CN109232761A - 一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，涉及菌类深加工技术领域。本发明方法包括以下步骤：对秦巴硒菇粗多糖进行脱色处理，得到脱色后秦巴硒菇粗多糖；采用柱层析技术对所述脱色后秦巴硒菇粗多糖进行一次分离提纯，获得一次提纯物；采用柱层析技术对所述一次提纯物进行二次分离提纯，获得二次提纯物，所述二次提纯物为秦巴硒菇多糖蛋白混合物。本发明方法避免了传统方法破坏多糖结构的缺点，保留了秦巴硒菇蛋白多糖的药用价值和营养。
Description
技术领域
本发明涉及菌类深加工技术领域，尤其涉及一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法。
背景技术
姬松茸是近年来新兴的一种食药兼用菌，因其富含多种活性成分，可作为免疫调节剂、抗癌剂、抗突变剂和抗菌物质的来源而受到广泛关注。姬松茸多糖的抗肿瘤、增强免疫、抗病毒和降血糖等活性已得到学术界的公认，而目前研究的比较多的是姬松茸粗多糖，由于姬松茸经过水煮提取的粗多糖中含有游离的杂蛋白质、色素以及其他一些低分子物质(包括寡糖、一些单糖、盐分等)，其中蛋白质含量较高，在药品开发过程中必须将其有效去除方能保证药品的稳定性并防止出现不良反应。因此，粗多糖的纯化分离的研究是必不可少的，目前国内外己有不少文献报道了姬松茸多糖的提取、纯化和一些组分研究，但是提取手段相对单一，有的甚至用酸、碱进行提取，可能会破坏多糖结构，进而影响功效，另外提取得率也不够高，报道的平均提取得率只有12.2％左右。
富硒姬松茸(又称为秦巴硒菇)，其富含的硒对动物体生理、生命作用有特殊功能，国内外学者研究发现缺硒可引发多种疾病，硒具有抗氧化、增强机体免疫力、促进新陈代谢、减轻放化疗的毒副作用、保护心脑血管系统、保护胰腺、改善糖尿病代谢功能、抗铅、汞、镉、钽重金属的毒性等功效。
硒是人和动物体内必需的微量元素,体内不能自行合成,必须由外界供给才能满足正常代谢需要。硒分为无机硒和有机硒，与无机硒相比，有机硒因具有更高的生物活性和更低的毒性而易被生物体吸收利用，而有机硒包括硒多糖、硒蛋白、硒核酸等。秦巴硒菇是一种药食两用型菌类，具有很高的营养价值和药用价值，其中含丰富的有机硒。硒多糖作为一种安全有效的免疫反应调节剂，具有毒性小，生物利用率高,药理作用明确等特点，已经用于食品添加剂和作为临床药物用于恢复期肿瘤病人或在化疗时辅助应用。多糖广泛存在于中草药中,资源极其丰富。许多中药多糖本身就是广谱的非特异性免疫促进剂,并且对人体正常细胞无不良效应。而硒与多糖的结合，优化了各自的功效，使其在抗肿瘤、免疫调节等作用方面效果更加显著。秦巴硒菇多糖相比于普通的姬松茸多糖，有着更显著的抗肿瘤、免疫调节等作用。传统提取工艺中，大部分的文献报道的是姬松茸多糖的提取工艺，经过了脱色、脱蛋白的过程，该工艺过程不仅具有上述缺陷，也并不适合提取秦巴硒菇。因此，为了适应市场需求，提高秦巴硒菇药用和营养价值，亟需研究一种针对秦巴硒菇粗多糖的分离纯化工艺。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，主要目的是通过优化的分离提纯工艺提取秦巴硒菇多糖蛋白复合物。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种秦巴硒菇多糖的分离纯化方法，包括以下步骤：
对秦巴硒菇粗多糖进行脱色处理，得到脱色后秦巴硒菇粗多糖；
采用柱层析技术对所述脱色后秦巴硒菇粗多糖进行一次分离提纯，获得一次提纯物；
采用柱层析技术对所述一次提纯物进行二次分离提纯，获得二次提纯物；
所述二次提纯物经过浓缩、透析及冷冻干燥后得到淡黄色粉状物质，即秦巴硒菇多糖蛋白复合物。
本发明的上述提取工艺中，采用层析柱技术进行纯化分离，不会破坏提取物的结构；提取过程中采用NaCl溶液洗脱，二次纯化过程中不能完全除去NaCl，透析可以除去NaCl等小分子物质，得到纯度更高的提纯物；采用冷冻干燥技术，不破坏提取物活性。
作为优选，所述脱色处理的具体过程包括：
(1)将秦巴硒菇粗多糖溶解于蒸馏水中，形成秦巴硒菇粗多糖溶液；
(2)用氨水调整所述秦巴硒菇粗多糖溶液的pH为8-9；
(3)向所述秦巴硒菇粗多糖溶液中加入30％过氧化氢，在50℃水浴4h，停止加热；
(4)冷却至室温后离心，取上清液；
(5)所述上清液浓缩后经干燥，得到所述脱色后秦巴硒菇粗多糖。
作为优选，所述一次分离提纯的具体过程包括：
将所述脱色后秦巴硒菇粗多糖与蒸馏水配制成脱色后秦巴硒菇粗多糖溶液；
对所述脱色后秦巴硒菇粗多糖溶液进行梯度洗脱，采集各梯度洗脱的样品；
用紫外分光光度计在490nm波长下分别测量所述各梯度洗脱的样品的吸光度值；
收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品，作为一次提纯物。
作为优选，所述二次分离提纯的具体过程包括：
对所述一次提纯物进行梯度洗脱，采集各梯度洗脱的样品；
用紫外分光光度计在490nm波长下分别测量所述各梯度洗脱的样品的吸光度值；
收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品，作为二次提纯物。
作为优选，所述一次分离提纯的过程中采用的柱层析技术的填料选用TOYOPEARLDEAE-650M；所述二次分离提纯的过程中采用的柱层析技术的填料选用TOYOPEARL HW-55S。
作为优选，所述梯度洗脱是在蒸馏水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液、0.5mol/LNaCl溶液、0.7mol/LNaCl溶液及0.9mol/LNaCl溶液中进行洗脱。
作为优选，所述收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品的过程包括先收集符合要求的样品，再将样品在旋转蒸发仪中浓缩，最后用透析袋进行透析处理，得到所述一次提纯物或所述二次提纯物。
另一方面，本发明实施例提供了一种秦巴硒菇多糖蛋白复合物，其是由上述方法分离提纯得到。
本发明主要获得的是秦巴硒菇多糖蛋白复合物，在纯化分离过程中，多糖损失率与蛋白损失率呈正比，在除蛋白的过程中会对多糖造成影响，同时，多糖蛋白复合物有着更显著的抗肿瘤活性，粗多糖中含有游离的杂蛋白质、色素以及其他一些低分子物质(包括寡糖、一些单糖、盐分等)，其中杂蛋白质含量较高，在药品开发过程中必须将其有效去除方能保证药品的稳定性并防止出现不良反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
传统工艺涉及去除蛋白质的过程是为了防止其影响药品稳定性，出现该问题主要是由于提取多糖的传统工艺不够优化，未能进一步纯化分离；本发明针对传统工艺出现的上述缺陷对粗多糖进一步的纯化分离，使得提取物纯度更高，因此，采用本发明工艺提取的多糖蛋白复合物在药物和营养价值上效果更优。
本发明对秦巴硒菇粗多糖进行两次纯化分离，对秦巴硒菇粗多糖先进行脱色处理，减少洗脱过程中对层析柱填料的影响以避免对秦巴硒菇粗多糖二次纯化分离的影响，在纯化分离过程中未进行脱蛋白处理，可以更大程度的保留多糖，更大程度的保留秦巴硒菇多糖蛋白复合物的活性，同时在纯化分离的过程中，用多梯度NaCl溶液进行洗脱，保证洗脱完全，对得到的提纯物透析、低温度浓缩后冷冻干燥，最大程度保留提取物的活性。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的秦巴硒菇粗多糖分离纯化工艺流程图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
实施例1
1.秦巴硒菇粗多糖脱色处理(过氧化氢法)
(1)称取秦巴硒菇粗多糖50g充分溶解于500ml蒸馏水中；
(2)用氨水调整溶液PH值，使溶液呈弱碱性(PH＝8-9)；
(3)加入50ml 30％过氧化氢，50℃水浴4h，停止加热(过氧化氢在加热过程中加入，同时在加热过程中加入适宜氨水使PH值保持在8-9)；
(4)冷却至室温后离心(8000rpm,10min)，取上清液；
(5)上清液浓缩后冷冻干燥机干燥，得到样品7.4g。
2.秦巴硒菇多糖分离纯化(柱层析法)
2.1 DEAE-650M填料的处理及装填
(1)取TOYOPEARL DEAE-650M 100g静置，倒去20％乙醇溶液；
(2)加入3倍柱体积(约300ml)蒸馏水，搅匀后静置1h，倒去上清液(重复3次)；
(3)加入3倍柱体积(约300ml)蒸馏水，搅匀后直接倒入层析柱中，连接蠕动泵加压，蒸馏水冲洗，直至无乙醇。
2.2上样
(1)取脱色后样品1g，溶于15ml蒸馏水中，用滴管贴柱壁缓慢加入样品；
(2)在蒸馏水、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/LNaCl溶液不同浓度梯度下洗脱；
(3)用样品自动收集器收集样品(蠕动泵1.3rpm，接样器3min/管)，用紫外分光光度计在490nm波长下测量吸光度值(苯酚-硫酸法)；
(4)收集各个梯度下吸光度峰值面积下的样品，旋转蒸发仪(60℃，转速30rpm)浓缩，透析袋透析处理后4℃冰箱中保存备用(合计上样6g)。
注：苯酚-硫酸法：依次取2ml样品，1ml苯酚溶液，5ml硫酸，摇匀80℃水浴15min，冷却至室温，定容至10ml；空白管：1ml苯酚溶液，5ml硫酸，摇匀80℃水浴15min，冷却至室温，定容至10ml；冷却至室温后测量。
2.3 HW-55S填料的处理及装填
(1)取TOYOPEARL HW-55S 150g静置，倒去20％乙醇溶液；
(2)加入3倍柱体积(约300ml)蒸馏水，搅匀后抽滤(重复3次)；
(3)加入3倍柱体积(约300ml)蒸馏水，搅匀后直接倒入层析柱中，连接蠕动泵加压，蒸馏水冲洗，直至无乙醇。
2.4上样
将上述第一次过柱后得到的样品浓缩至约30ml，取约10ml样品过层析柱，步骤同2.2(1)、(2)、(3)，收集各个梯度下吸光度峰值面积下的样品，旋转蒸发仪(60℃，转速30rpm)浓缩，透析袋透析处理，冷冻干燥机干燥，得样品约2.5g。
传统分离纯化姬松茸多糖的技术采用稀碱或稀酸法提取多糖，具有降解和破坏多糖原有结构、使所得溶液变稠、所得溶液色素高等缺点，会让接下来的过滤和分离纯化操作变得困难。本发明采用的柱层析技术避免了传统方法破坏多糖结构的缺点，可以保留纯化物的结构完整性。本发明区别于传统姬松茸多糖的纯化分离，并未去除蛋白，得到的纯化物为多糖蛋白复合物，在分离纯化过程中多糖的损失率会随着蛋白的损失率增加，避免脱蛋白处理可以避免多糖的丢失，同时多糖蛋白复合物具有更显著的抗肿瘤作用。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
对秦巴硒菇粗多糖进行脱色处理，得到脱色后秦巴硒菇粗多糖；
采用柱层析技术对所述脱色后秦巴硒菇粗多糖进行一次分离提纯，获得一次提纯物；
采用柱层析技术对所述一次提纯物进行二次分离提纯，获得二次提纯物；
所述二次提纯物经过浓缩、透析及冷冻干燥后得到淡黄色粉状物质，即秦巴硒菇多糖蛋白复合物。
2.如权利要求1所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述脱色处理的具体过程包括：
(1)将秦巴硒菇粗多糖溶解于蒸馏水中，形成秦巴硒菇粗多糖溶液；
(2)用氨水调整所述秦巴硒菇粗多糖溶液的pH为8-9；
(3)向所述秦巴硒菇粗多糖溶液中加入30％过氧化氢，在50℃水浴4h，停止加热；
(4)冷却至室温后离心，取上清液；
(5)所述上清液浓缩后经干燥，得到所述脱色后秦巴硒菇粗多糖。
3.如权利要求1所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述一次分离提纯的具体过程包括：
将所述脱色后秦巴硒菇粗多糖与蒸馏水配制成脱色后秦巴硒菇粗多糖溶液；
对所述脱色后秦巴硒菇粗多糖溶液进行梯度洗脱，采集各梯度洗脱的样品；
用紫外分光光度计在490nm波长下分别测量所述各梯度洗脱的样品的吸光度值；
收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品，作为一次提纯物。
4.如权利要求1所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述二次分离提纯的具体过程包括：
对所述一次提纯物进行梯度洗脱，采集各梯度洗脱的样品；
用紫外分光光度计在490nm波长下分别测量所述各梯度洗脱的样品的吸光度值；
收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品，作为二次提纯物。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述一次分离提纯的过程中采用的柱层析技术的填料选用TOYOPEARL DEAE-650M；所述二次分离提纯的过程中采用的柱层析技术的填料选用TOYOPEARL HW-55S。
6.如权利要求3或4所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱是在蒸馏水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液、0.5mol/LNaCl溶液、0.7mol/LNaCl溶液及0.9mol/LNaCl溶液中进行洗脱。
7.如权利要求3或4所述的一种秦巴硒菇粗多糖的分离纯化方法，其特征在于，所述收集测量结果在吸光度峰值面积下的样品的过程包括先收集符合要求的样品，再将样品在旋转蒸发仪中浓缩，最后用透析袋进行透析处理，得到所述一次提纯物或所述二次提纯物。
8.一种秦巴硒菇多糖蛋白复合物，其特征在于，其是由权利要求1-7任一项所述方法分离提纯得到。
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| CN111982874A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-24 | 奥迈检测有限公司 | 一种谷物中硒元素的检测方法 |
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