶还没有得到工业化生产，不容易获得。Marukin公司也同时采用了异构化酶的方法，他们让整个反应过程在碱性条件下进行，但是这导致了唾液酸醛缩酶活性受抑制以及异构化速率的下降。
1997年，Mahmoudian小组采用让丙酮酸和重亚硫酸盐形成络合物以除去丙酮酸的方法。后来，他们又采用富集ManNAc的方法，使反应体系中ManNAc过量，而省却了除丙酮酸这一步。但是，形成络合物的方法又引入了新的杂质，需要进一步去除。
从上面的几种合成方法可以看出，到目前为止，还没有找到非常完美的方法来解决异构化过程和醛缩过程中所存在的一系列问题，生产成本很大，造成唾液酸的价格居高不下。
(三)发明内容
本发明针对上述现有方法中，产品成本相对偏高的不足。本发明要解决的问题是，提供一种由底物乳酸钠和GlcNAc，通过乳酸氧化酶和唾液酸醛缩酶联合转化制备唾液酸的方法。该方法具有价格低廉，操作简单，可有效解除丙酮酸钠对乳酸氧化酶的产物抑制的特点。
本发明涉及的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，具体步骤如下所述：
(1)乳酸氧化酶菌种：选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171、假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452之一。
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％琼脂并加有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25℃～45℃培养15～30小时。
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠液体基本培养基BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子。
(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于300～1000mL含有质量体积比为0.2-3％的DL型或L型乳酸钠BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子。
(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于1.8～8L含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的BLM中，25℃～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼即DNP与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞乳酸氧化酶的酶活，至酶活达到0.9～2.0U/ml时，终止发酵培养。
在上述方法中，乳酸氧化酶酶活的单位(U)定义为：37℃，每分钟催化底物乳酸转化生成1μmol丙酮酸的酶量。
上述的液体基本培养基BLM，具体配方按质量体积比是：KH2PO40.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟。
金属离子混合液的配方如下：Na2EDTA 50g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，MnCl2·4H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 1.5g/L，CoCl2·H2O 1.6g/L，CaCl2·2H2O 5.5g/L。
(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，并用生理盐水洗涤2～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，将所得的菌体即生物催化剂A，在4℃储存，备用。
(7)唾液酸醛缩酶菌株的构建：以常规的方法构建大肠杆菌工程菌株即含有pBV220-ALD质粒的E.coli HB101。
重组工程菌株的构建：采用常规的方法制备E.coli K12菌株的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取E.coli K12菌株的基因组DNA；使用合成的引物从E.coli K12菌株的基因组DNA中PCR扩增得到唾液酸醛缩酶基因；使用EcoRI、PstI双酶切质粒pBV220，然后与扩增得到的唾液酸醛缩酶基因连接，得到重组质粒pBV220-ALD；再将重组质粒pBV220-ALD经过转化导入载体E.coli HB101，得到工程菌株E.coli HB101(pBV220-ALD)；
其中宿主为E.coli HB101；唾液酸醛缩酶(EC4.1.3.3)基因由E.coli K12菌株的基因组DNA中PCR扩增得到；质粒为pBV220；5’端的引物为AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC，加上一个EcoRI的位点；3’端的引物为TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT，加上一个PstI的位点。
(8)平板培养：将步骤(7)所得的菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，25℃～40℃培养10～12小时。
(9)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(8)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养10～12小时。
(10)二级种子：在无菌条件下，取步骤(9)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μtg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养5～10小时。
(11)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(10)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，25℃～40℃培养5～12小时，改变温度为42℃～50℃培养3～7小时。
上述改良的M9液体培养基，具体配方按质量体积比是：蛋白胨0.5％～2％；酵母粉0.25％～0.6％；Na2HPO4·7H2O 0.5％～2％；KH2PO4 0.1％～0.5％；NaCl 0.02％～0.1％；NH4Cl 0.05％～0.2％；CaCl2 0.0011％；葡萄糖0.2％～2％；115℃灭菌15分钟。
(12)收集菌体：将步骤(11)培养得到的培养物5,000转/分钟离心5～30分钟；用0.85％的生理盐水洗涤菌体1～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体；将菌体置于0℃～-30℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂B，待用。
(13)N-乙酰氨基甘露糖即ManNAc的异构化：取100～400g的N-乙酰氨基葡萄糖即GlcNAc和2.2～8.8g的氢氧化钠溶解在1～4L水中，然后在室温的条件下，异构化反应36～96小时。
(14)浓缩：将步骤(13)所得的异构化溶液经过732H型的离子交换树脂或用冰乙酸调节pH值为5～7；然后在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩或加入6-10倍体积的异丙醇，除去沉淀后再在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到黄色的GlcNAc和ManNAc的固体混合物。
(15)ManNAc富集：将步骤(14)得到的黄色固体，用0.5～3倍体积的甲醇浸泡12～36小时或用甲醇回流萃取0.5～2小时，抽滤将固液分离，得到ManNAc的富集液。
(16)浓缩ManNAc：将步骤(15)中得到的富集液，在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到油状的物质，即为ManNAc富集物，在-20℃冰箱中保存待用。
(17)转化实验：将步骤(6)所得的生物催化剂A和步骤(12)所得的生物催化剂B与底物乳酸钠和步骤(16)所得的ManNAc富集物混合；在5℃～40℃，pH 6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～50小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
上述反应混合物中底物乳酸钠的浓度为200～700mM；ManNAc富集物的浓度为40～100g/L；生物催化剂A的浓度：湿细胞5～80g/L；生物催化剂B的浓度：湿细胞1～10g/L。
(18)转化液的预处理：将步骤(17)所得的转化液，用732H型树脂或者冰乙酸调节pH至4～5，以5,000～12,000转/分离心5～10分钟，去除步骤(17)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(19)树脂处理：将选用的HZ201×8树脂、330树脂或者717树脂之一，用3～6倍柱体积的1N～2N的氢氧化钠水溶液以每小时0.5～2倍柱体积流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用3～6倍体积的1N～3N的甲酸水溶液以0.5～2倍柱体积流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6～7，然后待用。
(20)上柱：将步骤(18)所得的转化液预处理液以0.5～2倍柱体积流速上步骤(19)处理所得的离子交换柱，上柱过程中检测流出液中有没有唾液酸漏出，若有漏出即停止上样。
(21)洗脱：将步骤(20)处理过的离子交换柱的，先用2～4倍柱体积的去离子水以每小时0.5～2倍柱体积流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N～1N的甲酸水溶液先洗脱1～4倍的柱体积，再用1N～3N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N～3N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(22)浓缩：将步骤(21)收集的流出液，在真空度0.08～0.1MPa，25℃～50℃的条件下浓缩2～6倍。
(23)冰乙酸沉淀：将步骤(22)所得的浓缩液中加入体积比为4～10倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2～6天。
(24)唾液酸晶体收集：将步骤(23)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为3～6倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在30℃～70℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时。
(25)样品检测：将步骤(24)所得的唾液酸粉末，用13CNMR和HPLC检测产品的纯度。
上述步骤(1)中所述的菌种优选假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452。
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中涉及的菌株所使用的液体培养基是液体基本培养基BLM。
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养温度优选30～37℃。
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌体培养时间优选15～30小时。
上述步骤(2)、(3)、(4)、(5)中DL型或L型乳酸钠浓度优选0.5～2％。
上述步骤(7)中所述的大肠杆菌工程菌株为含唾液酸醛缩酶(EC4.1.3.3)基因的重组菌E.coli HB101(pBV220-ALD)。
上述步骤(8)、(9)、(10)中的培养温度优选30℃～40℃。
上述步骤(9)、(10)中培养大肠杆菌所用的培养基为液体LB培养基，具体配方是(质量/体积)：蛋白胨1％；酵母粉0.5％；氯化钠1％；121℃灭菌20分钟。
上述步骤(11)中前期培养温度优选30℃～40℃，后期诱导过程的温度优选42℃～45℃。
上述步骤(11)中所述的改良的M9培养基，具体配方按质量体积比是：蛋白胨1％；酵母粉0.5％；Na2HPO4·7H2O 1.28％；KH2PO4 0.3％；NaCl 0.05％；NH4Cl 0.1％；CaCl20.0011％；葡萄糖0.4％；115℃灭菌15分钟。
上述步骤中涉及的氨苄青霉素由无菌蒸馏水配制。
上述步骤(17)中的生物催化剂A是指含有乳酸氧化酶的假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452的完整细胞；生物催化剂B是指含有唾液酸醛缩酶的工程菌株E.coli HB101(pBV220-ALD)的完整细胞。
上述步骤(17)中生物催化剂A的浓度：湿细胞15～60g/L；生物催化剂B的浓度：湿细胞3～7g/L。
上述步骤(17)中的底物乳酸钠的浓度优选400～500mM。
上述步骤(17)中的转化反应温度优选15℃～35℃。
上述步骤(17)中的转化反应pH优选6.5～8.5。
上述步骤(19)中选用的树脂优选HZ201×8。
上述步骤(25)中，涉及的13CNMR由FX-90Q核磁共振仪分析，溶剂为重水。
上述步骤(25)中，涉及的HPLC方法采用Agilent1100仪器，色谱柱为Prontosil120-3-AMINO柱(150×3.0mm)，0.5mM硫酸为流动相，流速0.5mL/min，用紫外检测器205nm下检测，柱温为30℃。
本发明是一种利用含有乳酸氧化酶的完整细胞和含唾液酸醛缩酶的E.coli全细胞作为生物催化剂合成唾液酸，并且利用HZ201×8离子交换树脂分离纯化唾液酸的方法。
本发明涉及的不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171、假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452，同时具有D型乳酸氧化酶(D-LOD)和L型乳酸氧化酶(L-LOD)活性，并且该酶催化乳酸生成丙酮酸的过程不产生过氧化氢。
本发明涉及的由乳酸钠经多步偶联转化制备唾液酸方法的转化原理可用下述化学反应式表示：
本发明具有以下特点：
(1)用含乳酸氧化酶的菌体和含唾液酸醛缩酶的菌体作为催化剂偶联转化生产唾液酸。
(2)可以从更廉价的底物乳酸钠出发来生产唾液酸。
(3)同时由于在唾液酸合成的过程中丙酮酸的进一步消耗，减少了丙酮酸的积累，从而消除丙酮酸对乳酸氧化酶的底物抑制作用。
(4)含乳酸氧化酶菌株要求的培养基简单、成本低。
(5)能转化DL-乳酸或者L-乳酸，生成丙酮酸，底物成本低。
(6)该菌株的细胞通透性好，不需破碎，可直接用完整细胞进行转化，操作方便。
(7)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续分离提取费用低廉。
(四)附图说明
图1标准品的HPLC图谱。
其中，1.817min处为GlcNAc和ManNAc的峰；4.562min处为Neu5Ac峰；7.091min处为丙酮酸峰。
图2Neu5Ac晶体的HPLC图谱。
(五)具体实施方式
实施例1：含乳酸氧化酶菌株的培养
1假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452的培养
(1)乳酸氧化酶菌种：选择假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452；
(2)斜面培养：将假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452接种于含有质量体积比为1.5％琼脂并加有质量体积比为1％的L型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于30mL含有质量体积比为1％的L型乳酸钠液体基本培养基BLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于500mL含有质量体积比为2％的L型乳酸钠BLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养16小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于8L含有质量体积比为2％的L型乳酸钠的BLM中，30℃条件下，培养16小时，期间以2，4-二硝基苯肼即DNP与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞乳酸氧化酶的酶活，至酶活达到每毫升培养液1.2U时，终止发酵培养；
上述的液体基本培养基BLM，具体配方按质量体积比是：KH2PO4 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
金属离子混合液的配方如下：Na2EDTA 50g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，MnCl2·4H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 1.5g/L，CoCl2·H2O 1.6g/L，CaCl2·2H2O 5.5g/L。
(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心8分钟，并用质量体积比为0.85％的氯化钠水溶液洗涤2次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，得到湿菌体166克，将所得的菌体即生物催化剂A，在4℃储存，备用。
2、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171的培养
(1)乳酸氧化酶菌种：选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171；
(2)斜面培养：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171接种于含有质量体积比为1.5％琼脂并加有质量体积比为1％的L型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于30mL含有质量体积比为1％的L型乳酸钠液体基本培养基BLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于500mL含有质量体积比为2％的L型乳酸钠BLM中，30℃条件下，在摇床上振荡培养16小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于8L含有质量体积比为2％的L型乳酸钠的BLM中，30℃条件下，培养16小时，期间以2，4-二硝基苯肼即DNP与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞乳酸氧化酶的酶活，至酶活达到每毫升培养液最高0.53U时，终止发酵培养；
上述的液体基本培养基BLM，具体配方按质量体积比是：KH2PO4 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
金属离子混合液的配方如下：Na2EDTA 50g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，MnCl2·4H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 1.5g/L，CoCl2·H2O 1.6g/L，CaCl2·2H2O 5.5g/L。
收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心8分钟，并用质量体积比为0.85％的氯化钠水溶液洗涤2次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，得到湿菌体157.6克，将所得的菌体即生物催化剂A，在4℃储存，备用。
实施例2：工程菌株大肠杆菌E.coli HB101(pBV220-ALD)的构建
唾液酸醛缩酶菌株的构建：以常规的方法构建大肠杆菌工程菌株即E.coli HB101(pBV220-ALD)；
重组工程菌株的构建：采用常规的方法制备E.coli K12菌株的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法，提取E.coli K12菌株的基因组DNA；使用合成的引物从E.coli K12菌株的基因组DNA中PCR扩增得到唾液酸醛缩酶基因；使用EcoRI、PstI双酶切质粒pBV220，然后与扩增得到的唾液酸醛缩酶基因连接，得到重组质粒pBV220-ALD；再将重组质粒pBV220-ALD经过转化导入载体E.coli HB101，得到工程菌株E.coli HB101(pBV220-ALD)；
其中宿主为E.coli HB101购自北京工业微生物菌种保藏中心；唾液酸醛缩酶(EC4.1.3.3)基因由E.coli K12菌株(购自北京工业微生物菌种保藏中心)的基因组DNA中PCR扩增得到；质粒为pBV220(购自北京工业微生物菌种保藏中心)；引物合成在上海生工生物技术有限公司，5’端的引物为AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC，加上一个EcoRI的位点；3’端的引物为TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT，加上一个PstI的位点。
实施例3：工程菌株大肠杆菌E.coli HB101(pBV220-ALD)的培养
(1)平板培养：将工程菌株大肠杆菌E.coli HB101(pBV220-ALD)划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上，30℃培养12小时；
(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，30℃摇床振荡培养12小时；
(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到240mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养6小时；
(4)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种3L的改良的M9液体培养基，30℃培养7小时，改变温度为42℃培养4小时；
上述步骤(4)中所述的改良的M9液体培养基，具体配方按质量体积比是：蛋白胨1％；酵母粉0.5％；Na2HPO4·7H2O 1.28％；KH2PO4 0.3％；NaCl 0.05％；NH4Cl 0.1％；CaCl2 0.0011％；葡萄糖0.4％；115℃灭菌15分钟。
(5)收集菌体：将步骤(4)培养得到的培养物5,000转/分钟离心15分钟；并用质量体积比为0.85％的氯化钠水溶液洗涤菌体2次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，得到湿菌体17.5克；将菌体置于-20℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂B，待用。
实施例4：N-乙酰氨基甘露糖的制备
(1)N-乙酰氨基甘露糖即ManNAc的异构化：取200g的N-乙酰氨基葡萄糖即GlcNAc和4.4g的氢氧化钠溶解在2L水中，然后在室温的条件下，异构化反应48小时；
(2)浓缩：将步骤(1)所得的异构化溶液用冰乙酸调节pH值为6；然后在真空度0.95MPa，60℃的条件下浓缩，得到黄色的GlcNAc和ManNAc的固体混合物；
(3)ManNAc富集：将步骤(2)得到的黄色固体，用1倍体积即500ml的甲醇浸泡24小时，抽滤将固液分离，得到ManNAc的富集液；
(4)浓缩ManNAc：将步骤(3)中得到的富集液，在真空度0.95MPa，60℃的条件下浓缩，得到油状的物质，即为ManNAc富集物，称重为83.44克，在-20℃冰箱中保存待用。
实施例5：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞3克(即浓度为30克/升)和所得的生物催化剂B0.7克(即浓度为7克/升)与底物乳酸钠5.6克(即浓度为500mM)和所得的ManNAc富集物5克(即浓度为50克/升)混合，用蒸馏水定容到100ml，装入300ml的三角瓶中；在30℃，pH 7.5(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，180转/分钟振荡48小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将20ml HZ201×8树脂(上海华振树脂有限公司)，用60ml的2N的氢氧化钠水溶液以20ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用60ml的2N的甲酸水溶液以20ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以12ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用60ml体积的去离子水以60ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱60ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩6倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为5倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥4小时。
(9)样品检测：将步骤(8)所得的唾液酸粉末1克，用HPLC检测产品的纯度为98％。
实施例6：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞3克(即浓度为30克/升)和所得的生物催化剂B 0.7克(即浓度为7克/升)与底物乳酸钠5.6克(即浓度为500mM)和所得的ManNAc富集物5克(即浓度为50克/升)混合，用蒸馏水定容到100ml，装入300ml的三角瓶中；在30℃，pH 7.5(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，180转/分钟振荡48小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将20ml鲁抗717树脂(山东济宁鲁抗树脂厂)，用60ml的2N的氢氧化钠水溶液以20ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用60ml的2N的甲酸水溶液以20ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以12ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用60ml体积的去离子水以60ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱60ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩6倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为7倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶5天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥6小时。
(9)样品检测：将步骤(8)所得的唾液酸粉末0.6克，用HPLC检测产品的纯度为94％。
实施例7：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞12克(即浓度为12克/升)和所得的生物催化剂B 3.5克(即浓度为3.5克/升)与底物乳酸钠22.5克(即浓度为200mM)和所得的ManNAc富集物20克(即浓度为20克/升)混合，用蒸馏水定容到1000ml，装入5000ml的三角瓶中；在30℃，pH7(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，180转/分钟振荡48小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将200ml HZ201×8树脂(上海华振树脂有限公司)，用600ml的2N的氢氧化钠水溶液以200ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用600ml的2N的甲酸水溶液以200ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以120ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用600ml体积的去离子水以600ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱600ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩3倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为8倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶3天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥2小时。
(9)样品检测：将步骤(8)所得的唾液酸粉末6克，用HPLC检测产品的纯度为97.2％。
实施例8：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞60克(即浓度为30克/升)和所得的生物催化剂B 15克(即浓度为7.5克/升)与底物乳酸钠122克(即浓度为544mM)和所得的ManNAc富集物100克(即浓度为50克/升)混合，用蒸馏水定容到2000ml，装入5升的贝朗发酵罐中；在30℃，pH 7.5(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，以400rpm的搅拌速度，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，48小时后完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将400ml HZ201×8树脂(上海华振树脂有限公司)，用1200ml的2N的氢氧化钠水溶液以400ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用1200ml的2N的甲酸水溶液以400ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以240ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用1200ml体积的去离子水以1200ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱1200ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩6倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为5倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥4小时。
(9)样品检测：将步骤(8)所得的唾液酸粉末11.5克，用HPLC检测产品的纯度为95％。
实施例9：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞12克(即浓度为24克/升)和所得的生物催化剂B 1.75克(即浓度为3.5克/升)与底物乳酸钠20克(即浓度为357mM)和所得的ManNAc富集物20克(即浓度为40克/升)混合，用蒸馏水定容到500ml，装入3000ml的三角瓶中；在30℃，pH 7.5(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，180转/分钟振荡48小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将100ml HZ201×8树脂(上海华振树脂有限公司)，用300ml的2N的氢氧化钠水溶液以100ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用300ml的2N的甲酸水溶液以100ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以60ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用300ml体积的去离子水以60ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱300ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩6倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为5倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥4小时。
(9)样品检测：将步骤(8)所得的唾液酸粉末3.88克，用HPLC检测产品的纯度为96.4％。
实施例10：N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的制备
(1)转化实验：将所得的乳酸氧化酶活力高的生物催化剂A即假单胞菌(Pseudomonassp.)ATCC11452的湿细胞30克(即浓度为60克/升)和所得的生物催化剂B 2.5克(即浓度为5克/升)与底物乳酸钠25克(即浓度为446mM)和所得的ManNAc富集物20克(即浓度为40克/升)混合，用蒸馏水定容到500ml，装入3000ml的三角瓶中；在30℃，pH7(用加入乙酸的方法调节pH值)条件下，180转/分钟振荡48小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化。
(2)转化液的预处理：将步骤(1)所得的转化液，用冰乙酸调节pH至4，以12,000转/分离心5分钟，去除步骤(1)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液。
(3)树脂处理：将100ml HZ201×8树脂(上海华振树脂有限公司)，用300ml的2N的氢氧化钠水溶液以100ml/小时的流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用300ml的2N的甲酸水溶液以100ml/小时的流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6，然后待用。
(4)上柱：将步骤(2)所得的转化液预处理液以60ml/小时的流速上步骤(3)处理所得的离子交换柱。
(5)洗脱：将步骤(4)处理过的离子交换柱的，先用300ml体积的去离子水以300ml/小时的流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N的甲酸水溶液先洗脱300ml柱体积，再以相同流速用1N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液。
(6)浓缩：将步骤(5)收集的流出液，在真空度0.095MPa，40℃的条件下浓缩6倍。
(7)冰乙酸沉淀：将步骤(6)所得的浓缩液中加入体积比为5倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2天。
(8)唾液酸晶体收集：将步骤(7)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为5倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在50℃，真空度为0.095MPa的条件下，干燥4小时。
(9)样品检测：将步骤(3)所得的唾液酸粉末3.94克，用HPLC检测产品的纯度为93.5％。该样品的HPLC图谱见图2，保留时间4.532的峰即是唾液酸的峰。
Claims (6)
1.一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其步骤顺序如下：
(1)乳酸氧化酶菌种：选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171、假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452之一；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％琼脂并加有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25℃～45℃培养15～30小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠液体基本培养基BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于300～1000mL含有质量体积比为0.2-3％的DL型或L型乳酸钠BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于1.8～8L含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的BLM中，25℃～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼即DNP与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到0.9～2.0U/ml时，终止发酵培养；
上述的液体基本培养基BLM，具体配方按质量体积比是：KH2PO4 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O 0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH 7.0，115℃条件下灭菌20分钟；
金属离子混合液的配方如下：
Na2EDTA 50g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，MnCl2·4H2O 5g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O1g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，CuSO4·5H2O 1.5g/L，CoCl2·H2O 1.6g/L，CaCl2·2H2O5.5g/L；
(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，并用生理盐水洗涤2～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，将所得的菌体即生物催化剂A，在4℃储存，备用；
(7)唾液酸醛缩酶菌株的构建：以常规的方法构建大肠杆菌工程菌株即含有pBV220-ALD质粒的E.coli HB101；
其中宿主为E.coli HB101；唾液酸醛缩酶EC4.1.3.3基因由E.coli K12菌株的基因组DNA中PCR扩增得到；质粒为pBV220；5’端的引物为AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC，加上一个EcoR I的位点；3’端的引物为TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT，加上一个Pst I的位点；
(8)平板培养：将步骤(7)所得的菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上；
(9)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(8)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养10～12小时；
(10)二级种子：在无菌条件下，取步骤(9)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养5～10小时；
(11)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(10)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，25℃～40℃培养5～12小时，改变温度为42℃～50℃培养3～7小时；
上述改良的M9液体培养基，具体配方按质量体积比是：
蛋白胨0.5％～2％；酵母粉0.25％～0.6％；Na2HPO4·7H2O 0.5％～2％；KH2PO40.1％～0.5％；NaCl 0.02％～0.1％；NH4Cl 0.05％～0.2％；CaCl2 0.0011％；葡萄糖0.2％～2％；115℃灭菌15分钟；
(12)收集菌体：将步骤(11)培养得到的培养物5,000转/分钟离心5～30分钟；并用质量体积比为0.85％的氯化钠水溶液洗涤菌体1～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体；将菌体置于0℃～-30℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂B，待用；
(13)N-乙酰氨基甘露糖即ManNAc的异构化：取100～400g的N-乙酰氨基葡萄糖即GlcNAc和2.2～8.8g的氢氧化钠溶解在1～4L水中，然后在室温的条件下，异构化反应36～96小时；
(14)浓缩：将步骤(13)所得的异构化溶液经过732H型的离子交换树脂或用冰乙酸调节pH值为5～7；然后在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩或加入6-10倍体积的异丙醇，除去沉淀后再在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到黄色的GlcNAc和ManNAc的固体混合物；
(15)ManNAc富集：将步骤(14)得到的黄色固体，用0.5～3倍体积的甲醇浸泡12～36小时或用甲醇回流萃取0.5～2小时，抽滤将固液分离，得到ManNAc的富集液；
(16)浓缩ManNAc：将步骤(15)中得到的富集液，在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到油状的物质，即为ManNAc富集物，在-20℃冰箱中保存待用；
(17)转化实验：将步骤(6)所得的生物催化剂A和步骤(12)所得的生物催化剂B与底物乳酸钠和步骤(16)所得的ManNAc富集物混合；在5℃～40℃，pH 6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～50小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化；
上述反应混合物中底物乳酸钠的浓度为200～700mM；ManNAc富集物的浓度为40～100g/L；生物催化剂A的浓度：湿细胞5～80g/L；生物催化剂B的浓度：湿细胞1～10g/L；
(18)转化液的预处理：将步骤(17)所得的转化液，用732H型树脂或者冰乙酸调节pH至4～5，以5,000～12,000转/分离心5～10分钟，去除步骤(17)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液；
(19)树脂处理：将选用的HZ201×8树脂、330树脂或者717树脂之一，用3～6倍柱体积的1N～2N的氢氧化钠水溶液以每小时0.5～2倍柱体积流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用3～6倍体积的1N～3N的甲酸水溶液以0.5～2倍柱体积流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6～7，然后待用；
(20)上柱：将步骤(18)所得的转化液预处理液以0.5～2倍柱体积流速上步骤(19)处理所得的离子交换柱，上柱过程中检测流出液中有没有唾液酸漏出，若有漏出即停止上样；
(21)洗脱：将步骤(20)处理过的离子交换柱的，先用2～4倍柱体积的去离子水以每小时0.5～2倍柱体积流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N～1N的甲酸水溶液先洗脱1～4倍的柱体积，再用1N～3N的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N～3N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液；
(22)浓缩：将步骤(21)收集的流出液，在真空度0.08～0.1MPa，25℃～50℃的条件下浓缩2～6倍；
(23)冰乙酸沉淀：将步骤(22)所得的浓缩液中加入体积比为4～10倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2～6天；
(24)唾液酸晶体收集：将步骤(23)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为3～6倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在30℃～70℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时；
(25)样品检测：将步骤(24)所得的唾液酸粉末，用13CNMR和HPLC检测产品的纯度。
2.如权利要求1所述的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其特征在于步骤(11)中所述的改良的M9培养基，具体配方按质量体积比是：蛋白胨1％；酵母粉0.5％；Na2HPO4·7H2O 1.28％；KH2PO4 0.3％；NaCl 0.05％；NH4Cl 0.1％；CaCl2 0.0011％；葡萄糖0.4％；115℃灭菌15分钟。
3.如权利要求1所述的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其特征在于步骤(17)中生物催化剂A的浓度：湿细胞15～60g/L；生物催化剂B的浓度：湿细胞3～7g/L。
4.如权利要求1所述的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其特征在于步骤(17)中的底物乳酸钠的浓度为400～500mM。
5.如权利要求1所述的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其特征在于步骤(17)中的转化反应温度为15℃～35℃。
6.如权利要求1所述的一种由乳酸钠经多步偶联生物转化制备唾液酸的方法，其特征在于步骤(17)中的转化反应pH为6.5～8.5。
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