CN117982526A - 银杏叶多糖在制备治疗或预防hcmv药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了银杏叶多糖在制备治疗和/或预防HCMV药物中的应用。银杏叶多糖（polysaccharide from Ginkgo biloba L.GP）对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数都有显著的抑制作用，对HCMV感染具有显著的预防和治疗作用，而且GP毒副作用小，安全有效，可以用于HCMV的感染，具有良好的应用前景。

Description

银杏叶多糖在制备治疗或预防HCMV药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体是一种银杏叶多糖在制备治疗或预防HCMV药物中的应用。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒β亚科，HCMV是最大的一类疱疹病毒，病毒直径大小200nm左右，其基因组由235kb双链DNA(dsDNA)组成，至少编码165个以上的病毒相关蛋白。HCMV在人群中普遍易感，与其他人类疱疹病毒一样，HCMV在感染后不会被完全清除，而是在宿主体内潜伏，在免疫力低下或者器官移植病人中，极易发生激发感染，加重病情。同时，HCMV感染也是造成孕妇流产以及新生儿先天性疾病的主要病原体，引起小头畸形、黄疸性肝炎、智力低下、失明、认知障碍等。因此，HCMV感染造成了严重的社会和医疗负担。

虽然HCMV疫苗研发取得了一些进展，但是目前还没有成熟的疫苗获准上市，抗病毒药物是临床上唯一的选择，其中更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)、膦甲酸(Foscarnet，FOS或PFA)和西多福韦(cidofovir，CDV)是临床批准的用于治疗HCMV感染的主要药物，这些药物主要是通过抑制病毒DNA聚合酶发挥抗HCMV的作用。但是这些药物具有骨髓抑制、肾毒性和电解质紊乱等不良反应，同时临床上出现的一些耐药毒株，都显著降低了这些药物使用的效果，限制了其在临床上的应用。综上所述，对人巨细胞病毒感染进行有效的预防以及对感染者进行积极有效的治疗，是提高出生人口素质和提高免疫力低下老年人生活质量的重要手段。

银杏(Ginkgo biloba L.)别称白果、公孙树，属于裸子植物门中银杏科银杏属的落叶大乔木。银杏树系中国特产，分布广泛，尤其在江苏省泰兴市为最多。银杏树具有欣赏、经济和药用价值。明代《本草纲目》中记载，银杏“熟食温肺益气，定喘嗽，缩小便，止白浊；生食降痰消毒、杀虫。”，说明银杏果在治疗咳嗽、哮喘、遗精遗尿、白带方面具有良好的效果；银杏果还具有抗过敏、抑制真菌，延缓大脑衰老、增强记忆能力等功效。现代研究表明，银杏叶提取物对治疗冠心病、心绞痛和高脂血症有良好效果，可以明显改善冠心病患者的头晕、胸闷、心悸、气短、乏力等症状。但是到目前为止，银杏叶包括其来源的活性物质多糖暂未见在制备预防和/或治疗HCMV药物中的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过从银杏叶中提取多糖GP，进行了系列的生物学实验，目的是提供一种毒副作用小，安全有效的抑制HCMV的药物。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了银杏叶多糖GP在制备治疗和/或预防HCMV感染药物中的用途。

所述银杏叶多糖的制备方法包括如下步骤：

1)采摘新鲜银杏叶，剪除枝茎，反复冲洗至洁净后漏网晾干；

2)晾干的银杏叶放置到托盘中自然干燥，随后将银杏叶放入烘干箱中于70℃恒温干燥；

3)将完全烘干的银杏叶粉碎后过80目筛得粉末；

4)称量银杏叶粉末，将银杏叶粉末加入到三颈圆底烧瓶中，加入石油醚；组装好冷凝回流装置，将三颈圆底烧瓶放置到水浴锅中，水浴锅温度为70℃，恒温回流脱脂1次，此过程耗时1h；

5)脱色后银杏叶粉末加入蒸馏水，100℃恒温煮沸提取2h；

6)将料液使用尼龙布过滤出滤渣重新准备再提取一次，提取过程要求与第一次相同，重复提取1h后再次使用尼龙布过滤，合并两次滤液；

7)合并的滤液随后使用循环水真空泵过滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩，装入到截留分子量为500Da的透析袋中透析，使用旋转蒸发仪浓缩后以1：4的体积比例倒入酒精开始醇沉，静置过夜，抽滤后烘干称重。

所述的应用，步骤4)中银杏叶粉末与石油醚的重量体积比为1:5。

所述的应用，步骤5)中银杏叶粉末与蒸馏水的重量体积比为1:15。

银杏叶多糖GP通过对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的抑制来抑制HCMV。

银杏叶多糖GP可以显著保护HCMV感染引起的细胞病变效应。

本发明生物学实验的研究结果表明：

1、银杏叶多糖GP单独处理HCMV宿主细胞WI-38，在1.5625μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml的浓度梯度对WI-38没有表现出明显的细胞毒性，当银杏叶多糖GP的浓度达到50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml时会表现出细胞毒性。

2、银杏叶多糖GP在5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的浓度都能够缓解HCMV引起的WI-38细胞病变效应，特别是10μg/ml、20μg/ml的浓度效果最明显；其中20μg/ml银杏叶多糖GP处理的效果与200μg/ml的阳性药物PFA效果相当。

3、银杏叶多糖GP在10μg/ml、20μg/ml的浓度都能够显著抑制HCMV立即早期蛋白IE1/2以及早期蛋白p52在WI-38中的表达。与单独接种HCMV的组别相比较，5μg/ml的浓度可以抑制IE1/2和p52表达水平分别至84％(p>0.05，差异不显著)和78％(p>0.05，差异不显著)；10μg/ml的浓度可以抑制IE1/2和p52表达水平分别至66％(^**p<0.01，差异极显著)和59％(^**p<0.01，差异极显著)；当GP浓度达到20μg/ml时，可以抑制IE1/2和p52表达水平分别至44％(^*p<0.05，差异显著)和30％(^***p<0.001，差异极其显著)。

4、银杏叶多糖GP在5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的浓度可以降低HCMV立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数。与单独接种HCMV的组别相比较，5μg/ml的浓度可以抑制早期基因UL44拷贝数至78％(^**p<0.01，差异极显著)，抑制晚期基因UL32的DNA拷贝数至81％(^*p<0.05，差异显著)；10μg/ml的浓度可以抑制早期基因UL123拷贝数至80％(^*p<0.05，差异显著)，抑制早期基因UL44的DNA拷贝数至71％(^**p<0.01，差异极显著)，抑制晚期基因UL32的DNA拷贝数至65％(^**p<0.01，差异极显著)；20μg/ml的浓度可以抑制早期基因UL123拷贝数至72％(^*p<0.05，差异显著)，抑制早期基因UL44的DNA拷贝数至64％(^***p<0.001，差异极其显著)，抑制晚期基因UL32的DNA拷贝数至66％(^**p<0.01，差异极显著)。

本发明所述的药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。

本发明所述的药物的制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂，例如，片剂、粉末剂、胶囊、溶液、分散液、混悬剂、糖浆、喷雾、凝胶、乳状液、凝胶、贴片等。

本发明的有益效果如下：本发明提供了银杏叶多糖GP在制备治疗和/或预防HCMV药物中的应用，银杏叶多糖GP在没有明显细胞毒性的剂量下具有显著的抗HCMV作用，表现为对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数都有显著的抑制作用，安全有效，可以用于HCMV的感染，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是CCK8法测定银杏叶多糖GP对HCMV宿主细胞-人胚肺成纤维细胞(WI-38)细胞毒性的影响。其中，Control组是无银杏叶多糖GP处理的细胞，作为实验对照组。银杏叶多糖GP各个浓度组与Control组进行比较和统计分析，其中^***P<0.001，说明差异极其显著。

图2是银杏叶多糖GP缓解HCMV感染人胚肺成纤维细胞WI-38引起的细胞病变效应，其中，

Control对照组细胞，不感染HCMV，不加银杏叶多糖GP处理；

HCMV组细胞是HCMV单独感染，不加银杏叶多糖GP处理；

PFA组细胞是阳性药物膦甲酸(PFA，200μg/ml)单独处理，不感染HCMV，做为阳性药物对照；

所有感染HCMV的组别都是MOI＝0.5的剂量进行接种，感染五天(5dpi)进行观察拍照。

图3是Western-blot法测定不同浓度银杏叶多糖GP(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)处理WI-38细胞对HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白p52的影响(GAPDH为内参，进行均一化处理)；其中图3(A)是银杏叶多糖GP处理细胞后，即刻早期蛋白IE1/2和早期蛋白p52表达水平的代表性图片；图3(B)是对图3(A)结果的定量分析和统计。

图3(B)中HCMV alone组是HCMV单独感染，不添加银杏叶多糖GP处理，该组在统计时设为1，做为药物处理前后样品组的对照；

三种浓度银杏叶多糖GP处理组以及阳性药物PFA处理组感染HCMV都按照MOI＝0.5的剂量进行接种，HCMV感染后五天(5dpi)进行收样，裂解液裂解细胞进行蛋白检测。与HCMValone单独感染细胞组比较，^*表示P<0.05，^**表示P<0.01，^***表示P<0.001。

图4是qPCR法测定不同浓度银杏叶多糖GP对HCMV立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的影响。三种浓度银杏叶多糖GP处理组以及阳性药物PFA处理组都按照MOI＝0.5的剂量进行接种，HCMV感染后三天(3dpi)进行收样，提取病毒DNA，进行qPCR检测。与HCMV alone单独感染细胞组比较，^*表示P<0.05，^**表示P<0.01，^***表示P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、抗体、化学试剂等，如无特殊说明，均可从相应的公司购买。

本发明所涉及的人胚肺成纤维细胞株WI-38和人巨细胞病毒(HCMV)Towne株均来自于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。

实施例1银杏叶多糖GP的制备

采摘新鲜银杏叶，剪除枝茎，反复冲洗至洁净后漏网晾干。晾干的银杏叶放置到托盘中自然干燥，随后将银杏叶放入烘干箱中于70℃恒温干燥。将完全烘干的银杏叶粉碎后将过80目筛得粉末。银杏叶粉末称量至100g，将银杏叶粉末加入到三颈圆底烧瓶中，加入石油醚500mL[比例为以1：5(g/mL)]。组装好冷凝回流装置，将三颈圆底烧瓶放置到水浴锅中，水浴锅温度为70℃恒温回流脱脂1次，此过程耗时1h。脱色后银杏叶粉末以料液比为1：15加入蒸馏水，100℃恒温煮沸提取2h。将料液使用尼龙布过滤出滤渣重新准备再提取一次(实验过程要求与第一次相同)，重复提取1h后再次使用尼龙布过滤，合并两次滤液。合并的滤液随后使用循环水真空泵过滤。滤液使用旋转蒸发仪浓缩，装入到截留分子量为500Da的透析袋中透析。使用旋转蒸发仪浓缩后以1：4(按照体积)的比例倒入酒精开始醇沉。静置过夜，抽滤后烘干称重。即可得银杏叶多糖GP。

实施例2银杏叶多糖GP单独处理对WI-38细胞毒性的影响

通过常规的CCK-8法检测银杏叶多糖GP对细胞毒性的影响。

测定细胞毒性方法简述如下：选择传代代次为30代的(PD30)人胚肺成纤维细胞WI-38细胞，待细胞长满细胞瓶，胰酶消化后进行细胞计数，以5000个/孔的细胞密度铺细胞于96孔细胞培养板，置于37℃，5％ CO₂的培养箱中培养。第二天观察细胞，待细胞长满单层后，弃去原来的培养基，更换为含不同浓度(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml)的银杏叶多糖GP的新鲜培养基，每一浓度设置3个平行孔，同时设不加银杏叶多糖GP的阴性对照组和无细胞的空白对照组，也同样设置3个平行孔，置于37℃，5％CO₂的培养箱继续培养5天，添加培养基时注意不要带入气泡。然后向每孔加入10μl CCK-8溶液，注意不要向孔中引入气泡，防止影响后续OD值测定，37℃、5％CO₂条件下继续培养1-2h，待培养基颜色变为深棕色时，从培养箱取出置于450nm处测定光吸收度，根据测得的数据计算相对细胞活力，以不加银杏叶多糖GP的对照组细胞活力设定为1，实验结果分析如下：细胞活力＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]。银杏叶多糖GP对细胞毒性影响结果见图1。

实施例3 HCMV的接种以及银杏叶多糖GP处理

选择处于对数生长期PD30的WI-38细胞，用胰酶消化后进行细胞计数，用常规的含10％ FBS的DMEM培养基稀释细胞，然后按照2×10⁴/cm²的细胞密度铺板六孔细胞培养板，置于37℃，5％ CO₂的培养箱中培养24小时。待细胞长成单层后更换成含0.2％ FBS的DMEM培养基，继续培养36-48小时，使细胞G0/G1同步化，有利于后续HCMV的感染实验。HCMV病毒(Towne病毒株)接种剂量为MOI＝0.5，放入37℃，5％ CO₂的培养箱中培养至指定时间进行相关检测(DNA拷贝数检测为HCMV感染后3天，蛋白检测为HCMV感染后5天)。进行银杏叶多糖GP以及阳性药物磷甲酸PFA处理时，在HCMV感染细胞前2小时，更换含不同浓度的(5、10、20μg/ml)银杏叶多糖GP培养基，再接种HCMV(MOI＝0.5)进行病毒感染，最后观察银杏叶多糖GP处理与否，不同时间细胞形态学变化以及病毒蛋白表达和DNA拷贝数等的变化。

实施例4银杏叶多糖GP处理WI-38细胞对HCMV感染后细胞病变效应的影响

WI-38细胞接种HCMV(MOI＝0.5)后，三天后可以观察到HCMV单独感染组中由于HCMV感染引起的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，主要特征是病毒感染的细胞变大变圆，细胞间的间隙增大，到第五天，这种细胞病变现象更加显著，形成明显的拉网状，细胞开始有脱落。银杏叶多糖GP(5、10、20μg/ml)预处理细胞，可以明显缓解HCMV感染引起的CPE，特别是当银杏叶多糖GP的浓度达到10μg/ml和20μg/ml时，效果更加明显，没有出现严重的CPE(图2)。同时，单独用5、10、20μg/ml浓度的银杏叶多糖GP处理细胞，没有引起细胞形态明显比阿奴啊(图2)，这个结果与图1中的CCK8法测定银杏叶多糖GP对细胞活力的结果一致。

实施例5银杏叶多糖GP处理对HCMV病毒蛋白表达的影响

为了进一步确认银杏叶多糖GP抗HCMV作用，我们选择HCMV立即早期蛋白1/2(IE1/2)和早期蛋白p52做为检测病毒的指标，检测不同浓度(5、10、20μg/ml)的银杏叶多糖GP预处理细胞对IE1/2和p52的表达影响。细胞培养和铺板、多糖处理以及接种HCMV处理同上述实施例3所述。设立不感染HCMV和无多糖处理的阴性对照组(-)；单独接种HCMV和无多糖处理的HCMV alone对照组，以及不同浓度(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)的银杏叶多糖预处理和接种HCMV的三个实验组；同时设置阳性药物磷甲酸PFA预处理和接种HCMV的阳性药物对照组，一共六个实验组别。同时HCMV的剂量为MOI＝0.5，HCMV感染后5天收集细胞样品，裂解细胞细胞进行病毒相关蛋白的检测。常规方法进行SDS-PAGE蛋白电泳和转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭2小时后，用鼠源的抗IE1/2和p52抗体4℃孵育过夜，用TBST洗膜三次，每次五分钟，然后用HRP-偶联的羊抗鼠二抗室温孵育1小时，最后进行化学发光检测。结果显示银杏叶多糖GP在5μg/ml的浓度下可以降低HCMV立即早期蛋白IE1/2和早期蛋白p52的表达，但是无统计学差异(图3)，当浓度达到10μg/ml及以上时，对IE1/2和p52蛋白的抑制作用明显，具有显著性差异。

实施例6银杏叶多糖GP预处理对HCMV在宿主细胞中的DNA拷贝数的影响

细胞培养、多糖处理以及HCMV接种处理同上述实施例3所述。HCMV也是按照MOI＝0.5的剂量进行感染，样品收集时间为HCMV感染后3天(3dpi)。采用qPCR法测定HCMV DNA的拷贝数，使用QIAamp DNAMini Kit试剂盒提取病毒DNA，取10ng总DNA，使用2×UniversalSYBR Green Fast qPCR Mix进行qPCR实验，所用引物如下表所示：

表1：实验所用引物名称和序列

扩增条件：95℃5min，(95℃5sec，60℃30sec)×40循环，经2^-△△Ct法计算，以单独HCMV感染的样品(HCMV alone)的DNA拷贝数设置为1，结果如图4所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.银杏叶多糖在制备治疗或预防HCMV药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于银杏叶多糖通过对HCMV立即早期蛋白IE1/2，早期蛋白p52以及立即早期基因UL123、早期基因UL44和晚期基因UL32的DNA拷贝数的抑制来抑制HCMV。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述银杏叶多糖的制备方法包括如下步骤：

采摘新鲜银杏叶，剪除枝茎，反复冲洗至洁净后漏网晾干；

晾干的银杏叶放置到托盘中自然干燥，随后将银杏叶放入烘干箱中于70℃恒温干燥；

将完全烘干的银杏叶粉碎后过80目筛得粉末；

称量银杏叶粉末，将银杏叶粉末加入到三颈圆底烧瓶中，加入石油醚；组装好冷凝回流装置，将三颈圆底烧瓶放置到水浴锅中，水浴锅温度为70℃，恒温回流脱脂1次，此过程耗时1 h；

脱色后银杏叶粉末加入蒸馏水，100℃恒温煮沸提取2 h；

将料液使用尼龙布过滤出滤渣重新准备再提取一次，提取过程要求与第一次相同，重复提取1 h后再次使用尼龙布过滤，合并两次滤液；

合并的滤液随后使用循环水真空泵过滤，滤液使用旋转蒸发仪浓缩，装入到截留分子量为500 Da的透析袋中透析，使用旋转蒸发仪浓缩后以1：4的体积比例倒入酒精开始醇沉，静置过夜，抽滤后烘干称重。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤4）中银杏叶粉末与石油醚的重量体积比为1:5。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于步骤5）中银杏叶粉末与蒸馏水的重量体积比为1:15。