CN114933662B - 一种忍冬藤多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种忍冬藤多糖及其制备方法和应用。本发明所述的忍冬藤多糖，由1,3,6‑β‑D‑Galp,1,4‑α‑D‑Glcp,1,4,6‑α‑D‑Glcp,1,5‑α‑L‑Araf,1,4‑β‑D‑Galp,1,2‑α‑L‑Rhap,1,2,4‑α‑L‑Rhap和1,4‑α‑D‑GalpA‑6‑OMе构成，以摩尔比计，Glc:GalA:Ara:Gal:Rha＝3.89:2.49:1.87:1.51:1.00；所述的忍冬藤多糖，Mw为7.0kDa，Mn为6.6kDa，分散系数为1.06。本发明的忍冬藤多糖，结构新颖，是首次分离得到；其制备方法简单、适用，该产品可用于制备抗类风湿性关节炎药物在临床上应用。

Description

一种忍冬藤多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种忍冬藤多糖及其制备方法和应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种进行性自身免疫疾病，以关节滑膜增生、慢性炎症和血管翳形成为主要特征，致残率较高。传统中医学将RA归属于“痹症”范畴，《素问·痹论》曰：“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”。现代医学认为，成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)是RA发病过程中主要的效应细胞，受炎症因子刺激而被激活的FLS表现出过度增殖、凋亡不足、持续分泌炎症因子、侵袭性迁移以及黏附性增强等现象，这是造成软骨破坏的关键因素。因此，抑制滑膜增生、减轻滑膜炎症反应已经成为控制RA病程的主要策略。现代临床中常用于治疗类风湿性关节炎的药物包括非甾体类抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、类固醇、糖皮质激素等。然而，这些抗炎药物有着明显毒副作用，会引起胃肠道溃疡、急性肾衰竭、肝脏毒性反应，诱发血栓、心肌梗死、过敏性皮炎等，甚至导致癌症。一些新兴的免疫抑制剂和生物制剂虽然效果显著，但成本昂贵，普通大众难以承受。因此，开发安全有效、副作用小、价格低廉的抗类风湿性关节炎新药迫在眉睫。近年来，许多从自然资源中分离出的天然产物因其新颖的化学结构和显著的生物活性而备受关注，尤其是具有调节人体机能活性的多糖类物质(polysaccharide)。
忍冬藤(Lonicerae Japonicae Caulis)为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥茎枝，具有清热解毒、疏风通络等功效，主治温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛等，在治疗类风湿性关节炎时经常应用。目前，关于忍冬藤的化学成分研究主要集中在黄酮、酚酸、挥发油、萜类等小分子物质上，对于多糖这类大分子物质的研究鲜有报道。李振等通过响应面法优化了忍冬藤多糖的超声提取工艺，评价了其清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的功能。刘蕾等使用Sephadex G200分离出忍冬藤多糖，并通过体内和体外实验证明其具有良好的抗氧化能力。不足的是，关于忍冬藤多糖的结构至今未见报道，而多糖是否是忍冬藤发挥抗类风湿性关节炎作用的药效物质也未明确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有药用价值的忍冬藤多糖及其制备方法和应用。本发明的忍冬藤多糖，结构新颖，是首次分离得到；其制备方法简单、适用。该产品可用于制备抗类风湿性关节炎药物在临床上应用。
本发明采用以下技术方案：
一种忍冬藤多糖，其特征在于，由1,3,6-β-D-Galp,1,4-α-D-Glcp,1,4,6-α-D-Glcp,1,5-α-L-Araf,1,4-β-D-Galp,1,2-α-L-Rhap,1,2,4-α-L-Rhap和1,4-α-D-GalpA-6-OMе构成，其结构式如下：
所述忍冬藤多糖中，以摩尔比计，Glc:GalA:Ara:Gal:Rha＝3.89:2.49:1.87:1.51:1.00；所述的忍冬藤多糖，Mw为7.0kDa，Mn为6.6kDa，分散系数为1.06。
本发明还提供了所述忍冬藤多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)前处理：将新鲜采集的忍冬藤洗净后晒干，粉碎成粗粉，加入无水乙醇，回流提取，于通风处自然晾干，得忍冬藤脱脂粉备用；
(2)提取：将忍冬藤脱脂粉中加入蒸馏水，浸泡过夜，提取，过滤，合并滤液，浓缩；将浓缩后的滤液离心后收集上清液；加入无水乙醇，醇沉，离心，冷冻干燥，得到忍冬藤总多糖粗品；
(3)脱蛋白：采用三氯乙酸法对忍冬藤总多糖粗品进行脱蛋白处理，离心，取上清液，透析，冷冻干燥，得到忍冬藤粗多糖；
(4)阴离子交换柱层析：将忍冬藤粗多糖溶解后经DEAE-纤维素柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集不同浓度洗脱液得到的洗脱峰，各洗脱组分经浓缩，透析，冷冻干燥后，得到固体样品，分别命名为CLJP-1、CLJP-2、CLJP-3；
(5)凝胶柱层析：将CLJP-2组分用NaCl溶液溶解，离心，取上清液；然后，凝胶柱色谱分离，收集洗脱峰，洗脱组分经浓缩，透析，冷冻干燥，收集固体样品，得忍冬藤多糖。
步骤(1)中，粗粉与无水乙醇的质量体积比为1g：5mL；提取时间为2h。
步骤(2)中，忍冬藤脱脂粉与蒸馏水的质量体积比为1g：10mL，提取温度为90℃，提取时间为每次3h，提取三次；离心速度为4000rpm，离心时间为15min；上清液与无水乙醇的体积比为1:4，醇沉温度为4℃，醇沉时间为48h。
步骤(3)中，脱蛋白处理的具体过程为：将忍冬藤总多糖粗品配置成200mg/mL的溶液，边搅拌边加入等体积5％的TCA溶液，置于4℃条件下静置24h。
步骤(4)中，所述DEAE-纤维素柱层析的条件为：采用预先平衡好的DEAEcellulose-52进行分级层析，依次使用0、0.1、0.5mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速为1.5mL/min。
步骤(5)中，所述的凝胶柱为预先平衡好的Sephadex G75柱，凝胶柱层析条件为：洗脱液为0.1mol/L的NaCl，流速为0.15mL/min。
本发明所述的忍冬藤多糖可以用于制备抗类风湿性关节炎药物。
本发明所述的忍冬藤多糖，是首次从忍冬藤中分离获得，结构新颖。
研究发现，忍冬藤多糖CLJP-2b可以在体外对TNF-α诱导的RA-FLS的功能产生显著影响，不仅可以抑制其增殖、炎症因子IL-6和IL-1β的分泌、削弱其迁移和粘附能力还能促进其凋亡，初步展现了在体外的抗类风湿性关节炎活性，表明多糖类组分是忍冬藤治疗RA的有效成分之一。可用于抗类风湿性关节炎药物药物中。此活性多糖在本发明之前未见报道。
附图说明
图1为CLJP-2b分子量分布图；
图2为CLJP-2b紫外扫描图；
图3为标准单糖与CLJP-2b单糖组成色谱图；
图4为CLJP-2b红外光谱图；
图5为羧基还原CLJP-2b的PMAAs总离子流图；
图6为CLJP-2b的1H-NMR谱图，其中，∫1表示酯化半乳糖醛酸单元的H-1和H-5信号，∫2表示非酯化半乳糖醛酸单元的H-5信号；
图7为CLJP-2b的13C-NMR谱图；
图8为CLJP-2b的COSY谱图；
图9为CLJP-2b的HMBC谱图；
图10为CLJP-2b的HSQC谱图；
图11为CLJP-2b的NOESY谱图；
图12为FLS的荧光免疫阳性图；
图13为CLJP-2b在不同时间点对TNF-α诱导的RA-FLS增殖的影响(n＝6)，与对照组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01；
图14为CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS凋亡的影响(n＝3)，A为Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡；B为细胞凋亡率，与对照组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01；
图15为CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS炎症因子IL-6(A)、IL-1β(B)分泌的影响(n＝3)，与对照组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01；
图16为CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS迁移能力的影响(n＝3)，A为Transwell检测细胞迁移；B为细胞迁移数目，与对照组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01；
图17为CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS粘附能力的影响(n＝3)，A为细胞粘附数量的显微观察图；B为细胞粘附能力，与对照组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01；
图18为CLJP-2b的HPGPC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1
忍冬藤多糖的制备，它包括以下步骤：
(1)前处理
由于忍冬藤中存在大量色素及脂溶性小分子物质，会对提取多糖的品质产生影响，故在提取前需要进行脱脂处理，以减少杂质含量。将新鲜采集的忍冬藤洗净后晒干，粉碎成粗粉，按料液比1︰5(m/v)加入无水乙醇，60℃回流提取2h，于通风处自然晾干，备用。
(2)提取
称取3kg忍冬藤脱脂粉，以1︰10的料液比加入蒸馏水，浸泡过夜，90℃提取3h，16层纱布过滤，提取3次，合并滤液。将浓缩后的滤液离心(4000rpm，15min)后收集上清液。随后，加入4倍量无水乙醇，在4℃下醇沉48h，再经过离心，冷冻干燥，得到忍冬藤总多糖粗品。
(3)脱蛋白
采用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法对忍冬藤总多糖粗品进行脱蛋白处理。首先将忍冬藤粗多糖配置成200mg/mL的溶液，边搅拌边加入等体积5％的TCA溶液，置于4℃条件下静置24h。然后，离心，取上清液，透析48h(截留分子量为3500kDa)，冷冻干燥，得到忍冬藤粗多糖CLJP。
(4)阴离子交换柱层析
称取500mg忍冬藤粗多糖，复溶于蒸馏水中，用涡旋仪使其充分溶解，配置成20mg/mL溶液，离心(9000rpm,10min)，取上清液。随后，用预先平衡好的DEAE cellulose-52(5.5cm×50cm)进行分级层析，依次使用0、0.1、0.5mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，自动组分收集器收集，流速为1.5mL/min，每管收集10mL。使用苯酚硫酸法测定每管溶液在490nm处的吸光度值，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集不同浓度洗脱液得到的洗脱峰。各洗脱组分经过旋转蒸发仪浓缩，透析(截留分子量为3500kDa)，冷冻干燥后，得到固体样品，分别命名为CLJP-1、CLJP-2、CLJP-3。
(5)凝胶柱层析
Sephadex G75凝胶柱色谱分离：称取一定质量的CLJP-2组分，用0.1mol/L的NaCl溶液配制成5mg/mL的样品溶液，充分溶解后离心(9000rpm，10min)，弃掉沉淀，取上清液。然后，滴加于预先平衡好的Sephadex G75(1.6×100cm)柱床表面，用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱、分离(0.15mL/min)。使用苯酚硫酸法测定每管溶液在490nm处的吸光度值，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集洗脱峰。洗脱组分经过旋转蒸发仪浓缩，透析(截留分子量为3500kDa)脱盐，冷冻干燥后，收集固体样品，分别命名为CLJP-2a和CLJP-2b，CLJP-2b即忍冬藤多糖。
实施例2
分子量分布及均一性测定
用0.1mol/mL的NaNO3将干燥的CLJP-2b配制成1mg/mL的样品溶液，并用0.45μm微孔滤膜过滤，然后进样分析。
采用凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统(GPC-RI-MALLS)，配备三根串联的凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)，Ohpak SB-803HQ(300×8mm))，柱温设置45℃，进样量100μL，流动相为0.1mol/mL的NaNO3，流速0.4mL/min，在分子计算过程中，dn/dc的值为0.141mL/g。
记录色谱峰如图1，从图1中可以看到4种主要的信号峰，按照保留时间顺序分别命名为Peak 1、Peak 2、Peak 3和Peak 4。其中，Peak 1显示出巨大的LS信号，但没有明显的RI信号，表明Peak 1是一种分子量巨大但在CLJP-2b中含量极低的物质。Peak 2在LS和RI信号中都表现出单一的对称峰，且分散系数为1.06，说明其是均一性极好的多糖组分。Peak 3和Peak4则显示出RI信号，没有LS信号，说明这两种物质属于含量较低的寡糖碎片。在这4种物质中，Peak 2相对含量为90.6％，可以认为是CLJP-2b的主要均一性成分，Mw为7.0kDa，Mn为6.6kDa。
实施例3
紫外光谱分析
将干燥的CLJP-2b样品用蒸馏水配制成1mg/mL的溶液，使用紫外分光光度计在190～400nm波长范围内进行扫描。CLJP-2b的紫外扫描图如图2所示。在260nm和280nm处曲线较为平顺，未检测到明显吸收峰，这说明CLJP-2b中几乎不含核酸及蛋白质类物质。
实施例4
单糖组成分析及总糖含量测定
(1)标准溶液配制
精密称取单糖标准品(岩藻糖、古罗糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖醛酸、半乳糖、核糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)各10mg，用蒸馏水定容于10mL容量瓶中，配制成1mg/mL的混合标准溶液。将混合标准溶液稀释成0.01mg/mL的标准母液，接着进行逐级稀释，在浓度范围0.4～40μg/mL进样检测，绘制各单糖标准曲线。
(2)样品溶液配制
精密称取5mg CLJP-2b，加入1mL三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，2mol/L)，在121℃下水解2h，氮气吹干，并用甲醇反复清洗3～5次，再吹干。随后，加入纯水溶解，转入色谱瓶中，进样检测。通过与混合标准溶液中各单糖保留时间对比，定性分析单糖种类，并根据标准曲线计算CLJP-2b中各单糖的含量。
(3)色谱参数
色谱系统采用Thermo ICS5000离子色谱系统，配备DionexTMCarboPacTMPA20(150×3.0mm，10μm)色谱柱，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。进样量5μL，流速0.5mL/min；柱温设置30℃，洗脱梯度如表1所示。
表1离子色谱洗脱梯度
注：流动相A(0.1MNaOH)，流动相B(0.1MNaOH，0.2MNaAc)。
(4)总糖含量测定
标准曲线绘制：按照单糖组成比例Glc:GalA:Ara:Gal:Rha＝3.89:2.49:1.87:1.51:1.00配制并稀释成一系列浓度分别为0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1mg/mL的混合标准溶液。根据苯酚-硫酸法绘制标准曲线。
多糖样品含量测定：精密称取干燥至恒重的CLJP-2b适量，用适量蒸馏水溶解，使用苯酚-硫酸法测定吸光度值并带入标准曲线，计算总糖含量。
通过与标准单糖色谱图(图3)进行对比可以看出，CLJP-2b是一种杂多糖，主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖组成，根据标准曲线计算得出各单糖相应的摩尔比为Glc:GalA:Ara:Gal:Rha＝3.89:2.49:1.87:1.51:1.00。标准单糖的标准曲线信息汇总在表2中。根据所得单糖组成摩尔比，配制相应的混合单糖标准品，利用苯酚硫酸法测定得到总糖含量为91.2％。
表2标准曲线信息
实施例5
红外光谱分析
取2mg干燥的CLJP-2b，与干燥的200mg KBr粉末混合，研磨均匀。用压片机将混合物压制成薄片，放置于傅里叶红外光谱仪中进行红外扫描，扫描波长范围4000～400cm-1。
如图4所示，CLJP-2b具有多个多糖特征吸收峰：3405cm-1处存在强且宽的吸收峰，为多糖分子间或分子内氢键O-H伸缩振动的强吸收峰，与多糖水溶性有关；2933cm-1附近的中等强度尖峰为甲基(-CH3)和次甲基(-CH2)的C-H伸缩振动吸收峰；糖醛酸的特征结构导致红外光谱中1732cm-1出现吸收峰；1609cm-1处的吸收峰为-COO-的不对称伸缩振动导致的；1450-1200cm-1的吸收峰1417cm-1、1335cm-1,1236cm-1为C-H的变角振动吸收峰，它和C-H的伸缩振动构成了糖环的特征吸收；1147cm-1为吡喃糖C-O-C的伸缩振动；1150-1010cm-1之间的3个强吸收峰，1078cm-1、1046cm-1和1024cm-1处再次证明了吡喃糖苷的存在，这3处的吸收为C-O-H或C-O-C结构中C-O键的弯曲振动；895cm-1为β-吡喃糖苷键的特征区域，推测为多糖中含有β型吡喃糖；833cm-1为吡喃糖α-端基差向异构体的C-H变角振动峰；760cm-1显示吡喃环的对称环伸缩振动峰。这些结果与单糖组成分析相互验证，表明CLJP-2b是一种含有β-和α-吡喃糖的酸性多糖。
实施例6
甲基化分析
(1)多糖衍生化处理
羧基还原：精密称取10mg干燥的CLJP-2b，溶解于1mL一级水中，加入1mL1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(100mg/mL)，反应2h。随后，加入1mL咪唑(2M)，再加入1mLNaBH4或NaBD4(30mg/mL)，反应3h，再加入100μL乙酸终止反应。将样品透析48h，冷冻干燥。
甲基化和水解：将样品用500μL DMSO溶解，加入1mg NaOH，孵育30min，再加入50μL碘甲烷溶液，反应1h。接着，加入1mL水和2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃去水相，如此反复水洗3次。之后，吸取下层二氯甲烷相并蒸干，充入氮气密封，加入100μL TFA(2M)，在121℃条件下反应90min，蒸干剩余TFA。
还原和乙酰化：水解完成后，向样品中依次加入50μL氨水(2M)和NaBD4(1M)，混匀，反应2.5h。随后，加入20μL乙酸终止反应，用氮气吹干，再加入甲醇洗涤2次，吹干。然后，加入乙酸酐250μL，混匀，在100℃下反应2.5h。接着，加入1mL水静置10min，再加入500μL二氯甲烷，振荡混匀，离心后取有机相，如此反复水洗3次。最后，吸取二氯甲烷相，经微孔滤膜过滤后，使用GC-MS系统进样检测。
(2)色谱参数
使用Agilent气相色谱系统，进样量1μL，分流比10︰1，载气为高纯氦气，初始温度为140℃，保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3min。
(3)质谱参数
质谱采用Agilent四极杆质谱检测系统，用电子轰击离子源(EI)，全扫描(SCAN)模式，质量扫描范围(m/z):30～600。
如图5所示，Glc残基主要以1,4-Glcp键的形式存在，并伴有少量的t-Glcp和1,4,6-Glcp键。Gal残基中的主要连接类型是1,4-Galp(大多数来自1,4-GalpA)和1,3,6-Galp。用NaBD4还原糖醛酸后，根据m/z 233:235的面积计算出1,4-Galp和总1,4-GalpA的比例为1︰4。Ara残基主要由1,5-Araf和t-Araf组成。此外1,2-Rhap和1,2,4-Rhap也被发现。CLJP-2b中糖苷键的主要类型是→4)-GalpA-(1→和→4)-Glcp-(1→占所有单糖残基的60.48％，表明半乳糖醛酸和葡萄糖可能是主链构型的主要部分。详细的甲基化数据汇总在表3中，其中非还原末端的比例高于分支点，这可能是由于低聚糖片段的存在造成的。此外，一些甲基化峰的特征并不明显，不能被准确归属于某种PMMAs，这些峰可能是甲基化不足或在漫长的柱前衍生化过程中引入的。通过甲基化分析可以得知糖苷键的信息，但糖残基之间的连接信息需要进一步借助NMR光谱进行分析。
表3CLJP-2b甲基化数据
实施例7
核磁共振分析
取20mg干燥的CLJP-2b，用0.5mLD2O溶解后冻干，反复多次以置换活泼氢，并使用600MHz Bruker核磁共振光谱仪，测定一维核磁光谱和二维核磁光谱(1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、NOESY)。
甲基化程度(DM)定义为酯基与羧酸和酯基的总量之比。CLJP-2b的甲酯化程度通过1H图谱中酯化半乳糖醛酸区域(∫1)与非酯化半乳糖醛酸区域(∫2)和∫1的比值确定。
通过图6、图7的一维核磁共振谱图(1H-NMR、13C-NMR)和图8、图9、图10、图11的二维核磁共振谱图(1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)，进一步获得了CLJP-2b的结构信息，并对各个糖残基的H和C化学位移进行归属，结合甲基化分析和单糖组成分析结果，推断糖残基之间的连接顺序，相关信号归属见表4。
在1H-NMR谱图上，δ3.0～5.5ppm区域出现大量CLJP-2b中的质子共振信号，其中，在δ4.5～5.5ppm区域发现多个异头质子信号，表明存在多种糖残基，其他质子信号出现在δ4.5～3.0ppm区域，信号堆叠严重，难以区分。从13C-NMR谱图中可以在δ90～110ppm的异头信号区间发现13个异头碳信号，表明CLJP-2b有13种糖残基。在δ93.39ppm和δ97.23ppm处出现了还原端α-GalpA和β-GalpA的C-1信号峰，但在δ58～66ppm范围内没有检测到信号，表明CLJP-2b中糖残基C-6为糖醛酸、酯化或者发生取代，也可能存在6位脱氧糖。一些典型的特征信号可以从1H-NMR和13C-NMR谱图上发现：(1)位于高场的δ1.18ppm处的共振信号为典型的鼠李糖残基甲基质子H-6的化学位移，其甲基碳C-6特殊的脱氧结构在δ17.96ppm处，并且在HSQC谱图上可以找到这两个信号的交叉峰δ1.18/17.96ppm；在1H-NMR和13C-NMR谱图上峰的信号强度很小，说明存在少量鼠李糖残基，与单糖组成结果相符。(2)单糖组成分析中，存在半乳糖醛酸，推测δ174.72ppm是未酯化的半乳糖醛酸残基中的C-6位的特征吸收峰。
根据CLJP-2b的单糖组成和甲基化分析结果，结合NMR谱图，可以找到13个异头质子和异头碳信号峰具有显著性，可以用于结构分析，分别命名为糖残基A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K，以及还原性端基Rα和Rβ。分别对各个糖残基的异头质子和异头碳信号进行归属，结果见表2。13种糖残基的结构分析如下：
糖残基A：位于1HNMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.30ppm(H-1)和碳信号δ100.87ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1H NMR确定的残基A的H-1化学位移δ5.30ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰找到了其余氢信号H-2(δ3.53ppm)、H-3(δ3.87ppm)、H-4(δ3.58ppm)、H-5(δ3.85ppm)、H-6a(δ3.75ppm)。残基A上的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ100.87ppm)、C-2(δ72.88ppm)、C-3(δ69.95ppm)、C-4(δ77.90ppm)、C-5(δ74.35ppm)和C-6(δ61.68ppm)。残基A在C-1和C-4的化学位移向低场偏移，表明其在C-1和C-4位置发生了取代，结合甲基化结果和文献报道，推断残基A为→4)-α-D-Glcp-(1→。
糖残基B：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.26ppm(H-1)和碳信号δ100.90ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1H NMR确定的残基B的H-1化学位移δ5.26ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.52ppm)、H-3(δ3.87ppm)、H-4(δ3.57ppm)、H-5(δ3.85ppm)、H-6a(δ3.70ppm)。残基B上的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ100.90ppm)、C-2(δ72.59ppm)、C-3(δ69.95ppm)、C-4(δ78.26ppm)、C-5(δ73.49ppm)和C-6(δ67.85ppm)。残基B在C-1、C-4和C-6的化学位移向低场偏移，表明在C-1、C-4和C-6位置发生了取代，结合甲基化结果和文献报道，推断残基B为→4,6)-α-D-Glcp-(1→。
糖残基C：位于1HNMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.88ppm(H-1)和碳信号δ99.15ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1HNMR确定的残基C的H-1化学位移δ4.88ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.44ppm)、H-3(δ3.67ppm)、H-4(δ3.32ppm)、H-5(δ3.61ppm)、H-6a(δ3.32ppm)。残基C上的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ99.15ppm)、C-2(δ72.07ppm)、C-3(δ71.24ppm)、C-4(δ70.76ppm)、C-5(δ73.52ppm)和C-6(δ61.52ppm)。残基C在C-1的化学位移向低场偏移，表明其在C-1位置发生了取代，推断残基C为α-D-Glcp-(1→。
糖残基D：位于1HNMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.15ppm(H-1)和碳信号δ110.30ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1HNMR确定的残基D的H-1化学位移δ5.15ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ4.11ppm)、H-3(δ3.92ppm)、H-4(δ4.03ppm)、H-5(δ3.64ppm)。残基D上的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ110.30ppm)、C-2(δ82.48ppm)、C-3(δ77.90ppm)、C-4(δ84.97ppm)、C-5(δ62.25ppm)。残基D在C-1的化学位移向低场偏移，表明在C-1位置发生了取代，推断残基D为α-L-Araf-(1→。
糖残基E：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.00ppm(H-1)和碳信号δ108.57ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1H NMR确定的残基E的H-1化学位移δ5.00ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ4.02ppm)、H-3(δ3.86ppm)、H-4(δ4.02ppm)、H-5(δ3.66ppm)。残基E上的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ108.57ppm)、C-2(δ82.03ppm)、C-3(δ77.62ppm)、C-4(δ84.85ppm)、C-5(δ66.83ppm)。残基E在C-1的化学位移向低场偏移，表明在C-1、C-5位置发生了取代，推断残基E为→5)-α-L-Araf-(1→。
糖残基F：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.98ppm(H-1)和碳信号δ100.80ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1H NMR确定的残基F的H-1化学位移δ4.98ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.66ppm)、H-3(δ3.91ppm)、H-4(δ4.35ppm)、H-5(δ4.48ppm)。残基F的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ100.80ppm)、C-2(δ69.30ppm)、C-3(δ69.94ppm)、C-4(δ80.27ppm)、C-5(71.18ppm)。在HMBC谱图(图9)上找到H-5与C-6的交叉峰δ4.48/174.72ppm，得到C-6的化学位移为δ174.72ppm，δ174.72ppm是未酯化的半乳糖醛酸残基中的C-6位的特征吸收峰。残基F在C-1和C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1和C-4位置发生了取代，结合文献，推断糖残基F为→4)-α-D-GalpA-(1→。
糖残基G：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.96ppm(H-1)和碳信号δ99.60ppm(C-1)表明该残基为α构型。根据1HNMR确定的残基G的H-1化学位移δ4.96ppm，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.65ppm)、H-3(δ3.82ppm)、H-4(δ4.20ppm)、H-5(δ4.85ppm)。残基G的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ99.60ppm)、C-2(δ69.35ppm)、C-3(δ69.65ppm)、C-4(δ79.21ppm)、C-5(δ74.35ppm)。在HSQC谱图上找到甲酯的甲基质子信号和碳信号分别为δ3.75ppm和δ57.10ppm。残基G在C-1和C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1和C-4位置发生了取代，并且H-5发生了很大的低场偏移，这是由于甲氧基基团的引入使得质子的化学位移发生偏移，结合文献，推断糖残基G为→4)-α-GalpA-6-OMе-(1→。
糖残基H：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.24ppm(H-1)和碳信号δ101.92ppm(C-1)表明该残基为α构型，属于鼠李糖残基。根据1HNMR确定的残基H的H-1(δ5.24ppm)和H-6(δ1.18ppm)信号，通过COSY图谱(图8)的交叉峰进一步明确了H-2(δ4.27ppm)、H-3(δ3.96ppm)、H-4(δ3.47ppm)、H-5(δ3.75ppm)。残基H的碳信号通过HSQC相关谱(图10)分别归属为C-1(δ101.92ppm)、C-2(δ80.68ppm)、C-3(δ70.51ppm)、C-4(δ72.02ppm)、C-5(δ70.96ppm)、C-6(δ17.96ppm)。残基H在C-1和C-2的化学位移向低场偏移，表明在C-1和C-2位置发生了取代，结合文献，推断残基H为→2)-α-L-Rhap-(1→。
糖残基I：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.12ppm(H-1)和碳信号δ100.34ppm(C-1)表明该残基为α构型，属于鼠李糖残基。根据1HNMR确定的残基I的H-1(5.12ppm)和H-6(δ1.18ppm)信号，通过COSY图谱(图8)的交叉峰进一步明确了H-2(δ4.06ppm)、H-3(δ4.03ppm)、H-4(δ3.86ppm)、H-5(δ3.65ppm)。残基I的碳信号通过HSQC相关谱(图10)分别归属为C-1(δ100.34ppm)、C-2(δ80.11ppm)、C-3(δ69.65ppm)、C-4(δ80.56ppm)、C-5(δ70.60ppm)、C-6(δ17.96ppm)。残基I在C-1、C-2和C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1、C-2和C-4位置发生了取代，结合文献报道，推断残基I为→2,4)-α-L-Rhap-(1→。
糖残基J：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.38ppm(H-1)和碳信号δ100.46ppm(C-1)表明该残基为β构型。根据1H NMR确定的残基J的H-1(δ4.38ppm)信号，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.43ppm)、H-3(δ3.65ppm)、H-4(δ4.04ppm)、H-5(δ3.87ppm)、H-6a(δ3.81ppm)。残基J的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ104.46ppm)、C-2(δ71.72ppm)、C-3(δ81.13ppm)、C-4(δ69.65ppm)、C-5(δ74.80ppm)、C-6(δ67.85ppm)。残基J在C-1、C-3和C-6的化学位移向低场偏移，表明在C-1、C-3和C-6位置发生了取代，结合甲基化结果和文献报道，推断残基J为→3,6)-β-D-Galp-(1→。
糖残基K：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.43ppm(H-1)和碳信号δ105.36ppm(C-1)表明该残基为β构型。根据1H NMR确定的残基K的H-1(δ4.43ppm)信号，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.54ppm)、H-3(δ3.63ppm)、H-4(δ4.06ppm)、H-5(δ3.85ppm)、H-6a(δ3.65ppm)。残基K的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ104.30ppm)、C-2(δ72.59ppm)、C-3(δ73.61ppm)、C-4(δ80.27ppm)、C-5(δ72.88ppm)、C-6(δ62.25ppm)。残基K在C-1、C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1、C-4位置发生了取代，结合文献，推断残基K为→4)-β-D-Galp-(1→。
糖残基Rα：位于1H NMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ5.24ppm(H-1)和碳信号δ93.39ppm(C-1)表明该残基为α构型，属于还原性端基。根据1H NMR确定的残基Rα的H-1(δ5.24ppm)信号，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.72ppm)、H-3(δ3.90ppm)、H-4(δ4.52ppm)、H-5(δ4.50ppm)。残基Rα的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ93.39ppm)、C-2(δ69.31ppm)、C-3(δ69.58ppm)、C-4(δ80.04ppm)、C-5(δ71.44ppm)，其13C NMR谱图上在δ58～66ppm范围内没有检测到信号，说明C-6位没有连接氢，H-5并未发生了大的低场偏移，可归属于半乳糖醛酸残基，C-6化学位移通过HMBC谱图(图9)确定为为δ174.72ppm。残基Rα在C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1位置发生了取代，根据参考文献，推断糖残基Rα为→4)-α-D-GalpA。
糖残基Rβ：位于1HNMR(图6)和13C-NMR(图7)中的质子信号δ4.55ppm(H-1)和碳信号δ97.23ppm(C-1)表明该残基为β构型，属于还原性端基。根据1H NMR确定的残基Rβ的H-1(δ4.55ppm)信号，通过COSY图谱(图8)和HSQC相关谱(图10)的交叉峰进一步明确了H-2(δ3.40ppm)、H-3(δ3.85ppm)、H-4(δ4.21ppm)、H-5(δ4.14ppm)。残基Rβ的碳信号通过HSQC相关谱分别归属为C-1(δ97.23ppm)、C-2(δ72.69ppm)、C-3(δ67.20ppm)、C-4(δ80.21ppm)、C-5(δ75.11ppm)，其13C NMR谱图上在δ58～66ppm范围内没有检测到信号，说明C-6位没有连接氢，H-5并未发生了大的低场偏移，可归属于半乳糖醛酸残基，在HMBC谱图(图9)上找到H-5与C-6的交叉峰δ4.14/174.72ppm，得到C-6的化学位移为δ174.72ppm，δ174.72ppm是未酯化的半乳糖醛酸残基中的C-6位的特征吸收峰。残基Rβ在C-4的化学位移向低场偏移，表明在C-1位置发生了取代，结合甲基化结果和文献报道，推断糖残基Rβ为→4)-β-D-GalpA。
各个残基之间的连接顺序通过HMBC相关谱(图9)进一步明确。从图中可找到CLJP-2b中的偶合信号，残基A的H-1(δ5.30ppm)与残基A的C-4(δ77.90ppm)有偶合信号(AH-1/AC-4)，残基A的H-1(δ5.30ppm)与残基B的C-4(δ78.26ppm)有偶合信号(AH-1/B C-4)，残基B的H-1(δ5.26ppm)与残基A的C-4(δ77.90ppm)有偶合信号(B H-1/AC-4)，残基E的H-1(δ5.00ppm)与残基H的C-2(δ80.68ppm)有偶合信号(E H-1/H C-2)，残基J的H-1(δ4.38ppm)与残基A的C-4(δ77.90ppm)有偶合信号(J H-1/AC-4)，残基J的H-6(δ3.81ppm)与残基K的C-1(δ105.36ppm)有偶合信号(J H-6/K C-1)，残基B的H-6(δ3.70ppm)与残基E的C-1(δ108.57ppm)有偶合信号(B H-6/E C-1)，残基E的H-5(δ3.66ppm)与残基D的C-1(δ110.30ppm)有偶合信号(E H-5/D C-1)，残基A的H-4(δ3.58ppm)与残基J的C-1(δ104.46ppm)有偶合信号(A H-4/J C-1)，残基K的H-4(δ4.06ppm)与残基K的C-1(δ104.30ppm)有偶合信号(AK-4/K C-1)。NOESY谱中(图11)残基H的H-1(δ5.24ppm)与残基I的H-4(δ3.86ppm)存在交叉峰(H H-1/IH-4)，残基B的H-1(δ5.26ppm)与残基I的H-2(δ4.06ppm)存在交叉峰(B H-1/I H-2)，残基I的H-1(δ5.12ppm)与残基F的H-4(δ4.35ppm)存在交叉峰(I H-1/F H-4)。剩余残基的连接点没有发现，可能与其信号重叠、含量低有关。
根据文献报道的计算公式DM＝(∫1-∫2)/(∫1+∫2)计算得出CLJP-2b的DM为90.9％，说明在GalA中存在大部分甲酯化。综合单糖组成、甲基化结果以及核磁信息分析，推断CLJP-2b主要由1,3,6-β-D-Galp,1,4-α-D-Glcp,1,4,6-α-D-Glcp,1,5-α-L-Araf,1,4-β-D-Galp,1,2-α-L-Rhap,1,2,4-α-L-Rhap和1,4-α-D-GalpA-6-OMе构成，其可能的结构模型下所示：
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实施例7
1、实验方法
1.1、RA-FLS细胞培养、免疫荧光染色
RA-FLS细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基中，在37℃恒温培养箱中5％CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3天换一次培养液，当细胞长至80％铺满时再消化传代。根据文献，将RA-FLS培养至第四代，进行免疫荧光染色，观察细胞形态。使用4％多聚甲醛进行固定，置于4℃下过夜，再用PBS清洗3次，每次5min。随后，用0.5％Triton通透5min，增加细胞膜的通透性，用PBS清洗3次，每次5min。接着，加入10％山羊血清封闭1h，再加入配制好的一抗稀释液Vimentin antibody(1︰1000)，置于4℃下过夜，用PBS清洗3次，各5min。加入二抗稀释液：山羊抗鸡IgY H&L(1︰500)和488-conjugatedAffininPure GoatAnti-Mouse IgG(H+L)(1︰300)，4℃下过夜，再用PBS清洗3次，每次5min。最后，用DAPI染核3min，PBS洗3次，洗去多余染色液。将成片放入荧光倒置显微镜下观察并拍照。实验重复3次。
1.2、MTT法检测细胞增殖
(1)用PBS溶液将TNF-α配制成20ng/mL的诱导液，将CLJP-2b配制成浓度为50、100、200μg/mL的药物溶液。
(2)将对数生长期的RA-FLS细胞用细胞胰酶消化后，加入新鲜配置的完全培养基重悬细胞，以5000个/孔的密度接种于96孔板中。实验设置对照组和实验组(模型组：TNF-α诱导组；给药组：TNF-α+不同浓度CLJP-2b组)。RA-FLS细胞按照分组处理，对照组加入等体积PBS溶液，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h、48h。
(3)孵育完成后，每孔加入10％的MTT反应液100μL，继续孵育4h，再加入150μLDMSO，振荡后用酶标仪在595nm处测定吸光度值。
(4)RA-FLS细胞相对增殖率计算
(5)实验重复6次。
1.3、流式细胞仪检测细胞凋亡
(1)用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；用PBS溶液将TNF-α配制成20ng/mL的诱导液，将CLJP-2b配制成浓度为50、100、200μg/mL的药物溶液。
(2)按“1.2”项下的实验分组处理各组细胞24h后，用不含EDTA的胰酶消化，并在室温中离心(2000rpm，10min)，收集细胞；用预冷的1×PBS(4℃)重悬细胞，再次离心(2000rpm，10min)，洗涤细胞，再加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞。
(3)加入5μL的AnnexinV-FITC混匀后，在避光条件下室温孵育15min，并在上机前5min再加入5μL的PI染色，最后，补加200μL的1×Binding Buffer上机检测。
(4)实验重复3次。
1.4、Transwell检测细胞迁移
(1)取对数生长期的RA-FLS细胞，用胰酶消化后将细胞用无血清培养基重悬，调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于上室中，每孔200μL。随后按分组分别加入50、100、200μg/mL的CLJP-2b溶液。下室加入20ng/mL的TNF-α和/或800μL完全培养基。
(2)各组小室孵育24h后，取出小室，吸干上室液体，用PBS清洗2次，移入预装800μL含4％多聚甲醛的甲醇孔中，室温下固定10-30min。之后，取出小室，用PBS清洗后再次用甲醇固定20min。最后，用2％结晶紫染色液在室温下染色30min。
(3)染色完成后，用PBS清洗小室，将上室底部膜表面的细胞用湿棉签轻柔擦去，并彻底晾干小室，置于荧光倒置显微镜下观察细胞的迁移情况，计数、拍照。
(4)实验重复3次。
1.5、细胞粘附实验
(1)用10μg/mL的粘连蛋白(Fibronectin，FN)预铺96孔板，100μL/孔，置于4℃过夜后，用PBS清洗3遍。再用1％牛血清蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)在37℃下封闭1h，PBS洗3遍。
(2)取对数生长期的RA-FLS细胞，胰酶消化后，按“1.2”项下的实验分组处理各组细胞24h，用无血清培养基悬浮细胞，血球计数板计数，调整浓度为5×105个/mL，分别接种于预铺FN的96孔板中，每孔10000个细胞，在37℃下孵育2h后，PBS洗去未黏附的细胞。
(3)用3.5％的戊二醛在4℃下固定0.5h，PBS洗3遍，再用0.1％的结晶紫染色，室温静置0.5h，PBS洗3遍，每孔加入100μL 10％的乙酸，5～10min后用酶标仪检测595nm处的吸光度值。
1.6、ELISA法检测炎症因子IL-1β、IL-6的表达
(1)取对数生长期的RA-FLS细胞，胰酶消化后，配制成5×104个/mL，每孔接种200μL，在96孔板中按“1.2”项下的分组处理各组RA-FLS细胞并在37℃，含5％的CO2培养箱中孵育24h后，离心收集上清液。
(2)按照酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒说明书，检测各组中IL-1β、IL-6的分泌水平。
(3)实验重复3次。
1.7、数据处理
数据使用Prism 8.0进行统计学分析，符合正态分布的数据采用平均值±标准差表示，按One-wayANOVA法进行显著性分析，p<0.05被认为具有统计学意义。采用Origin2019b进行图像处理。
2、实验结果
2.1、细胞形态观察及鉴定
采用荧光免疫染色法对所培养的RA-FLS细胞进行形态观察。从图12中可以明显观察到，RA-FLS细胞多为长梭形，呈巢状分布，细胞核圆润规则。Vimentin蛋白作为RA-FLS的特征性标记蛋白，其阳性染色率为100％，表明形态较好的细胞为RA-FLS，可以进一步研究。
2.2、CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS增殖的影响
采用MTT法探究CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS存活率是否有影响。如图13所示，当用TNF-α(20ng/mL)刺激RA-FLS 24、48h后，模型组的细胞活力明显高于对照组(p<0.01)，特别是作用48h后，这说明炎症环境可以显著促进RA-FLS的增殖。当不同浓度的CLJP-2b(50,100,200μg/mL)介入后，与模型组相比，TNF-α诱导的RA-FLS细胞存活率呈剂量依赖性降低(p<0.01)，200μg/mL的CLJP-2b作用24h和48h的抑制率分别是16.90％和16.36％。以上结果表明CLJP-2b具有抑制TNF-α诱导的RA-FLS增殖的作用。
2.3、CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS凋亡的影响
采用AnnexinV-FITC/PI双染色法检测CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS凋亡的影响。根据流式细胞图所示(图14中的A)，50,100,200μg/mL的CLJP-2b处理TNF-α诱导的RA-FLS后，处于晚期凋亡的细胞比例大于早期凋亡的细胞比例。细胞凋亡率结果显示，对照组凋亡率为2.52％±0.94，TNF-α诱导组凋亡率为3.76％±0.31，50μg/mL CLJP-2b组凋亡率为14.25％±1.03，100μg/mL CLJP-2b组凋亡率为19.51％±0.74，200μg/mL CLJP-2b组凋亡率为24.28％±1.11。与对照组凋亡率相比，TNF-α(20ng/mL)引起了RA-FLS的极小凋亡，没有显著性差异(p>0.05)。与TNF-α诱导组相比，当不同浓度的CLJP-2b(50,100,200μg/mL)介入后，TNF-α诱导的RA-FLS细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(p<0.01)。以上结果表明，CLJP-2b具有诱导TNF-α诱导的RA-FLS凋亡的作用。
2.4、CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS炎症因子分泌的影响
为了评估CLJP-2b的抗炎作用，用ELISA试剂盒测量TNF-α诱导细胞中IL-1β和IL-6的分泌水平。如图15中的A和B所示，未经处理的RA-FLS分泌的IL-6较少，且几乎不分泌IL-1β。然而，经过TNF-α诱导后，IL-6和IL-1β的分泌水平分别增加了117.4％和354.5％(p<0.01)，说明TNF-α可以引起RA-FLS的炎症反应。与模型组相比，CLJP-2b(50,100,200μg/mL)可以抑制IL-6和IL-1β的升高(p<0.01)，且呈剂量依赖性。特别是200μg/mL的CLJP-2b，其对IL-6和IL-1β的抑制率分别为37.7％和83.9％。上述结果表明CLJP-2b可以通过降低IL-6和IL-1β的分泌来减弱TNF-α造成的炎症反应。
2.5、CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS迁移能力的影响
通过Transwell实验评价CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS迁移能力的影响。从图16中的A和B中可以直观地看出，与对照组相比，模型组的迁移数目显著增加(p<0.01)，说明TNF-α可以增强RA-FLS的迁移能力。与模型组相比，在不同浓度的CLJP-2b组中，50,100,200μg/mL的CLJP-2b的抑制率分别为18.6％，39.0％和46.6％。RA-FLS的迁移数目成剂量依赖性地降低，且具有显著性差异(p<0.01)，这表明CLJP-2b可以显著抑制RA-FLS的迁移能力。
2.6、CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS粘附能力的影响
通过细胞粘附实验评价CLJP-2b对TNF-α诱导的RA-FLS粘附能力的影响。从图17中的A和B中可以直观地看出，与对照组相比，模型组对FN基质的粘附数目明显增加，吸光度值提高了134.3％(p<0.01)，说明TNF-α可以促进RA-FLS对基质的粘附。与模型组相比，在不同浓度的CLJP-2b组中，随着CLJP-2b浓度增加，细胞粘附的数目逐渐降低，50,100,200μg/mL的CLJP-2b对细胞粘附的抑制率分别为16.9％，28.7％和52.0％，具有显著性差异(p<0.01)。结果表明，CLJP-2b可以显著抑制RA-FLS对细胞基质的粘附作用。

Claims (4)

1.一种忍冬藤多糖在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于，所述忍冬藤多糖的制备方法包括以下步骤：
（1）前处理：将新鲜采集的忍冬藤洗净后晒干，粉碎成粗粉，加入无水乙醇，回流提取，于通风处自然晾干，得忍冬藤脱脂粉备用；
（2）提取：将忍冬藤脱脂粉中加入蒸馏水，浸泡过夜，90℃提取，过滤，合并滤液，浓缩；将浓缩后的滤液离心后收集上清液；加入4倍上清液体积的无水乙醇，醇沉，离心，冷冻干燥，得到忍冬藤总多糖粗品；
（3）脱蛋白：采用三氯乙酸法对忍冬藤总多糖粗品进行脱蛋白处理，离心，取上清液，透析，冷冻干燥，得到忍冬藤粗多糖；
（4）阴离子交换柱层析：将忍冬藤粗多糖溶解后经DEAE-纤维素柱层析，苯酚-硫酸法检测多糖，收集不同浓度洗脱液得到的洗脱峰，各洗脱组分经浓缩，透析，冷冻干燥后，得到固体样品，分别命名为CLJP-1、CLJP-2、CLJP-3；
步骤（4）中，所述DEAE-纤维素柱层析的条件为：采用预先平衡好的DEAE cellulose-52进行分级层析，依次使用0、0.1、0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速为1.5 mL/min；
（5）凝胶柱层析：将CLJP-2组分用0.1mol/L的NaCl溶液配制成5mg/mL的样品溶液，充分溶解后离心，取上清液；然后，凝胶柱色谱分离，收集洗脱峰，洗脱组分经浓缩，透析，冷冻干燥，收集固体样品，得忍冬藤多糖；所述的凝胶柱为预先平衡好的Sephadex G75柱，凝胶柱层析条件为：洗脱液为0.1 mol/L的NaCl，流速为0.15mL/min；
所述的忍冬藤多糖，由1,3,6-β-D-Galp, 1,4-α-D-Glcp, 1,4,6-α-D-Glcp, 1,5-α-L-Araf, 1,4-β-D-Galp, 1,2-α-L-Rhap, 1,2,4-α-L-Rhap 和1,4-α-D-GalpA-6-OMе构成，其结构式如下：
；
所述忍冬藤多糖中，以摩尔比计，Glc : GalA : Ara : Gal : Rha = 3.89 : 2.49 :1.87 : 1.51 : 1.00；所述的忍冬藤多糖，Mw为7.0 kDa，Mn为6.6 kDa，分散系数为1.06。
2.根据权利要求1所述的忍冬藤多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，粗粉与无水乙醇的质量体积比为1g：5mL；提取时间为2h。
3.根据权利要求1所述的忍冬藤多糖的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，忍冬藤脱脂粉与蒸馏水的质量体积比为1g：10mL，提取时间为每次3h，提取三次；离心速度为4000rpm，离心时间为15min；醇沉温度为4 ℃，醇沉时间为48h。
4.根据权利要求1所述的忍冬藤多糖的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，脱蛋白处理的具体过程为：将忍冬藤总多糖粗品配置成200 mg/mL的溶液，边搅拌边加入等体积5 %的TCA溶液，置于4 ℃条件下静置24 h。
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