CN101204405A - 槐耳菌质提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种槐耳菌质提取物，该提取物为一种治疗肿瘤的药物，含有游离蛋白质、多糖和蛋白多糖。本发明还公开了这种提取物的制备方法和它的医药用途。本发明提供的槐耳菌质提取物活性组分明确，质量可控；活性成分纯度高，用于治疗各种类型的肿瘤疗效可靠，并且几乎无副作用。本发明提供的制备方法工艺简单，所得产品进一步富集了有效组分。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域。更具体地涉及槐耳菌质提取物及其制备方法和用途。
背景技术
槐耳(槐蛾)是我国民间重要药用真菌，其学名为Trametes robiniophilaMurr.，它仅生长于老龄中国槐Sophora japonica树干上。按Ainsworth等1973年分类系统，属担子菌亚门Basidiomycotina，多孔菌科Polyporaceae，栓菌属。由于天然槐耳的稀缺，现多用其人工培养物——槐耳菌质。
槐耳菌质组成复杂，包括槐耳菌丝体和培养基质。槐耳菌质的主要活性成分是多糖和多糖蛋白(PS-T)，其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。以往的提取工艺，如煎煮和高温浓缩，提取过程时间长、温度高，还要使用一些有机溶剂，这样不仅会使最终产品颜色加深，而且破坏多糖蛋白的结构，影响治疗效果。传统工艺获得的槐耳菌质水提浓缩物多糖含量低，约12％。活性组分纯度相对较低，因此用药剂量大，每天要服用约25克浓缩物。含有大量杂质，如小分子成分，尤其是无机盐，口感较差。
因此，本领域迫切需要提供一种活性组分(多糖和多糖结合蛋白)含量高的槐耳菌质提取物，以确保制备治疗肿瘤药物疗效的稳定，并可具有更明确的质量控制指标。
发明内容
本发明旨在提供一种槐耳菌质提取物。
本发明的另一个目的是提供上述提取物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供上述提取物的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种槐耳菌质提取物，它含有多糖和多糖结合蛋白，其中总多糖含量为45-55％，总多糖和结合蛋白含量为50-80％。
在另一优选例中，所述的总多糖含量为48-55％，总多糖和结合蛋白含量为60-80％。
在另一优选例中，蛋白质含量为15-40％，酸水解后氨基酸总量为10-20％。
在另一优选例中，所述的槐耳菌质提取物有三个主要分子量段组分，所述的分子量段组分的多糖重均分子量分别为60000±5000Da，10000±2000Da和4000±1000Da。
在另一优选例中，所述的分子量段组分的多糖重均分子量分别为60000±2000Da，10000±1000Da和4000±500Da。
在另一优选例中，它的多糖、蛋白质或多糖结合蛋白分子量分布为3000-2000000Da。
在另一优选例中，所述的槐耳菌质提取物三个主要分子量段组分的高效液相保留时间分别为19.5-20.5分钟、21-22分钟和22.5-24.5分钟；
所述的高效液相测定条件为：
固定相：TSKgel G4000PWXL(7.8mm×30cm)；
流动相：0.7％硫酸钠水溶液；
流速：0.6ml/min。
在另一优选例中，所述的槐耳菌质提取物中多糖的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为1-4∶1-2∶1-3∶3-6∶8-19∶3-13。
在另一优选例中，所述的单糖组成中还含有微量鼠李糖。
在另一优选例中，所述的槐耳菌质提取物由下述制备方法获得：
a.将槐耳菌质用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2-70％的无机盐溶液或2-70％的水醇溶液；
b.将密度为1-1.4的提取液超滤或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；
c.将截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌质提取物。
在另一优选例中，所述的提取物是由下述的制备方法获得的：a’.将槐耳菌质用水浸提，料液比1∶2-20，得到浸提液；b’.浸提液用1-30kDa的超滤膜超滤，所得截留液即为槐耳菌质水溶性提取物。
在本发明的第二方面，提供了一种组合物，它包括(i)治疗有效量的上述的槐耳菌质提取物；和(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、散剂、微囊、纳米粒、注射剂或糖浆剂。
在本发明的第三方面，提供了一种上述的槐耳菌质提取物的制备方法，它包括步骤：
a.将槐耳菌质用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2-70％的无机盐溶液或2-70％的水醇溶液；
b.将密度为1-1.4的提取液超滤或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；
c.将截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌质提取物。
在另一优选例中，所述的水性溶液包括水、0.2-2％的无机盐溶液或2-20％的水醇溶液。
在另一优选例中，步骤a中的提取温度为4-90℃。
在另一优选例中，步骤b中可将提取液浓缩到密度1-1.4。
在另一优选例中，步骤b中用50-95％乙醇溶液沉淀。
在另一优选例中，步骤b中在将一定密度的提取液过滤或离心后用1-30kDa超滤膜超滤。
在另一优选例中，步骤c中将截留液或沉淀物进行减压真空干燥或喷雾干燥。
在另一优选例中，所述的制备方法包括步骤：
a’.将槐耳菌质用水，料液比1∶2-20，得到提取液；
b’.用1-30kDa的超滤膜超滤，所得截留液即为上述的槐耳菌质提取物。
在另一优选例中，步骤a’中在4-90℃浸提1-5次，每次浸提1-10小时，然后合并浸提液。
在另一优选例中，离心速度为5000-15000g；用0.25μm-0.5μm的微滤膜过滤或离心。
在本发明的第四方面，提供了一种上述的槐耳菌质提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在另一优选例中，所述肿瘤是指临床常见的胃癌、食道癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤、白血病等。
据此，本发明提供了一种含活性组分(多糖和多糖结合蛋白)高的槐耳菌质提取物，它确保所制备的治疗肿瘤的药物疗效稳定，并可具有更明确的质量控制指标。
附图说明
图1显示多糖分子量标准曲线。
图2显示槐耳菌质提取物中组分的分子量分布情况。
具体实施方式
发明人经过广泛深入的研究，意外地发现在一定温度下用水或稀无机盐溶液或稀醇溶液反复提取槐耳菌质后，所得的提取液经过离心或过滤，超滤截留或乙醇沉淀后，便能获得含活性组分高的槐耳菌质提取物。所得到的槐耳菌质提取物的总多糖和结合蛋白含量可达50％以上，由该提取物获得的制剂可大大减少用药剂量。
如本文所用，术语“多糖”是指槐耳菌质提取物中游离的多糖，是本发明提供的提取物中的活性成分/活性部位。
如本文所用，术语“多糖结合蛋白”或“蛋白结合多糖”是指槐耳菌质提取物中多糖与蛋白的结合物，是本发明提供的提取物中的活性成分/活性部位。
如本文所用，术语“总多糖”是指槐耳菌质提取物中活性成分/活性部位中的游离的多糖和与其它大分子结合的多糖的总和。
如本文所用，术语“结合蛋白”是指槐耳菌质提取物中其它大分子与蛋白的结合物中的蛋白。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。
如本文所用，术语“基本上由……构成”指在组合物中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。例如，可以含有甜味剂以改善口味、抗氧化剂以防止氧化，以及其他本领域常用的添加剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如稀释剂、赋型剂和水等。填充剂如淀粉、甘露糖、糊精、乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油等；崩解剂如甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂和碳酸氢钠；表面活性剂如十六烷醇、十二烷基磺酸钠、土温-80等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁或钙、微粉硅胶和聚乙二醇。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如色素、香味剂和甜味剂等。
槐耳菌质提取物
本发明提供的槐耳菌质提取物中含有多糖、多糖结合蛋白、蛋白质等，其中的活性成分/活性部位是多糖和多糖结合蛋白。
所述的多糖和结合蛋白以提取物计含量达50-80wt％，由高效液相色谱(HPLC)测定的分子量分布情况显示，提取物中的多糖、蛋白质、蛋白多糖分子量大多分布于2500-4600Da、10000-20000Da和40000-80000Da处。提取物中的单糖组成包括岩藻糖(Fuc.)、阿拉伯糖(Ara.)、木糖(Xyl.)、甘露糖(Man.)、半乳糖(Gal.)、葡萄糖(Glu.)和微量鼠李糖，其中葡萄糖的摩尔百分比为40-60％，半乳糖的摩尔百分比为15-30％，甘露糖的摩尔百分比为10-20％，阿拉伯糖的摩尔百分比为5-10％，岩藻糖或木糖的摩尔百分比为2-6％；优选地，葡萄糖的摩尔百分比为45-55％，半乳糖的摩尔百分比为20-25％，甘露糖的摩尔百分比为12-18％，阿拉伯糖的摩尔百分比为6-8％，岩藻糖或木糖的摩尔百分比为3-5％。
所述的结合蛋白质以提取物计含量为15-40wt％。
槐耳菌质提取物制备方法
本发明提供的提取物有槐耳菌质由水性溶液提取后，经超滤截留或用50-95％的有机溶剂沉淀得到。具体地，是将槐耳菌质放入水或70％以下含水的有机溶剂或无机盐溶液中，在4-90℃浸提或回流提取。提取液合并后离心或过滤，取上清或滤过液，或将上清液或滤过液直接或浓缩到一定密度后，离心或用微滤膜过滤，然后用1-30kDa的超滤膜超滤或50-95％醇沉淀，截留液或沉淀物减压真空干燥或喷雾干燥，得到槐耳菌质提取物。
本发明获得的槐耳菌质提取物，总多糖和结合蛋白质含量由水提浓缩物的百分之十几提高到50％以上，使原来每日服用25克水提浓缩物的日剂量降低到5克以下，并且抑制肿瘤的活性还略有提高。
所述的水性溶液包括水、0.2-70％的无机盐溶液或2-70％的水醇溶液，优选水、0.2-2％的无机盐溶液或2-20％的水醇溶液。
所述的无机盐选自但不限于：钠盐、钾盐、盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐。其中优选钠盐、盐酸盐，更优选NaCl。
所述的水醇溶液选自但不限于：乙醇溶液、甲醇溶液，优选乙醇溶液。
槐耳菌质提取物用途
本发明的槐耳菌质提取物具有明显的抑制肿瘤生长的作用。对于药品而言，其治疗组分的纯度与疗效和用药量密切相关。本发明得到的提取物总多糖和结合蛋白含量大于50％，纯度的提高，确保了在治疗肿瘤疾病方面的稳定疗效，质量控制指标明确。
本发明槐耳菌质提取物应用在肿瘤治疗或辅助治疗方面，可与一种或多种药学可接受的载体(辅料)配制成药剂。
所述的肿瘤是指临床常见的胃癌、食道癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、鼻咽癌、恶性黑色素瘤、白血病等。
本发明提供的组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。制成制剂时，可将其制成片剂如肠溶片、胃溶片、咀嚼片、口含片、泡腾片、分散片、速崩片等；胶囊剂如肠溶胶囊、胃溶胶囊、硬胶囊和软胶囊等；颗粒剂；滴丸剂；散剂；微囊如肠溶微囊、胃溶微囊；纳米粒；注射剂如注射液、大输液、冻干粉等；糖浆剂等。
本发明槐耳菌质提取物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等而变化，其日剂量按提取物量计可以是1-1000mg/kg体重，优选5-400mg/kg体重。可以一次或多次施用。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的槐耳菌质提取物活性组分明确，质量可控；
2、本发明提供的制备槐耳菌质提取物的方法工艺简单，所得产品多糖和结合蛋白含量高；
3、本发明提供的槐耳菌质提取物由于活性成分纯度高，用于治疗各种类型的肿瘤疗效可靠，并且几乎无副作用。
4、本发明提供的槐耳菌质提取方法有利于规模化生产。
以下通过特定的具体实施例来说明本发明的实施方式，本领域技术人员可通过实施例所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明也可通过其它不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明选用槐耳Trametes robiniophila Murr.的人工培养物——槐耳菌质。
实施例1
制备槐耳菌质提取物①
取槐耳菌质适当粉碎，加入12倍水，在4-90℃浸提3次，8h/次。合并浸提液浓缩到一定密度后，离心，上清液用1-30kDa的超滤膜超滤，截留液减压真空干燥，得到槐耳菌质热水浸提超滤提取物，总多糖和结合蛋白含量78.4％。
组分分析结果：
1.槐耳菌质热水浸提超滤提取物总多糖含量为52.7％
2.槐耳菌质热水浸提超滤提取物结合蛋白质含量为25.7％
3.槐耳菌质水溶性提取物多糖分子量分布：
(1)色谱条件
色谱柱：TSKgel G4000PWXL(7.8mm×30cm)；柱温：35℃；RI内部加热器：40℃；
流动相：0.7％硫酸钠水溶液；流速：0.6ml/min。
(2)结果
a.校准曲线：取不同分子量右旋糖苷用去离子水配制成浓度约2mg/ml的溶液，200ul定量环分别手动进样。
结果见图1和表2。
表1分子量标定
| 分子量M | 峰顶时间Ve(1) | Ve平均 |
| 2500 | 23.707 | 23.707 |
| 4600 | 23.046 | 23.046 |
| 7100 | 22.565 | 22.565 |
| 10000 | 22.43 | 22.43 |
| 21400 | 21.407 | 21.407 |
| 41100 | 20.121 | 20.121 |
| 84400 | 18.935 | 18.935 |
| 133800 | 18.067 | 18.067 |
| 2000000 | 12.828 | 12.828 |
| A＝9.7817 | B＝0.2612 | 相关系数＝0.9914 |
b.槐耳菌质水溶性提取物多糖分子量测定。
结果见图2。
表2T＝20.428段多糖分子量测试报告
| 数均分子量Mn | 36006 |
| 重均分子量Mw | 60754 |
| Z均分子量Mz | 113562 |
| Z+1均分子量Mz+1 | 170584 |
| 粘均分子量Mη | 83062 |
| 分布宽度指数D | 1.69 |
表3T＝21.805段多糖分子量测试报告
| 数均分子量Mn | 10246 |
| 重均分子量Mw | 10991 |
| Z均分子量Mz | 11734 |
| Z+1均分子量Mz+1 | 12421 |
| 粘均分子量Mη | 11356 |
| 分布宽度指数D | 1.07 |
表4T＝23.401段多糖分子量测试报告
| 数均分子量Mn | 2299 |
| 重均分子量Mw | 3932 |
| Z均分子量Mz | 4547 |
| Z+1均分子量Mz+1 | 4842 |
| 粘均分子量Mη | 4228 |
| 分布宽度指数D | 1.71 |
结果表明，槐耳菌质水溶性提取物中主要含有3个分子量段组分，分子量分布从3932-60754Da。槐耳菌质提取物，多糖含量比清膏明显提高，组成成分主要为中等大小分子和大分子多糖、多糖蛋白和蛋白质。
4.槐耳水溶性提取物组成单糖及摩尔比见表5
表5槐耳水溶性提取物单糖组成及摩尔比
| 样品名称 | Ara. | XyL. | Fuc. | Man. | Glu. | Gal. |
| 槐耳菌质水溶性提取物 | 2.1 | 1.0 | 1.2 | 4.8 | 14.4 | 6.7 |
5.槐耳菌质水溶性提取物氨基酸含量见表6
表6槐耳水溶性提取物中17种常见氨基酸含量(％)测定
| 检测项目 | 槐耳菌质水溶性提取物 |
| 天冬氨酸 | 1.69 |
| 苏氨酸 | 0.87 |
| 丝氨酸 | 0.77 |
| 谷氨酸 | 2.11 |
| 甘氨酸 | 1.11 |
| 丙氨酸 | 0.71 |
| 胱氨酸 | 0.26 |
| 缬氨酸 | 0.67 |
| 蛋氨酸 | 0.15 |
| 异亮氨酸 | 0.71 |
| 亮氨酸 | 0.79 |
| 酪氨酸 | 0.48 |
| 苯丙氨酸 | 0.60 |
| 赖氨酸 | 0.64 |
| 组氨酸 | 0.32 |
| 精氨酸 | 0.79 |
| 脯氨酸 | 0.89 |
| 以上氨基酸总和 | 13.56 |
实施例2
制备槐耳菌质提取物②
取槐耳菌质1000克放入一定的容器中，加18升水，于80℃浸提4次，不时搅拌，每次提取8小时。过滤、合并，浓缩至密度1.15得到提取液。微孔滤膜过滤后用8kDa的超滤膜超滤，截留液减压真空干燥，得到槐耳菌质水溶性提取物37.5克，总多糖和结合蛋白含量79.5％。
实施例3
制备槐耳菌质提取物③
取槐耳菌质1000克放入一定的容器中，加18升生理盐水，于60℃浸提4次，不时搅拌，每次提取10小时。过滤、合并，浓缩至密度1.03得到提取液。微孔滤膜过滤后用8kDa的超滤膜超滤，截留液减压真空干燥，得到槐耳菌质生理盐水提取物40.2克，总多糖和结合蛋白含量74.3％。
实施例4
制备槐耳菌质提取物④
取槐耳菌质1000克放入一定的容器中，加18升10％乙醇，于80℃浸提4次，不时搅拌，每次提取8小时。过滤、合并，浓缩至密度1.10得到提取液。离心后用加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％，然后于4℃放置12小时后滤出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后减压干燥，得到槐耳菌质醇沉提取物52克，总多糖和结合蛋白含量69.6％。
实施例5
制备槐耳菌质提取物⑤
取槐耳菌质1000克放入一定的容器中，加18升水，于80℃浸提4次，不时搅拌，每次提取8小时。过滤、合并，浓缩至密度1.15得到提取液。离心后用加入乙醇，使醇沉浓度达到80％，然后于4℃放置12小时后滤出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后减压干燥，得到槐耳菌质醇沉提取物48克，总多糖和结合蛋白含量53.9％。
实施例6
槐耳菌质提取物抑瘤试验
抑制肿瘤活性
一、样品制备
1.实施例1制得的槐耳菌质提取物①；
2.槐耳清膏：槐耳菌质的热水提取浓缩至一定密度而成。
二、对小鼠肉瘤重的影响
1、对小鼠肉瘤S180瘤重的影响
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22克，所有小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的S180瘤细胞液0.2ml/鼠。
接种肿瘤后随机分为荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、槐耳清膏组、槐耳菌质水溶性提取物组和超滤滤过液组。
于接种肿瘤后次日开始，给药组分别腹腔注射给予槐耳清膏、槐耳菌质提取物和超滤滤过液，剂量均以清膏计，4.5g清膏/kg，荷瘤对照组腹腔注射给予同体积的生理盐水，阳性药组腹腔注射环磷酰胺30mg/kg，连续7天，其余小鼠均连续给药10天。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表9。
表7槐耳菌质提取物对小鼠肉瘤S180的抑制作用
| 组别 | 剂量(g/kg×d) | 瘤重(g，X±SD) | 抑瘤率(％) |
| 荷瘤对照组 | / | 1.323±0.226 | / |
| Cy组 | 0.03×7 | 0.588±0.203*** | 55.56 |
| 槐耳清膏 | 4.5×10 | 0.854±0.299*** | 35.45 |
| 槐耳菌质水浸超滤提取物 | 4.5×10 | 0.814±0.236*** | 38.47 |
| 超滤滤过液 | 4.5×10 | 1.124±0.187* | 15.07 |
注：与荷瘤对照组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
2、对小鼠肝癌H22瘤重的影响
昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22克，所有小鼠均于右前肢腋部皮下接种1∶4稀释的肝癌H22瘤细胞液0.2ml/鼠。
接种肿瘤后随机分为荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、槐耳清膏组、槐耳菌质水溶性提取物组和超滤滤过液组。
于接种肿瘤后次日开始，给药组分别腹腔注射给予槐耳清膏、槐耳菌质提取物和超滤滤过液，剂量均以清膏计，4.5g清膏/kg，荷瘤对照组腹腔注射给予同体积的生理盐水，阳性药组腹腔注射环磷酰胺30mg/kg，连续7天，其余小鼠均连续给药10天。于末次给药后24小时，小鼠脱颈椎处死，剥离肉瘤，电子天平称重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。本试验共进行三批。结果见表10。
表8槐耳菌质提取物对小鼠肉瘤H22的抑制作用
| 组别 | 剂量(g/kg×d) | 瘤重(g，X±SD) | 抑瘤率(％) |
| 荷瘤对照组 | / | 1.650±0.580 | / |
| Cy组 | 0.03×7 | 0.643±0.193*** | 61.03 |
| 槐耳清膏 | 4.5×10 | 1.021±0.298*** | 46.52 |
| 槐耳菌质水溶性提取物 | 4.5×10 | 0.904±0.413*** | 52.67 |
| 膜超滤滤过液 | 4.5×10 | 1.353±0.346*** | 18.00 |
注：与荷瘤对照组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3、对小鼠Lewis肺癌瘤重及抑瘤率的影响
C57BL/6小鼠，雌雄各半，体重18-22克，取皮下接种Lewis肺癌瘤株14天的荷瘤小鼠，无菌操作下取出瘤块称重，按瘤块重量加入灭菌生理盐水，于组织匀浆器中研磨，组织和生理盐水的比例为1g∶4ml，配成混悬液(镜检含瘤细胞数2×107/ml)，于所有小鼠右前肢腋部皮下接种0.2ml/鼠。
将接种瘤液的小鼠分为荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、槐耳清膏组、槐耳菌质提取物组和超滤滤过液组。
于接种肿瘤后次日开始，给药组分别腹腔注射给予槐耳清膏、槐耳菌质水溶性提取物和超滤滤过液，剂量均以清膏计，4.5g清膏/kg，阳性药组给予环磷酰胺30mg/kg，连续7天，其余小鼠均给药14天。于末次给药后24小时，脱颈椎处死小鼠，剥离肉瘤，千分之一电子天平称取瘤重。计算各组小鼠瘤重平均值及抑瘤率。结果见表11。
表9槐耳水溶性提取物对小鼠Lewis肺癌瘤的抑瘤作用
| 组别 | 剂量(g/kg×d) | 瘤重(g，X±SD) | 抑瘤率(％) |
| 荷瘤对照组 | / | 1.641±0.326 | / |
| Cy组 | 0.03×7 | 0.856±0.238*** | 47.85 |
| 槐耳清膏 | 4.5×14 | 1.103±0.209*** | 32.78 |
| 槐耳菌质水溶性提取物 | 4.5×14 | 1.056±0.345** | 35.64 |
| 膜超滤滤过液 | 4.5×14 | 1.384±0.258 | 15.70 |
注：与荷瘤对照组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
4、对裸鼠乳腺癌MCF7瘤重及抑瘤率的影响
BALB/c/nu小鼠，雌，16-18g，适应环境3天。无菌条件下，将人乳腺癌MCF7细胞在5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养，于对数生长期用胰酶和EDTA混合消化液消化，调整细胞浓度为5×107个/ml，然后无菌操作下种植到裸鼠背部右肩胛皮下，0.2ml/只。
观察移植瘤生长情况，待瘤块直径为10mm左右，按体积随机均衡分组，接种肿瘤后随机分为荷瘤对照组、环磷酰胺化疗组、槐耳清膏组、槐耳菌质提取物组和超滤滤过液组。
每组均为6只。分组后次日，开始给药，剂量均以清膏计，4.5g清膏/kg。除CTX为ip给药外(腹腔注射，每次30mg/kg，隔日给药，连续8次)，其余均ig10ml/kg，对照组ig等量生理盐水，每d给药1次。药后20d，处死，剥离瘤块，称重。根据瘤块重计算抑瘤率。
表10.槐耳水溶性提取物对裸鼠乳腺癌MCF7的抑制作用(x±s，n＝6)
| 组别 | 剂量(g/kg×d) | 瘤重(g，X±SD) | 抑瘤率(％) |
| 荷瘤对照组 | / | 0.917±0.147 | / |
| Cy组 | 0.03×8 | 0.508±0.062*** | 44.59 |
| 槐耳清膏 | 4.5×20 | 0.598±0.119** | 34.87 |
| 槐耳菌质水溶性提取物 | 4.5×20 | 0.581±0.112** | 36.66 |
| 膜超滤滤过液 | 4.5×20 | 0.770±0.082 | 16.03 |
注：与荷瘤对照组比较(t-检验)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
三、结果
槐耳菌质提取物和槐耳清膏按4.5g清膏/kg的剂量腹腔注射给药，对实体瘤S180、肝癌H22、Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重有减轻作用，而对于乳腺癌MCF7荷瘤裸鼠口服给药，对肿瘤也有明显抑制作用。
结果表明，槐耳菌质提取物和清膏均具明显的抗肿瘤作用。槐耳菌质提取物对几种试验肿瘤的抑制率均较清膏为高。而膜超滤滤过液对试验肿瘤抑瘤作用均较弱，说明槐耳菌质提取物制备工艺中去掉的大部分组分几乎为无效组分，使有效成分得到进一步富集。
本发明获得的槐耳菌质提取物，总多糖和结合蛋白含量由水提浓缩物的百分之二十几提高到50％以上，使原来每日服用25克水提浓缩物的日剂量降低到5克以下，并且抑制肿瘤的活性还略有提高。
实施例7-10
槐耳菌质提取物抑瘤试验
参照实施例6的方法，将实施例2-5制得的槐耳菌质提取物②-⑤进行试验，得到类似的结果。表明由本发明提供的方法获得的槐耳菌质提取物具有有效的抑瘤作用。
实施例11-15
槐耳口服液的制备
实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤ 50克
苯甲酸钠 2克
取实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤，加苯甲酸钠，加注射用水适量，加热溶解，放冷。再加注射用水1000ml，搅拌，用0.45μm微孔滤膜过滤，罐装，封口，灭菌，即得。
实施例16-20
槐耳胶囊的制备
实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤ 500克
糊精 425克
羧甲基纤维素钠 60克
硬脂酸镁 15克
取实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤，糊精，羧甲基纤维素钠，硬脂酸镁混合均匀，过80目筛，用干式制粒机制粒，用60目筛整粒，灌于胶囊中，即得。
实施例21-25
槐耳注射液的制备
实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤ 500克
土温-80 1ml
注射用水 加水至1000ml
实施例1-5制得的槐耳菌质提取物①-⑤100克，加注射用水800ml，溶解，除热源后，用1％氢氧化钠调pH至6-7，加1ml土温-80，补加注射用水至1000ml，低温静置，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封，灭菌，即得。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种槐耳菌质提取物，其特征在于，它含有多糖和多糖结合蛋白，其中总多糖含量为45-55％，总多糖和结合蛋白含量为50-80％。
2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，它有三个主要分子量段组分，所述的分子量段组分的多糖重均分子量分别为60000±5000Da，10000±2000Da和4000±1000Da。
3.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，它的三个主要分子量段组分的高效液相保留时间分别为19.5-20.5分钟、21-22分钟和22.5-24.5分钟；
所述的高效液相测定条件为：
固定相：TSKgel G4000PWXL(7.8mm×30cm)；
流动相：0.7％硫酸钠水溶液；
流速：0.6ml/min。
4.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述多糖的单糖组成为阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩尔比为1-4∶1-2∶1-3∶3-6∶8-19∶3-13。
5.一种槐耳菌质提取物，其特征在于，由下述制备方法获得：
a.将槐耳菌质用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2-70％的无机盐溶液或2-70％的水醇溶液；
b.将密度为1-1.4的提取液超滤或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；
c.将截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌质提取物。
6.一种组合物，其特征在于，它包括(i)治疗有效量的如权利要求1所述的槐耳菌质提取物；和(ii)药学上可接受的载体。
7.一种如权利要求1所述的槐耳菌质提取物的制备方法，其特征在于，它包括步骤：
a.将槐耳菌质用水性溶液提取得到提取液，所述的水性溶液包括水、0.2-70％的无机盐溶液或2-70％的水醇溶液；
b.将密度为1-1.4的提取液超滤或乙醇沉淀得到截留液或沉淀物；
c.将截留液或沉淀物干燥，得到槐耳菌质提取物。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤b中在将一定密度的提取液过滤或离心后用1-30kDa超滤膜超滤。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤c中将截留液或沉淀物进行减压真空干燥或喷雾干燥。
10.一种如权利要求1所述的槐耳菌质提取物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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