CN102659958A

CN102659958A - 一种蒲公英多糖提取物及其制备方法和用途

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Publication number: CN102659958A
Application number: CN2012101693056A
Authority: CN
Inventors: 王顺春; 刘飞; 王宏伟; 鲍斌; 范洪伟; 施松善; 王峥涛; 胡之璧
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-05-28
Filing date: 2012-05-28
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2032-05-28
Also published as: CN102659958B

Abstract

本发明公开了一种蒲公英多糖提取物及其制备方法和用途。所述多糖提取物是由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离而得；所述多糖提取物中含有7～8wt%的多糖A、22～23wt%的多糖B、17～18wt%的多糖C、6～7wt%的多糖D、1～2wt%的多糖E、0.5～1.5wt%的多糖F。本发明所提供的蒲公英多糖提取物具有显著抗补体活性，可作为预防和/或治疗系统性免疫缺陷疾病的药物和功能性食品，使用安全，无副作用之忧，且制备工艺简单，质量稳定，适于规模化生产，具有广阔的应用前景和市场价值。

Description

一种蒲公英多糖提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种蒲公英多糖提取物及其制备方法和用途，属于中药技术领域。

背景技术

蒲公英（Herba Taraxaci）是菊科多年生草本，别名黄花地丁，黄花三七。具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋，用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。现代药理研究表明，蒲公英具有利胆保肝，抗内毒素，抗癌，降血糖，抗凝血，利尿，健脾胃，益生元，广谱抑菌和免疫促进等作用。

蒲公英作为药用植物在国内外研究已有很久的历史，蒲公英有丰富的营养价值，含有蛋白质、脂肪、碳水化合物及维生素等。（许丹等，蒲公英的化学研究，中国中药杂志，2004，29(3):229-230）。迄今为止，已见报道的蒲公英化学成分主要有黄酮类、三萜类、植物甾醇类、香豆素类、长链脂肪族类、倍半萜内酯类、色素类、挥发油、胆碱、乙酰酯类、酚酸类、绿原酸、咖啡酸、有机酸、氨基酸以及矿物质等（袁瑾等，野生植物蒲公英营养成分的研究，氨基酸和生物资源，2006，28(2):22-23），具体如：蒲公英甾醇(Taraxasterol)、胆碱(Choline)、菊糖(Inulin)、果胶(Pectin)；蒲公英醇(Taraxol)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-香树脂醇(β-Amyrin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、蒲公英赛醇(taraxerol)、蒲公英素(Taraxacerin)、蒲公英苦素(Taraxacin)和维生素A、B、C等。

补体系统是人体重要的免疫防御系统之一。补体系统的正常激活在消灭外来微生物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织以及维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。然而该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，导致人体自身正常组织的损伤和炎症反应，是炎症反应的重要介质。研究表明，与补体过度激活相关的疾病涉及类风湿性关节炎、老年性痴呆、急性呼吸窘迫综合征以及系统性红斑狼疮等多种疾病。有报道，重症非典型肺炎（SARS）和由H5N1型病毒感染引起的禽流感，临床上可发现免疫系统的过度反应症状，如ARDS，败血症休克及Reyes综合征等，上述反应症状被人与细胞免疫、体液免疫过度激活有关。鉴于补体过度激活在引发人类许多危重疾病中的重要作用，因此，对补体系统激活的抑制性治疗具有十分重要的临床意义。

天然药物中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，国内外已完成部分天然药物如麻黄、人参、杜仲等的筛选，发现自然界中广泛存在的某些多糖、蛋白质、多肽、甾类、萜类和生物碱等化学物具有显著的抗补体活性，其中以糖基化蛋白和多聚糖化合物为多。肝素是有糖醛酸和氨基葡萄糖聚合而成的一个硫酸化多糖，是研究较早、较成熟的补体抑制剂。但由于肝素具有抗凝血作用，在生物体内需较高浓度才能发挥药效，且副作用大，限制了其临床用途。申请号为200710046222.7的中国专利文献公开了一种具有抗补体活性的植物多糖，采用五种多糖的杂多糖，由鱼腥草、野菊花、茵陈、佩兰和草果制备，作用于补体C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C9组分，且不具有抗凝血作用。申请号为200710044099.5的中国专利文献公开了一种自杜仲提取的木制素在制备抗补体药物的用途。申请号为200910201362.6的中国专利文献公开了一种自苦参提取的黄酮类在制备抗补体药物的用途，所得的黄酮类化合物对补体系统的经典途径和旁路途径均有较强的抑制作用。但至今未见蒲公英及其多糖提取物的抗补体活性的相关研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种具有抗补体活性的蒲公英多糖提取物及其制备方法，以改进现有技术中蒲公英多糖的提取工艺和完善对蒲公英多糖的药理作用研究。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种蒲公英多糖提取物，由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离而得；所述多糖提取物中含有7～8wt%的多糖A、22～23wt%的多糖B、17～18wt%的多糖C、6～7wt%的多糖D、1～2wt%的多糖E、0.5～1.5wt%的多糖F；其中：多糖A的单糖组成为Ara:Man:Glc:Gal=2:1.0:1.7:4；多糖B的单糖组成为Rha:Ara:Gal=1.0:1.8:2.2；多糖C的单糖组成为Rha:Ara:Glc:Gal=1.1:4.5:1.0:5；多糖D的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.4:7.9:1:2.6:10.6；多糖E的单糖组成为Ara:Glc:Gal=1.4:1.0:2.7；多糖F的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.7:4.5:1:2.7:5.2；上述的单糖组成比例均为摩尔比。

一种所述蒲公英多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

a)首先将蒲公英全草用乙醇回流脱脂，然后过滤，挥干药渣中的乙醇；加水浸泡、煎煮提取；合并提取液，浓缩，离心，收集上清液；加入乙醇进行沉析；离心得沉淀，并挥干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析24～72小时；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品；

b)将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，离心；将沉淀再加水加热溶解，离心；合并两次离心所得上清液，上样于二乙胺基乙基（DEAE）阴离子交换柱，依次用蒸馏水、0.2、0.5、0.8、1.0mol/L的NaCl溶液及0.2mol/L的NaOH溶液阶梯式洗脱，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集各部位多糖洗脱液；减压浓缩所得各部位多糖洗脱液，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋进行流水透析24小时；浓缩透析液，冷冻干燥，即得所述的蒲公英多糖提取物。

作为进一步优选方案，所述回流脱脂的操作如下：向蒲公英全草中加入体积百分含量为95%的乙醇，加入的乙醇体积为蒲公英全草质量的2～4倍；然后进行回流1～3小时。

作为进一步优选方案，所述提取的操作如下：向药渣中加入去离子水，于室温浸泡1～3小时，然后加热煮沸进行煎煮2～4小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作1～3次；每次加水体积为药渣质量的8～10倍。

作为进一步优选方案，将提取液浓缩到在60～80℃的相对密度为1.0～1.5。

作为进一步优选方案，所述沉析的操作如下：在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的乙醇，乙醇的加入体积为上清液体积的2～4倍；加毕，在0～5℃静置12～24小时。

本发明所述的蒲公英多糖提取物的一种用途，是以所述蒲公英多糖提取物作为抗补体活性成分用于制备保健食品。

本发明所述的蒲公英多糖提取物的另一种用途，是以所述蒲公英多糖提取物作为抗补体活性成分用于制备药物制剂。

所述的药物制剂可以是任何一种适合于临床使用的剂型，包括固体制剂（如胶囊、片剂、颗粒剂等）、半固体制剂（如软膏等）、液体制剂（如口服液、混悬剂、乳剂等）、注射剂等。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所提供的蒲公英多糖提取物具有显著抗补体活性，可作为预防和/或治疗系统性免疫缺陷疾病的药物和功能性食品，使用安全，无副作用之忧，且制备工艺简单，质量稳定，适于规模化生产，具有广阔的应用前景和市场价值。

附图说明

图1为本发明中所述的洗脱曲线图；

图2为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖A的GC-MS图；

图3为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖B的GC-MS图；

图4为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖C的GC-MS图；

图5为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖D的GC-MS图；

图6为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖E的GC-MS图；

图7为本发明所述的蒲公英多糖提取物中的多糖F的GC-MS图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。实施例中所述的单糖组成比例均为摩尔比；文中各单糖缩写含义如下：Rha表示α-D-鼠李糖；Ara表示α-D-阿拉伯糖；Man表示α-D-甘露糖；Glc表示α-D-葡萄糖；Gal表示α-D-半乳糖。

实施例1

取蒲公英全草置于提取器内，加入体积百分含量为95%的乙醇，加入的乙醇体积为蒲公英全草质量的2倍；进行回流脱脂2小时，过滤，挥干药渣中的乙醇；向药渣中加入去离子水，于室温浸泡3小时，然后加热煮沸进行煎煮4小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作3次；每次加水体积为药渣质量的10倍；合并提取液，将提取液浓缩到在80℃的相对密度为1.2，离心，收集上清液；在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的乙醇，乙醇的加入体积为上清液体积的4倍；加毕，置入4℃冰箱静置12小时；离心得沉淀，并挥干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析72小时，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及盐和一些水溶性杂质；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率约为全草质量的7.13%。

将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm离心10min；将沉淀再加水加热溶解，再次于8500rpm离心10min；合并两次离心所得上清液，上样于二乙胺基乙基（DEAE）阴离子交换柱，依次用蒸馏水、0.2、0.5、0.8、1.0mol/L的NaCl溶液及0.2mol/L的NaOH溶液阶梯式洗脱，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线（如图1所示）分别收集各部位多糖洗脱液；减压浓缩所得各部位多糖洗脱液，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋分别进行流水透析24小时；浓缩透析液，冷冻干燥，即得组成所述蒲公英多糖提取物的各多糖：多糖A（得率为7.5wt%）、多糖B（得率为22.9wt%）、多糖C（得率为17.3wt%）、多糖D（得率为6.5wt%）、多糖E（得率为1.2wt%）、多糖F（得率为0.85wt%）。

对上述各多糖进行单糖组成分析：取2mg多糖置于试管中，加入新鲜配制的浓度为80mg/mL的4-甲基吗啡啉硼烷水溶液50μL和3mol/L的三氟乙酸水溶液（TFA）200μL，混匀后于80℃水浴加热5分钟；待溶液冷却后再加入50μL 4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，于120℃油浴还原1小时；待溶液冷却后再加入100μL4-甲基吗啡啉硼烷水溶液，于50℃旋蒸蒸干，再加2mL乙腈蒸干3次；等其冷却至室温后，加入醋酐和三氟乙酸各200μL，于50℃水浴中密封乙酰化10分钟，加2mL蒸馏水终止反应，再加氯仿3mL萃取，然后用蒸馏水洗多次，过无水硫酸钠柱干燥，装瓶进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件为：TR-5MS(Thermo)，色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm）；程序升温条件：升温从140℃开始，以2℃/min升温至198℃，保温4min，再以4℃/min升温至214℃，再以1℃/min升温至217℃，保持4min，最后以3℃/min升温至250℃，保持5min；进样口温度为250℃；载气为He，流速为1mL/min。

图2是所述多糖A的GC-MS图，由图2可见：所述多糖A的单糖组成为Ara:Man:Glc:Gal=2:1:1.7:4；

图3是所述多糖B的GC-MS图，由图3可见：所述多糖B的单糖组成为Rha:Ara:Gal=1.0:1.8:2.2；

图4是所述多糖C的GC-MS图，由图4可见：所述多糖C的单糖组成为Rha:Ara:Glc:Gal=1.1:4.5:1.0:5；

图5是所述多糖D的GC-MS图，由图5可见：所述多糖D的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.4:7.9:1:2.6:10.6；

图6是所述多糖E的GC-MS图，由图6可见：所述多糖E的单糖组成为Ara:Glc:Gal=1.4:1.0:2.7；

图7是所述多糖F的GC-MS图，由图7可见：所述多糖多糖F的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.7:4.5:1:2.7:5.2。

实施例2

取蒲公英全草置于提取器内，加入体积百分含量为95%的乙醇，加入的乙醇体积为蒲公英全草质量的3倍；进行回流脱脂2小时，过滤，挥干药渣中的乙醇；向药渣中加入去离子水，于室温浸泡2小时，然后加热煮沸进行煎煮3小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作2次；每次加水体积为药渣质量的9倍；合并提取液，将提取液浓缩到在70℃的相对密度为1.1，离心，收集上清液；在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的乙醇，乙醇的加入体积为上清液体积的3倍；加毕，置入4℃冰箱静置12小时；离心得沉淀，并挥干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析72小时，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及盐和一些水溶性杂质；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率约为全草质量的6.54%。

将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm离心10min；将沉淀再加水加热溶解，再次于8500rpm离心10min；合并两次离心所得上清液，上样于二乙胺基乙基（DEAE）阴离子交换柱，依次用蒸馏水、0.2、0.5、0.8、1.0mol/L的NaCl溶液及0.2mol/L的NaOH溶液阶梯式洗脱，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线（如图1所示）分别收集各部位多糖洗脱液；减压浓缩所得各部位多糖洗脱液，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋分别进行流水透析24小时；浓缩透析液，冷冻干燥，即得组成所述蒲公英多糖提取物的各多糖：多糖A（得率为7.7wt%）、多糖B（得率为22.6wt%）、多糖C（得率为17.5wt%）、多糖D（得率为6.9wt%）、多糖E（得率为1.4wt%）、多糖F（得率为0.75wt%）。

实施例3

取蒲公英全草置于提取器内，加入体积百分含量为95%的乙醇，加入的乙醇体积为蒲公英全草质量的4倍；进行回流脱脂2小时，过滤，挥干药渣中的乙醇；向药渣中加入去离子水，于室温浸泡1小时，然后加热煮沸进行煎煮2小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作1次；加水体积为药渣质量的8倍；合并提取液，将提取液浓缩到在60℃的相对密度为1.5，离心，收集上清液；在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的乙醇，乙醇的加入体积为上清液体积的2倍；加毕，置入4℃冰箱静置12小时；离心得沉淀，并挥干其中的乙醇；用水溶解沉淀，所得溶液用截留分子量为10000道尔顿的透析袋在水中透析72小时，以除去其中的小分子多糖、蛋白、乙醇及盐和一些水溶性杂质；浓缩透析液，冷冻干燥，得蒲公英多糖提取物粗品，得率约为全草质量的6.07%。

将上述蒲公英多糖提取物粗品加水溶解，于8500rpm离心10min；将沉淀再加水加热溶解，再次于8500rpm离心10min；合并两次离心所得上清液，上样于二乙胺基乙基（DEAE）阴离子交换柱，依次用蒸馏水、0.2、0.5、0.8、1.0mol/L的NaCl溶液及0.2mol/L的NaOH溶液阶梯式洗脱，分管收集；收集液用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线（如图1所示）分别收集各部位多糖洗脱液；减压浓缩所得各部位多糖洗脱液，用截留分子量为3500道尔顿的透析袋分别进行流水透析24小时；浓缩透析液，冷冻干燥，即得组成所述蒲公英多糖提取物的各多糖：多糖A（得率为7.9wt%）、多糖B（得率为22.3wt%）、多糖C（得率为17.7wt%）、多糖D（得率为6.2wt%）、多糖E（得率为1.7wt%）、多糖F（得率为0.95wt％)。

实施例4

检测本发明所述蒲公英多糖提取物及其所含的各多糖的经典途径抗补体的CP₅₀值，补体经典途径的溶血活性（CP₅₀）测定取确定临界浓度的补体与供试品混匀，按抗补体实验经典方法学操作。具体为：

37℃水浴30min后低温离心10min，取每管上清液离心后取0.2mL，用酶标仪在405nm下测定吸收度。以样品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图，计算CP₅₀值。具体检测结果见表1所示。

表1蒲公英多糖提取物及其所含的各多糖的经典途径抗补体的CP₅₀值

样品	CP₅₀(mg/mL)
		多糖提取物	0.027
多糖A	1.34
		多糖B	1.27
多糖C	0.284
		多糖D	0.11
多糖E	0.0047
		多糖F	0.019
阳性对照肝素	0.0206

由表1可见：本发明所述的蒲公英多糖提取物具有抗补体活性，且其中所含的多糖C、D、E、F均显示较强的抗补体活性。可望用于制备预防和/或治疗系统性免疫缺陷疾病的药物和功能性食品。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种蒲公英多糖提取物，其特征在于：由蒲公英全草经水提醇沉、透析截取分子量大于10000道尔顿的组分，然后经阴离子交换柱层析分离而得；所述多糖提取物中含有7～8wt%的多糖A、22～23wt%的多糖B、17～18wt%的多糖C、6～7wt%的多糖D、1～2wt%的多糖E、0.5～1.5wt%的多糖F；其中：多糖A的单糖组成为Ara:Man:Glc:Gal=2:1:1.7:4；多糖B的单糖组成为Rha:Ara:Gal=1.0:1.8:2.2；多糖C的单糖组成为Rha:Ara:Glc:Gal=1.1:4.5:1.0:5；多糖D的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.4:7.9:1:2.6:10.6；多糖E的单糖组成为Ara:Glc:Gal=1.4:1.0:2.7；多糖F的单糖组成为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.7:4.5:1:2.7:5.2；上述的单糖组成比例均为摩尔比。

2.一种权利要求1所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述回流脱脂的操作如下：向蒲公英全草中加入体积百分含量为95%的乙醇，加入的乙醇体积为蒲公英全草质量的2～4倍；然后进行回流1～3小时。

4.根据权利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述提取的操作如下：向药渣中加入去离子水，于室温浸泡1～3小时，然后加热煮沸进行煎煮2～4小时，过滤，对所得药渣再重复上述操作1～3次；每次加水体积为药渣质量的8～10倍。

5.根据权利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于：将提取液浓缩到在60～80℃的相对密度为1.0～1.5。

6.根据权利要求2所述的蒲公英多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述沉析的操作如下：在不断搅拌下向上清液中加入体积百分含量为95%的乙醇，乙醇的加入体积为上清液体积的2～4倍；加毕，在0～5℃静置12～24小时。

7.一种权利要求1所述的蒲公英多糖提取物的用途，其特征在于：以所述蒲公英多糖提取物作为抗补体活性成分用于制备保健食品。

8.一种权利要求1所述的蒲公英多糖提取物的用途，其特征在于：以所述蒲公英多糖提取物作为抗补体活性成分用于制备药物制剂。