CN101560265A - 油茶蒲多糖的制备方法及提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油茶蒲多糖的制备方法，包括以下步骤：1)将油茶蒲粉末用水提取至少1次，提取液经离心或过滤处理，将所得的上清液进行真空浓缩，得浓缩液；2)在浓缩液中加入醇沉淀处理12～48小时，然后离心，所得沉淀物依次用无水乙醇、无水乙醚以及丙酮清洗后，真空干燥，即得粉末状的油茶蒲多糖。本发明还同时公开了上述油茶蒲多糖的提纯方法。采用本发明方法所得的油茶蒲多糖具有抗氧化功能和抗肿瘤功能。

Description

油茶蒲多糖的制备方法及提纯方法

技术领域

本发明涉及一种油茶蒲提取物及其用途；更具体的说，涉及一种油茶蒲多糖及其用途。

背景技术

油茶(Camellia oleifera Abel)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)木本植物，是我国特有的油料树种，主要分布在我国的江西、湖南、浙江、广西、广东、福建、贵州等地。油茶按花的颜色不同可分为白花油茶、红花油茶和黄花油茶，种植最广的为白花油茶，其中以普通油茶分布最广。山茶油含有丰富的不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，被誉为东方的橄榄油。目前中国油茶种植面积正逐年增加，油茶籽的产量也在逐步增长。

油茶蒲又称茶包，为油茶果的外壳，约占油茶果总重量的2/3，是油茶生产的废弃物，每年产量约有170多万吨。在油茶产区，油茶蒲或作为燃料或被丢弃，利用率极低[中国油脂，1996，21(4)：39-42]。有关油茶蒲的研究，有文献报道利用油茶蒲生产碳酸钾和焦磷酸钾，对它的深入研究利用未见报道。可见对油茶蒲的开发和利用对振兴油茶产业、增加油茶的附加值、实现油茶副产物的综合利用，具有深远的意义。迄今为止，对油茶蒲多糖的提取及其研究未见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种油茶蒲多糖的制备方法及提纯方法，所得的油茶蒲多糖(即油茶蒲提取物)具有抗氧化功能和抗肿瘤功能。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种油茶蒲多糖的制备方法，包括以下步骤：

1)、将油茶蒲粉末用水提取至少1次，提取液经离心或过滤处理，将所得的上清液进行真空浓缩，得浓缩液；

2)、在上述浓缩液中加入醇于0～10℃沉淀处理12～48小时，然后离心，所得沉淀物依次用无水乙醇、无水乙醚以及丙酮清洗后，真空干燥，即得粉末状的油茶蒲多糖。

作为本发明的油茶蒲多糖的制备方法的改进：步骤1)为：油茶蒲粉末用水提取1～4次；将提取液经离心或过滤处理后，合并所得的上清液；将此上清液真空浓缩至原体积的1/5～1/7。

作为本发明的油茶蒲多糖的制备方法的进一步改进：步骤2)为：在浓缩液中加入醇，使醇的终浓度为30％～90％。醇选用乙醇或甲醇。进一步的优选方案如下：浓缩液中加入醇于0～10℃沉淀12～48小时后，4000～6000r/min离心；真空干燥的温度为：40～70℃，或者选用冷冻真空干燥。

作为本发明的油茶蒲多糖的制备方法的进一步改进：步骤1)中，提取料液比1∶3～1∶30g/mL，提取时间为0.1～5小时；提取方式为浸提法、热回流提取法、逆流提取法、超声波提取法、酶辅助提取法、或微波辐射提取法。提取温度一般控制在0～100℃(微波辐射提取法除外)。

更进一步的优选方案如下：油茶蒲粉末是指油茶蒲粉碎后能过40～60目筛的粉末，提取液3000～5000r/min进行离心；离心所得上清液于50～70℃真空浓缩。

作为本发明的油茶蒲多糖的制备方法的进一步改进：浸提法为：提取温度20～100℃，提取时间0.1～5小时；微波辐射提取法为：微波辐射功率为100～6000W，辐射提取时间为20秒～1小时；超声波提取法为：提取温度20～100℃，超声波功率50～5000W，超声波提取时间为12～180分钟；酶辅助提取法选用木瓜蛋白酶或纤维素酶。

更进一步的优选方案如下：浸提法时，优选的温度80～100℃；时间为2～3小时；微波辐射提取法为：优选的辐射提取时间为2min～0.5h。

本发明还同时提供了一种油茶蒲多糖的提纯方法，依次进行以下步骤：

1)、将油茶蒲多糖进行去蛋白、去色素和去小分子物质的处理，得初步纯化的油茶蒲多糖；

2)、将初步纯化的油茶蒲多糖进行进一步分离纯化，得油茶蒲多糖。

作为本发明的油茶蒲多糖的提纯方法的改进：步骤1)中去蛋白的方法为Savag法(Savag试剂：正丁醇和氯仿的体积比例为1∶2～1∶6)、三氯乙酸法或大孔树脂法，去色素的方法为大孔树脂法或柱层析法，去小分子物质的方法为透析袋分离法或膜分离法。

作为本发明的油茶蒲多糖的提纯方法的进一步改进：步骤2)中的分离纯化法为柱层析或膜过滤或分级纯化。

作为本发明的油茶蒲多糖的提纯方法的改进：步骤1)中：去蛋白时选用的大孔树脂法中的大孔树脂为D-201或DA-201；去色素时选用的大孔树脂法中的大孔树脂为D-101或DA-201，柱层析法中的填料为DEAE-52或LH-20；透析袋分离法中的透析袋的孔径为5000或7000Da。

作为本发明的油茶蒲多糖的提纯方法的改进：步骤2)中：所述柱层析的填料为葡聚糖G-50、G-100或G-200，膜过滤采用卷式超滤膜系统，操作压力为0.4～1.2Mpa，操作温度20～60℃；截留分子量的膜为7,000Da、1,000,0Da、1,000,00Da、3,000,00Da、5,000,00Da、或1,000,000Da。

采用本发明方法所得的油茶蒲多糖具有如下特性：

a.理化性质：该多糖为棕色粉末，气微，易溶于水，不溶于氯仿、乙醚有机溶剂，与苯酚-硫酸反应呈橙黄色，与斐林试剂呈阴性反应，与碘-碘化钾呈阴性反应。

b.多糖组成：多糖含量(苯酚-硫酸法测定)在30％～50％(以葡萄糖计)；分子量分布范围为7,000～200,000,0Da；多糖由以下6种单糖组成：葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖。

该油茶蒲多糖可用于清除自由基，具体为：用于化妆品或保健品，每mL或每克化妆品中含有10～20000μg的油茶蒲多糖，每mL或每克保健品中含有10～500mg的油茶蒲多糖。优选：每ml或每克化妆品中含有50～10000μg的油茶蒲多糖；每mL或每克保健品中含有50～300mg的油茶蒲多糖。

该油茶蒲多糖还可用于制备治疗抗肿瘤功能药物，例如治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌或胃癌。

本发明将油茶蒲粉末进行提取后得到的油茶蒲多糖首次进行体外细胞实验，结果表明多糖浓度在1-1000μg/mL范围内具有较好的抑制癌细胞增值作用；适用于抑制肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、胃癌细胞等癌细胞珠。将本发明的油茶蒲多糖进行体内实验表明，口服给予油茶蒲多糖10-500mg/kg·d，对S₁₈₀实体瘤小鼠的肿瘤具有明显的抑制生长作用，并具有剂量依赖关系，这就表明油茶蒲多糖具有较好的抗肿瘤作用，适用于肺癌、肝癌等化疗和放疗等辅助治疗以及癌症的预防作用，能适用于抗肿瘤药物和功能食品的应用开发。一般，病人按照10-500mg/kg·d的剂量进行口服或注射。

本发明的油茶蒲多糖在1-20000μg/mL范围内，具有较好的清除自由基的活性，并具有剂量依赖关系，适宜用于保健品和化妆品中。

本发明的主要优点在于：

1、建立了有效的油茶蒲多糖的提取工艺，确定了油茶蒲提取物(油茶蒲多糖)的抗氧化、抗辐射以及抗肿瘤作用效果；

2、可保证达到药品有效、安全、稳定的三个基本要求；

3、充分利用了以前被丢弃的油茶蒲，减少了资源浪费，有利于环境保护；

4、提供了山茶资源的利用度，提高了经济效益，有利于农民的增收。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是CPPS的液相图谱；

图2是CPPS-1的液相图谱；

图3是CPPS-2的液相图谱；

图4是标准多糖分子量标准曲线图；

图5是混合单糖气相色谱图；

图6是多糖样品1气相色谱图；

图7是多糖样品2气相色谱图；

图5、6、7中：

1-鼠李糖(Rha)    2-岩藻(Fuc)      3-阿拉伯糖(Ara)    4-木糖(Xyl)

5-甘露糖(Man)    6-葡萄糖(Glu)    7-半乳糖(Gal)；

图8是油茶蒲多糖对DPPH自由基的清除作用图；

图9是油茶蒲多糖对ABTS自由基的清除作用图。

具体实施方式

下面通过实例对本发明作进一步的阐述，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、一种油茶蒲多糖的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、准确称取过50目筛的油茶蒲粉末20g，按照1g/20mL的料液比，将上述粉末放入400mL的蒸馏水中，温度80℃条件下提取2小时后；按照上述条件共提取2次，提取液冷却后经4000r/min进行离心；合并上述2次提取、离心所得上清液，并于60℃真空浓缩到其原体积的1/6，得浓缩液；

2)、在上述浓缩液中加入乙醇溶液，控制乙醇的最终体积浓度为80％，即乙醇/(浓缩液+乙醇溶液)＝80％；4℃冰箱中过夜沉淀处理(即沉淀时间为20小时)，然后5000r/min离心，所得沉淀依次用无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，60℃真空干燥，得粉末状的油茶蒲多糖1.12g。

实施例2、一种油茶蒲多糖的制备方法，将实施例1中的提取方式改成：温度80℃条件下的超声循环萃取器中，1000w辅助提取0.5小时；共提取2次，其余均同实施例1。

得粉末状的油茶蒲多糖1.48g。

实施例3、一种油茶蒲多糖的制备方法，将实施例1中的提取方式改成：微波功率2000w条件下，提取30s；共提取2次，其余均同实施例1。

得粉末状的油茶蒲多糖1.63g。

从实施例1～实施例3的结果，我们可得知：采用微波和超声有助于多糖提取率的提高。

实施例4、一种油茶蒲多糖的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、准确称取过50目筛的油茶蒲粉末20g，按照1g/5mL的料液比，将上述粉末放入100ml的蒸馏水中，温度20℃条件下提取5小时后；按照上述条件共提取4次，提取液冷却后经4000r/min进行离心；合并上述4次提取、离心所得上清液，并于60℃真空浓缩到其原体积的1/6，得浓缩液；

2)、在上述浓缩液中加入甲醇溶液，控制甲醇的最终体积浓度为80％，即甲醇/(浓缩液+甲醇溶液)＝40％；4℃冰箱中过夜沉淀处理(即沉淀时间为20小时)，然后5000r/min离心，所得沉淀依次用无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，60℃真空干燥，得粉末状的油茶蒲多糖0.53g。

实施例5、一种油茶蒲多糖的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、准确称取过50目筛的油茶蒲粉末20g，按照1g/28ml的料液比，将上述粉末放入560mL的蒸馏水中，温度50℃条件下提取3小时后；按照上述条件共提取4次，提取液冷却后经4000r/min进行离心；合并上述4次提取、离心所得上清液，并于60℃真空浓缩到其原体积的1/6，得浓缩液；

2)、在上述浓缩液中加入乙醇溶液，控制乙醇的最终体积浓度为60％，即乙醇/(浓缩液+乙醇溶液)＝60％；7℃冰箱中沉淀处理30小时，然后5000r/min离心，所得沉淀依次用无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤，60℃真空干燥，得粉末状的油茶蒲多糖0.84g。

实验1、测定油茶蒲多糖中多糖含量(本发明的以下实验中多糖含量也采用此方法)：

标准曲线的制作：准确称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖40mg，用双蒸水溶解，定容到500mL，分别吸取0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.50、1.75mL，各以双蒸水补至2.0mL。然后加入5％苯酚1.0mL混匀后迅速加入浓硫酸5.0mL，静置10min，混匀后于室温放置20min，分光光度计上测定490nm处吸光值，以双蒸水按同样操作作为空白对照。以葡萄糖糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线回归方程为：A＝0.0135C+0.0022，r＝0.9998，其中：A为吸光值，r为相关系数，C为葡萄糖浓度(μg/mL)。

多糖含量测定：用蒸馏水将上述不同提取方法(实施例1～实施例5)提取的油茶蒲多糖配成1.0mg/mL，取0.2mL按以上操作测定490nm的吸光值，根据标准曲线计算多糖含量。

油茶蒲多糖含量(％)＝油茶蒲多糖中所含多糖的质量/油茶蒲多糖质量×100％。

结果表明：

实施例1中油茶蒲多糖中多糖含量为37.2％；

实施例2中油茶蒲多糖中多糖含量为36.4％；

实施例3中油茶蒲多糖品中多糖含量为36.8％；

实施例4中油茶蒲多糖品中多糖含量为48.13％；

实施例5中油茶蒲多糖品中多糖含量为48.72％。

对上述实施例1所得的油茶蒲多糖进行不同的纯化处理，分别相应的得到以下实施例。

实施例6、将实施例1所得的油茶蒲多糖进行如下纯化处理：

将DA-201大孔树脂预处理后装柱(3.0cm×80cm)，用蒸馏水平衡后，将实施例1所得的油茶蒲多糖用蒸馏水配成一定的浓度溶液(10mg/mL，50mL)上柱吸附，12小时后，分别用蒸馏水、20％乙醇溶液(体积浓度)、40％乙醇溶液、70％乙醇溶液以及无水乙醇依次洗脱2个柱体积的洗脱液，收集不同的组分，冷冻干燥后得到不同组分的粉末，分别测定不同组分的多糖含量、蛋白质含量以及多酚色素含量。

在本发明中，蛋白质含量测定和多酚测定可分别采用以下方法：

1)、蛋白质含量测定：考马斯亮蓝法

标准曲线的制作：精确称取牛血清白蛋白10.00mg，用少量蒸馏水溶解定容至100mL，即为0.1mg/mL蛋白质标准液，4℃-5℃冰箱中保存。分别精密吸取标准牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL具塞试管中，各管加水至1mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL，混匀，放置10min，于595nm处测定其吸光度，制作标准曲线。标准曲线回归方程为：A＝0.0055C-0.0223，r＝0.9951，其中：A为吸光值，r为相关系数，C为牛血清白蛋白的浓度(μg/mL)。

样品测定：取浓度为1.0mg/ml的不同样品溶液0.1mL、0.5mL、1mL，于具塞显色管中，用蒸馏水补至1.0mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5mL，混匀，放置10min，于595nm处测定其吸光度。

2)、多酚测定：福林酚比色法

标准溶液的配制：对照品标准溶液配制精确称取没食子酸标准品25mg，用水溶解并定容到250mL，得0.1mg/mL的对照品标准溶液。精密吸取标准样品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL于10mL容量瓶中，再加入1mL FC显色剂，摇匀后再加入2mL质量分数15％碳酸钠溶液，定容至10mL，室温下反应2h后测定A₇₆₀处吸光度，绘制标准曲线，A＝0.0129C+0.0253，r＝0.99813，其中：A为吸光值，r为相关系数，C为没食子酸含量(μg)。

样品测定：取稀释到一定浓度的样品溶液0.3ml，于10mL容量瓶中，再加入1mL FC显色剂，摇匀后再加入2mL质量分数15％碳酸钠溶液，定容至10mL，室温下反应2小时后测定A₇₆₀处吸光值。

实验2、

将实施例1所得的油茶蒲多糖、上述实施例6中的蒸馏水洗脱组分、以及20％乙醇洗脱组分用蒸馏水配成1.0mg/mL，取适量分别测定蛋白质含量，多酚含量以及多糖含量，结果如下表1：

表1DA-201大孔树脂纯化多糖样品

由以上表1结果看出，经DA-201大孔树脂纯化多糖样品后，与多糖相比，水洗组分多糖含量提高了24.5％，多酚含量下降了63.2％，蛋白质含量下降了23.7％；20％乙醇洗脱组分多糖含量提高了5.5％，多酚含量下降了26.0％，蛋白质含量下降了60.8％。

实施例7、将实施例1所得的油茶蒲多糖进行脱蛋白处理：

将油茶蒲多糖用蒸馏水溶解(配成5mg/mL)，得多糖溶液；然后分成8份，每份30mL，第1份进行1次脱蛋白处理，第2份进行两次脱蛋白处理，依此类推，第8份进行8次脱蛋白处理。每次加入多糖溶液体积的1/3的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，振摇30min后离心5min(5000r/min)，取上清液，摇匀后测多糖和蛋白质的含量。将上清液再加入相当于其体积1/3的氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，重复上述过程直至设定的脱除次数。

蛋白脱除率＝(脱蛋白前蛋白质百分含量-脱蛋白后蛋白质百分含量)/脱蛋白前蛋白质百分含量

多糖损失率＝(脱蛋白前多糖百分含量-脱蛋白后多糖百分含量)/脱蛋白前多糖百分含量

表2Savag法去蛋白效果

由上表2可以看出，经Savag法7次去蛋白后，多蛋白质去除率仅为16.85％，去除效果不佳，多糖损失量达到35.9％。

实施例8、将实施例6中的经DA-201大孔树脂蒸馏水洗脱组分的多糖样品进行膜分离纯化，依次进行以下步骤：

将样品配制成5mg/mL，采用卷式超滤膜系统进行分离，操作压力为0.4～1.2Mpa，操作温度30℃；选取截留分子量的膜为：1,000,0Da、1,000,00Da、5,000,00Da、或1,000,000Da。收集不同组分，冷冻真空干燥计算得率。

表3不同孔径的膜分离多糖样品

	＜1,000,0Da	1,000,0～1,000,00Da	1,000,00～5,000,00Da	5,000,00～1,000,000Da	＞1,000,000Da
						得率/％	10.2	17.4	12.3	32.4	23.5

由表3可以看出，多糖分子量分布较广：其中，分子量分布在5,000,00～1,000,000Da占总组分的32.4％，其次为分子量＞1,000,000Da占总组分的23.5％。

实施例9、将实施例6中的经DA-201大孔树脂蒸馏水洗脱组分的多糖样品进行柱层析DEAE-cellulose纯化，依次进行以下步骤：

将处理好的DEAE-cellulose装柱(2.6cm×70cm)，用蒸馏水平衡。将多糖样品配制成一定浓度(10mg/mL，2mL)溶液上柱，用0、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，5mL/管，1mL/min，隔管用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光值。绘制洗脱曲线，合并同一峰，合并液经7000Da透析袋透析72小时(水洗脱部分除外)，冷冻干燥，计算各不同组分的得率。

表4不同浓度的NaCl溶液洗脱所得多糖组分

经水洗部分主要为中性糖，经NaCl溶液洗脱部分的主要为酸性多糖。由上表4可以看出，经不同浓度的NaCl溶液洗脱后，其中以0.5mol/LNaCl溶液洗脱部分得率最高，达到20.5％；其次为0.3mol/LNaCl溶液洗脱组分达到19.3％，将该组分命名为：CPPS-1。

实施例10、将实施例9中的经DEAE-cellulose经0.3mol/LNaCl溶液洗脱组分多糖样品进行柱层析Sephadex G-100柱纯化纯化，依次进行以下步骤：

将处理好的Sephadex G-100装柱(1.6cm×110cm)，平衡后将一定浓度(3mg/mL，2mL)的0.3mol/LNaCl溶液洗脱组分多糖样品上柱，用0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分部收集洗脱液，5mL/管，1mL/min，隔管用苯酚-硫酸法在490nm处测吸光值绘制洗脱曲线，结果得到两个洗脱峰。将两个洗脱峰收集合并干燥后，再分别依次按实例10上述方法，上柱洗脱绘制洗脱曲线，分别得到单一峰，干燥后得到两个单一多糖组分，将含量多的组分进行后续实验，命名为：CPPS-2。

实验3、对油茶蒲多糖进行理化性质和活性研究：

对油茶蒲多糖和经大孔树脂以及柱层析进行纯化后的样品进行液相色谱的测定，探索多糖的分子量的分布。

实验材料：油茶蒲多糖(CPPS)：由实施例1方法所得；纯化油茶蒲多糖1(CPPS-1)：由实施例9中的经DEAE-cellulose经0.3mol/LNaCl溶液洗脱组分多糖；纯化油茶蒲多糖(CPPS-2)：由实施例10方法所得的组分；葡聚糖标准品Dextran10500(T-10)、Dextran43200(T-40)、Dextran76900(T-70)、Dextran188000(T-110)：购买自Sigma公司。

实验仪器：Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；

实验方法：色谱柱：日本TOSOH公司TSK-gel 3000 SWXL(7.8×300mm)；流动相为双蒸馏水；流速为0.7mL.min^-1；示差折光检测；柱温30℃；检测器温度：35℃，进样量为10μL。

表5、不同标品的保留时间和对应的分子量

由图1～图4和表5可以看出，本发明的油茶蒲多糖的RT分布范围为：6.35～16min，和标准品对应分析计算后，该多糖的分子量分布范围是：7,000-2,000,000Da。

实验4、利用气相色谱测定油茶蒲多糖的单糖组成：

试验试剂：鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、岩藻糖、盐酸羟胺、三氟乙酸、吡啶、醋酸酐等均为国产分析纯。

试验仪器：6890N型气相色谱仪(Agilent，FID检测器；DB-1701毛细管柱)；

微量分析天平：Sartrius，西德；

试验方法：称取20mg样品，加入2M三氟乙酸6mL，封管，在110℃下反应6h，然后在70℃下用氮气吹干，待用。准确称量单糖标准品鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、岩藻糖各10mg及上述浓缩至干的多糖样品，加入10mg盐酸羟胺和0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min并振荡。取出后冷至室温，加入0.5mL醋酸酐，在90℃下继续反应30min进行乙酸化，反应产物经滤膜过滤后直接进行气相色谱分析。将单糖衍生物各取10μL混合即为混合单糖。

色谱柱：DB-1701毛细管柱(30.0m×0.32mm×0.25μm)

恒流模式：流量为1.5mL/min。程序升温：以5℃/min从180℃到220℃，保持5min。进样口温度250℃，FID检测器的温度280℃，载气为氮气，进样量1μL。

混合单糖、多糖样品1(CPPS)、多糖样品2(CPPS-1)的气相色谱图分别如图5～图7所示。

表6混合单糖样品保留时间及所占比例

实验5、

将油茶蒲多糖(由实施例1所得)进行以下实验：

将油茶蒲多糖用双蒸水配制成质量浓度1.0mg/mL的溶液，并稀释成不同的浓度梯度(25.0、20.0、15.0、10.0和5.0μg/mL)，各取1.0mL上述浓度的样品溶液于试管中，再加入3.0mL质量浓度为0.04g/L的DPPH(2，2-二苯基-1-苦基苯肼)溶液，混合均匀，避光反应30min后以在517nm处测吸光值为A_i，根据不同浓度样品溶液对DPPH·的清除率作图。以抗坏血酸(Vc)作为对照，临用前以双蒸水配制。做三个平行样，每个平行测三次。

DPPH·的清除率由下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

其中：A₀为未加样品时DPPH溶液的吸光值；A_i为加入样品后溶液的吸光值；A_j为样品溶液的吸光值。

由图8可以看出，油茶蒲多糖的浓度在5～25μg/mL内，对DPPH自由基的清除率与浓度呈正相关。当多糖浓度为12.29μg/mL时DPPH自由基的清除率达到50％，当多糖浓度为25μg/mL时清除率高达87.72％；阳性对照抗坏血酸(Vc)的浓度为4.44μg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到50％。

实验6、将油茶蒲多糖(由实施例1所得)进行以下实验：

用去离子水将ABTS[2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]溶解，使ABTS浓度为7mmol/L，加入K₂S₂O₈，使K₂S₂O₈的浓度为2.45mmol/L，之后将该溶液在室温下置于暗处过夜(12～16h)。将生成的ABTS⁺·自由基溶液用磷酸缓冲液(PBS)稀释，使其在30℃、734nm波长下的吸光度为0.70±0.02，即得到ABTS⁺·自由基工作液。将油茶蒲多糖用PBS配制成质量浓度1.0mg/mL的溶液，并稀释成不同的浓度梯度(20.0、16.0、12.0、8.0和4.0μg/mL)，在试管中加入1.0mL的上述油茶蒲多糖溶液，再加入3.0ml的ABTS⁺·自由基工作液，混合，30℃静置6min，在734nm波长下读取吸光值。以抗坏血酸(Vc)作为对照，临用前以PBS配制。做三个平行样，每个平行测三次。

ABTS自由基清除率由下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

其中：A₀空白对照；A_i为加入样品后溶液的吸光值；A_j为样品溶液的吸光值。由图9可以看出，该法测定的结果与DPPH法结果相似。当多糖浓度为11.60μg/mL时对ABTS自由基的清除率达到50％，当多糖浓度为20μg/mL时清除率高达75.95％；阳性对照抗坏血酸(Vc)的浓度为6.65μg/mL时，对ABTS自由基的清除率达到50％。

实验7、将油茶蒲多糖(由实施例1所得)进行以下实验：

将油茶蒲多糖配入化妆品的防晒基质中，按照表7的配方和下面方法配制化妆品。

表7防晒化妆品配料表

制备方法：将A液和B液分别加热至72～82℃，连续搅拌直至各种成分全部溶解，边搅拌边将A液加入B液，继续搅拌直至所形成的乳剂冷却至室温(15-30℃)，最后得到100g防晒标准品。

将以上获得的化妆品通过测定其防晒系数(sun protect factor，SPF)评价油茶蒲多糖抗紫外辐射的性能。

利用胶带法测定样品的防晒系数。

①将3M胶带剪成1.1cm×4.5cm大小，粘贴在石英比色皿透光侧表面上。

②接通电源，预热分光光度计，选定多波长测量，测量参数分两次分别设定为T％和Abs设定紫外线波长分别为290nm-400nm，波长间隔为5nm。

③将贴有胶带的石英比色皿置于样品光路和参比光路中，调整仪器零点。

④称量9.9mg待测样品，将样品均匀涂在石英比色皿3M胶带上。

⑤将制备好的样品比色皿置与37℃的干燥箱里，干燥15分钟。

⑥将待测样品比色皿置与样品光路中，取另一贴有胶带的石英池置于参比光路中，分别测定UVB区设定波长紫外线吸光度值和透射率，取各测定数值的算术均值。

⑦依次测定5个平行样品，计算均值，在算均值的算术均数及为该样品的吸光度值和透射率。

⑧利用下列公式计算样品的SPF值。

$\mathrm{SPF}=\frac{{\mathrm{\Σ}}_{290}^{400}E\left(\mathrm{\λ}\right)I\left(\mathrm{\λ}\right)}{{\mathrm{\Σ}}_{290}^{400}E\left(\mathrm{\λ}\right)I\left(\mathrm{\λ}\right)T\left(\mathrm{\λ}\right)}$

其中：E(λ)：北纬40度，太阳顶角20度，夏天中午阳光不同波长的辐射强度。

I(λ)：为不同波长光的红斑效应系数。

T(λ)：为不同波长样品的透射率。

结果空白组的SPF值为8.72±2.19，样品组的SPF值为17.13±3.38(SPF≥15为超级防晒)，所以茶蒲多糖具有较强的抗紫外辐射性能。

实验8、将油茶蒲多糖(由实施例1所得)进行以下实验：

体外抑制癌细胞增值实验：MTT法。

将购买的癌细胞株肺癌细胞H460、肝癌细胞HepG2以及宫颈癌细胞Hela细胞复苏，5％CO₂、37℃培养、传代，倒置显微镜计数，调整细胞浓度。取对数期生长的癌细胞(1×10⁵个/mL)接种于96孔板，(边缘孔用无菌PBS或培养基填充)每孔接种细胞100μL，5％CO₂、37℃孵育24小时。将96孔板中的培养基换成新鲜的培养基(边缘孔不用换)，加入不同浓度的多糖样品溶液100μl(最终浓度为0、31.25、62.5、125、250、500μg/mL)，5％CO₂、37℃孵育48小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入200uL二甲基亚砜，使结晶物充分溶解后，在酶标仪OD 570nm处测量各孔的吸光值，计算抑制率。每个浓度做5个复孔，三次平行实验。同时做空白和阳性对照组。

抑制率IR(％)＝(1-OD_样品/OD_空白)×100％

表8、多糖对不同癌细胞的生长抑制作用

由表8可以看出，油茶蒲多糖浓度在31.25～500μg/mL，随着浓度的增加，对3种癌细胞的生长抑制作用逐渐增强，当多糖浓度为500μg/mL时，对H460细胞的生长抑制率达到51.38％，对Hela细胞的生长抑制率达到63.42％，对HepG2细胞的生长抑制率达到74.54％。

实验9、将油茶蒲多糖(由实施例1所得)进行以下实验：

选取ICR小鼠(雄性，体重20g左右，来源于中科院上海动物中心)50只，无菌取传代7d的腹水型S180瘤株小鼠，无菌条件下颈椎脱臼处死后，常规消毒取腹水，用无菌生理盐水按1∶3配成细胞悬液，混匀，每只小鼠右前肢腋下接种该细胞悬液0.2mL，接种肿瘤24h后，称重并将小鼠随机分为5组，每组10只。分别设为空白对照组、阳性对照组及油茶蒲多糖样品低、中、高3个剂量实验组(50mg/kg.d、150mg/kg.d和450mg/kg.d)。空白对照组每天按0.2mL/10g灌服生理盐水，连续灌服10d；阳性对照组按剂量50mg/kg.d在第1天和第2天连续腹腔注射环磷酰胺(CTX)，注射量按0.2mL/10g计，共2次；多糖样品低、中、高3个剂量实验组每天按0.2mL/10g灌服不同浓度的药液，每天1次，连续10d。实验过程中每天记录小鼠体重变化，调整用药量。末次给药24h后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖摘取瘤块，计算抑瘤率(％)，按以下公式计算：具体如表9所示：

抑瘤率(％)＝(模型对照组瘤重(g)-样品组瘤重(g))/模型对照组瘤重(g)×100％

表9、油茶蒲提取物体内抗肿瘤作用

结果表明，油茶蒲多糖能有效的抑制小鼠体内肿瘤的的生长作用，油茶蒲多糖的高剂量组对肿瘤的抑制率达到了38.38％，并具有有剂量依赖关系。

实验10、油茶蒲多糖的急性毒理实验：由浙江省医学科学院委托检验。

实验方法：参照《食品安全毒性评价程序和方法》《GB 15193.1-2003》

判定依据：参照《食品安全毒性评价程序和方法》《GB 15193.1-2003》

试验结果表明：油茶提取物(即油茶蒲多糖)经小鼠口急性毒性：雌、雄小鼠LD50均为14.70g/kg体重，按急性毒性分级标准判定，油茶蒲多糖实属无毒。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1、一种油茶蒲多糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将油茶蒲粉末用水提取至少1次，提取液经离心或过滤处理，将所得的上清液进行真空浓缩，得浓缩液；

2)、在上述浓缩液中加入醇于0～20℃沉淀处理12～48小时，然后离心，所得沉淀物依次用无水乙醇、无水乙醚以及丙酮清洗后，真空干燥，即得粉末状的油茶蒲多糖。

2、根据权利要求1所述的油茶蒲多糖的制备方法，其特征是所述步骤1)为：油茶蒲粉末用水提取1～4次，将提取液经离心或过滤处理后，合并所得的上清液；将所述上清液真空浓缩至原体积的1/5～1/7。

3、根据权利要求2所述的油茶蒲多糖的制备方法，其特征是所述步骤2)为：在浓缩液中加入醇，使醇的终浓度为30％～90％。

4、根据权利要求3所述的油茶蒲多糖的制备方法，其特征是所述步骤1)中的提取料液比1∶3～1∶30g/mL，提取时间为0.1～5小时；提取方式为浸提法、热回流提取法、逆流提取法、超声波提取法、酶辅助提取法、或微波辐射提取法。

5、根据权利要求4所述的油茶蒲多糖的制备方法，其特征是浸提法为：提取温度20～100℃，提取时间0.1～5小时；微波辐射提取法为：微波辐射功率为100～6000W，辐射提取时间为20秒～1小时；超声波提取法为：提取温度20～100℃，超声波功率50～5000W，超声波提取时间为12～180分钟；酶辅助提取法选用木瓜蛋白酶或纤维素酶。

6、一种油茶蒲多糖的提纯方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、将油茶蒲多糖进行去蛋白、去色素和去小分子物质的处理，得初步纯化的油茶蒲多糖；

2)、将初步纯化的油茶蒲多糖进行进一步分离纯化，得纯化后的油茶蒲多糖。

7、根据权利要求6所述油茶蒲多糖的提纯方法，其特征是：所述步骤1)中去蛋白的方法为Savag法、三氯乙酸法或大孔树脂法，去色素的方法为大孔树脂法或柱层析法，去小分子物质的方法为透析袋分离法或膜分离法。

8、根据权利要求7所述的油茶蒲多糖的提纯方法，其特征是：所述步骤2)中的分离纯化法为柱层析、膜过滤或分级纯化。

9、根据权利要求8所述的油茶蒲多糖的提纯方法，其特征是所述步骤1)中：去蛋白时选用的大孔树脂法中的大孔树脂为D-201或DA-201；去色素时选用的大孔树脂法中的大孔树脂为D-101或DA-201，柱层析法中的填料为DEAE-52或LH-20；透析袋分离法中的透析袋的孔径为5000或7000Da。

10、根据权利要求9所述的油茶蒲多糖的提纯方法，其特征是：所述步骤2)中：所述柱层析的填料为葡聚糖G-50、G-100或G-200，膜过滤采用卷式超滤膜系统，操作压力为0.4～1.2Mpa，操作温度20～60℃；截留分子量的膜为7,000Da、1,000,0Da、1,000,00Da、3,000,00Da、5,000,00Da、或1,000,000Da。

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