CN103288973A - 板蓝根多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从板蓝根中提取的多糖组分，具体涉及从板蓝根提取的多糖成分S1、S3和S4，本发明还涉及所述多糖成分S1、S3和S4的制备方法，及其用于疫苗佐剂、免疫调节剂或制备疫苗组合物的用途。活性实验结果表明，本发明分离得到的多糖分S1、S3和S4具有疫苗佐剂活性和免疫调节作用，为免疫佐剂提供了新的选择。

Description

板蓝根多糖、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及从板蓝根中提取的多糖成分，具体涉及从板蓝根提取的多糖成分S1、S3和S4，本发明还涉及所述多糖成分S1、S3和S4的制备方法，及其用于免疫佐剂、免疫调节剂或制备疫苗组合物的用途。

背景技术

板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica)的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽之功效，常用于温毒发斑，舌绛紫暗，喉痹，烂喉丹痧，丹毒和痈肿。现代药理研究表明板蓝根具有提高免疫功能和抗肿瘤作用。板蓝根中主要化学成分有黄酮、木质素、生物碱以及多糖等。近年来有以下文献报道有关板蓝根水提物及总多糖作为佐剂对动物疫苗免疫的影响。

陈亮等(中国专利，专利号ZL03145034.2，授权日2006年5月17日)将板蓝根水煎液作为佐剂，与口蹄疫病毒DNA、乙肝病毒核心抗原原核表达产物或口蹄疫灭活疫苗联用，抗体产生量明显增加。该佐剂能直接或间接激活活性细胞，增加抗原表面积，延长抗原在局部组织的存留时间。

Chen L等(Intervitrology，2005，48：207-212)将板蓝根水煎液作为佐剂，与手足口病病毒(FMDV)的DNA疫苗一起注射小鼠，能明显增加FMDV的抗体反应，促进T细胞增殖，增强小鼠对手足口病病毒攻击的保护能力，作用效果优于单独注射FMDV DNA。

邱妍等(江苏农业科学，2009，2：32-35)采取水煎醇沉法提取板蓝根总多糖(糖含量为56％)，研究对鸡外周血T淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达的影响。结果表明该多糖能提高淋巴细胞IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平。邱妍等(南京农业大学学报2008，31(1)：77-8)又将该多糖与鸡新城疫-传染性支气管炎二联(NDV-IBV)弱毒苗一起免疫小鼠，能显著提高新城疫HI抗体效价，促进外周血T淋巴细胞增殖，提高CD4+、CD8+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+值。

孔祥峰等(畜牧兽医学报，2004，35(4)，468-472)用新城疫Ⅳ系疫苗免疫雏鸡，在免疫前、后分别注射高、低剂量的板蓝根总多糖(糖含量为82.94％)，结果表明能不同程度地提高抗体效价，且与给药时间、剂量和免疫接种次数有一定关系。

张红英等(河南农业大学学报，2009，43(2)：173-176)测定不同浓度的板蓝根总多糖对体外培养的猪脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果表明板蓝根总多糖能显著促进猪脾脏淋巴细胞的增殖，同时又能协同ConA或LPS诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖，能显著促进由ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ，抑制IL-2的分泌，显著促进NO的分泌。张红英等(中国免疫学杂志，2007，23：134-137)

以板蓝根总多糖作为免疫增强剂联合猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗免疫仔猪，结果显示该多糖能显著提高仔猪的CD3+、CD8+淋巴细胞的百分数和特异性抗体滴度。

李宁(中国专利，公开号CN101703772A，公开日2010年5月12日)制备复方板蓝根口服液，其中板蓝根总多糖0.5-20kg，黄芪多糖含量为50％的黄芪多糖原料药0.5-20kg，淫羊藿多糖含量为50％的淫羊藿多糖原料药0.5-10kg，巴戟天提取物0.5-10kg，山梨酸钾50g，余量的注射用水。该口服液对于禽类由于疾病或饲养条件造成的免疫力低下具有良好疗效，同时可增强疫苗免疫效果。

关于板蓝根总多糖及纯化多糖的制备方法，主要有以下文献报道。

张体祥等(时珍国药，2009，20(8)：1992-1994)采用以下路线制备精制多糖：板蓝根→粉碎→称量→乙醚脱脂→热水浸提→离心取上清液→残渣重复浸提两次→合并上清液→减压浓缩→透析→测含糖量→乙醇沉淀→有机溶剂洗涤→真空干燥→板蓝根粗多糖。粗多糖溶液→SehadexG-100柱层析→洗脱液浓缩→乙醇沉淀→冷冻干燥→精制板蓝根总多糖。该多糖得率25.63％，多糖含量76.42％。

鲁建江等(广东药学，2001，11(4)：16-18)将板蓝根洗净，晾干，精密称取100g，置索氏提取器中，依次用石油醚(60-90℃)、乙醚和80％乙醇回流提取4h。残渣挥干溶剂后，再继续以水回流提取4h，减压浓缩至一半体积，加入0.1％活性炭，脱色，滤过，滤液加入95％乙醇使溶液含醇80％，静置过夜，滤过，残渣用乙醚、无水乙醇反复洗涤，得板蓝根总多糖。测得板蓝根中多糖含量80.99％。

陈浩然等(中国药房，2009，20(21)：1642-1644)将板蓝根药材以8倍、6倍量水提取2次，水提取液减压浓缩，加入乙醇至终浓度为70％，得到沉淀为板蓝根粗多糖部位。板蓝根总多糖水溶解后，加乙醇分级沉淀，得到50％和70％醇沉多糖部分，70％醇沉多糖经SephadexG100排阻色谱分离，得到板蓝根纯化多糖A。板蓝根总多糖A的相对分子质量为11700，多糖A水解后有2个斑点，分别为阿拉伯糖和半乳糖。糖苷键构型以α为主，连接方式以1→3键连接为主，并同时存在1→2和(或)1→4的连接方式。

张体祥等(河南工程学院学报，2009，21(3)：13-17)采用水煮醇沉方法制备板蓝根粗多糖，再将粗多糖加水溶胀、煮沸和离心，取上层清液滴加一定量的三氯乙酸，剧烈搅拌，离心除去沉淀，经透析、醇沉、洗涤、干燥，即得脱蛋白多糖。利用葡聚糖凝胶(SephadexG-100)柱层析法进行多糖的分离，得到一种分子量均一的ISP2多糖，其相对分子量为2.24×10⁵。1SP2是由鼠李糖、果糖、葡萄糖、半乳糖四种单糖组成的杂多糖，它们的质量比为1∶4∶58.2∶3.1。

从以上文献可以看出：(1)板蓝根水提物及总多糖具有疫苗佐剂活性，但均未提及总多糖的制备工艺和理化性质，而不同制备方法所获得的总多糖，其理化性质可能差别很大。(2)文献报道从板蓝根中分离获得2个纯化多糖，分子量分别为11700和2.24×10⁵，但均未报道其生物活性。本发明采用不同于现有技术的方法提取板蓝根总多糖，对该总多糖进行系统分离和佐剂活性追踪。最终从板蓝根药材中分离、纯化获得3个具有疫苗佐剂活性的多糖成分，并对该多糖进行理化性质和结构研究。

发明内容

本发明提供了从板蓝根中分离得到的多糖成分、其制备方法以及作为疫苗佐剂或免疫调节剂、或用于制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。具体地，

本发明第一方面涉及板蓝根多糖，其包含选自以下板蓝根多糖成分中的一种或数种：

(1)多糖成分S1，其分子量范围为2000～5000Da，其由α构型的吡喃型葡萄糖组成，主要糖苷键构型为1→4连接，即→1)α-D-Glcp(4→；

(2)多糖成分S3，其分子量范围为4.0×10⁴～10.0×10⁴Da，由阿拉伯糖、半乳糖及糖醛酸组成，其中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Gal＝1.0∶(1.0～3.0)，糖醛酸含量为10％～20％，主要连接片段为→1)Galp(3，6→，并包括其它片段→1)Galp(6→，→1)Araf，→1)Araf(5→，→1)Araf(2，3→和→1)Galp；

(3)多糖成分S4，其为分子量均一多糖，峰高分子量为6460，分子量范围为3000～10000Da，其由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，三种糖的摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶(10.0～15.0)∶(0.5～2.0)。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S1为分子量均一的葡聚糖。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S1的峰高分子量为3600Da。

在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S3为分子量均一的多糖。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S3的峰高分子量为6.64×10⁴Da。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S3中的阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Gal＝1.0∶(1.5～2.0)。在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分S3中的阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Gal＝1.0∶1.5。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S3中的糖醛酸含量为10-15％；在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分S3中的糖醛酸含量为13.1％。

在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S4为分子量均一的多糖。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S4的峰高分子量为6460Da。在本发明的一个实施方案中，所述多糖成分S4中的阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶(12.0～14.0)∶1.0。在本发明的一个具体实施方案中，所述多糖成分S4中的阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶12.6∶1.0。

本发明的第二方面涉及板蓝根总多糖，其是通过如下方法制备得到的：

1)取板蓝根，加入水浸泡，得到水提液；

2)将步骤1)得到的水提液进行乙醇沉淀，取沉淀部分加入水中溶解，取上清液进行透析；

3)取透析液浓缩后得到板蓝根总多糖；任选地，浓缩后还包括冷冻干燥的步骤。

根据本发明第二方面的板蓝根总多糖，其特征在于如下的(1)-(13)项中的任意一项或多项：

(1)步骤1)中所述的板蓝根，其为未经提取的板蓝根，或者为经过有机溶剂例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇萃取后得到的板蓝根残渣，在本发明的一个实施方案中，所述有机溶剂为乙醇；

有机溶剂浸提的温度通常为室温；浸提的时间为4～72小时，优选为12～48小时，在本发明的一个实施方案中，为24小时；

(2)步骤1)中所用水为蒸馏水或去离子水；

(3)步骤1)中，加入水浸提的温度为4～100℃，优选为20～60℃；

在此温度范围内，不会破坏糖的性质，且随温度升高，糖的得率增加。

(4)步骤1)中，将水提后得到的板蓝根残渣按照相同条件进行一次或多次水提，合并水提液；在本发明的一个实施方案中，进行两次浸提。

(5)步骤1)中水的用量为板蓝根残渣的5-20倍量(L/Kg)；

(6)步骤1)中，水提期间进行搅拌；

(7)步骤1)中，将得到的水提液在50℃-55℃下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；

(8)步骤2)中，乙醇沉淀的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为60-80％，例如70-75％；优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；

(9)步骤2)中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀，合并上清液；

(10)步骤2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；

(11)步骤2)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；

(12)步骤2)中，透析进行一次或多次；

(13)步骤3)中所述浓缩为在50℃-55℃下进行减压浓缩。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述的板蓝根总多糖是通过如下方法获得的：

取中药材板蓝根，室温下向其中加入乙醇浸没浸泡；过滤，将滤液减压回收浸膏，任选地，可再浸提一次；浸提后的板蓝根残渣烘干后，向其中加入蒸馏水浸泡，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心，浸提后的板蓝根残渣在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3～4倍体积的95％乙醇进行醇沉；醇沉溶液离心，向沉淀部分中加入水搅拌溶解，离心，再将沉淀同样操作两次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量＞1000，用水透析；将得到的透析液减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得所述板蓝根总多糖。

本发明的第三方面涉及板蓝根多糖，其包含通过以下方法制备得到的多糖成分中的一种或数种：

取本发明第二方面任一项所述的板蓝根总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H₂O、0.25mol/L NaHCO₃和0.5mol/LNaHCO₃洗脱，硫酸-苯酚法检测糖，分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C；

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，纯化获得多糖分S1；和/或

多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，分别获得多糖成分S3和/或S4。

在本发明的一个实施方案中，所述DEAE-纤维素柱为DEAE-纤维素(HCO3^-)柱。

在本发明的一个实施方案中，多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，用H₂O洗脱，纯化获得多糖成分S1。

在本发明的一个实施方案中，多糖组分BLGP-B经SephadexG-100柱层析，得到0.1mol/L NaCl洗脱部分，再次用Sephadex G-100柱层析，用水洗脱，即得到多糖S3；多糖组分BLGP-B经SephadexG-100柱层析，得到0.1mol/L NaCl洗脱部分，再次用Sephadex G-75柱层析，用水洗脱，即得到多糖S4。

本发明的第四方面涉及本发明第一方面的板蓝根多糖的制备方法，其包括以下步骤：

取本发明第二方面的板蓝根总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H₂O、0.25mol/L NaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，硫酸-苯酚法检测糖，分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C；

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，纯化获得多糖成分S1；和/或

多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，分别获得多糖成分S3和/或S4。

在本发明的一个实施方案中，所述DEAE-纤维素柱为DEAE-纤维素(HCO3^-)柱。

在本发明的一个实施方案中，多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，用H₂O洗脱，纯化获得多糖成分S1；其洗脱曲线见图3。

在本发明的一个实施方案中，多糖组分BLGP-B经SephadexG-100柱层析，用0.1mol/L NaCl洗脱部分，再次用Sephadex G-100柱层析，用水洗脱，即得到多糖S3；多糖组分BLGP-B经SephadexG-100柱层析，用0.1mol/L NaCl洗脱部分，再次用Sephadex G-75柱层析，用水洗脱，即得到多糖S4；多糖S3和S4的洗脱曲线见图4。

本发明的第五方面涉及组合物，其包含本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖，任选地，还包含药用辅料和/或其它疫苗佐剂。

本发明的第六方面涉及疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖或本发明第五方面的组合物。

本发明的第七方面涉及疫苗佐剂，其包含本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖。

本发明还涉及本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖作为疫苗佐剂的用途；或者在制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。

本发明还涉及本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖作为免疫调节剂的用途。

本发明还涉及一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的本发明第一方面或第三方面的板蓝根多糖的步骤。

所述抗体例如为单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明中，所述疫苗为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗为H1N1流感疫苗；在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗为乙肝疫苗。

在本发明中，疫苗佐剂也称为佐剂，是指能非特异性地增强对抗原免疫应答的物质，其先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。

在本发明中，疫苗佐剂是指能够用于疫苗的佐剂，其它疫苗佐剂例如氢氧化铝佐剂。

在本发明中，所述有效量是指给予哺乳动物实现能够增强免疫效果的疫苗制剂或疫苗组合物的剂量。

在本发明中，疫苗与疫苗制剂含义相同，是指所有用减毒或杀死的病原生物(细菌、病毒、立克次体等)或其抗原性物质所制成，可使机体产生特异性免疫，用于预防接种或治疗的生物制剂。

在本发明中，免疫调节剂是指能调节、平衡并恢复机体免疫功能的一类制剂，常用的免疫调节剂有免疫促进剂、免疫抑制剂和免疫双向调节剂三大类。

发明的有益效果

本发明从板蓝根中分离得到了三种多糖成分S1、S3和S4，并对其理化性质和结构进行分析，其活性实验结果表明，三种多糖组分具有疫苗佐剂活性和免疫调节作用，为疫苗佐剂和免疫功能调节提供了新的选择。

附图说明

图1板蓝根总多糖分离制备流程图

图2总多糖经DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线图(Φ7.0×30cm)

图3BLGP-A经Sephadex G-75柱层析分离图(2.0×100cm)，λ＝490nm处检测

图4BLGP-B经Sephadex G-100柱层析的分离图(2.0×120cm)，λ＝490nm处检测

图5多糖S1分子量测定的GPC图谱

其中纵坐标为电位，单位为毫伏(mV)，图6和图7与此图相同。

图6多糖S3分子量测定的GPC图谱

图7多糖S4分子量测定的GPC图谱

图8标准单糖糖醇乙酸酯GC图

其中横坐标为时间，单位为分钟，纵坐标为电位，单位为毫伏(mV)，图9-11与此图相同。

图9多糖S1糖醇乙酸酯的GC图

图10多糖S3糖醇乙酸酯的GC图

图11多糖S4糖醇乙酸酯的GC图

图12多糖S1和S3的TLC色谱图

其中泳道1：BLGP-B-1为S3，泳道2：GalA为半乳糖醛酸，泳道3：GlcA为葡萄糖醛酸，泳道4：BLGP-A-1为S1。

图13S1的IR图谱

其中横坐标为波数，纵坐标为透过百分比。

图14S1的¹H-NMR(600MHz)图谱

图15S1的¹³C-NMR(600MHz)图谱

图16多糖S3的IR图谱

图17多糖S3的¹H-NMR(600MHz)图谱

图18多糖S3的¹³C-NMR(600MHz)图谱

图19多糖对流感疫苗初次免疫小鼠抗体滴度的影响

图20多糖对流感疫苗初次免疫小鼠抗体亚型的影响

图21多糖对乙肝疫苗初次免疫小鼠抗体生成的影响

其中Saline为生理盐水组，HBsAg为乙肝亚单位组，S1为乙肝亚单位+S1组，S3为乙肝亚单位+S3组，Al(OH)₃为乙肝疫苗组(即乙肝亚单位+铝佐剂)。

图22.多糖对乙肝疫苗二次免疫小鼠抗体生成的影响

其中Saline为生理盐水组，HBsAg为乙肝亚单位组，S1为乙肝亚单位+S1组，S3为乙肝亚单位+S3组，Al(OH)₃为乙肝疫苗组(即乙肝亚单位+铝佐剂)。

图23.多糖S1和S3对乙肝疫苗免疫小鼠抗体亚型的影响

其中Saline为生理盐水组，HBsAg为乙肝亚单位组，S1为乙肝亚单位+S1组，S3为乙肝亚单位+S3组，Al(OH)₃为乙肝疫苗组(即乙肝亚单位+铝佐剂)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：多糖S1、S3和S4的制备

中药材板蓝根1kg，粉碎，室温下加入10L 75％乙醇浸泡24小时，过滤，离心(3000r/min×10min)，残渣同样条件再浸提一次，合并滤液，40℃-45℃减压回收浸膏。经过75％乙醇浸提后的板蓝根残渣50℃烘干后，加入15L蒸馏水，在50℃下浸提5小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心10min(转速3000r/min)，浸提后的板蓝根残渣在同样条件下进行第二次提取。合并两次提取的水提液，50℃-55℃减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积(3000ml)95％的乙醇进行72小时的醇沉。醇沉溶液离心(3000r/min×10min)，沉淀部分加入1000ml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作两次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量＞1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析24小时。该透析液50℃-55℃减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得淡黄色粉末，即板蓝根总多糖(BLGP)。

称取1g板蓝根总多糖，溶于蒸馏水进行DEAE-纤维素(HCO₃ ^-)(购自上海试剂二厂)柱层析，依次用H₂O、0.25mol/LNaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，流速1ml/min，洗脱液隔管检测A₄₉₀(苯酚硫酸法，参考文献：Dubois M.，et al.Colorimetric method fordetemination of sugars and related substances.Anal.Chem.1956；28：350-56)，收集吸收峰，蒸馏水透析48h，然后冷冻干燥。分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C三个含糖组分。BLGP-A和BLGP-B分别经过Sephadex G-75(购自法玛西亚公司)和SephadexG-100(购自法玛西亚公司)凝胶柱层析，洗脱液隔管检测A₄₉₀(苯酚硫酸法)，收集吸收峰，获得多糖成分S1、S3和S4(见图1)。

板蓝根总多糖经DEAE-纤维素柱层析，依次用H₂O、0.25mol/LNaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，硫酸-苯酚法检测糖，分别获得BLGP-A、BLGP-B和BLGP-C三个多糖组分，洗脱曲线见图2。

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，用水洗脱，流速0.3ml/min，纯化获得分子量均一多糖S1；多糖组分BLGP-B经SephadexG-100柱层析，流速0.3ml/min，得到0.1mol/L NaCl洗脱部分，该部分再次用Sephadex G-100柱层析，用水洗脱，流速0.3ml/min，即得到多糖S3；多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，流速0.3ml/min，得到用0.1mol/L NaCl洗脱部分，该部分再次用Sephadex G-75柱层析，用水洗脱，流速0.3ml/min，即得到多糖S4。多糖S3和S4的洗脱曲线见图3和图4。

实施例2：多糖S1、S3和S4的理化性质

1、多糖S1、S3和S4分子量测定(HPLC方法)：

凝胶色谱柱：TSK-4000

流动相：0.1M Na2SO4

流速：0.6ml/min

检测器：示差

S1、S3和S4分子量测定结果见图5，图6和图7。

分子量测定结果表明多糖S1峰高分子量为3600Da，S3峰高分子量为66400Da，S4峰高分子量为6460Da。

2、多糖S1、S3和S4的单糖组成测定(气相色谱法)

S1、S3和S4经完全酸水解，还原、乙酰化后制成糖醇乙酸酯衍生物，进行气相色谱分析，单糖标准品及S1、S3和S4衍生物气相色谱结果见图8，图9，图10和图11。

气相色谱分析表明多糖S1由葡萄糖组成，为葡聚糖。S3由阿拉伯糖和半乳糖组成，摩尔比为1∶1.5；多糖S4由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶12.6∶1.0。薄层色谱分析表明S3含有半乳糖醛酸。见图12。

采用三羟基联苯法测定糖醛酸含量(参考文献：Blumenkrantz N，etal.New method for quantitative determiation of uronic acid.AnalBiochem 1973；54：484-89)，测得S3中半乳糖醛酸的含量为13.1％。

3、多糖S1的结构确定

多糖S1的红外光谱图见图13。根据在760.5cm^-1处有吸收峰，推测为S1的吡喃糖振动引起的吸收峰。在846.7cm^-1处有吸收峰，推测多糖S1为α构型的多糖。通过1H-NMR也可以判断S1中的葡萄糖为α构型，见图14、15。表1是S1甲基化产物的气相色谱质谱联用(GC-MS)结果。

表1多糖S1甲基化产物的GC-MS结果分析

以上研究结果表明S1由α构型的吡喃型葡萄糖组成，主要糖苷键构型为1→4连接，即→1)α-D-Glcp(4→。

4、多糖S3的结构确定

S3的红外光谱见图16。图中在868.4cm^-1处有相应吸收，为吡喃型半乳糖振动引起的吸收峰。在775.0cm^-1和706cm^-1处有相应吸收，为阿拉伯呋喃糖振动引起的吸收峰。S3的¹H-NMR(600MHz)和¹³C-NMR(600MHz)图谱见图17、18。表2是S3甲基化产物的气相色谱质谱联用(GC-MS)结果。

表2多糖S3甲基化产物的GC-MS结果分析

以上研究结果表明多糖S3主要由吡喃型半乳糖和呋喃型阿拉伯糖组成，主要含有以下连接片段：

主要骨架片段为→1)Galp(3，6→，以及其它片段→1)Galp(6→，→1)Araf，→1)Araf(5→，→1)Araf(2，3→和→1)Galp。

实施例3：多糖S1、S3和S4对流感疫苗的佐剂活性

将实施例1制备的多糖S1、S3和S4作为疫苗佐剂(剂量均为0.1mg/鼠)，分别与H1N1流感疫苗(H1N1流感病毒裂解液，30μg/ml，购自北京科兴生物制品有限公司)混和肌肉注射免疫小鼠，免疫2周后采用ELISA方法测定抗体滴度。实验分为生理盐水组、H1N1疫苗组、H1N1+S1组、H1N1+S3组和H1N1+S4组。结果说明H1N1病毒裂解液为免疫抗原，多糖S1、S3和S4作为佐剂初次免疫即可产生较高滴度的特异性抗体(见图19)。增加抗体亚型IgG、IgM、IgG2a和IgG2b(见图20)。

实施例4：多糖S1、S3和S4对乙肝疫苗的佐剂活性

乙肝疫苗：大连汉信生物医药有限公司生产。

重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母表达HBsAg，含铝佐剂，批号2009116501)

重组乙型肝炎亚单位(汉逊酵母表达HBsAg，不含铝佐剂，蛋白浓度0.221mg/ml)

动物：雌性Balb/c小鼠，6-8W

实验分组：生理盐水组、乙肝疫苗组(含铝佐剂)、乙肝亚单位组、S1+乙肝亚单位组、S3+乙肝亚单位组。

剂量：乙型肝炎亚单位2μg/鼠，乙肝疫苗组中乙型肝炎亚单位的剂量为2μg/鼠，S1和S3均为150μg/鼠。

免疫方案：肌肉注射，初次免疫2周后ELISA方法测定小鼠血清抗体滴度，然后进行第2次免疫。第2次免疫2周后再次测定抗体滴度和抗体亚型。

结果：板蓝根多糖S1和S3分别与乙肝疫苗(不含铝佐剂)联用注射免疫小鼠2次，对初次免疫和二次免疫小鼠血清抗体滴度以及抗体亚型的影响见图21、图22和图23。结果显示多糖S1和S3能显著提高乙肝疫苗免疫的抗体滴度，对抗体亚型IgG1、IgM、IgG2a、IgG2b以及IgA产出均有促进作用。

实施例5：S1、S3和S4对H1N1疫苗免疫小鼠的免疫功能调节

实施例3所述的小鼠，采用H1N1病毒裂解液分别和板蓝根多糖S1、S3及S4联用，肌肉注射方式免疫小鼠2周。处死后，无菌取脾脏，制备细胞悬液。分别加入ConA和LPS进行刺激培养48小时，MTT法测定脾脏T细胞和B细胞增殖效果。结果表明与生理盐水组相比，注射H1N1裂解液可刺激B细胞增殖，多糖S1+H1N1可显著提高免疫小鼠脾脏T细胞和B细胞的增殖能力；但S3和S4与H1N1却显著抑制脾脏T细胞和B细胞的增殖(见表3)。同样多糖S1可促进免疫小鼠脾脏T细胞分泌IFN-γ，而S3和S4则抑制IFN-γ的分泌(见表4)。

结果表明，S1、S3和S4具有显著的免疫功能调节作用。

表3.多糖S1、S3和S4对H1N1疫苗免疫小鼠T和B细胞增殖的影响

^*与正常组比较，#与免疫组比较有统计学差异

表4.多糖成分对H1N1病毒免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响

^*与正常组比较，#与免疫组比较有统计学差异

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (13)

1.板蓝根多糖，其包含选自以下板蓝根多糖组分中的一种或数种：

(1)多糖成分S1，其分子量范围为2000～5000Da，其由α构型的吡喃型葡萄糖组成，主要糖苷键构型为1→4连接，即→1)α-D-Glcp(4→；

(2)多糖成分S3，其分子量范围为4.0×10⁴～10.0×10⁴Da，由阿拉伯糖、半乳糖及糖醛酸组成，其中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Gal＝1.0∶(1.0～3.0)，糖醛酸含量为10％～20％，主要连接片段为→1)Galp(3，6→，还包括其它连接片段→1)Galp(6→，→1)Araf，→1)Araf(5→，→1)Araf(2，3→和→1)Galp；

(3)多糖成分S4，其分子量范围为3000～10000Da，其由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，三种糖的摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶(10.0～15.0)∶(0.5～2.0)。

2.权利要求1的板蓝根多糖，其中多糖成分S3中的阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Gal＝1.0∶(1.5～2.0)。

3.权利要求1的板蓝根多糖，其中多糖成分S4中的阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比为Ara∶Glc∶Gal＝1.0∶(12.0～14.0)∶1.0。

4.板蓝根总多糖，其是通过如下方法制备得到的：

1)取板蓝根，加入水浸泡，得到水提液；

2)将步骤1)得到的水提液进行乙醇沉淀，取沉淀部分加入水中溶解，取上清液进行透析；

3)取透析液浓缩后得到板蓝根总多糖；任选地，浓缩后还包括冷冻干燥的步骤。

5.权利要求4的板蓝根总多糖，其特征在于如下的(1)-(13)项中的任意一项或多项：

(1)步骤1)中所述的板蓝根，为未经提取的板蓝根，或者为经过有机溶剂例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇萃取后得到的板蓝根残渣；

(2)步骤1)中所用水为蒸馏水或去离子水；

(3)步骤1)中，加入水浸提的温度为4～100℃，优选为20～60℃；

(4)步骤1)中，将水提后得到的板蓝根残渣按照相同条件进行一次或多次水提，合并水提液；

(5)步骤1)中水的用量为板蓝根残渣的5-20倍量(L/Kg)；

(6)步骤1)中，水提期间进行搅拌；

(7)步骤1)中，将得到的水提液在50℃-55℃下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；

(8)步骤2)中，乙醇沉淀的条件是：醇沉后乙醇的终浓度为60-80％，例如70-75％；优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；

(9)步骤2)中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀，合并上清液；

(10)步骤2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；

(11)步骤2)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；

(12)步骤2)中，透析进行一次或多次；

(13)步骤3)中所述浓缩为在50℃-55℃下进行减压浓缩。

6.板蓝根多糖，其包含通过以下方法制备得到的多糖成分中的一种或数种：

取权利要求4或5的板蓝根总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H₂O、0.25mol/L NaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，硫酸-苯酚法检测糖，分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C；

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，纯化获得多糖成分S1；和/或

多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，分别获得多糖成分S3和/或S4。

7.权利要求1的板蓝根多糖的制备方法，其包括以下步骤：

取权利要求4或5的板蓝根总多糖，溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H₂O、0.25mol/L NaHCO₃和0.5mol/L NaHCO₃洗脱，硫酸-苯酚法检测糖，分别得到多糖组分BLGP-A、BLGP-B、BLGP-C；

多糖组分BLGP-A经Sephadex G-75柱层析，纯化获得多糖成分S1；和/或

多糖组分BLGP-B经Sephadex G-100柱层析，分别获得多糖成分S3和/或S4。

8.组合物，其包含权利要求1或6的板蓝根多糖，任选地，还包含药用辅料和/或其它疫苗佐剂。

9.疫苗制剂或疫苗组合物，其包含权利要求1或6的板蓝根多糖或权利要求8的组合物。

10.疫苗佐剂，其包含权利要求1或6的板蓝根多糖。

11.权利要求1或6的板蓝根多糖作为疫苗佐剂的用途；或者在制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。

12.权利要求1或6的板蓝根多糖作为免疫调节剂的用途。

13.一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的权利要求1或6的板蓝根多糖的步骤。

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