CN101525646B - 黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖的提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖的提取工艺，包括黄伞菌种的活化、液体培养种子的制备、种子的扩大培养和黄伞硒多糖的提取等方法步骤，本发明通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，具有工艺合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒浓度含量高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖提取工艺。
背景技术
黄伞(pholiota adiposa(Fr.)Quèl.)是野生于泰山上的一种珍贵药、食两用真菌，脆嫩可口、营养丰富。从黄伞中提取的多糖物质具有抑制肿瘤生长，预防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌感染等作用。硒元素是人体必需的微量元素之一，具有降低癌症发生率和死亡率，防治脑血管疾病、糖尿病，抗衰老等作用，并且能够解除重金属的致癌性与毒害。而硒制剂中以有机硒为佳，与无机硒相比有机硒具有吸收率高、无毒性等优点。近年来的研究表明，有机硒对铅具有一定的拮抗作用。多糖类等大分子物质，其糖链上丰富的游离-OH和-COOH基团可与铅络合，形成难以吸收的凝胶，有效地阻止铅在胃肠道的吸收，起到促进排铅的作用，说明硒多糖具有复合排铅的功能。本发明通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，通过动物实验，具有较好的排铅效果，为黄伞硒多糖的开发利用奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是通过黄伞菌丝体的富硒培育，提取黄伞硒多糖，为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括以下方法步骤：
(1)黄伞菌种的活化
将由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的培养基装入试管，灭菌摆斜面后冷却，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化后，接种到配置好的培养基上，在25℃恒温培养箱进行菌种的扩大培养；
(2)液体培养种子的制备
将由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的液体培养基装入培养瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15Mpr/cm2，125℃条件下灭菌20h；待液体培养基温度降至30℃以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)扩大培养后菌丝浓密、生长优良的菌种，接入液体培养基中，每支试管菌种扩接6瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为24℃，转速为145r/min，培养96h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；
(3)种子的扩大培养
在由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的液体培养基中添加亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm；调整后的培养基装入50-200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70％，经灭菌冷却待培养液温度降到25℃左右时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到培养基中，接种量为培养液体积的10％；控制培养温度24℃，罐压0.02MPa/cm2，通气量0.03m3/min，培养96h，待菌丝球布满培养基时停止培养；
(4)黄伞硒多糖的提取
将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球重量的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为95℃，提取时间2h；将压滤后的滤液导入浓缩罐中，在0.09MPa的真空度下，浓缩至原体积的1/4；浓缩液取出后按1∶2比例加入95％乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10min，60℃烘干，即得粗黄伞硒多糖。
通过该培育工艺提取的黄伞硒多糖经称量测定得率为0.08g/100ml、硒多糖中硒浓度为2120ppm，因此本发明工艺合理，硒多糖的得率高，硒多糖中的硒浓度含量高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步描述：
本发明的黄伞菌丝体富硒培育工艺包括以下方法步骤：
(1)黄伞菌种的活化
将由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的培养基装入试管，灭菌摆斜面后冷却，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化后，接种到配置好的培养基上，在25℃恒温培养箱进行菌种的扩大培养；
(2)液体培养种子的制备
将由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的液体培养基装入培养瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15Mpr/cm2，125℃条件下灭菌20min；待液体培养基温度降至30℃以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)扩大培养后菌丝浓密、生长优良的菌种，接入液体培养基中，每支试管菌种扩接6瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为24℃，转速为145r/min，培养96h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；
(3)种子的扩大培养
在由土豆100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的液体培养基中添加亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm；调整后的培养基装入50-200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70％，经灭菌冷却待培养液温度降到25℃左右时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到培养基中，接种量为培养液体积的10％；控制培养温度24℃，罐压0.02MPa/cm2，通气量0.03m3/min，培养96h，待菌丝球布满培养基时停止培养；
(4)黄伞硒多糖的提取
将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球重量的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为95℃，提取时间2h；将压滤后的滤液导入浓缩罐中，在0.09MPa的真空度下，浓缩至原体积的1/4；浓缩液取出后按1∶2比例加入95％乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10min，60℃烘干，即得粗黄伞硒多糖。
黄伞硒多糖抗铅作用试验如下：
试验动物采用体重为20(±2)g小白鼠30只，随机分成3组，每组10只，分别饲以普通饲料(硒含量为0.1497mg/kg)，添加硒多糖饲料(硒含量为0.4387mg/kg)，饲料组成为：玉米70％，大豆29％，食盐1％，自由进食进水。
给药方式采用腹腔注射方法。给药量为：铅20mg/kg，(药量/体重)。前两次隔日给药，第3次3d给药，第4次，5次隔4d给药。第5次给药后饲养9d后断脊处死取样。
黄伞硒多糖对小鼠组织中硒、铅含量的影响试验结果见下表：
小鼠组织中硒、铅的含量(X±S，湿组织)
由上表可见，在本试验浓度下硒多糖可使小鼠各组织硒含量增加，使心、肾硒含量明显增加(P＜0.05)，使血、肝硒含量极显著增加(P＜0.01)；使血、心、肝、肾硒含量极显著增加(P＜0.01)硒多糖的补硒效果显著。可降低小鼠各组织中铅含量，减少铅在体内的蓄积，但硒多糖的排铅效果对心、肾等组织可达极显著水平，对肝等组织可达显著水平。
上述实验表明，硒多糖具有较好抗铅作用，可不同程度减低小鼠各组织中铅含量，迅速增加各组织中的硒含量，表明硒多糖具有对抗铅毒性作用。为寻求解决目前由于铅污染对人体危害的预防提供了一条新途径。
Claims (1)
1.一种黄伞菌丝体富硒培育及黄伞硒多糖提取工艺，其特征在于包括以下方法步骤：
(1)黄伞菌种的活化
将由土豆200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml组成的培养基，装入规格为180×80的试管内，封口、灭菌、摆斜面，培养基冷却后，在无菌条件下，将冷藏保存的黄伞菌母种转接活化，在25℃下进行菌种的扩大培养；
(2)液体培养种子的制备
按马铃薯100g、麦麸50g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g和蒸馏水1000ml的配比制备液体培养基，分装于500ml的三角瓶封口后，进行高压灭菌，在0.15MPa、125℃条件下灭菌20min；取出待液体培养基温度降至30℃以下时，按无菌操作规程选取经步骤(1)活化培养后的菌种，接入液体培养基中；每支试管菌种扩接6-8瓶三角烧瓶；将接种后的三角烧瓶置于摇床中进行避光培养，温度为22-26℃，转速为120-160r/min，培养时间为90-120h，待菌丝球呈米粒状并布满培养液时，停止培养，用作液体培养的种子；
(3)种子的扩大培养
在由(2)组成的液体培养基中添加配制成一定浓度的亚硒酸钠母液，调整培养基中硒离子浓度为20-50ppm；将上述培养液装入50-200L液体发酵罐中，装入培养基的体积量为发酵罐容量的70％；经灭菌冷却待培养液温度降到20-30℃时，按无菌操作规程将步骤(2)制备的液体培养种子接种到发酵罐中，接种量为培养液体积的3％-10％；控制培养温度22-26℃，罐压0.01-0.03MPa，通气量0.02-0.04m3/min，培养时间为80-120h，待菌丝球布满培养基时停止培养；
(4)黄伞硒多糖的提取
将扩大培养的获得的菌丝球用蒸馏水清洗3-5次后，加入10倍于菌丝球湿重的蒸馏水进行热水浸提，提取温度为85-100℃，提取时间2-4h；将压滤后的滤液导入浓缩罐中，在0.085-0.095MPa的真空度下，浓缩至原体积的1/3-1/5；浓缩液取出后按1∶2-1∶4比例加入60-95％乙醇，静置一夜，取其沉淀部分，于5000r/min下离心10min，60℃烘干，即得粗黄伞硒多糖。
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