CN1030470C - 新抗生素金核霉素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新抗生素金核霉素(Aureonuclemycin)及其制备方法。该抗生素对因蜡黄杆菌属细菌(Xanthomonas)引起的植物细菌病害有很强的生长抑制作用。本发明还提供了一种有效成份为金核霉素的高效低毒低残留的农用杀菌剂。特别对防治水稻白叶枯病有卓效。本抗生素可通过培养金色链霉菌苏州变种SP-371而制得。

Description

本发明是关于新抗生素金核霉素（Aureonuclemycin）和其制备方法，以及以金核霉素为有效成份的农业园艺用杀菌剂。

近年来，抗生素不仅在医药方面，而且在农药方面也正在被广泛应用。本发明者为了寻找出比以往更为有效的新抗生素，从多种土壤中分离出微生物来制取抗生素，然后对这些抗生素分别进行精制、鉴定和开发应用。

本发明的目的在于提供一种新抗生素，并提供一种从链霉菌属的微生物中分离、制取该抗生素的方法。从而能开发出一种高效、低毒、低残留量的新农药。

使用的微生物

用来生产本发明所述的抗生素金核霉素是一种属于链霉菌属的菌种，其具有生产该抗生素的能力。金色链霉菌苏州变种SP-371（Streptomyces    aureus    Var    Suzhouneusisn    Var    yen    etal1982）（以下简称为“SP-371菌株”）就具有上述特性，适于生产本发明所述的金核霉素。该菌株于1981年6月自我国江苏省苏州市东山地区土壤中分离而得，其于1987年2月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为CGMCCNo0122。

“SP-371菌株”具有下述性质：

1.形态特征：

以插片法在天冬素、葡萄糖琼脂培养基上28℃培养本菌株7～10天后，用光学显微镜及电子显微镜分别观察菌丝的形态和孢子形态，表面结构。结果表明，该菌的气生菌丝呈螺旋状，一般在2～6圈左右;孢子呈球形或卵形，大小不均，孢子表面光滑。

2.在各种培养基上的特征：

28℃培养接种后，分别于第7、14、30天观察三次，以科学出版社出版的色谱（1957年版）作为颜色描述的标准。

（1）蔗糖、硝酸盐琼脂培养基

气生菌丝    生长弱薄    Ⅳ62′-Ⅴ62′-Ⅴ72′

营养菌丝    Ⅳ51′

可溶色素    无

（2）天门冬酰胺。葡萄糖琼脂培养基（ISP5）

气生菌丝    生长良好    中灰驼-Ⅴ72′带灰白小点

营养菌丝    莲子白-Ⅱ42′

可溶色素    无

（3）高氏-号琼脂培养基

气生菌丝    生长良好    Ⅴ72′

营养菌丝    Ⅱ22′-莲子白

可溶色素    微黄

（4）淀粉琼脂培养基（ISP4）

气生菌丝    生长中等    白-Ⅱ62′-Ⅴ72′

营养菌丝    乳白

可溶色素    微黄

（5）酪氨酸琼脂培养基（ISP7）

气生菌丝    生长良好    中灰驼-Ⅴ72′

营养菌丝    笋皮棕

可溶色素    黄棕色

（6）苹果酸钙琼脂培养基

气生菌丝    生长良好    Ⅴ61′-Ⅴ71′-Ⅴ72′

营养菌丝    笋皮棕-Ⅱ33′

可溶色素    黄棕色

（7）酵母·葡萄糖琼脂培养基

气生菌丝    生长中等    浅中灰驼-Ⅴ72′

营养菌丝    Ⅳ72′

可溶色素    褐棕色

（8）甘油·天门冬酰胺琼脂培养基

气生菌丝    生长良好    浅中灰驼-Ⅴ72′

营养菌丝    肉色-Ⅲ65′-笋皮棕

可溶色素    棕黄色

（9）燕麦粉琼脂培养基（ISP3）

气生菌丝    生长差    灰白

营养菌丝    黄褐色

可溶色素    无

（10）克氏-号琼脂培养基

气生菌丝    生长良好    中灰驼-Ⅴ72′

营养菌丝    莲子白

可溶色素    淡黄

（11）土豆块培养基

气生菌丝    丰茂、折皱、有水珠、

浅灰-Ⅱ51′-Ⅳ61′

营养菌丝

可溶色素    块变褐

3.生理生化特征：

（1）明胶液化+（有黑色褐色素）

（2）淀粉水介-

（3）硝酸盐还原+（在察氏溶液中）

（4）牛奶胨化+（牛奶变成深咖啡透明液）

牛奶凝固-

（5）H₂S产生+

（6）纤维素分介-（不生长）

（7）色素产生+

4.碳源利用：

很好利用：D-葡萄糖    D-阿拉伯糖

D-木糖    D-果糖

L-鼠李糖    甘露醇

一般利用：D-肌醇

不利用或生长可疑：蔗糖、棉子糖

根据中国科学院微生物研究所的链霉菌鉴定手册和上述试验的结果表明“SP-371菌株”属于金色链霉菌类群，但又与金色链霉菌又有明显的区别。其主要不同点在于该菌株不能在纤维素上生长，不产生能抑止革兰氏阳性、阴性细菌及丝状真菌的活性物质（平皿法）。经中国科学院微生物研究所阎逊初教授审定，将该菌株定名为Streptomycesaureus    Var    Suzhouneusisn    Var    yen    etal    1982.

培养及精制方法

用链霉菌属的上述生产菌，通过常规的抗生素生产方法，可以培养“SP-371菌株”，并制得本发明所述的抗生素金核霉素。培养方式既可为液体培养，也可为固体培养。为了有利于工业性生产时的培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液接种到培养基上，并进行通气搅拌。

对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、米糖、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。至于其它营养源则可适当添加一些无机盐类。例如食盐、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐。必要时也可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。

对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于使用菌的生长为准，并以选择金核霉素产量最高的条件为好。例如，培养基的pH范围可为4～9，尤以接近中性为好。培养温度宜在25～35℃，当然这些培养基的组分、氢离子浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用菌株的种类及外部条件等进行适当的调节，以获得最好的效果。

由上述所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能制得金核霉素，这些方法是常使用于提取代谢物的方法。例如可利用金核霉素与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取。这些方法可以单独使用，也可适当配合或反复利用。具体地讲，金核霉素存在于发酵滤液中，可用阳离子、阴离子交换树脂进行交换，然后用稀盐酸和醋酸解吸，也可用大孔吸附树脂或活性炭进行吸附，然后用含水丙酮进行解吸，这样可得到粗提物，粗提物再通过大孔吸附树脂或离子交换树脂，就可制得淡黄色的半精制品。最后采用低温放置，析出白色结晶。结晶经分离后在水中重结晶一次，即得金核霉素的纯品。

如上所得的金核霉素具有下述理化及生物性质：

1.形状：白色长方形片状结晶

2.熔点：146℃以上（分介变褐）

3.分子量：425（FAB-MS）（见附图1）

4.分子式：C₁₆H₁₉N₅O₉·H₂O

5.推定化学结构式：

6.元素分析：

分析值：碳43.41%、氢4.76%、氮15.7%、氧36.6%

理论值：碳43.43%、氢4.74%、氮15.8%、氧36.1%

7.比旋度[α]²⁵ _D＝+0.22（C＝0.25水中）

8.紫外吸收光谱：λ_max＝258nm（0.1N HCl中）

260nm（0.1N    NaOH中）

260nm（中性水中）

9.红外吸收光谱：（KBr法）（见附图2）

3400、2945、2362、1694、1643、1604、1504、1477、1416、1382、1308、1222、1176、1129、1087、1016、984、896、850、795、709、849、559、454cm¹

10.¹H-核磁共振谱：（见附图3）

（表1见文后）

S-单峰    d-双峰    m-多重峰

11.13C-核磁共振谱：（见附图4）

（表2见文后）

S-单峰    d-双峰    t-三重峰

12.抗菌谱：

采用通常的琼脂平板稀释法，结晶样品浓度128r/ml，用多点接种器接种细菌，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus    aureus）6株，大肠杆菌（Escherichia    coli）6株，枸橼酸杆菌（Citrobacter）5株，绿脓杆菌（Pseudomonas    auruginosa）7株，肺炎杆菌（Kebsiella    Pneumoniae）6株，阴沟肠杆菌（Enterbacter）6株，弗氏痢疾杆菌（Flexueri    Shigella）6株，伤寒杆菌（Subtilis    typhi）5株，宋纳氏痢病杆菌（Scmei    Shigella）6株等9种51株菌均无抗菌作用。

13.急性毒性：小白鼠口服，观察2周，10000mg/kg，无任何中毒症状。

14.稳定性：在酸性中稳定，在碱性中不稳定。

经中国医学科学院抗生素研究所及日本理化学研究所抗生物质研究室编的二套抗生素电子计算机检索系统的检索均未发现有分子量为425分子式为C₁₆H₁₉N₅O₉·H₂O的核甘类抗生素。由上可知，本发明所述的金核霉素是一种未见文献报导的新抗生素，其在化学结构上类似于日本三共株式会社发表的除草素（Herbicdins A.B.C.E.F.G）

农业园艺用杀菌剂

本发明所述的金核霉素是一种对因蜡黄杆菌属细菌（Xanthomonas）引起的植物细菌病害，特别是对水稻白叶枯病（Xanthomonas    Oryzae）有效的新抗生素。其不但对作物的病害具有预防和治疗作用，而且具有耐雨水冲刷、对紫外光稳定等性能。

在制造以本发明所述的金核霉素为有效成份的农用杀菌剂时，可同样使用该技术领域中已知农药所通用的固相、液相及乳化分散剂等各种载体。并能配制成颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂、烟雾剂等任意的剂型。同时，在各种制剂中一般可适当添加一些辅助剂，但不能加入如季胺盐之类的碱性辅助剂。

一般而言，各制剂中有效成份的配比，在乳剂及可湿性粉剂中为10～90%;在粉剂及油剂等中为0.1-10%;当然，也可根据不同的使用目的而适当增减。

本发明的制剂还可与其他杀菌剂、除草剂、杀虫剂、肥料物质、土壤改良剂等配合使用，但不得与波尔多液、石灰水等碱性物质混合使用。

以下就本发明的制造、实施、试验事例作举例说明。

制造例：

以葡萄糖5%、花生饼粉2%、糊精1%、蛋白胨0.2%、硫酸铵0.2%、食盐0.3%、碳酸钙0.6%的比例制成培养基。灭菌前pH＝7.2-7.5，将上述金色链霉菌苏州变种（微生物储存号CGMCC    No0122）接种于该培养基中。250ml三角摇瓶中装置为50ml，在28℃振荡培养40小时，作为种子液。取200ml种子液于12立升的玻璃发酵罐中，内装9立升上述相同比例的培养基，在28℃以通气量1∶0.6-0.8搅拌培养76小时后过滤，此时金核霉素在发酵滤液中的含量约为 500r/ml。取滤液6立升（PN6.5）通过711阴离子交换树脂（COO^-型）柱（φ5.5×60cm），然后用1立升水洗涤，再用1N乙酸溶液介吸。收集260nm处有吸收的部分，再通过300ml1×4阳离子交换树脂（H⁺型）柱（φ3.5×20cm），经水洗后用0.3NHCl4000ml介吸，收集260nm处有吸收的部分，用2N NaOH调节到pH＝3，再通过大孔吸附树脂1300-Ⅱ型，水洗后用20%乙醇水溶液介吸，介吸液经减压浓缩、静置过液（低温0℃左右），有白色结晶析出。过滤后在水中重结晶一次，得纯品1500mg，总收率在50%左右。

实施例1可湿性粉剂

将10份金核霉素与5份十二烷基磺酸钠、2份二苯甲烷。二磺酸钠，甲醛聚合物及83份陶土混合、粉碎、即得100份制剂。

实施例2乳剂

将8份金核霉素与10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份烷基二甲苯氯化铵及52份甲醇混合溶介，即得100份乳剂。

实施例3粉剂

将0.2份金核霉素与0.5份硬脂酸钙、50份滑石粉及49.3份陶土混合粉碎，即得100份粉剂。

实施例4颗粒剂

将10份金核霉素与15份淀粉、72份皂土粉及3份硫酸十二烷基酯的钠盐混合粉碎，即得100份颗粒剂

试验1对水稻白叶枯病的预防试验

将按实施例1所制成的可湿性粉剂稀释至所预定的浓度，然后喷撒到分蘖期的盆栽稻植株上（品种：元丰早）。风干后，分别于12、24、48小时，用多针法在叶片接种浓度为10亿胞子数的白叶枯病源菌悬浮液。在温室中培养14天（喷药后），按5级发病指数方法计算预防效果，结果如下表：

（表3见文后）

＊敌枯双的化学名称为N，N-甲撑-双（2-氨基-1，3，4-噻二唑）

试验2对水稻白叶枯病的治疗试验

药剂、水稻植株、病源菌液均同试验1。本试验采用先在植株上接种白叶枯菌，然后于第1、3、5、7天后喷药，接种后15天检查治疗效果，结果如下表：

（表4见文后）

试验3耐雨水冲刷试验

药剂、水稻植株、病源菌液均同试验1。本试验采用先喷药，然后分别于0.5、3、24小时后用水冲刷叶片同不用水冲刷作对照，喷药后48小时再接种病源菌。每次冲刷长65cm、宽39cm、面积为2535cm²，冲刷时间为10分钟，冲水量为3500ml。在喷药15天后进行检查其结果如下表：

（表5见文后）

试验4紫外光照射稳定性试验

药剂、水稻植株、病源菌液均同试验1。本试验采用先接种病源菌，48小时后再喷药。药液先经30W紫外灯在远离1米处照射24、48小时后再使用。喷药后14天进行检查，其结果如下表：

（表6见文后）

根据以上试验可以证明，以本发明所述的金核霉素为有效成份的药剂是一种新型的农用杀菌剂。这样药剂特别对防治水稻白叶病显示出卓越的效果，而且毒性及残留量均很低。

表1

化学位移δPPM    1.97～2.05    3.58    4.16    4.19    4.44    5.34    6.08    6.28    7.25    8.15    8.63

氢原子数与峰形    2Hm    1HS    2Hd    2Hd    2Hm    1HS    1HS    1HS    2HS    1HS    1HS

表2

化学位移δPPM    25.2    63.3    69.4    71.9    75.4    75.8    77.2    81.0

峰形    t    d    d    d    d    d    d    d

化学位移δPPM    88.8    92.6    117.9    140.1    149.1    152.3    155.7    170.4

峰形    d    S    S    d    S    d    S    S

表3

样品    浓度（倍）    预防效果（%）

12小时后接种    24小时后接种    48小时后接种

金    2000    88.5    88.98    92.11

核    4000    83.3    74.41    68.65

霉    8000    52.83    48.87    35.83

素    16000    30.68    29.74    18.87

^＊敌枯双 250PPM 93.15 93.60 99.04

CK    病指    100

表4

治疗效果（%）

样品    浓度（倍）    接种后    接种后    接种后    接种后    备注

第1天    第3天    第5天    第7天

2000    94.92    89.29    80.68    63.26

4000    95.00    85.84    78.13    64.18

金核霉素

8000    86.15    83.86    64.86    51.33

16000    75.00    61.2    36.69    22.08

敌枯双    250PPM    97.64    100    84.82    65.42

CK    病指    100

表5

样品    浓度（倍）    防治效果（%）

0.5小时    3小时    24小时    不冲刷

金    2000    73.98    75.84    98.66    100

核    4000    65.78    66.15    86.61    99.97

霉    8000    76.73    52.85    85.56    88.41

素    16000    61.98    50.56    80.12    90.84

敌枯双    250PPM    87    96    90.15    98.11

CK    病指    98

表6

样品    浓度（倍）    防治效果（%）    常规

照射24小时    照射48小时    不照光48小时

2000    88.43    86.53    92.51    81.95

金    4000    83.39    58.96    86.33    79.33

核    8000    73.93    50.77    57.98    70.29

霉

素    16000    70.00    49.42    50.15    55.71

250PPM    48.68    48.47    63.17    60.58

CK    病指    99.46

Claims (1)

1、一种新抗生素金核霉素的制备方法，该抗生素具有下述理化性质：

(1)形状：白色长方形片状结晶

(2)熔点：146℃以上(分解变褐色)

(3)分子量：425(据FAB-MS)

(4)分子式：C₁₆H₁₉N₅O₉·H₂O

(5)化学结构式：

其特征在于先培养金色链霉菌苏州变种SP-371(该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会的编号为CGMCCNo.0122)，再从这些培养物中经树脂交换分离、稀酸解吸、溶剂提取而制得。

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