CN117209618A

CN117209618A - 黄精纯化多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117209618A
Application number: CN202311061323.7A
Authority: CN
Inventors: 杜志云; 乔西凤; 林展乐; 马丛伟; 黄菁霞; 江岭; 张勇民
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2023-08-22
Filing date: 2023-08-22
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明属于天然高分子材料技术领域，具体涉及一种黄精纯化多糖及其制备方法和应用。本发明的黄精纯化多糖的糖苷键组成包括：→2,6)‑Galp‑(1→，→2,3)‑Manp‑(1→，→2,4)‑Manp‑(1→，T‑Manp，→2)‑Manp‑(1→，→2)‑Araf‑(1→以及→3)‑Xylp‑(1→；其中的阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖的摩尔比为4.13：1.82：0.18：0.14；其分子量分布在1000～20000Da内，分子量集中在12977Da。本发明的黄精纯化多糖具有分子量单一，组成固定，纯度高的特点。经实验证实，本发明的黄精纯化多糖没有明显的细胞毒性，对细胞活性影响相对较小，而且能够抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌NO，表明其具有良好的抗炎功效，且安全无毒性。

Description

黄精纯化多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然高分子材料技术领域，具体涉及一种黄精纯化多糖及其制备方法和应用。

背景技术

黄精，又名龙衔、白及、兔竹、垂珠，生于海拔在800-2800米的树林下、灌木丛以及山的阴面处，在整个温带北半球如中国，日本以及北美等地区均有种植。黄精，其化学成分较复杂，包括多糖、黄酮、木质素、甾体、皂苷、氨基酸和生物碱等，其中多糖是其主要成分之一。研究表明，黄精多糖具有一定的抗氧化、调节免疫力、抗疲劳、调节血糖血脂、抗菌抗炎等作用。但是，由于黄精多糖的组成复杂，通过水提、醇沉等简单的分离提取方法得到的黄精粗多糖在以上方面的功效并不显著。因此，需要针对性地分离提取黄精中的多糖成分，以获得在某一方面具有良好效果的黄精多糖，为研制开发黄精功能性保健食品、药品或化妆品创造条件。例如，现有技术CN111978427A公开了一种黄精多糖的提取方法，该提取方法包括步骤：S1：称取干燥的黄精饮片，粉碎，加入蒸馏水浸泡24h；S2：按一定料液比加入蒸馏水，回流提取后离心、浓缩；S3：在浓缩液中加入95％乙醇，过夜，离心，冷冻干燥得粗多糖；S4：取黄精粗多糖，溶解，与氯仿-正丁醇混合后，剧烈振摇30min，蛋白质变性生成凝胶状，离心除去中间层的变性蛋白；S5：向黄精多糖溶液中加入活性炭，脱色，其间每10min搅拌1次，向提取液中加入无水乙醇，使混合液中乙醇浓度达到80％，静置过夜，离心，冷冻干燥即可。提取的黄精多糖在黄精多糖浓度为6mg/mL的时候，对DPPH的清除率为59％，对羟基自由基的清除率为47％，表现了良好的抗氧化能力。

黄精多糖组成复杂，不同的分子量，不同的单糖组成，以及不同的连接方式等因素都可能造成多糖的活性不同。因此，分离纯化制备黄精中活性多糖并对其结构进行表征，对于黄精资源的开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种黄精纯化多糖，本发明的第二个目的在于提供该黄精纯化多糖的制备方法，本发明的第三个目的在于提供该黄精纯化多糖的应用。

根据本发明的第一个方面，提供了一种黄精纯化多糖，其化学结构式为：

其中，代表阿拉伯糖，/>代表甘露糖，/>代表木糖，/>代表半乳糖，n₁＝10，n₂＝2，n₃＝2，n₄＝5。

本发明的黄精纯化多糖的糖苷键组成包括：→2,6)-Galp-(1→，→2,3)-Manp-(1→，→2,4)-Manp-(1→，T-Manp，→2)-Manp-(1→，→2)-Araf-(1→以及→3)-Xylp-(1→。

在一些实施方式中，黄精纯化多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖，其中，阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖的摩尔比为4.13：1.82：0.18：0.14。

在一些实施方式中，黄精纯化多糖的分子量分布在1000～20000Da内，分子量集中在12977Da。

在一些实施方式中，黄精纯化多糖的红外图谱的主要伸缩振动吸收峰与附图5所示的红外图谱中的基本一致。

根据本发明的第二个方面，提供了该黄精纯化多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取黄精粉末，按照1:25～50的料液比加入水，搅拌均匀，浸泡24～36h，得到黄精水沫混合液，然后往黄精水沫混合液中加入1-3％(w/v)的酿酒酵母菌BY4741，在28℃、100-200rpm的条件下发酵24～48h，发酵结束后，离心，取上清液，得到黄精多糖发酵液；往黄精多糖发酵液中加入1-3％(w/v)的木瓜蛋白酶，在40-60℃水浴下辅助提取3-6h进行酶解，待酶解结束后，通过在100℃水浴下保持8-12min进行灭酶，得到黄精水提液，然后将黄精水提液冷却至室温，再离心，取上清液，减压浓缩，得到浓缩液，然后按照1:3～5的体积比向浓缩液中加入无水乙醇，在室温下静置过夜，然后离心，收集沉淀，得到黄精沉淀；

(2)将步骤(1)得到的黄精沉淀加水配制成浓度为40～60mg/mL的溶液，得到黄精多糖粗制品溶液，然后向黄精多糖粗制品溶液中加入Sevage试剂除蛋白，振荡静置过夜，然后离心，取上清液，随后将上清液减压浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液添加到大孔树脂中进行脱色处理，用纯水洗脱，收集洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，得到黄精粗多糖；

(3)将步骤(2)得到的黄精粗多糖加水配制成浓度为40～60mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后，得到滤液，再将滤液经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，上样量为柱体积的1.2～1.8％，用NaCl溶液进行洗脱，手动收集洗脱液，然后将洗脱液减压浓缩，得到浓缩液，再将浓缩液冷冻干燥，得到黄精盐洗多糖；

(4)将步骤(3)得到的黄精盐洗多糖加水配制成浓度为40～60mg/mL的溶液，将溶液加入Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱中进行纯化分离，上样量为柱体积的1.2～1.8％，用纯水进行洗脱，手动收集洗脱液，每管收集2mL，收集第28～35管洗脱液，合并后经减压浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液进行透析，得到透析液，然后将透析液冷冻干燥，得到黄精纯化多糖。

步骤(2)中，振荡静置过夜后离心，取上清液，目的是去除Sevage试剂中的氯仿和正丁醇。随后将上清液减压浓缩，目的是为了减少液体体积，提高冻干效率。

步骤(2)中，将浓缩液添加到大孔树脂中，用纯水洗脱具有较高的洗脱效率，且不会引入杂质，因此采用纯水进行洗脱。

步骤(3)中，采用滤膜过滤可以去除黄精粗多糖中比较大的杂质颗粒，提高分离效率。

步骤(3)中，将洗脱液减压浓缩的目的是为了提高冻干效率。

步骤(4)中，减压浓缩的目的是提高透析及冻干效率。

步骤(4)中，透析的目的是去除小分子杂质。

在一些实施方式中，步骤(1)中，发酵结束后，以5000rpm离心20min，取上清液，得到黄精多糖发酵液；将黄精水提液冷却至室温后以3000rpm离心30min，取上清液，减压浓缩，得到浓缩液；静置过夜后以6000r/min离心15min，收集沉淀，得到黄精沉淀；步骤(2)中，振荡静置过夜后以12000r/min离心10min后取上清液。

在一些实施方式中，步骤(2)中，用2BV纯水洗脱，洗脱的流速为20mL/min；步骤(3)中，用2BV浓度为0.3～0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱的流速为15mL/min；步骤(4)中，用2BV纯水进行洗脱，洗脱流速为1mL/min。

在一些实施方式中，步骤(2)中，Sevage试剂是将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1进行混合得到的，Sevage试剂与黄精多糖粗制品溶液的体积比为3:1。

在一些实施方式中，步骤(4)中，将浓缩液过截留分子量为2000Da的透析袋进行透析，透析时间为24h。

根据本发明的第三个方面，提供了该黄精纯化多糖在制备降低NO分泌量和/或抗炎的食品或药品或化妆品中的应用。

本发明的有益效果包括：

本发明的黄精纯化多糖具有分子量单一，组成固定，纯度高等特点。经实验证实，本发明的黄精纯化多糖没有明显的细胞毒性，对细胞活性影响相对较小，而且能够抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌NO，表明其具有良好的抗炎功效，且安全无毒性，可用于抗炎活性产品开发，对于黄精资源的利用和挖掘，具有积极的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03的制备工艺流程图。

图2为本发明实施例1的黄精盐洗多糖HJ-2在Sephadex G-50凝胶色谱柱上的洗脱曲线。

图3为葡萄糖标准曲线。

图4为标准品和本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03的HPLC测定结果。

图5为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03的红外分光图谱。

图6为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03的¹H-NMR谱。

图7为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03的¹³C-NMR谱。

图8为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03完全甲基化后的红外谱图。

图9为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03甲基化的二级质谱图。

图10为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03对RAW264.7细胞增殖的影响结果图。

图11为本发明实施例1的黄精纯化多糖HJ03对RAW264.7细胞分泌NO的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的实验原料和试剂均可从商业渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例的黄精纯化多糖的制备工艺流程图如图1所示。具体地，本实施例的黄精纯化多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将黄精清净，粉碎成粉末，按照1:30的料液比加入水后倒入搅拌机搅拌均匀，浸泡36h，得到黄精水沫混合液，然后往黄精水沫混合液中加入2％(w/v)的酿酒酵母菌BY4741，在28℃、150rpm的条件下发酵36h，发酵结束后，在5000rpm的条件下离心20min，取上清液，得到黄精多糖发酵液。然后往黄精多糖发酵液中加入2％(w/v)的木瓜蛋白酶，在50℃水浴下辅助提取6h进行酶解，待酶解结束后，通过在100℃水浴下保持10min进行灭酶，得到黄精水提液，将黄精水提液冷却至室温，然后于3000rpm的转速下离心30min，取上清液，减压浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液，然后按照1:3的体积比向浓缩液中加入无水乙醇，在室温下静置过夜，然后以6000r/min离心15min，收集沉淀，得到黄精沉淀。

(2)将步骤(1)得到的黄精沉淀加水配制成浓度为50mg/mL的溶液，得到黄精多糖粗制品溶液，然后向黄精多糖粗制品溶液中加入Sevage试剂除蛋白，其中，Sevage试剂是将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1进行混合得到的，Sevage试剂与黄精多糖粗制品溶液的体积比为3:1，振荡静置过夜，然后以12000r/min离心10min后取上清液，随后将上清液在60℃下减压浓缩至浓度为0.1g/mL，得到浓缩液，然后将浓缩液添加到大孔树脂(柱高80cm，内径10cm，装填树脂为1:1的D101和AB-8的混合物)中进行脱色处理，静置吸附12h后用2BV纯水洗脱，流速为20mL/min，收集全部的洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，得到黄精粗多糖。

(3)将步骤(2)得到的黄精粗多糖加水配制成浓度为50mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后，得到滤液，再将滤液经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，上样量为柱体积的1.5％，用2BV浓度为0.5mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速为15mL/min，手动收集全部的洗脱液，然后将洗脱液在60℃减压浓缩至浓度为1g/mL，得到浓缩液，再将浓缩液冷冻干燥，得到黄精盐洗多糖(命名为HJ-2)。

(4)将步骤(3)得到的HJ-2加水配制成浓度为50mg/mL的溶液，将溶液缓慢加入Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱中进行纯化分离，上样量为柱体积的1.5％，用2BV纯水进行洗脱，流速为1mL/min，手动收集洗脱液，每管收集2mL，采用苯酚-硫酸法跟踪测定每管洗脱液的多糖含量，HJ-2在Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱上的洗脱曲线如图2所示，收集第28～35管洗脱液，合并后经60℃减压浓缩至浓度为0.5g/mL，得到浓缩液，然后将浓缩液过截留分子量为2000Da的透析袋透析24h，得到透析液，然后将透析液冷冻干燥，得到黄精纯化多糖，命名为黄精纯化多糖HJ03。

通过苯酚-硫酸法对黄精纯化多糖HJ03的纯度进行检测，葡萄糖标准曲线的绘制方法为：于100℃将无水葡萄糖烘干至恒重，取适量无水葡萄糖配成0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mL的葡萄糖标准溶液，加超纯水补足至2mL，然后分别加入6％现配苯酚溶液1mL、浓硫酸5mL，在室温下密封静置15min后，100℃水浴40min，冷却至室温后，分别取0.2mL至96孔板中，于490nm波长下测定每管吸光度值，并绘制葡萄糖标准曲线。

将黄精纯化多糖HJ03配成0.1mg/mL的溶液，取1mL按照上述步骤进行操作，测定黄精纯化多糖HJ03溶液的吸光度值，通过葡萄糖标准曲线对黄精纯化多糖HJ03的纯度进行计算。所有样品均设置3次重复实验。

葡萄糖标准曲线如图3所示。由图3可知，葡萄糖标准曲线回归方程y＝0.9387x-0.0013，R²＝0.9975。经计算，得到黄精纯化多糖HJ03的纯度为81.83％。

下面，通过实验测定实施例1制得的黄精纯化多糖HJ03的平均相对分子量，分析其单糖组成，解析其糖苷键的种类及连接方式，并进一步验证其活性以及用途。

一、黄精纯化多糖HJ03的化学结构鉴定

1、黄精纯化多糖HJ03的平均相对分子量

采用SEC-RI-MALLS联用系统通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定黄精纯化多糖HJ03的平均相对分子量。用流动相将黄精纯化多糖HJ03溶解配成浓度为1mg/mL的溶液，流动相为0.1M Na₂SO₄溶液。色谱条件为：HQSB 804色谱柱与HQSB 802.5色谱柱串联，流动相为0.1MNa₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min，柱温为35℃，进样量为100μL，系统预校正，用PEG标准的平均分子量的对数绘制曲线，通过校正公式Mw＝∑(RIiMi)/∑RIi计算得到重均分子量(Mw)。经测定，黄精纯化多糖HJ03的平均相对分子量为12977Da。

2、黄精纯化多糖HJ03的单糖组成

按照如下方法分析黄精纯化多糖HJ03的单糖组成，具体步骤如下：准确称取5mg黄精纯化多糖HJ03，放入具塞试管中，加入1.0mL的2mol/L三氟乙酸(TFA)，密封，在110℃下油浴水解6h，冷却后用N₂将残余的TFA吹干，加入少量甲醇，混匀后用N₂吹干，反复3次至TFA除尽，然后在40℃下减压旋蒸，蒸干即得多糖水解产物。

向上述多糖水解产物中依次加入10mg盐酸羟胺以及0.5mL吡啶，振荡混匀，密封，然后于90℃中水浴加热30min，不时振荡，取出冷却后，加入0.5mL乙酸酐，密封，于90℃下继续水浴加热30min，不时振荡。反应停止后，在70℃水浴中用N₂将反应产物吹干，加入1mL三氯甲烷复溶，得到多糖乙酰化样品，取样0.5μL多糖乙酰化样品进行气相色谱分析。

各取2mg标准品单糖(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸)于圆底烧瓶中，加入10mg盐酸羟胺以及0.5mL吡啶，振荡混匀，密封，按照上述多糖水解产物乙酰化的步骤进行单糖样品的乙酰化处理，得到单糖乙酰化样品。

通过色谱柱DB-17分析上述乙酰化样品的单糖组成，操作条件为：色谱柱：DB-17(30m×0.32mm×0.5μm)；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；载气：N₂；进样口温度：280℃；检测器温度：280℃；流速：1mL/min；柱温：190℃。

黄精纯化多糖HJ03的HPLC分析结果如表1和图4所示。从表1和图4可以得出，黄精纯化多糖HJ03主要由阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖构成，且四者的摩尔比为4.13：1.82：0.18：0.14。

表1黄精纯化多糖HJ03的HPLC分析结果

3、黄精纯化多糖HJ03的红外光谱分析

称取1mg黄精纯化多糖HJ03，200mg干燥的KBr，放入研钵中，混合研磨均匀后，用压片机压成透明薄片，以空白KBr片作为空白对照，通过傅立叶变换红外光谱仪对样品进行扫描，扫描波长范围为400～4000cm^-1，分辨率：4cm^-1，扫描次数：16。检测得到黄精纯化多糖HJ03的红外光谱如图5所示。

由图5可以看出，黄精纯化多糖HJ03在波长3421cm^-1处存在—OH伸缩振动吸收峰；在2942cm^-1处产生了C—H伸缩振动吸收峰；在1637cm^-1处有CO伸缩振动吸收峰；在1427cm^-1处均存在C—H变角振动吸收峰；1074cm^-1和822cm^-1为吡喃糖特征吸收，表明此多糖为吡喃糖，其中822cm^-1为α-吡喃型糖苷键。以上结果说明该多糖有α-型吡喃多糖。

4、黄精纯化多糖HJ03的核磁共振波谱分析

称取40mg冻干的黄精纯化多糖HJ03，加入重水(D₂O)溶解，减压旋蒸，干燥，重复上述操作两次，然后将样品再次溶于D₂O中。通过核磁共振光谱仪检测并记录¹H-NMR和¹³C-NMR光谱，结果如图6和图7所示。

黄精纯化多糖HJ03的¹H-NMR谱图如图6所示。从图6可以看出，大部分质子信号出现在3.5-5.5ppm范围内，这是一个典型的多糖特征。¹H-NMR主要用于分析多糖中糖苷键的空间结构形式，通常α-型糖苷键的质子信号大于5ppm，而β-型糖苷键的质子信号小于5ppm。由图6可知，黄精纯化多糖HJ03在大于5ppm范围内有5.18ppm和5.40ppm两个质子信号峰，在小于5ppm处有丰富的质子信号峰，表明黄精纯化多糖HJ03主要含有β-型糖苷键，少量α-型糖苷键。

黄精纯化多糖HJ03的¹³C-NMR谱图如图7所示。从图7可以看出，在δ98.28ppm，δ99.30ppm，δ102.10ppm和δ107.62ppm处出现四个异头碳，分别是阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和木糖的异头碳原子，这与黄精纯化多糖HJ03的多糖组分分析的结果一致。

5、黄精纯化多糖HJ03的甲基化分析

称取10mg黄精纯化多糖HJ03(经P₂O₅干燥24h)于具塞试管中，加入2mL经4A分子筛处理过的二甲基亚砜(DMSO)，室温搅拌至样品完全溶解后，在N₂保护下加入现磨NaOH粉末25mg，冰浴10min至溶液完全冰冻后，逐渐滴入1mL碘甲烷，充入N₂排尽空气，在常温下超声波水浴1h，期间水温控制为18-20℃，加0.5mL纯净水终止甲基化。用3.5mL二氯化碳等体积萃取，用N₂干燥，得到甲基化样品。取适量甲基化样品，然后利用KBr法进行红外检测分析黄精纯化多糖HJ03的甲基化程度。黄精纯化多糖HJ03甲基化后的红外谱图如图8所示，从图8可以看出，样品在3421cm^-1处的羟基吸收峰消失，而在2924.90cm^-1处的甲基吸收峰增强，说明样品已被完全甲基化。

向完全甲基化后的样品中加入2mL 2mol/L的TFA，在110℃下密封后水解4h，冷却后，50℃下减压蒸干，加入2mL甲醇再蒸干，重复3次至过量的TFA除尽。加入3mL纯水溶解，再加入25mg NaBH₄，在室温下振荡还原反应2h，反应完全后，用0.1mol/L冰醋酸调节pH值至5.0，减压蒸发至干，加入3mL甲醇及一滴冰醋酸，再减压蒸干，重复5次直至NaBH₄完全除尽，然后真空干燥6h。

往干燥后的样品加入2mL乙酸酐，超声5min，于100℃下反应2h，取出后减压蒸干。加入3mL甲醇，重复洗涤三次，减压蒸干。然后加入4mL氯仿将乙酰化产物溶解，用纯净水洗涤3次后，氯仿层用3A分子筛干燥，减压浓缩至1mL后进行GC-MS分析。

黄精纯化多糖HJ03的甲基化产物在GC-MS联机分析中的气相色谱图如图9所示。从图9可以看出，黄精纯化多糖HJ03的甲基化产物在GC-MS中出现了七个甲基化衍生物离子峰，其保留时间分别为18.952min、23.856min、23.992min、29.439min、31.630min、32.250min和34.615min。根据离子吸收峰的分布范围可知，糖苷键的连接方式以→2)-Araf-(1→为主，此外含量较高的是→2)-Manp-(1→，这与多糖组分分析的分析结果一致。

二、黄精纯化多糖HJ03的细胞活性实验

1、主要材料及试剂：黄精纯化多糖HJ03(实施例1制备)，胚牛血清(Sigma)，Griess试剂(Sigma)，MTT(Sigma)，脂多糖LPS(Sigma)，CO₂恒温培养箱(美国Thermo公司)，酶标仪(奥地利Tecan公司)，光学倒置显微镜(美国Thermo Scientific公司)。所用PBS溶液的配制方法为：先在容器中准备800mL蒸馏水，然后向蒸馏水中依次加入8g NaCl、200mg KCl、1.44g Na₂HPO₄、240mg KH₂PO₄，将溶液pH调节至7.4，然后加入蒸馏水直至溶液体积为1L。

2、黄精纯化多糖HJ03在RAW264.7细胞中细胞毒性作用

将RAW264.7细胞以1×10³个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL。在5％CO₂、37℃下培养24h后，吸除旧培养液，将细胞分成7组，分别为空白对照组及不同浓度黄精纯化多糖HJ03的多糖组。每组分别加入200μL含0、5、25、125、250、500、1000μg/mL黄精纯化多糖HJ03的培养液，重复三次，培养24h。吸去培养液，加入100μL PBS溶液吹洗并吸除。在避光环境下，每孔加入200μL 0.5mg/mL的MTT溶液，37℃培养4h。4h后除去MTT溶液，加入200μLDMSO，振荡15min，在490nm处测量吸光度值并计算出细胞存活率，结果如图10所示。

从图10可以看出，各多糖组的RAW264.7巨噬细胞活力与空白对照组相比均无显著性差异，表明不同浓度梯度(0-1000μg/mL)的黄精纯化多糖HJ03对RAW264.7巨噬细胞活力的影响均较小，无明显的细胞毒性。因为125-500μg/mL的多糖组的细胞活性较高，该浓度范围内的多糖对细胞活性影响相对较小。因此，选取浓度为125-500μg/mL的黄精纯化多糖进行后续NO水平检测实验。

3、黄精纯化多糖HJ03对RAW264.7细胞的NO分泌量的影响

将RAW264.7细胞以1×10³个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔100μL。在5％CO₂、37℃下培养24h后，吸除旧培养液，将细胞分成6组：对照组(Control组)、模型组(简称LPS组)、阳性对照组(简称RPXP组)以及3个实验组，实验组包括HJ03-L组、HJ03-M组和HJ03-H组。

对照组加入200μL培养液；模型组加入含1μg/mL LPS的培养液200μL；阳性对照组加入含有1μg/mL LPS和20μg/mL乳癖消片的培养液200μL；HJ03-L组加入含有1μg/mL LPS和浓度为125μg/mL黄精纯化多糖HJ03的培养液200μL；HJ03-M组加入含有1μg/mL LPS和浓度为250μg/mL黄精纯化多糖HJ03的培养液200μL；HJ03-H组加入含有1μg/mL LPS和浓度为500μg/mL的黄精纯化多糖HJ03的培养液200μL。培养24h，收集细胞液。在96孔板中加入细胞液样品50μL以及Griess ReagentⅠ液及Ⅱ液各50μL，混匀并振荡5min，用酶标仪于540nm处测定吸光度，测定结果如图11所示，图中，与对照组相比，^###p<0.0001；与LPS组相比，^**p<0.01，^***p<0.001。

从图11可以看出，LPS对RAW264.7巨噬细胞产生较大的细胞损伤，具有较强的细胞毒性，显著降低细胞活力；黄精纯化多糖HJ03能够抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响，可以显著降低NO的分泌，减少细胞毒性损伤，保护细胞免受损伤，由此可见黄精纯化多糖HJ03具有良好的抗炎功效。在125-500μg/mL的浓度范围内，随着黄精纯化多糖HJ03的浓度逐渐增加，NO生成量逐渐减少，在黄精纯化多糖HJ03的浓度为500μg/mL时，NO的分泌量最少。

综上，本发明制备的黄精纯化多糖HJ03没有明显的细胞毒性，对细胞活性影响相对较小，而且能够抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌NO，表明其具有良好的抗炎功效，且安全无毒性。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.黄精纯化多糖，其特征在于，其化学结构式为：

2.根据权利要求1所述的黄精纯化多糖，其特征在于，其糖苷键组成包括：→2,6)-Galp-(1→，→2,3)-Manp-(1→，→2,4)-Manp-(1→，T-Manp，→2)-Manp-(1→，→2)-Araf-(1→以及→3)-Xylp-(1→。

3.根据权利要求1或2所述的黄精纯化多糖，其特征在于，其单糖组成包括阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖，所述阿拉伯糖、甘露糖、木糖和半乳糖的摩尔比为4.13：1.82：0.18：0.14。

4.根据权利要求1或2所述的黄精纯化多糖，其特征在于，所述黄精纯化多糖的分子量分布在1000～20000Da内，分子量集中在12977Da。

5.根据权利要求1或2所述的黄精纯化多糖，其特征在于，所述黄精纯化多糖的红外图谱的主要伸缩振动吸收峰与附图5所示的红外图谱中的基本一致。

6.权利要求1～5任一项所述的黄精纯化多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)称取黄精粉末，按照1:25～50的料液比加入水，搅拌均匀，浸泡24～36h，得到黄精水沫混合液，然后往黄精水沫混合液中加入1-3％的酿酒酵母菌BY4741，在28℃、100-200rpm的条件下发酵24～48h，发酵结束后，离心，取上清液，得到黄精多糖发酵液；往黄精多糖发酵液中加入1-3％的木瓜蛋白酶，在40-60℃水浴下辅助提取3-6h进行酶解，待酶解结束后，通过在100℃水浴下保持8-12min进行灭酶，得到黄精水提液，然后将黄精水提液冷却至室温，再离心，取上清液，减压浓缩，得到浓缩液，然后按照1:3～5的体积比向浓缩液中加入无水乙醇，在室温下静置过夜，然后离心，收集沉淀，得到黄精沉淀；

7.根据权利要求6所述的黄精纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵结束后，以5000rpm离心20min，取上清液，得到黄精多糖发酵液；将黄精水提液冷却至室温后以3000rpm离心30min，取上清液，减压浓缩，得到浓缩液；静置过夜后以6000r/min离心15min，收集沉淀，得到黄精沉淀；步骤(2)中，振荡静置过夜后以12000r/min离心10min后取上清液。

8.根据权利要求6或7所述的黄精纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，用2BV纯水洗脱，洗脱的流速为20mL/min；步骤(3)中，用2BV浓度为0.3～0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱的流速为15mL/min；步骤(4)中，用2BV纯水进行洗脱，洗脱流速为1mL/min。

9.根据权利要求8所述的黄精纯化多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Sevage试剂是将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1进行混合得到的，所述Sevage试剂与黄精多糖粗制品溶液的体积比为3:1。

10.权利要求1～5任一项所述的黄精纯化多糖在制备降低NO分泌量和/或抗炎的食品或药品或化妆品中的应用。