CN100494341C - 一种以中药为基质的灰树花发酵制备工艺 - Google Patents
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Abstract
一种以中药为基质的灰树花发酵制备工艺，涉及生物发酵领域，具体地说是一种以中药为发酵基质的灰树花发酵制备工艺。该方法包括以灰树花菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和以中药为基质的发酵培养。本发明还涉及由该工艺制备的以中药为基质灰树花发酵营养保健制剂。本发明对中药的制备和保健产品的开发具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体地说是一种以中药为发酵基质的灰树花发酵制备工艺，该方法包括以灰树花菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和以中药为基质的发酵培养。本发明还涉及由该工艺制备的以中药为基质灰树花发酵营养保健制剂。本发明对中药的制备和保健产品的开发具有重要的意义。
背景技术
随着现代人体生理学、医学及营养学的迅猛发展，人体衰老、病变的机理逐步得到认识，人体的多种疾病和衰老是由于人体器官机能的失去平衡、免疫功能的衰退、体内生物酶及内分泌的失调、体内各种代谢废物得不到清除所造成的。如何能使自己延缓衰老、抵御各种疾病、健康长寿，是每个现代人最关心的事情。中药在调节人体免疫、抗疲劳、防御疾病方面正发挥着越来越重要的作用。
中药成分复杂，含有黄酮、皂甙、生物碱、萜类等诸多水溶性及水不溶的成分，传统的水煮工艺麻烦多，剂量大，而且只能使水溶性成分溶出，因此疗效差。
目前，对灰树花进行液体发酵生产的研究报导不少，但都是灰树花菌自身的发酵，以复合中药为基质的灰树花大规模液体发酵工艺方面的论文和专利目前尚无报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种以中药为基质的灰树花发酵制备工艺，利用现代生物工程技术将中药的加工与灰树花菌的发酵制备相结合，获得一种用于制备预防和治疗癌症、调节人体免疫的药物和/或保健品。
本发明的另一目的是提供一种以中药作为发酵培养基液体深层发酵灰树花菌而得到中药～灰树花复合发酵液，以及由该发酵液制备的固体产品和其它形式的产品，例如发酵液的上清液，或发酵液的浓缩物等。该产品的特征是在所述产品的发酵制备工艺中是以中药为主要发酵基质。
按照本发明提供的技术方案，以中药为基质的灰树花发酵制备工艺包括，
a、摇瓶培养：以灰树花菌为出发菌株，在液体摇瓶培养的培养基中培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间180～240小时，得摇瓶培养发酵液；
b、摇瓶扩大培养：将摇瓶培养发酵液在摇瓶扩大培养的培养基中培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0，接种量5～10％(体积百分数)，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间150～200小时，得摇瓶扩大培养发酵液；
c、一级种子培养：将摇瓶扩大培养所得的发酵液在一级种子培养基内培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0；一级种子培养条件为：接种量5～10％(体积百分数)，培养温度25～27℃，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时，得一级种子培养发酵液；
d、中药为基质的发酵培养：将一级种子培养获得的发酵液在以中药为基质的培养基内培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0，接种量5～10％(体积百分数)，培养温度25～27℃，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间100～150小时，培养基的组成为每升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖10～35，山药粉15～25，薏苡仁粉5～15，枸杞粉10～15，沙参粉5～15，玉竹粉5～15，K2HPO40.5～1.5，MgSO40.5～1，得以中药为基质的灰树花发酵液。
摇瓶培养的培养基组成为每升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，麸皮5～10，K2HPO40.5～1.5，MgSO40.5～1。
摇瓶扩大培养的培养基组成为每升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，麸皮5～10，K2HPO40.5～1.5，MgSO40.5～1。
一级种子培养的培养基组成为每升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，薏苡仁粉5～15，K2HPO40.5～1.5，MgSO40.5～1。
将上述以中药为基质的发酵培养制得的发酵液，在高压均质机内30MPa条件下破碎均质20—30分钟，获得带淡黄色的悬浮液，即为灰树花发酵制剂。再将破碎和均质后的灰树花发酵制剂经喷雾干燥后获得固体粉末。
以中药为基质的灰树花发酵制备工艺获得的物质在制备预防和辅助治疗癌症、调节人体免疫的药物和保健品中的应用。
其中，山药(Dioscorea opposita Thunb.)又名薯蓣、薯药、淮山药等，为薯蓣科植物薯蓣的块茎，含皂甙、粘液质、胆碱、糖蛋白等活性成分。具有健脾，补肺，固肾，益精等功效；治脾虚泄泻，久痢，虚劳咳嗽，消渴。
薏苡仁(Coix lachryma-jobi L.)又名薏米、米仁、苡米等，为禾本科植物薏苡的种仁，含有多糖、薏苡素、薏苡酯等活性成分。具有健脾、补肺、清热、利湿等功效；治泄泻，湿痹，水肿，肺痈，肠痈。
枸杞(Lycium Chinese Mill.)又名杞子、枸杞果、血枸子等，为茄科植物枸杞或宁夏枸杞的成熟果实，含有多糖、甜菜碱、胡萝卜素、菸酸、β—谷甾醇、亚油酸等活性成分。具有滋肾、润肺，补肝，明目等功效；治肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，虚劳咳嗽，消渴。
沙参为桔梗科沙参属多年生草本植物轮叶沙参(Adenophora tetraphyllaFisch)、杏叶沙参(A.axilliflora Borb.)及阔叶沙参(A.pereskiaefolia G.Don)的根。具有清肺养阴，益胃生津的功效；用于肺热阴虚引起的燥咳及热病伤津所致的舌干口渴、食欲不振等。
玉竹(Polygonatum odoratum Druce var.pluriflorum Ohwi)又名女萎、玉术、山玉竹、连竹等，为百合科植物玉竹的根茎，含铃兰苦甙、铃兰甙、槲皮醇甙、粘液质等活性成分。具有养阴，润燥，止渴等功效；治热病伤阴，咳嗽烦渴，虚劳发热，消谷易饥。
灰树花(Grifola frondosa)又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、莲花菌等，日本称之为舞茸。灰树花是著名的食用、药用真菌，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗病毒、调节免疫以及防治高血压、高血脂、糖尿病等。
本发明的中药-灰树花复合发酵液为淡黄色到棕色的，有一定粘度的液体。所述的灰树花发酵制剂是由发酵液经高压破碎、均质获得。
本发明所述的固体发酵产物是从黄色到棕褐色的固体，是由发酵液经常规的高压破碎、均质、干燥、粉碎后获得。本发明的中药-灰树花复合发酵液的上清液可以通过将发酵液离心分离获得。上清液的浓缩物可以将上清液浓缩至一定体积获得。
本发明所述的水为普通的饮用水或纯水或蒸馏水或去离子水。
本发明的各种中药-灰树花复合发酵产品均可用于制备预防和治疗癌症、调节人体免疫、抗疲劳的药物和/或保健品。
本发明的优点是：本发明集中药加工与药用真菌(灰树花)液体发酵生产于一体，实现了传统中药加工与现代生物技术的结合，有别于传统的中药配伍后制备的中成药或保健制剂，更有利于中药制剂制备的工业化、标准化。
具体实施方式
本发明的制备工艺通过以下步骤来实现：
1、取出灰树花菌的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中，培养温度25～27℃，培养时间200～240小时。
2、将步骤1中的斜面菌种接入装有上述摇瓶培养基的摇瓶中，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间180～240小时。
3、将步骤2中摇瓶获得的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述摇瓶扩大培养基的摇瓶中进行扩大培养，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间150～200小时。
4、将步骤3中摇瓶获得的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述一级种子培养基的种子罐中，25～27℃培养，种子罐压力0.05Mpa，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。
5、将步骤4种子罐中获得的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述发酵培养基的发酵罐中，25～27℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间100～150小时。
每次培养后获得的发酵液内含灰树花菌体、灰树花胞外代谢产物、未利用完的中药基质、以及灰树花菌与中药基质相互作用的产物。
其中所述的斜面培养基为改良土豆葡萄糖培养基，其组成为每升水中含下列成分(单位：克)：土豆 200(煮汁)，葡萄糖 20，K2HPO4 1.5，MgSO4 1，琼脂 20。
本发明所使用的灰树花菌种可选用任意一种灰树花菌种，例如可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的CGMCC No.5.404，CGMCCNo.5.486，CGMCC No.5.4，87，CGMCC No.5.626，CGMCC No.5.692和CGMCCNo.5.694。
步骤2中的摇瓶培养基与三角瓶容积之比可以是3：10左右。
步骤3中的摇瓶扩大培养基与三角瓶容积之比可以是3：10左右。
当步骤4中的一级种子罐的容积为30～100L时，其中装有的一级种子培养基相应的为20～70L。
当步骤5中的一级种子罐的容积为300～3000L时，其中装有的一级种子培养基相应的为200～2000L。
本发明一级种子培养和发酵培养中所使用的中药经60～80℃烘干后，粉碎，过40～100目筛制备。
为了进一步阐述本发明所涉及的材料及实施工艺，给出了下述实施例，但是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
先制备中药饮片粉，当然，这种物质也可以外购。
实施例1
中药饮片粉的制备
分别将山药、薏苡仁、枸杞、沙参、玉竹在60℃烘干后粉碎，过40目筛，得到山药粉、薏苡仁粉、枸杞粉、沙参粉、玉竹粉。使用时以干粉形式添加。
实施例2
中药饮片粉的制备
分别将山药、薏苡仁、枸杞、沙参、玉竹在70℃烘干后粉碎，过60目筛，得到山药粉、薏苡仁粉、枸杞粉、沙参粉、玉竹粉。使用时以干粉形式添加。
实施例3
中药饮片粉的制备
分别将山药、薏苡仁、枸杞、沙参、玉竹在80℃烘干后粉碎，过80目筛，得到山药粉、薏苡仁粉、枸杞粉、沙参粉、玉竹粉。使用时以干粉形式添加。
实施例4
中药-灰树花复合发酵液的制备
在新鲜的斜面培养基中接入灰树花菌菌丝体，灰树花菌菌株为CGMCCNo.5.404(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度26℃，培养时间240小时。再将斜面菌种接入装有80mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中(共5瓶)，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。其中所述摇瓶培养基为：葡萄糖25，玉米粉20，麸皮10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，单位为每升水中加入多少克的培养基成分(在本文中所涉及的培养基成分的单位均是如此，为免累赘，在下面均省略了对单位的描述)，起始pH值为6.5。
将上述摇瓶菌种接入装有135mL摇瓶扩大培养基的500mL摇瓶中(共22瓶)，接种量为每瓶接入15mL摇瓶种子，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。其中所述摇瓶扩大培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
将上述摇瓶扩大培养的种子3000mL接入装有18L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为21L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间150小时。其中一级种子培养基为(单位克/升，这里的升就是指1升水，下同)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
将上述21L一级种子菌种接入装有330L发酵培养基的500L发酵罐中，罐中发酵液的总体积为351L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间120小时。其中发酵培养的培养基组成为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉15，薏苡仁粉10，枸杞粉5，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
实施例5
中药-灰树花复合发酵液的制备
此实施例的菌种及其发酵条件与实施例4相同。
具体地，在新鲜的斜面培养基中接入灰树花菌菌丝体，灰树花菌菌株为CGMCC No.5.404(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度26℃，培养时间240小时。再将斜面菌种接入装有80mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中(共5瓶)，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶菌种接入装有135mL摇瓶扩大培养基的500mL摇瓶中(共22瓶)，接种量为每瓶接入15mL摇瓶种子，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶扩大培养的种子3000mL接入装有18L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为21L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间150小时。然后将21L一级种子菌种接入装有330L发酵培养基的500L发酵罐中，罐中发酵液的总体积为351L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间120小时。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下：
摇瓶培养基为(单位克/升)：葡萄糖25，玉米粉20，麸皮10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
摇瓶扩大培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
一级种子培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
发酵培养的培养基组成为(单位克/升)：葡萄糖15，山药粉20，薏苡仁粉10，枸杞粉10，沙参10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
实施例6
中药-灰树花复合发酵液的制备
此实施例的菌种及其发酵条件与实施例4相同。
具体地，在新鲜的斜面培养基中接入灰树花菌菌丝体，灰树花菌菌株为CGMCC No.5.692(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度26℃，培养时间240小时。再将斜面菌种接入装有80mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中(共5瓶)，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶菌种接入装有135mL摇瓶扩大培养基的500mL摇瓶中(共22瓶)，接种量为每瓶接入15mL摇瓶种子，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶扩大培养的种子3000mL接入装有18L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为21L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间150小时。然后将21L一级种子菌种接入装有330L发酵培养基的500L发酵罐中，罐中发酵液的总体积为351L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间120小时。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下：
摇瓶培养基为(单位克/升)：葡萄糖25，玉米粉20，麸皮10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
摇瓶扩大培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
一级种子培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
发酵培养的培养基组成为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉10，枸杞粉10，沙参粉5，玉竹粉10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
实施例7
中药-灰树花复合发酵液的制备
此实施例的菌种及其发酵条件与实施例4相同。
具体地，在新鲜的斜面培养基中接入灰树花菌菌丝体，灰树花菌菌株为CGMCC No.5.692(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度26℃，培养时间240小时。再将斜面菌种接入装有80mL摇瓶培养基的250mL摇瓶中(共5瓶)，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶菌种接入装有135mL摇瓶扩大培养基的500mL摇瓶中(共22瓶)，接种量为每瓶接入15mL摇瓶种子，于26℃、150转/分钟摇瓶柜培养200小时。将摇瓶扩大培养的种子3000mL接入装有18L一级种子培养基的30L种子罐中，种子罐中发酵液的总体积为21L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间150小时。然后将21L一级种子菌种接入装有330L发酵培养基的500L发酵罐中，罐中发酵液的总体积为351L，维持罐温26℃，罐压0.05Mpa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，发酵时间120小时。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下：
摇瓶培养基为(单位克/升)：葡萄糖25，玉米粉20，麸皮10，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
摇瓶扩大培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
一级种子培养基为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉10，K2HPO41.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
发酵培养的培养基组成为(单位克/升)：葡萄糖20，山药粉20，薏苡仁粉15，K2HPO4 1.0，MgSO4 0.75，起始pH值为6.5。
实施例8
以中药为基质的灰树花发酵制剂的制备
将实施例4所得到的发酵液经高压破碎、均质，制剂为淡黄色、含固体物质、有一定粘度的液体。该制剂体内抑瘤试验表明能显著抑制肿瘤细胞株S-180的增殖，在连续口服30天，剂量30ml/kg.bw/d的条件下，抑瘤率达58.62％，较灰树花的清液发酵制剂高20.08％。
实施例9
固体发酵产品的制备
将实施例4所得到的发酵液经高压破碎、均质，喷雾干燥获得固体的发酵产品，产品为棕色粉末。该固体制剂体内抑瘤试验表明能显著抑制肿瘤细胞株S-180的增殖，在连续口服30天，剂量30mg/kg.bw/d的条件下，抑瘤率达62.77％，较灰树花的清液发酵制剂高24.21％。
实施例10
发酵液上清液的制备
将实施例4所得到的发酵液经3000转/分钟离心，获得的上清液，所得上清液为淡黄色、有一定粘度的液体。该制剂体内抑瘤试验表明能显著抑制肿瘤细胞株S-180的增殖，在连续口服30天，剂量30ml/kg.bw/d的条件下，抑瘤率达50.45％，较灰树花的清液发酵制剂高11.89％。
实施例11
发酵液浓缩物的制备
将实施例4所得到的发酵液经3000转/分钟离心，获得的上清液，所得上清液浓缩3倍后得到浓缩物，发酵液浓缩物为淡黄色、有一定粘度的液体该制剂体内抑瘤试验表明能显著抑制肿瘤细胞株S-180的增殖，在连续口服30天，剂量30ml/kg.bw/d的条件下，抑瘤率达56.74％，较灰树花的清液发酵制剂高18.22％。。
Claims (4)
1、一种以中药为基质的灰树花发酵制备工艺，其特征在于，
a、摇瓶培养：以灰树花菌为出发菌株，在液体摇瓶培养的培养基中培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间180～240小时，得摇瓶培养发酵液；
b、摇瓶扩大培养：将摇瓶培养发酵液在摇瓶扩大培养的培养基中培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0，接种量5～10％，单位为体积百分数，培养温度25～27℃，摇床转速120～180转/分钟，培养时间150～200小时，得摇瓶扩大培养发酵液；
c、一级种子培养：将摇瓶扩大培养所得的发酵液在一级种子培养基内培养，培养时，起始pH值为6.0～7.0；一级种子培养条件为：接种量5～10％，单位为体积百分数，培养温度25～27℃，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时，得一级种子培养发酵液；
d、中药为基质的发酵培养：将一级种子培养获得的发酵液在以中药为基质的培养基内培养，培养时，在该培养基内加水至适当体积，起始pH值为6.0～7.0，接种量5～10％，单位为体积百分数，培养温度25～27℃，搅拌转速100～160转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间100～150小时；
培养基的组成为每升水中含下列成分：葡萄糖10～35，山药粉15～25，薏苡仁粉5～15，枸杞粉10～15，沙参粉5～15，玉竹粉5～15，K2HPO4 0.5～1.5，MgSO40.5～1，得以中药为基质的灰树花发酵液，单位为克；
所述摇瓶培养的培养基组成为每升水中含下列成分：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，麸皮5～10，K2HPO4 0.5～1.5，MgSO4 0.5～1，单位为克；
所述摇瓶扩大培养的培养基组成为每升水中含下列成分：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，麸皮5～10，K2HPO4 0.5～1.5，MgSO4 0.5～1，单位为克；
所述一级种子培养的培养基组成为每升水中含下列成分：葡萄糖15～35，玉米粉15～25，薏苡仁粉5～15，K2HPO4 0.5～1.5，MgSO4 0.5～1，单位为克。
2、如权利要求1所述以中药为基质的灰树花发酵制备工艺，其特征是：以中药为基质的灰树花发酵液，在高压均质机内30Mpa条件下破碎均质20～30分钟，获得带淡黄色的悬浮液，即为灰树花发酵制剂。
3、如权利要求2所述以中药为基质的灰树花发酵制备工艺，其特征是：将破碎和均质后的灰树花发酵制剂经喷雾干燥后获得固体粉末。
4、如权利要求1或2或3所述以中药为基质的灰树花发酵制备工艺获得的物质在制备预防和辅助治疗癌症、调节人体免疫的药物或保健品中的应用。
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| CNB2006101560275A CN100494341C (zh) | 2006-12-28 | 2006-12-28 | 一种以中药为基质的灰树花发酵制备工艺 |
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