CN114751995A - 一种具有抗炎药效作用的西红花花瓣多糖csp1、制备方法及其应用 - Google Patents
一种具有抗炎药效作用的西红花花瓣多糖csp1、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种具有抗炎药效作用的西红花花瓣多糖CSP1、制备方法及其应用,本发明所获西红花多糖CSP1分子量为110KDa,其主要组成包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等,各组分的摩尔比为8.52:35.69:22.37:5.77:13.56:10.65:3.44。与现有的藏红花花瓣总多糖相比,其具有分子量单一,组成固定,纯度更高等特点。本发明所获多糖为西红花花瓣中获得的首个纯多糖。本发明所用提取分离方法较其他提取方法提取率高,花瓣多糖的纯度高,提取时间短。本发明的多糖具有一定的抗炎活性,且分化减轻程度与多糖浓度呈现一定的正相关,提示西红花花瓣纯化多糖具有进一步开发的价值。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域,尤其涉及一种制备西红花花瓣多糖、提取方法及其用途。
背景技术
炎症是机体对外来物质侵犯的一种防御反应。一般而论,炎症是以防御为主的天然局部反应,对机体是有利的。但炎症反应又是一些疾病的发病基础,如严重的超敏炎症反应可威胁病人的生命。此外,特殊部位或器官所发生的炎症可造成严重后果。目前,以抗生素为代表的抗炎类药物被证实具有较大毒副作用,其使用在一定程度上受到限制。因而,挖掘天然、无毒的植物源抗炎制剂已成为研究热点。
西红花(Crocus sativus L.)为鸢尾科(Iridaceae)番红花属(crocus)植物,以其柱头入药,具有极高的药用和经济价值。西红花是“新浙八味之一”,是建德市的地理标志性农作物。研究表明,在西红花柱头采收过程中,需采集超过17万朵花才能收集1kg番红花柱头,而花瓣等剩余部位则被作为废弃物而抛弃。这造成了极大的资源浪费,同时也限制了西红花的市场价值。现代科学研究表明,西红花花瓣中包含了黄酮、多糖、酚酸等多种生物活性物质,其具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗肿瘤等多种药效作用。这些研究主要以黄酮或多糖的抗氧化性与抗肿瘤研究为主,其中花瓣多糖的药理活性研究鲜有报道。因此,如何挖掘西红花花瓣中多糖的药效作用目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明通过分离提取,从西红花花瓣中获得了一种西红花多糖CSP1,药理活性评价实验证实该多糖具有较好的抗炎作用。
本发明提供了一种西红花花瓣多糖的提取方法,该方法提取率高,花瓣多糖的纯度高,提取时间短,而且能耗低,原料资源丰富,有利于工业化生产。该方法具体包括以下步骤:
(1)将西红花花瓣加入蒸馏水中,油浴提取,得到提取液;
(2)将步骤(1)获得的提取液旋蒸浓缩,加入无水乙醇,静置,离心,得多糖沉淀;
(3)将步骤(2)获得的多糖沉淀复溶,加入Sevage试剂,振摇,离心,保留最上层溶液;
(4)在步骤(3)获得的最上层溶液中加入活性炭,振荡,离心,保留上清液;
(5)将步骤(4)获得的上清液透析过夜,将透析液上样于DEAE阴离子层析柱中,用洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样。
(6)将步骤(5)获得的洗脱样透析过夜并浓缩,将透析液上样于Sephadex G-200凝胶层析柱中,用洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样,浓缩,真空冷冻干燥获得西红花花瓣多糖CSP1。
优选地,步骤(1)中所述西红花花瓣与蒸馏水的质量体积比为1:60,提取温度为100℃,提取次数为3次,提取时间为2h;油浴中的油为甘油。
优选地,步骤(2)中所述的旋蒸条件为水温55℃,转速30r/min。
优选地,步骤(2)中加入无水乙醇,使其终浓度为70%。
优选地,步骤(2)中静置温度为4℃,时间为24h;离心的转速为5000-7000r/min,时间为5-10min。
优选地,步骤(3)中加入的Sevage试剂由氯仿和正丁醇以4:1的体积比组成,加入的体积为多糖溶液的1/4。
优选地,步骤(3)中振摇的时间为10min,离心的转速为8000r/min,时间为15min。
优选地,步骤(3)中加入Sevage试剂,振摇,离心,取最上层溶液,最上层溶液再加入Sevage试剂,重复上诉步骤,共三次,得到溶液1。
优选地,步骤(4)中活性炭的含量为4%,振荡条件为恒温55℃振荡40min,离心转速为8000r/min,时间为20min。
优选地,步骤(5)中的洗脱液为0.1mol/L NaCl溶液。
优选地,步骤(6)中的洗脱液为水。
本发明还提供了一种西红花花瓣多糖,其分子量为110KDa,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等,各组分的摩尔比为8.52:35.69:22.37:5.77:13.56:10.65:3.44(其他成分)。
本发明还提供了一种西红花花瓣多糖的应用,具体地:
采用LPS刺激RAW 264.7细胞制备炎症反应细胞模型,考察纯化多糖给药后对细胞的影响。结果表明其具有一定的抗炎活性,且分化减轻程度与多糖浓度呈现一定的正相关,提示西红花花瓣纯化多糖具有进一步开发的价值。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
(1)本发明所获西红花多糖CSP1分子量为110KDa,其主要组成包括甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖等,各组分的摩尔比为8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65。与现有的藏红花花瓣总多糖相比,其具有分子量单一,组成固定,纯度更高等特点。本发明所获多糖为西红花花瓣中获得的首个纯多糖。
(2)本发明所用提取分离方法较其他提取方法提取率高,花瓣多糖的纯度高,提取时间短。
附图说明
图1紫外可见吸收光谱分析多糖
图2红外吸收光谱分析多糖
图3西红花花瓣多糖CSP1电镜检测结果,其中A-D放大倍数分别为100、300、2000、5000;
图4西红花花瓣多糖CSP1抗炎活性评价。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明确,以下结合实施例对本发明进行进一步阐述,但并不限制本发明的保护范围。
多糖含量的测定:
采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。以葡萄糖为标准品,以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标, 490nm处吸光度为纵坐标,绘制得标准曲线y=1.404*x+0.05518,R2=0.998,线性范围为0~1.0 mg/mL。
提取率为提取的西红花花瓣多糖质量与西红花花瓣质量的百分比,提取纯度为采用苯酚- 硫酸法测得多糖的含量与提取方法制备冷冻干燥得到的西红花花瓣多糖质量的百分比。
实施例1西红花花瓣多糖CSP1的提取与制备
一种西红花花瓣多糖的提取方法,具体操作如下步骤:
(1)取新鲜的西红花花瓣,称重,加入花瓣质量60倍的蒸馏水,油浴提取,温度为100℃,每次提取时间为2h,提取为3次;
(2)将提取液旋蒸浓缩,旋蒸条件为水温55℃,转速30r/min;旋蒸至较少溶液时,加入无水乙醇,使其终浓度为70vol%,4℃条件下沉淀24h,5000r/min离心5min,得多糖沉淀;
(3)将多糖复溶,以多糖溶液:Sevage试剂=4:1(V/V)加入Sevage试剂,Sevage试剂由氯仿和正丁醇以4:1的体积比组成。振摇10min,8000r/min离心15min,取最上层溶液,最上层溶液再加入Sevage试剂,重复上述步骤,共三次,得到溶液1;
(4)按4g/100mL在溶液1中加入活性炭,恒温55℃振荡40min,8000r/min离心20min取上清液2;
(5)将上清液2透析过夜,将透析液上样于DEAE阴离子层析柱中,用0.1mol/L NaCl洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样3。
(6)将洗脱样3透析过夜并浓缩,将透析液上样于Sephadex G-200凝胶层析柱中,用洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样4,浓缩,真空冷冻干燥,即得。苯酚-硫酸法测定,其提取率为39.88%,多糖纯度为87.7%。
实施例2西红花花瓣多糖CSP1的结构表征:
紫外可见吸收光谱的分析:
(1)取少量冻干后的纯化样品,用超纯水复溶,制备成0.22mg/mL的溶液;
(2)使用紫外可见近红外光谱仪UV-3600(日本岛津)在200-700nm范围内测定所制备样品的紫外可见吸收光谱,扫描间距为1nm;
结果(图1)表明在260nm和280nm处无明显吸收峰,说明纯化后的多糖中含有的蛋白质和核酸可忽略不计。
红外吸收光谱的分析:
(1)取少量纯化后的样品与溴化钾粉末混合并制成1mm厚的压片
(2)用傅里叶变换红外光谱仪在4000-400cm-1区域进行测定分析。
结果(图2)显示,所得样品具有多数典型的多糖吸收峰。其中3423cm-1处的吸收峰为羟基(-OH)的伸缩振动吸收峰,2923cm-1处的吸收峰为-CH的伸缩振动吸收峰,1438-1261cm-1处的吸收峰由-CH的变角振动产生;1744cm-1处有吸收峰,表明可能存在糖醛酸结构;917cm-1和832cm-1处的特征吸收峰表明存在α和β构型。
多糖样品扫描电镜分析:
(1)取少量冻干后的纯化样品,减压条件下喷镀一层金原子;
(2)用扫描电子显微镜在2.0kV的加速电压下分别放大100、300、2000、5000倍成像观察样品的形态特征。
结果表明(图3)在100倍电镜下,多糖样品呈不规则的薄片状结构,边缘褶皱,表面有许多大小不一的孔洞;300倍电镜下,多糖表面略微凹凸不平,其上孔洞结构更为明显;2000倍和5000倍电镜下,多糖样品表面光滑,孔洞呈圆形,边缘光滑,结构更为清晰。
实施例3:西红花多糖CSP1的分子量测定
采用高效液相色谱仪(HPLC)和凝胶色谱柱对西红花多糖CSP1进行分子量测定和纯度鉴定。
(1)标准曲线绘制:用分子量为11840、25820、58400、124700、460000、965000、1250450 的葡聚糖制作分子量标准曲线。
(2)样品测定:取适量干燥西红花多糖CSP1样品,溶解于超纯水中,配置成浓度为1mg/mL的糖液。用水系微孔滤膜过滤后上机测定。
(3)HPLC条件:采用凝胶色谱柱(GPC)和示差折光检测器(RID)。柱温为30℃,检测器温度为25℃。流动相为超纯水,流速1.0mL/min,进样量为10μL。
结果表明多糖的相对分子量为110kDa。
实施例4:西红花多糖CSP1的单糖组成分析
1、流动相配置:
流动相A(0.1mol/L磷酸盐缓冲液):取KH2PO4 13.6g,加水1L溶解,滴加NaOH溶液调节pH值至6.85,抽滤,超声脱气,即得;
流动相B(ACN):乙腈
2、标准品溶液配置:
2.1标准品储备液:分别称取葡萄糖、鼠李糖等糖分子标准品约30mg,超纯水5ml使溶解,得各单糖母液浓度约为6mg/ml,备用;
2.2标准品混合溶液母液:分别取各标准品母液1ml,混匀,即得标准品混合溶液;
2.3标准品线性溶液:分别取混合溶液母液适量,稀释成系列浓度得混合对照品工作溶液;
3、供试品溶液制备:
3.1待检样品水解:取待检样品10mg至具塞试管中,加2mol/L三氟乙酸2mL,混匀,盖紧,于110℃烘箱中水解5h,取出后,水解液旋干(或通风橱内蒸发皿挥干),加甲醇洗涤,并旋干,重复加甲醇旋干3次,挥去三氟乙酸,加适量超纯水溶液,并定容至10ml,备用。
3.2单糖衍生:取步骤2.2、2.3、3.1各工作溶液500μL,置具塞试管中,加0.5mol/L氢氧化钠200μL,混匀,加0.5mol/L PMP-甲醇溶液500μL,盖紧混匀,置70℃水浴1h,取出,加0.5mol/L盐酸200μL,混匀。加三氯甲烷1mL,涡旋振荡萃取1min,3000r/min离心5min,弃去下层三氯甲烷,水层用三氯甲烷重复萃取2次,除去多余得PMP试剂,取上清液,过 0.22μm微孔滤膜,得衍生后进样供试品。
4、液相条件
选取通用性C18型色谱柱(250mm 4.6μm);梯度洗脱,洗脱程序如下表,检测波长250nm,流速1.0mL/min,柱温箱25℃,进样量10μL。
流动相洗脱程序
液相分析显示西红花多糖CSP1主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖,葡萄糖,半乳糖,阿拉伯糖组成,含量比为:8.31:1.73:43.97:3.77:31.56:10.65,剩余摩尔含量为其他成分。
实施例5:西红花多糖CSP1抗炎活性评价
1、RAW264.7细胞培养
将RAW 264.7细胞置于含有10%FBS、1%青链霉素混合液的DMEM的完全培养基,于37℃、5%CO2培养箱中培养放置,当细胞达到80-90%汇合度时,进行消化传代。
2、西红花多糖CSP1的抗炎活性
(1)将RAW 264.7以3×105个/孔的密度接种于96孔板中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24h待细胞完全贴壁后进行分组。(2)试验分为空白对照组、LPS模型组、LPS+CSP1(0.125、0.25、0.5、1mg/mL)组,LPS浓度为2μg/mL,每组设4个复孔。(3)细胞培养 24h后,弃去上清液,加入含以上药物的培养基,37℃、5%CO2培养箱中培养24h(LPS+CSP1 组在CSP1给药后2h,加入LPS刺激22h),显微镜下对细胞进行形态学检测。
3、结果如图4显示,空白对照组的细胞呈圆形、椭圆形的正常形态,LPS模型组的细胞分化严重,LPS+CSP1组的细胞分化明显减轻,且分化减轻程度与CSP1浓度呈现一定的正相关,尤其当CSP1浓度为1mg/mL时,效果明显。结果表明纯化后的西红花多糖CSP1有一定的抗炎活性,具有进一步开发的价值。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有抗炎药效作用的西红花花瓣多糖CSP1的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将西红花花瓣加入蒸馏水中,油浴提取,得到提取液;
(2)将步骤(1)获得的提取液旋蒸浓缩,加入无水乙醇,静置,离心,得多糖沉淀;
(3)将步骤(2)获得的多糖沉淀复溶,加入Sevage试剂,振摇,离心,保留最上层溶液;
(4)在步骤(3)获得的最上层溶液中加入活性炭,振荡,离心,保留上清液;
(5)将步骤(4)获得的上清液透析过夜,将透析液上样于DEAE阴离子层析柱中,用洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样。
(6)将步骤(5)获得的洗脱样透析过夜并浓缩,将透析液上样于Sephadex G-200凝胶层析柱中,用洗脱液洗脱纯化柱,收集洗脱样,浓缩,真空冷冻干燥获得西红花花瓣多糖CSP1。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述西红花花瓣与蒸馏水的质量体积比为1:60,提取温度为100℃,提取次数为3次,每次提取时间为2h;油浴中的油为甘油。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的旋蒸条件为水温55℃,转速30r/min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中加入无水乙醇,使其终浓度为70vol%。静置温度为4℃,时间为24h;离心的转速为5000-7000r/min,时间为5-10min。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中加入的Sevage试剂由氯仿和正丁醇以4:1的体积比组成,加入的体积为多糖沉淀复溶溶液的1/4。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中采用多次加入Sevage试剂,振摇,离心,保留最上层溶液;振摇的时间为10min,离心的转速为8000r/min,时间为15min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中加入的活性炭的质量体积比为4%,振荡条件为恒温55℃振荡40min,离心转速为8000r/min,时间为20min。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中的洗脱液为0.1mol/L NaCl溶液。步骤(6)中的洗脱液为水。
9.一种权利要求1-8任一项制备方法制备获得的西红花花瓣多糖。
10.一种权利要求9所述西红花花瓣多糖在制备抑制抗炎活性药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220715 |
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