CN103404855B - 一种灰树花保健口服液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰树花保健口服液及其制备方法，以灰树花菌为出发菌株，获得灰树花液态菌种；然后将液态菌种接种至由五节芒、巨菌草、象草、芒萁等野生草本植物经特定比例配制而成的固体培养基上，固态发酵25-40天，取出发酵菌丝体产物，菌丝体产物用热水浸提法获得富含灰树花多糖的提取液并制成浓缩液；将浓缩液与降糖传统中药熬制的中药液按质量比1:0.5-1进行混合并调配成适口性良好的口服液。本发明通过固体发酵菌丝体得到的灰树花多糖含量可达3.05%；产品经动物降血糖试验，表明其具有降低由四氧嘧啶（Alloxan）致病的Ⅰ型高血糖模型小鼠血糖的功效，降糖率可达到41.10%；工艺稳定可靠，适合于工业化生产。

Description

一种灰树花保健口服液及其制备方法

技术领域

本发明属于保健食品、生物医药领域，具体涉及一种灰树花保健口服液及其制备方法。

背景技术

灰树花(GrifoLa frondosa)属担子菌亚门(Basidiso mycotina)，层菌纲(Hgmenomyc etes)，无隔担子菌亚纲(HoLobasidiomy ceidae)，非褶菌目(AphyLLophraLes)，多孔菌科(PoLrrIordeaL)，树花菌属(Origola)真菌，又名贝叶多孔菌、干佛菌、栗子蘑、莲花菌等，日本称之舞茸(Maitake)。早在1984 年，日本学者Ohno等首次报道了灰树花多糖具有抗肿瘤活性, 美国国家癌症研究院在1992 年证实, 灰树花的萃取物有抵抗艾滋病病毒的功效；随后，大量的科学研究表明，仅灰树花多糖就具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗病毒、抗辐射和清除自由基等功效。因此，灰树花及其提取物的医学价值前景广阔。在我国，灰树花的人工栽培研究起步较晚，无法满足市场的需求。灰树花加工品在国际医药市场上价格昂贵、供不应求。研究以大量人工发酵菌丝体在生产上应用，这对于保护天然资源、解决资源缺乏，具有十分重要的意义。 

经检索，该技术领域有孟昭宇等的“一种抗衰延年长寿丹”（专利申请号200310105465.5）,对灰树花多糖的提取工艺进行了阐述，并将其与其它真菌等提取物科学搭配制成产品；以及蒋峰等的“一种复合真菌多糖营养剂”（专利申请号200410102983.6），将灰树花提取物与其它真菌等提取物制成一种复合营养剂，并将制成的产品用在修复胃肠粘膜、抗肿瘤、护肝上；雷红等的“一种降血糖组合食物”（专利申请号201110284448.7），将由灰树花子实体提取得到的多糖粉与传统降糖中药黄芪按特定质量比例混合制成一种降糖食物，并对由四氧嘧啶（Alloxan）致病的Ⅰ型糖尿病小鼠进行降血糖功能试验，发现其具有降血糖功能。

目前在该领域的技术上存在发酵培养基单一、培养基原料代价高、菌丝粗多糖含量较低及发酵产物上没有有效的提取和高附加值利用等问题。目前，尚未见将灰树花固体发酵培养物结合传统中医药制成具降血糖功能的口服液的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灰树花保健口服液及其制备方法，通过固体发酵菌丝体得到的灰树花多糖含量可达3.05%；产品经动物降血糖试验，表明其具有降低由四氧嘧啶（Alloxan）致病的Ⅰ型高血糖模型小鼠血糖的功效，降糖率可达到41.10%；工艺稳定可靠，适合于工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种灰树花保健口服液的制备方法包括以下步骤：

（1）灰树花固体发酵菌种的制备：

A、将灰树花保存种（福建农林大学食品生物技术实验室保存）用PDA培养基进行活化、复壮，置25-32℃恒温箱静止培养10-15天，得到生产斜面种，置冰箱中冷藏备用；将生产斜面种用摇瓶培养基进行扩大培养，得到生产摇瓶一级种；

PDA培养基配方：去皮马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，加水定容至所需体积，pH自然；

摇瓶培养基配方：葡萄糖30-60 g/L、蛋白胨5-15 g/L、KH₂PO₄ 1-3 g/L、MgSO₄·7H₂O 1-2 g/L、VB₁ 0.05-0.15 g/L，pH自然；培养条件：以100-200mL/500mL装量，接入1cm²的生产斜面种，旋转式摇床80-200rpm培养7-10d，温度25-28℃；

将生产摇瓶一级种用5-20%的接种量，按上述的摇瓶培养基配方和培养条件，再次扩大培养4-6天，得生产摇瓶二级种；

B、将生产摇瓶二级种转接入菌草固体培养基中发酵培养25-40d，待原基形成取出；

菌草固体培养基配方：五节芒 20-40g/100g，巨菌草 5-15g/100g，象草5-15g/100g，芒萁10-20g/100g，玉米粉 10-15g/100g，麸皮 13-18g/100g，石膏粉 1-5g/100g，含水量45%-65%，pH值为5-8；

培养条件为：接种量1-10%，培养温度25-32℃；

（2）浓缩液的制备：

A、在形成原基后的灰树花发酵产物中加入20-40倍水进行水提3次并过滤得滤液A；

B、将滤液A在50-70℃、0.05-0.095MPa条件下浓缩至可溶性固形物为5-10%，得浓缩液B；

C、取玉竹 40-60g、黄芪40-60g、桑叶 20-40g、三七 40-60g和枸杞子40-60g，于砂锅中用水浸过药材表面2-3cm，浸泡10-30min，煮沸后文火煎煮20-40min，冷却至室温，用纱布过滤、2000-4000r/min离心并浓缩至100-200mL，得浓缩液C；

D、将浓缩液B和浓缩液C按质量比为1:0.5-1进行混合得到初始保健液D；

（3）口服液的调制：

A、将初始保健液D煮沸，离心去除其中的不溶物质后，按重量比加入阿斯巴甜200-500 ppm，苹果酸0.1-0.5%；

B、趁热用盐水瓶灌装、锁盖，经水浴杀菌并检验合格后即成为产品；水浴杀菌的公式为：5’-10’／100℃。

本发明的显著优点在于：

（1）工艺稳定可靠，适合于工业化生产。

（2）筛选了适合灰树花菌丝生长的原料及配比，并且将不溶性原料磨成150目的细粉，原料得到充分的利用，发酵生产获得大量产物，其干菌丝得率高达4.5%，菌丝粗多糖含量可达3.05%。

（3）产品经动物降血糖试验，表明其具有降低由四氧嘧啶（Alloxan）致病的Ⅰ型高血糖模型小鼠血糖的功效，降糖率可达到41.10%。

（4）本发明通过液体发酵培养菌种，利用菌草作为固体培养基进行发酵方法，能获得大量的所需产物，用热水提取法能获得富含灰树花多糖的浓缩液，并结合传统中医药配制成具有显著降低血糖功能保健口服液。该工艺的应用，还能够保护天然资源、缓解目前野生灰树花资源严重缺乏的问题，部分代替灰树花子实体进行应用。

具体实施方式

实施例1

一种灰树花保健口服液的制备方法包括以下步骤：

（1）灰树花固体发酵菌种的制备：

A、将灰树花保存种用PDA培养基进行活化、复壮，置25℃恒温箱静止培养10天，得到生产斜面种，置冰箱中冷藏备用；将生产斜面种用摇瓶培养基进行扩大培养，得到生产摇瓶一级种；

PDA培养基配方：去皮马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，加水定容至所需体积，pH自然；

摇瓶培养基配方：葡萄糖30g/L、蛋白胨5 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、VB₁ 0.05g/L，pH自然；培养条件：以100mL/500mL装量，接入1cm²的生产斜面种，旋转式摇床80rpm培养7d，温度25℃；

将生产摇瓶一级种用5%的接种量，按上述的摇瓶培养基配方和培养条件，再次扩大培养4天，得生产摇瓶二级种；

B、将生产摇瓶二级种转接入菌草固体培养基中发酵培养25d，待原基形成取出；

菌草固体培养基配方：五节芒 20g/100g，巨菌草 5g/100g，象草5g/100g，芒萁10g/100g，玉米粉 10g/100g，麸皮 13g/100g，石膏粉 1g/100g，含水量45%，pH值为5；

培养条件为：接种量1%，培养温度25℃；

（2）浓缩液的制备：

A、在形成原基后的灰树花发酵产物中加入20倍水进行水提3次并过滤得滤液A；

B、将滤液A在50℃、0.05MPa条件下浓缩至可溶性固形物为5%，得浓缩液B；

C、取玉竹 40g、黄芪40g、桑叶 20g、三七 40g和枸杞子40g，于砂锅中用水浸过药材表面2cm，浸泡10min，煮沸后文火煎煮20min，冷却至室温，用纱布过滤、2000r/min离心并浓缩至100mL，得浓缩液C；

D、将浓缩液B和浓缩液C按质量比为1:0.5进行混合得到初始保健液D；

（3）口服液的调制：

A、将初始保健液D煮沸，离心去除其中的不溶物质后，按重量比加入阿斯巴甜200ppm，苹果酸0.1%；

B、趁热用盐水瓶灌装、锁盖，经水浴杀菌并检验合格后即成为产品；水浴杀菌的公式为：5’-10’／100℃。

实施例2

一种灰树花保健口服液的制备方法包括以下步骤：

（1）灰树花固体发酵菌种的制备：

A、将灰树花保存种用PDA培养基进行活化、复壮，置32℃恒温箱静止培养15天，得到生产斜面种，置冰箱中冷藏备用；将生产斜面种用摇瓶培养基进行扩大培养，得到生产摇瓶一级种；

PDA培养基配方：去皮马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，加水定容至所需体积，pH自然；

摇瓶培养基配方：葡萄糖60 g/L、蛋白胨15 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、MgSO₄·7H₂O 2 g/L、VB₁ 0.15 g/L，pH自然；培养条件：以200mL/500mL装量，接入1cm²的生产斜面种，旋转式摇床200rpm培养10d，温度28℃；

将生产摇瓶一级种用20%的接种量，按上述的摇瓶培养基配方和培养条件，再次扩大培养6天，得生产摇瓶二级种；

B、将生产摇瓶二级种转接入菌草固体培养基中发酵培养40d，待原基形成取出；

菌草固体培养基配方：五节芒 40g/100g，巨菌草 15g/100g，象草15g/100g，芒萁20g/100g，玉米粉 15g/100g，麸皮 18g/100g，石膏粉 5g/100g，含水量65%，pH值为8；

培养条件为：接种量10%，培养温度32℃；

（2）浓缩液的制备：

A、在形成原基后的灰树花发酵产物中加入40倍水进行水提3次并过滤得滤液A；

B、将滤液A在70℃、0.095MPa条件下浓缩至可溶性固形物为10%，得浓缩液B；

C、取玉竹 60g、黄芪60g、桑叶 40g、三七 60g和枸杞子60g，于砂锅中用水浸过药材表面3cm，浸泡30min，煮沸后文火煎煮40min，冷却至室温，用纱布过滤、4000r/min离心并浓缩至200mL，得浓缩液C；

D、将浓缩液B和浓缩液C按质量比为1:1进行混合得到初始保健液D；

（3）口服液的调制：

A、将初始保健液D煮沸，离心去除其中的不溶物质后，按重量比加入阿斯巴甜500 ppm，苹果酸0.5%；

B、趁热用盐水瓶灌装、锁盖，经水浴杀菌并检验合格后即成为产品；水浴杀菌的公式为：5’-10’／100℃。

实施例3

一种灰树花保健口服液的制备方法包括以下步骤：

（1）灰树花固体发酵菌种的制备：

A、将灰树花保存种用PDA培养基进行活化、复壮，置28℃恒温箱静止培养12天，得到生产斜面种，置冰箱中冷藏备用；将生产斜面种用摇瓶培养基进行扩大培养，得到生产摇瓶一级种；

PDA培养基配方：去皮马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L，加水定容至所需体积，pH自然；

摇瓶培养基配方：葡萄糖45 g/L、蛋白胨10 g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O1.5 g/L、VB₁ 0.10 g/L，pH自然；培养条件：以150mL/500mL装量，接入1cm²的生产斜面种，旋转式摇床120rpm培养8d，温度26℃；

将生产摇瓶一级种用10%的接种量，按上述的摇瓶培养基配方和培养条件，再次扩大培养5天，得生产摇瓶二级种；

B、将生产摇瓶二级种转接入菌草固体培养基中发酵培养30d，待原基形成取出；

菌草固体培养基配方：五节芒 30g/100g，巨菌草 10g/100g，象草10g/100g，芒萁15g/100g，玉米粉 12g/100g，麸皮15g/100g，石膏粉 3g/100g，含水量55%，pH值为6；

培养条件为：接种量5%，培养温度30℃；

（2）浓缩液的制备：

A、在形成原基后的灰树花发酵产物中加入30倍水进行水提3次并过滤得滤液A；

B、将滤液A在60℃、0.07MPa条件下浓缩至可溶性固形物为7%，得浓缩液B；

C、取玉竹 50g、黄芪50g、桑叶30g、三七 50g和枸杞子50g，于砂锅中用水浸过药材表面2.5cm，浸泡20min，煮沸后文火煎煮30min，冷却至室温，用纱布过滤、3000r/min离心并浓缩至150mL，得浓缩液C；

D、将浓缩液B和浓缩液C按质量比为1:0.8进行混合得到初始保健液D；

（3）口服液的调制：

A、将初始保健液D煮沸，离心去除其中的不溶物质后，按重量比加入阿斯巴甜350 ppm，苹果酸0.3%；

B、趁热用盐水瓶灌装、锁盖，经水浴杀菌并检验合格后即成为产品；水浴杀菌的公式为：5’-10’／100℃。

所得产品呈浅黄色、酸甜可口；含有丰富的矿物元素和17种以上的氨基酸，多糖含量达35mg/mL以上；具有显著的降低血糖功能。

将本发明的灰树花保健口服液，按国家食品药品监督管理局的《保健食品审评专家培训资料汇编（三）》（2011年）方法进行辅助降血糖的药效学试验，其结果如下：

1、灰树花口服液对小鼠血糖影响（见表1）：

灰树花口服液按100mg/kg和400mg/kg剂量小鼠灌胃给药，运用DPS数据分析软件对结果进行分析，18天后高剂量口服液和模型对照组相比可显著降低小鼠血糖含量，27天后高剂量、低剂量口服液和模型对照组相比均可显著降低小鼠血糖含量，此时，100mg/kg剂量口服液的降糖率达到26.08%；400mg/kg剂量口服液的降糖率达到41.10%，阳性对照组的降糖率达到51.99%，400mg/kg剂量组与阳性对照组（药物组）相差仅为10.89个百分点；实验结果表明，灰树花口服液具有显著的降血糖效果。

表1 灰树花口服液对小鼠血糖的影响（n =10, x ±s）（mmoL/L）

注: ^a,b,c,d同一列中不同字母表明差异显著(p<0.05, n=10)

2、灰树花口服液对小白鼠糖耐量的影响（见表2）：

灰树花口服液按100mg/kg和400mg/kg剂量小鼠灌胃给药，实验结果表明：小鼠给药27天后，模型组的血糖曲线下面积（AUC）为41.095，而灰树花口服液（100mg/kg）组的AUC和灰树花口服液（400mg/kg）组AUC分别为29.086和29.290，口服液组葡萄糖曲线下面积均小于模型对照组，因此，口服液可提高小鼠的糖耐量。

表2  灰树花口服液灌胃给药对小鼠糖耐量的影响（n =10, x ±s）（mmoL/L）

以上实验表明，100mg/kg剂量口服液的降糖率达到26.08%；400mg/kg剂量口服液的降糖率达到41.10%，和阳性对照组（药物组）相差仅为10.89个百分点；同时，口服液组葡萄糖曲线下面积均小于高血糖模型对照组。依据《保健食品审评专家培训资料汇编（三）》（2011）结果判定，灰树花口服液具有辅助降血糖功能，即产品具有显著降低血糖功能的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种灰树花保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）灰树花固体发酵菌种的制备：

A、将灰树花保存种用PDA培养基进行活化、复壮，将生产斜面种用摇瓶培养基进行两次扩大培养，得到生产摇瓶二级种；

B、将生产摇瓶二级种转接入菌草固体培养基中发酵培养25-40d，待原基形成取出；

菌草固体培养基配方：五节芒 20-40g/100g，巨菌草 5-15g/100g，象草5-15g/100g，芒萁10-20g/100g，玉米粉 10-15g/100g，麸皮 13-18g/100g，石膏粉 1-5g/100g，含水量45%-65%，pH值为5-8；

培养条件为：接种量1-10%，培养温度25-32℃；

（2）浓缩液的制备：

A、在形成原基后的灰树花发酵产物中加入20-40倍水进行水提3次并过滤得滤液A；

B、将滤液A在50-70℃、0.05-0.095MPa条件下浓缩至可溶性固形物为5-10%，得浓缩液B；

C、取玉竹 40-60g、黄芪40-60g、桑叶 20-40g、三七 40-60g和枸杞子40-60g，于砂锅中用水浸过药材表面2-3cm，浸泡10-30min，煮沸后文火煎煮20-40min，冷却至室温，用纱布过滤、2000-4000r/min离心并浓缩至100-200mL，得浓缩液C；

D、将浓缩液B和浓缩液C按质量比为1:0.5-1进行混合得到初始保健液D；

（3）口服液的调制：

A、将初始保健液D煮沸，离心去除其中的不溶物质后，按重量比加入阿斯巴甜200-500 ppm，苹果酸0.1-0.5%；

B、趁热用盐水瓶灌装、锁盖，经水浴杀菌并检验合格后即成为产品。

2.一种如权利要求1所述的方法制得的灰树花保健口服液。