CN113698507A - 一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法和应用，它属于多糖修饰改性技术领域。本发明要解决现有多糖保水剂性能有限、锁水效果差的问题，同时淀粉经过蒸煮处理后其成分主要是RDS，而SDS与RS含量很低的问题。制备方法：一、制备纯化蒲公英多糖；二、制备羧甲基化蒲公英多糖。本发明用于羧甲基化蒲公英多糖的制备和应用。
Description
技术领域
本发明属于多糖修饰改性技术领域。
背景技术
分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得不同结构类型衍生物的方法。多糖是一种天然高分子物质，来源广泛易得，具有生物活性，生物相容性，低或无细胞毒性。多糖的生物活性与其结构密切相关，用适当的方法对多糖的结构进行分子修饰，能在一定程度上增强天然多糖的生物活性或使多糖产生新的活性、降低某些毒副作用，从而有利于多糖类的开发与应用。羧甲基化多糖(carboxymethylated polysaccharide，CP)是指多糖链中单糖分子上的一个或几个羟基被羧甲基基团取代而形成的一类结构复杂、活性多样的、具有良好溶解特性的多聚电解质产物。
蒲公英(Taraxacum officinale)多年生草本植物，俗称婆婆丁、黄花地丁等，是国家卫计委公布的药食同源材料之一。其药用价值早已载入各种医书，性平味甘、微苦，可清热解毒、消肿散结，有“天然抗生素”之美称。在食用方面，近年已被一些国家和地区列为“天然野味”和“健康食品”。蒲公英的化学成分主要有多糖类、黄酮类、三萜类、甾醇类和香豆精类等。其中的多糖作为重要组分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗辐射、降血糖等多种作用。
肉的保水性即持水性、系水性，是指肌肉在受外力作用，如加压、加热、油炸、冷冻、解冻、腌制等加工或贮藏条件下，保持其原有水分与添加水分的能力，是肉的重要品质指标，与肉的其它品质指标如风味、颜色、嫩度等密切相关。增强肉的保水性对于提高肉品品质和企业经济效益有重要的影响，已成为国内外肉类行业的研究重点。
传统的保水方法是利用三聚磷酸盐、焦磷酸盐、六偏磷酸盐的混合制剂来提高肉的持水力。但当磷酸盐用量超过0.5％时，会降低人体钙的吸收，导致骨骼组织中钙的流失。采用多糖作为保水剂可以避免膳食中磷酸盐摄入过量，但存在保水性能欠佳、锁水效果差的问题。
淀粉按其消化特性可分为快速消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)。摄入RDS可引起人体血糖水平的快速升高，关于RDS对健康带来的好处报道有限；SDS能够以较慢的速率在小肠中完全消化，具有持续释放能量，维持餐后血糖稳态，预防和治疗各种与饮食相关慢性疾病的特殊生理学功能；RS不能消化，可被结肠中的微生物菌群发酵产生短链脂肪酸，降低肠道内的pH，调节人体肠道菌群和免疫功能，对人体健康具有极大的益处。如预防结肠癌、降低胆固醇、抑制脂肪积累和增加矿物质吸收等。研究表明，各种食材中的淀粉经过蒸煮处理后其成分主要是RDS，而SDS与RS含量很低。因此，研究SDS和RS的制备、性质及其形成机理日益成为食品科学和现代营养学领域的一个研究热点。
发明内容
本发明要解决现有多糖保水剂性能有限、锁水效果差的问题，同时淀粉经过蒸煮处理后其成分主要是RDS，而SDS与RS含量很低的问题，而提供一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法和应用。
一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，它是按以下步骤进行：
一、对蒲公英多糖进行提取及纯化，得到纯化蒲公英多糖；
二、羧甲基化蒲公英多糖制备：
将纯化蒲公英多糖、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A和异丙醇A搅拌混合2h～4h后，在搅拌条件下加入羧甲基化试剂，在温度为50℃～70℃的条件下，搅拌2h～4h，然后冷却至室温并调节pH至6.5～7.5，自来水流水透析40h～50h，蒸馏水透析20h～30h，浓缩至原体积的5％～10％，最后冻干，得到羧甲基化蒲公英多糖；
所述的羧甲基化试剂为氯乙酸、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B及异丙醇B的混合物；所述的氯乙酸的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B的体积比为 1g:(1.5～4)mL；所述的氯乙酸的质量与异丙醇B的体积比为1g:(4～8)mL；
所述的纯化蒲公英多糖的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A的体积比为 1g:(10～20)mL；所述的纯化蒲公英多糖的质量与异丙醇A的体积比为1g:(20～40)mL；所述的纯化蒲公英多糖与氯乙酸的质量比为1:(5～7)。
羧甲基化蒲公英多糖的应用，羧甲基化蒲公英多糖用于增加玉米淀粉中抗性淀粉的含量，降低玉米淀粉的体外消化率；羧甲基化蒲公英多糖用于提高肉的保水性。
本发明的有益效果是：
化学结构修饰是指对分子的结构和构型用理化手段做适当的修饰，本发明通过对蒲公英多糖进行了适当的羧甲基化修饰，改变蒲公英多糖的分子结构和构型，使其理化性质发生改变成为一种新的化合物的衍生物，引入了活性官能团，从而增强了蒲公英多糖的生物学活性。相比未经修饰的蒲公英多糖，羧甲基蒲公英多糖对复合肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度(最高可达8g/cm2以上)和保水性(最高可达到66％以上)的作用效果得到提升，体外消化实验表明羧甲基蒲公英多糖可增加玉米淀粉的抗性淀粉含量，降低淀粉消化率，当加入5％的羧甲基化多糖并蒸煮处理后，RDS的含量由85.18±0.20％降至80.21±0.11％。SDS和RS含量分别上升至12.30±0.06％和7.09±0.08％。
本发明用于一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法和应用。
附图说明：
图1为标准单糖衍生物的气相色谱图，1为鼠李糖(Rha)，2为岩藻糖(Fuc)，3 为阿拉伯糖(Ara)，4为木糖(Xyl)，5为甘露糖(Man)，6为葡萄糖(Glc)，7为半乳糖(Gal)，8为内标物肌醇；
图2为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖水解单糖衍生物气相色谱图，1为葡萄糖，2为半乳糖，3为肌醇；
图3为红外谱图对比图，a为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖，b为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖；
图4为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的13C NMR图；
图5为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H NMR图；
图6为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-1H COPY图；
图7为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-13C HSQC图；
图8为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-13C HMBC图；
图9为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖对凝胶强度和保水性的影响，其中柱状为凝胶强度，线条为保水性；
图10为肌原纤维蛋白与含有质量百分数为5％羧甲基化蒲公英多糖的多糖和肌原纤维蛋白的红外光谱图，a为肌原纤维蛋白，b为含有质量百分数为5％羧甲基化蒲公英多糖的多糖和肌原纤维蛋白；
图11为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖添加不同量的肌原纤维蛋白的SEM图像，1为0％，2为1％，3为2％，4为3％，5为4％，6为5％；
图12为玉米淀粉与羧甲基化蒲公英多糖复配体系糊化后的红外谱图，A为玉米淀粉、 B为玉米淀粉-1％羧甲基化多糖、C为玉米淀粉-2％羧甲基化多糖、D为玉米淀粉-3％羧甲基化多糖、E为玉米淀粉-4％羧甲基化多糖、F位玉米淀粉-5.0％羧甲基化多糖。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，它是按以下步骤进行：
一、对蒲公英多糖进行提取及纯化，得到纯化蒲公英多糖；
二、羧甲基化蒲公英多糖制备：
将纯化蒲公英多糖、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A和异丙醇A搅拌混合2h～4h后，在搅拌条件下加入羧甲基化试剂，在温度为50℃～70℃的条件下，搅拌2h～4h，然后冷却至室温并调节pH至6.5～7.5，自来水流水透析40h～50h，蒸馏水透析20h～30h，浓缩至原体积的5％～10％，最后冻干，得到羧甲基化蒲公英多糖；
所述的羧甲基化试剂为氯乙酸、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B及异丙醇B的混合物；所述的氯乙酸的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B的体积比为 1g:(1.5～4)mL；所述的氯乙酸的质量与异丙醇B的体积比为1g:(4～8)mL；
所述的纯化蒲公英多糖的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A的体积比为 1g:(10～20)mL；所述的纯化蒲公英多糖的质量与异丙醇A的体积比为1g:(20～40)mL；所述的纯化蒲公英多糖与氯乙酸的质量比为1:(5～7)。
本实施方式的有益效果是：
化学结构修饰是指对分子的结构和构型用理化手段做适当的修饰，本实施方式通过对蒲公英多糖进行了适当的羧甲基化修饰，改变蒲公英多糖的分子结构和构型，使其理化性质发生改变成为一种新的化合物的衍生物，引入了活性官能团，从而增强了蒲公英多糖的生物学活性。相比未经修饰的蒲公英多糖，羧甲基蒲公英多糖对复合肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度(最高可达8g/cm2以上)和保水性(最高可达到66％以上)的作用效果得到提升，体外消化实验表明羧甲基蒲公英多糖可增加玉米淀粉的抗性淀粉含量，降低淀粉消化率，当加入5％的羧甲基化多糖并蒸煮处理后，RDS的含量由85.18±0.20％降至 80.21±0.11％。SDS和RS含量分别上升至12.30±0.06％和7.09±0.08％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的提取具体是按以下步骤进行：
①、蒲公英根粉末预处理：
将蒲公英根粉末加到脂肪提取器的抽提筒中，采用质量百分数为80％～90％的乙醇，磁力搅拌回流8h～12h，然后在温度为50℃～60℃的条件下烘干，得到脱脂后的蒲公英根粉末；
②、水提醇沉法提取蒲公英多糖：
a、将脱脂后的蒲公英根粉末溶于蒸馏水中，在温度为60℃～80℃的条件下，水浴加热提取2h～3h，得到提取液，在转速为3500r/min～4500r/min的条件下，将提取液离心10min～20min，得到沉淀物及上清液；
b、将沉淀物按步骤②a重复提取1次～2次；
c、将步骤②a及步骤②b中得到的上清液合并，然后依次进行过滤并旋蒸浓缩至原体积的5％～10％，得到浓缩物，将浓缩物置于质量百分数为80％～95％的乙醇中沉淀，低温静置过夜，最后在转速为3500r/min～4500r/min的条件下，离心10min～20min，得到粗蒲公英多糖。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤①中所述的蒲公英根粉末的质量与质量百分数为80％～90％的乙醇的体积比为1g:(5～20)mL；步骤②a中所述的脱脂后的蒲公英根粉末的质量与蒸馏水的体积比为1g:(20～40)mL；步骤②c中所述的过滤并旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：采用布氏漏斗经减压抽滤去除沉淀，滤液通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下浓缩；步骤②c中所述的低温静置过夜具体为在温度为-4℃的条件下，静置12h～24h。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的纯化，具体是按以下步骤进行：
①、将粗蒲公英多糖溶于蒸馏水中，得到粗多糖溶液；
②、向粗多糖溶液中加入Sevag试剂并振摇20min～40min，然后在转速为 3000r/min～4000r/min的条件下，离心10min～15min并去除沉淀，得到上层多糖溶液；
所述的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积的1:4；
③、将上层多糖溶液按步骤②重复，直至多糖溶液在280nm处无吸光度，得到去除蛋白质的蒲公英多糖溶液；
④、将去除蛋白质的蒲公英多糖溶液透析去除多糖溶液中的有机溶剂，然后旋蒸浓缩至原体积的5％～10％，得到浓缩物，将浓缩物置于质量百分数为80％～95％的乙醇中沉淀，最后冷冻干燥，得到干燥后的多糖；
⑤、将干燥后的多糖溶于蒸馏水中，得到浓度为4mg/mL～8mg/mL的多糖溶液，采用D101大孔树脂柱分离浓度为4mg/mL～8mg/mL的多糖溶液，在流速为1mL/min～2.0mL/min的条件下，用蒸馏水洗脱，然后利用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖浓度，将多糖洗脱液冷冻干燥，得到纯化蒲公英多糖。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤①中所述的粗蒲公英多糖的质量与蒸馏水的体积比为1g:(200～300)mL；步骤②中所述的Sevag试剂为丁醇与氯仿的混合物，且丁醇与氯仿的体积比1:4。其它与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤④中所述的透析为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋，蒸馏水透析20h～30h；步骤④中所述的旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下加热浓缩；步骤④中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥15h～30h；步骤⑤中所述的D101大孔树脂柱尺寸为2.5cm×(40～60)cm；步骤⑤中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥 15h～30h。其它与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中利用浓度为0.5mol/L的HCl溶液调节pH为6.5～7.5。其它与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七之一不同的是：步骤二中所述的自来水流水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋；步骤二中所述的蒸馏水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋。其它与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤二中所述的浓缩具体是通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下加热浓缩；步骤二中所述的冻干具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥15h～30h。其它与具体实施方式六至八相同。
具体实施方式十：本实施方式羧甲基化蒲公英多糖的应用，羧甲基化蒲公英多糖用于增加玉米淀粉中抗性淀粉的含量，降低玉米淀粉的体外消化率；羧甲基化蒲公英多糖用于提高肉的保水性。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，它是按以下步骤进行：
一、对蒲公英多糖进行提取及纯化，得到纯化蒲公英多糖；
二、羧甲基化蒲公英多糖制备：
将2.5g纯化蒲公英多糖、30mL质量百分数为20％的NaOH溶液A和72mL异丙醇 A搅拌混合3h后，在搅拌条件下加入羧甲基化试剂，在温度为60℃下的条件下，搅拌4h，然后冷却至室温并调节pH至7，自来水流水透析2d，蒸馏水透析1d，浓缩至原体积的10％，最后冻干，得到羧甲基化蒲公英多糖；
步骤二中所述的羧甲基化试剂为15.5g氯乙酸、30mL质量百分数为20％的NaOH溶液B及72mL异丙醇B的混合物；
步骤二中利用浓度为0.5mol/L的HCl溶液调节pH为7。
步骤二中所述的自来水流水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋；步骤二中所述的蒸馏水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋。
步骤二中所述的浓缩具体是过旋转蒸发仪于温度为50℃的条件下加热浓缩；步骤二中所述的冻干具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥24h。
步骤一中所述的提取具体是按以下步骤进行：
①、蒲公英根粉末预处理：
将50g蒲公英根粉末加到脂肪提取器的抽提筒中，采用300mL质量百分数为90％的乙醇，磁力搅拌回流8h，然后在温度为60℃的条件下烘干，得到脱脂后的蒲公英根粉末；
②、水提醇沉法提取蒲公英多糖：
a、将30g脱脂后的蒲公英根粉末溶于900mL蒸馏水中，在温度为80℃的条件下，水浴加热提取3h，得到提取液，在转速为4000r/min的条件下，将提取液离心15min，得到沉淀物及上清液；
b、将沉淀物按步骤②a重复提取1次；
c、将步骤②a及步骤②b中得到的上清液合并，然后依次进行过滤并旋蒸浓缩至原体积的10％，得到浓缩物，将15mL浓缩物置于85mL质量百分数为95％的乙醇中沉淀，低温静置过夜，最后在转速为4000r/min的条件下，离心15min，得到粗蒲公英多糖。
步骤②c中所述的过滤并旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：采用布氏漏斗经减压抽滤去除沉淀，滤液通过旋转蒸发仪于温度为50℃的条件下浓缩；步骤②c中所述的低温静置过夜具体为在温度为-4℃的条件下，静置12h。
步骤一中所述的纯化，具体是按以下步骤进行：
①、将0.2g粗蒲公英多糖溶于50mL蒸馏水中，得到粗多糖溶液；
②、向粗多糖溶液中加入Sevag试剂并振摇30min，然后在转速为4000r/min的条件下，离心10min并去除沉淀，得到上层多糖溶液；
所述的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积的1:4；
③、将上层多糖溶液按步骤②重复，直至多糖溶液在280nm处无吸光度，得到去除蛋白质的蒲公英多糖溶液；
④、将去除蛋白质的蒲公英多糖溶液透析去除多糖溶液中的有机溶剂，然后旋蒸浓缩至原体积的10％，得到浓缩物，将15mL浓缩物置于85mL质量百分数为80％的乙醇中沉淀，最后冷冻干燥，得到干燥后的多糖；
⑤、将干燥后的多糖溶于蒸馏水中，得到浓度为5mg/mL的多糖溶液，采用D101大孔树脂柱分离浓度为5mg/mL的多糖溶液，在流速为2.0mL/min的条件下，用蒸馏水洗脱，然后利用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖浓度，将多糖洗脱液冷冻干燥，得到纯化蒲公英多糖。
步骤②中所述的Sevag试剂为丁醇与氯仿的混合物，且丁醇与氯仿的体积比1:4；
步骤④中所述的透析为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋，蒸馏水透析24h；步骤④中所述的旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：通过旋转蒸发仪于温度为50℃的条件下加热浓缩；步骤④中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥24h；步骤⑤中所述的D101大孔树脂柱尺寸为2.5cm×40cm；步骤⑤中蒸馏水洗脱流速为2mL/管，用量约100mL；步骤⑤中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥24h。
(一)蒲公英多糖单糖组成结构及分子量
图1为标准单糖衍生物的气相色谱图，1为鼠李糖(Rha)，2为岩藻糖(Fuc)，3 为阿拉伯糖(Ara)，4为木糖(Xyl)，5为甘露糖(Man)，6为葡萄糖(Glc)，7为半乳糖(Gal)，8为内标物肌醇；图2为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖水解单糖衍生物气相色谱图，1为葡萄糖，2为半乳糖，3为肌醇。由图可知，蒲公英多糖单糖组成为葡萄糖和半乳糖，摩尔比为2.6:1。
图3为红外谱图对比图，a为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖，b为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖；由图可知，羧甲基化多糖在3379.3、2934.7、1607.6、1431.2和1078.2cm-1处有特征吸收峰。在3379.3cm-1处有典型较宽的吸收峰，表明存在分子间的O-H伸缩振动；2934.7cm-1的特征吸收峰与饱和C-H健伸缩振动有关。1078.2cm-1的吸收峰由糖环上和糖苷键上C-O伸缩振动所引起的。1607.6、1431.2和1330.9cm-1处的三个特征峰为-COOH的特征吸收峰，且羧甲基化多糖的峰强度明显比原糖的增大，表明衍生化成功。
图4为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的13C NMR图；图5为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H NMR图；图6为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-1HCOPY图；图7为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-13C HSQC图；图8为实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖的1H-13C HMBC图；
表1蒲公英多糖1H和13C NMR的化学位移
经核磁确定，实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖主要糖残基为→4)-α-D-Glcp-(1→，→6)-α-D-Glcp-(1→，→2,4)-β-D-Galp-(1→，→4)-β-D-Galp-(1→。
经凝胶渗透色谱测试，实施例一步骤一制备的纯化蒲公英多糖重均分子量为470kDa，经羧甲基化修饰后，实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖重均分子量为292kDa。
取代度测定：取10mg实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖置于50mL锥形瓶中，在温度为100℃的烘干箱内干燥，取出冷却至室温，然后加入3mL质量百分数为70％的甲醇溶液，混合后放置3min～5min。再向其中加入10mL水及50mL浓度为0.5mol/L的NaOH 溶液，混合后振荡直至样品溶解。最后向其中滴加甲基红指示剂后，用盐酸滴定至滴定终点，记录所用盐酸体积，根据如下公式计算多糖羧甲基化取代度(DS)：
式中：V0——加入的NaOH的体积，mL；
V2——初始未滴定前HCl的体积，mL；
V1——滴定后剩余HCl的体积，mL；
M0——加入的NaOH的浓度，mol/L，本实验中为0.5mol/L；
M——测定所用HCl的浓度，mol/L，本实验中为1.434mol/L；
W——测定所用样品的质量，g；
经测试实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖取代度为0.87±0.12。
(二)保水性实验：
1、猪肉肌原纤维蛋白的提取：
剔除肌肉的结缔组织和脂肪，切成1cm2左右的薄片，称取80g，用搅拌机低档搅碎，搅拌10s，间隔10s，重复搅拌并间隔3次，间隔时可用冰浴防止蛋白质变性及钻头发热，然后加入8倍质量的缓冲液A(缓冲液A中KCl的浓度为0.1M，MgCl2的浓度为2mM， EGTA的浓度为1mM，DTT的浓度为0.5mM，K2HPO4的浓度为10mM，并用HCl调 pH＝7.0)，冰浴中匀浆机1档高速分散10s，间隔10s，重复分散并间隔3次，20目过滤筛过滤一次，在转速为2000g/min及温度为4℃的条件下，离心15min，弃上清液，取沉淀物，得到的沉淀物即为粗的肌原纤维蛋白，向粗的肌原纤维蛋白中加入8倍质量缓冲液B (缓冲液B中NaCl的浓度为0.1M，NaN3的浓度为1mM)，用20目过滤筛过滤一次，在转速为2000g/min及温度为4℃的条件下，离心15min，弃上清液，取沉淀物，再次加入 8倍质量缓冲液B，重复以上过筛、离心等操作，共重复3次，得到的沉淀物即为纯肌原纤维蛋白，将肌原纤维蛋白密封好，置于4℃保存备用。
2、多糖、肌原纤维蛋白热诱导凝胶的制备：
稀释肌原纤维蛋白至浓度为40mg/mL，然后添加实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖，冰浴中用匀浆机分散10s，得到羧甲基化蒲公英多糖和肌原纤维蛋白混合液，羧甲基化蒲公英多糖和肌原纤维蛋白混合液中羧甲基化蒲公英多糖的质量百分数分别为0％、1％、2％、3％、4％及5％，分装于离心管中，然后将离心管置于水浴锅中，在加热速度为 1℃/min的条件下，将离心管的温度由25℃升温至80℃，并在温度为80℃的条件下，保持20min，形成凝胶，将凝胶用自来水冷却30min，最后置于温度为4℃的条件下冷却平衡12h，得到含有羧甲基化蒲公英多糖的蛋白质凝胶，含有羧甲基化蒲公英多糖的蛋白质凝胶中羧甲基化蒲公英多糖的质量百分数为0％、1％、2％、3％、4％及5％(w/w)，最后进行保水性测试。
3、凝胶保水性的测定：
分别称取一定量含有羧甲基化蒲公英多糖的蛋白质凝胶，羧甲基化蒲公英多糖的蛋白质凝胶中羧甲基化蒲公英多糖的质量百分数为0％、1％、2％、3％、4％及5％(w/w)。在转速为10000r/min及温度为4℃的条件下，离心10min，离心后用吸水纸将离心出的水分吸出，离心前后称重测保水性WHC，每个样做3个平行。
其中W1和W2分别表示离心前后凝胶样品的重量；
图9为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖对凝胶强度和保水性的影响，其中柱状为凝胶强度，线条为保水性；凝胶强度和保水能力通常用于客观评价肉和肉制品的质量和产量。凝胶强度和保水能力均受多糖浓度的影响。由图可知，在相同蛋白质浓度下，多糖浓度从0％增加到5％，引起了凝胶强度和保水能力明显的改善。羧甲基化蒲公英多糖浓度为0％、1％、2％、3％、4％、5％的样品的凝胶强度分别为6.61±0.11、6.70±0.13、6.92±0.16、 7.25±0.12、7.58±0.12、8.92±0.16g/cm2，保水能力分别为50.70±2.41％、56.80±1.00％、 59.87±2.02％、64.90±2.94％、65.83±1.03％、66.89±1.34％。而同样条件下添加5％未衍生化的蒲公英多糖时，凝胶强度仅为6.86±0.08g/cm2、保水能力为59.66±0.42％。
图10为肌原纤维蛋白与含有质量百分数为5％羧甲基化蒲公英多糖的多糖和肌原纤维蛋白的红外光谱图，a为肌原纤维蛋白，b为含有质量百分数为5％羧甲基化蒲公英多糖的多糖和肌原纤维蛋白；由图可知，添加5％羧甲基多糖和未添加多糖的肌原纤维蛋白红外光谱一致，表明了在肌原纤维蛋白中添加多糖没有改变猪肌原纤维蛋白的结构，未产生新的官能团。在3565cm-1～3114cm-1范围内有一个宽带，这主要由于-OH基团伸缩振动形成的，添加羧甲基多糖后-OH基团的伸缩振动强度有所增加。
4、扫描电镜表征(SEM)：
分别将含有羧甲基化蒲公英多糖的蛋白质凝胶，切成小块，蛋白质凝胶中羧甲基化蒲公英多糖的质量百分数为0％、1％、2％、3％、4％及5％(w/w)，然后置于质量百分数为2.5％的戊二醛溶液中，在温度为4℃的条件下固定过夜，用浓度为0.1mol/L及pH为 7.3的磷酸盐缓冲液冲洗3次，再用质量百分数为1％的锇酸溶液固定化样品，再次用浓度为0.1mol/L及pH为7.3的磷酸盐缓冲液冲洗，然后依次用质量百分数为50％、70％、 90％及100％的乙醇脱水，最后用扫描电镜分析仪观察样品的表面形态。
图11为实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖添加不同量的肌原纤维蛋白的SEM图像，1为0％，2为1％，3为2％，4为3％，5为4％，6为5％。用扫描电镜分析仪观察样品的表面形态，添加羧甲基多糖使肌原纤维蛋白微观结构有一定变化。未添加羧甲基多糖的纯肌原纤维蛋白表面存在明显的、直径较大的孔洞和空隙。随着羧甲基多糖的添加，产生了明显的充填效应，肌原纤维蛋白三维网络的紧凑性得到提高，孔洞直径变小，空隙数目有所增加。
以上红外光谱和SEM表征结果表明，羧甲基化蒲公英多糖具有长链结构，其分子上的羧基和多羟基与水分子结合后，与肌原纤维蛋白形成的网状凝胶能截留大量的水，使其具有更好的持水能力、稳定性。相比未经羧甲基衍生化的多糖，亲水基团羧甲基的引入可进一步增加多糖与蛋白质分子中氨基之间静电相互作用，使蛋白质结构松弛，水分更易进入蛋白质分子之间的空隙，从而显著改善肌原纤维蛋白的持水能力。
(三)羧甲基化蒲公英多糖增加抗性淀粉含量测定：
将1000U/mLα-淀粉酶和13U/mL糖化酶(即葡萄糖淀粉酶)分散在5mL浓度为0.1mol/L及pH为5.2的醋酸缓冲液中，然后在转速为4000rmp的条件下，离心10min，去除残留物，得到混合酶制剂，将混合酶制剂在温度为37℃的水浴中预热，得到预热的混合酶制剂；将200mg淀粉或200mg含有羧甲基化蒲公英多糖的淀粉(含有羧甲基化蒲公英多糖的淀粉中羧甲基化蒲公英多糖的质量百分数为0％、1％、2％、3％、4％及5％) 分散在20mL浓度为0.1mol/L及pH为5.2的醋酸缓冲液中，加入3个玻璃珠，在沸水浴中加热20min，充分糊化，得到糊状淀粉或糊状淀粉/多糖混合物。冷却至37℃后，将5mL 预热的混合酶制剂分别加入到50mL糊状淀粉或糊状淀粉/多糖混合物中，在温度为37℃的水浴振荡器中沉淀，进行玉米淀粉-羧甲基化多糖混合体系的水解反应。
在水解过程中的特定时间点(0min，20min，120min)，取出1mL的样品，并与8mL 质量百分数为80％的乙醇混合灭活，灭活后取出1mL并加入1mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温，最后加8mL去离子水，于540nm处测溶液的吸光度，以去离子水代替样品为空白，测得葡萄糖的含量。
根据下式计算玉米淀粉-羧甲基化多糖混合体系中RDS(快速消化淀粉)、SDS(慢性消化淀粉)、RS(抗性消化淀粉)含量：
式中：
G0为淀粉没被水解时的葡萄糖量(mg)；
G20为淀粉被酶水解20min后产生的葡萄糖量(mg)；
G120为淀粉被酶水解120min后产生的葡萄糖量(mg)；
PS为每组复配体系中淀粉的质量(g)。
表2玉米淀粉-羧甲基化多糖混合体系RDS、SDS和RS的含量
由表可知，玉米淀粉中RDS、SDS和RS的含量因加入羧甲基化多糖而发生了明显的变化。相比未添加羧甲基化多糖的玉米淀粉，加入1％羧甲基化多糖后RDS的含量由 85.18±0.20％降至83.92±0.13％，当加入5％的羧甲基化多糖后，RDS的含量已降低至 80.21±0.11％。同时加5％的羧甲基化多糖后，SDS和RS含量分别上升至12.30±0.06％和7.09±0.08％。慢消化淀粉和抗性淀粉的含量增加，说明加入羧甲基化多糖可以降低玉米淀粉的体外消化率。
(四)玉米淀粉与羧甲基化蒲公英多糖复配体系的红外谱图：
1、淀粉糊的制备：准确称量1.0g(干基)玉米淀粉，随后加入50.0mL去离子水制成浓度为2％(w/v)的淀粉糊。
2、玉米淀粉与羧甲基化蒲公英多糖复配体系的制备：向制备好的淀粉糊中分别加入 0％、1％、2％、3％、4％和5％的羧甲基化蒲公英多糖(实施例一制备的羧甲基化蒲公英多糖占玉米淀粉干基的质量百分数分别为0％、1％、2％、3％、4％和5％)，配制成玉米淀粉与羧甲基化蒲公英多糖复配体系。将上述样品在沸水浴中加热30min使其完全糊化，冷却至室温，然后在温度为-80℃低温冰箱中冷冻6h，最后置于真空冷冻干燥机上进行冷冻干燥12h后，放在干燥器中备用。采用KBr压片法，用FT-IR测定复配体系的红外光谱。测定参数如下：分辨率为4cm-1，扫描次数为32次，扫描范围4000cm-1～400cm-1。
图12为玉米淀粉与羧甲基化蒲公英多糖复配体系糊化后的红外谱图，A为玉米淀粉、 B为玉米淀粉-1％羧甲基化多糖、C为玉米淀粉-2％羧甲基化多糖、D为玉米淀粉-3％羧甲基化多糖、E为玉米淀粉-4％羧甲基化多糖、F位玉米淀粉-5.0％羧甲基化多糖；如图所示，玉米淀粉、玉米淀粉与羧甲基化多糖复配体系的FT-IR呈现相似的特征，与玉米淀粉相比，玉米淀粉与羧甲基化多糖复配体系未出现新的吸收峰，表明羧甲基化多糖的加入没有改变玉米淀粉结构且未产生新的基团。随着多糖添加量由0.0％增加至5.0％，1646.2cm-1附近的吸收峰发生红移，从1646.2cm-1逐渐移至1616.3cm-1。该吸收峰是水中的O-H弯曲振动引起的，表明存在与淀粉中-OH相连的结合水。结合水吸收峰的红移表明，羧甲基化多糖的-OH可能与玉米淀粉的-OH相互作用，特别是与浸出直链淀粉之间形成氢键，且羧甲基化多糖与直链淀粉之间的相互作用强于直链淀粉间的相互作用。因此，在糊化过程中，羧甲基化多糖与浸出直链淀粉通过氢键相连，然后包围在淀粉颗粒表面，降低糊化程度，从而抑制淀粉的体外消化。
Claims (10)
1.一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行：
一、对蒲公英多糖进行提取及纯化，得到纯化蒲公英多糖；
二、羧甲基化蒲公英多糖制备：
将纯化蒲公英多糖、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A和异丙醇A搅拌混合2h～4h后，在搅拌条件下加入羧甲基化试剂，在温度为50℃～70℃的条件下，搅拌2h～4h，然后冷却至室温并调节pH至6.5～7.5，自来水流水透析40h～50h，蒸馏水透析20h～30h，浓缩至原体积的5％～10％，最后冻干，得到羧甲基化蒲公英多糖；
所述的羧甲基化试剂为氯乙酸、质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B及异丙醇B的混合物；所述的氯乙酸的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液B的体积比为1g:(1.5～4)mL；所述的氯乙酸的质量与异丙醇B的体积比为1g:(4～8)mL；
所述的纯化蒲公英多糖的质量与质量百分数为15％～25％的NaOH溶液A的体积比为1g:(10～20)mL；所述的纯化蒲公英多糖的质量与异丙醇A的体积比为1g:(20～40)mL；所述的纯化蒲公英多糖与氯乙酸的质量比为1:(5～7)。
2.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤一中所述的提取具体是按以下步骤进行：
①、蒲公英根粉末预处理：
将蒲公英根粉末加到脂肪提取器的抽提筒中，采用质量百分数为80％～90％的乙醇，磁力搅拌回流8h～12h，然后在温度为50℃～60℃的条件下烘干，得到脱脂后的蒲公英根粉末；
②、水提醇沉法提取蒲公英多糖：
a、将脱脂后的蒲公英根粉末溶于蒸馏水中，在温度为60℃～80℃的条件下，水浴加热提取2h～3h，得到提取液，在转速为3500r/min～4500r/min的条件下，将提取液离心10min～20min，得到沉淀物及上清液；
b、将沉淀物按步骤②a重复提取1次～2次；
c、将步骤②a及步骤②b中得到的上清液合并，然后依次进行过滤并旋蒸浓缩至原体积的5％～10％，得到浓缩物，将浓缩物置于质量百分数为80％～95％的乙醇中沉淀，低温静置过夜，最后在转速为3500r/min～4500r/min的条件下，离心10min～20min，得到粗蒲公英多糖。
3.根据权利要求2所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤①中所述的蒲公英根粉末的质量与质量百分数为80％～90％的乙醇的体积比为1g:(5～20)mL；步骤②a中所述的脱脂后的蒲公英根粉末的质量与蒸馏水的体积比为1g:(20～40)mL；步骤②c中所述的过滤并旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：采用布氏漏斗经减压抽滤去除沉淀，滤液通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下浓缩；步骤②c中所述的低温静置过夜具体为在温度为-4℃的条件下，静置12h～24h。
4.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤一中所述的纯化，具体是按以下步骤进行：
①、将粗蒲公英多糖溶于蒸馏水中，得到粗多糖溶液；
②、向粗多糖溶液中加入Sevag试剂并振摇20min～40min，然后在转速为3000r/min～4000r/min的条件下，离心10min～15min并去除沉淀，得到上层多糖溶液；
所述的Sevag试剂与粗多糖溶液的体积的1:4；
③、将上层多糖溶液按步骤②重复，直至多糖溶液在280nm处无吸光度，得到去除蛋白质的蒲公英多糖溶液；
④、将去除蛋白质的蒲公英多糖溶液透析去除多糖溶液中的有机溶剂，然后旋蒸浓缩至原体积的5％～10％，得到浓缩物，将浓缩物置于质量百分数为80％～95％的乙醇中沉淀，最后冷冻干燥，得到干燥后的多糖；
⑤、将干燥后的多糖溶于蒸馏水中，得到浓度为4mg/mL～8mg/mL的多糖溶液，采用D101大孔树脂柱分离浓度为4mg/mL～8mg/mL的多糖溶液，在流速为1mL/min～2.0mL/min的条件下，用蒸馏水洗脱，然后利用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖浓度，将多糖洗脱液冷冻干燥，得到纯化蒲公英多糖。
5.根据权利要求4所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤①中所述的粗蒲公英多糖的质量与蒸馏水的体积比为1g:(200～300)mL；步骤②中所述的Sevag试剂为丁醇与氯仿的混合物，且丁醇与氯仿的体积比1:4。
6.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤④中所述的透析为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋，蒸馏水透析20h～30h；步骤④中所述的旋蒸浓缩具体是按以下步骤进行：通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下加热浓缩；步骤④中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥15h～30h；步骤⑤中所述的D101大孔树脂柱尺寸为2.5cm×(40～60)cm；步骤⑤中所述的冷冻干燥具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥15h～30h。
7.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤二中利用浓度为0.5mol/L的HCl溶液调节pH为6.5～7.5。
8.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的自来水流水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋；步骤二中所述的蒸馏水透析具体为利用截留分子量为10000道尔顿的透析袋。
9.根据权利要求1所述的一种羧甲基化蒲公英多糖的制备方法，其特征在于步骤二中所述的浓缩具体是通过旋转蒸发仪于温度为45℃～55℃的条件下加热浓缩；步骤二中所述的冻干具体是采用真空冷冻干燥机，在温度为-70℃的条件下，冷冻干燥15h～30h。
10.如权利要求1制备的羧甲基化蒲公英多糖的应用，其特征在于羧甲基化蒲公英多糖用于增加玉米淀粉中抗性淀粉的含量，降低玉米淀粉的体外消化率；羧甲基化蒲公英多糖用于提高肉的保水性。
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| CN113698507B (zh) | 2023-05-16 |
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