TWI232753B

TWI232753B - Adjuvant compositions comprising QS-21,3D-MPL and CpG and vaccine compositions comprising the same

Info

Publication number: TWI232753B
Application number: TW089107209A
Authority: TW
Inventors: Martin Friede; Nathalie Garcon; Philippe Hermand
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2005-05-21
Also published as: AU764969B2; US7399472B2; JP4805242B2; WO2000062800A2; BRPI0010612B8; AU4114900A; PL351893A1; US20080095788A1; EP1187629A2; CN1227030C; US6544518B1; PT1187629E; HK1044484A1; NO20015073D0; DE60014076T2; BR0010612B1; EP1187629B1; US20080311156A1; HU229255B1; HUP0200815A2

Description

1232753 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關在疫苗中使用的新穎佐劑組合物。特別者，本發明佐劑組合物包括包素和免疫刺激性低聚核芬酸之組合物，該組合物視情況更包含載體。本發明也提出包括本發明佐劑組合物和至少一種抗原的疫苗，更提出製造本發明佐劑組合物和疫苗的方法及彼等作為醫藥品之用途。此外，本發明提出經由非經腸或黏膜給用本發明疫苗來治療易感染或已患上疾病的個體之方法。免疫刺激性低聚核荅酸含有未甲基化CpG二核甞酸 (’’CpG")並在故藝中係已知作為佐劑經由系統或黏膜途徑給藥者（WO 96/02555，EP 468520，Davis et al·，J. Immunol , 1998 ? 160(2) · 870-876 ； McCluskie and Davis » J. Immunol.，1998，161(9) : 4463-6) o CpG為在 DNA 中的胞口密啶-鳥嘌呤核茹二核答酸型主體（motifs )的縮寫。歷史上曾觀察到BCG的DNA部份能夠發出抗腫瘤作用。在進一步研究中，從BCG基因序列衍生的合成低聚核苷酸被證實能夠謗導免疫刺激作用（在試管内（in vitro)和活體内（in vivo)兩者）。彼等研究的作者總結出某些復發的序列，包括中樞 CG型主，帶有這種活性。CG型主在免疫刺激的中樞作用於後來在Krieg，Nature 347，p546 1995的文中闡明。詳細的分析已顯示CG型主必在某一序列知之内，且彼等序列在細菌的DNA中很普遍但在脊椎動物的DNA中卻很稀少。彼等免疫刺激性序列通常是：嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中二核苷酸CG型主係未甲基化的，但其他未甲基化CpG序列係已知具免疫刺激性並可用于本發明中者。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（2 ) 在六種核茹酸的某些組合物中含有一種復發的序列。彼等型主的幾種，可能為一種型主的重覆或為不同型主的組合，可存在於同一低聚核甞酸中。一種或更多的包含低聚核甞酸的彼等免疫刺激性序列之存在能活化多種免疫亞組合，包括天然殺手細胞（其可產生干擾素T且有溶細胞活性）和巨嗟細胞（Wooldrige et al Vol 89 (Νο·8)，1977)。不過含有不具此一致序列的序列之其他未甲基化CpG現已被證明是有免疫刺激性者。當經調配到疫苗中時，CpG通常係與游離的抗原一起給用（W0 96/02555 ; McCluskie and Davis，上引資料）或經共價地拼合到一抗原後給用（PCT公報No. WO 98/16247)，或與一載體例如氫氧化鋁調配後給用（（肝炎表面抗原）Davis et al.、上引資料；Brazolot-Millan et al·、Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 1998, 95(26)，15553-8) ° 皂素在 Lacaille-Dubois，M和 Wagner H.中講述過（1996.皂素的生物和藥物學活性的評論。Phytomedicine vol 2 pp 363-3 86)。皂素是廣泛分佈於植物界和海洋動物界中的類固醇或三萜配醣體。皂素因能在水中形成因搖動而起泡的膠體性溶液，和使膽固醇沈澱而出名。當皂素接近細胞膜時，彼等會在膜裏產生像孔洞的構造促成細胞膜脹裂。紅血球的溶血就是這種現象的例子，是某些而不是全部皂素的特性。皂素係已知可用為疫苗中的佐劑供全身給藥所用。別皂素的輔助和溶血活性係已在技藝中經廣泛地研究過者。例 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（3 ) 如 Quil A (在南美樹，皂樹（Quillaja Saponaria Molina)的樹皮中取得）和其部份體，即載於美國專利第5,057,540號和 ’’ Saponins as vaccine adjuvants (作為疫苗佐劑的皂素）”， Kensil，C. R. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2) : 1-55 ;和 EP 〇 362 279 B1 之中。包括Quil A的部份體，稱為免疫刺激性複合體（ISCOMS) 的粒狀性構造物是溶血性的且已用於疫苗的製造中（Morein， B·，EP 0 109 942 B1)。彼等構造物已被報導有佐劑活性（EP 0 109 942 Bl ; WO 96/11711)。溶血性皂素QS21和QS17 (Quil A經HPLC鈍化的部份）業經述及可作為有效力的系統性佐劑且其製法經揭示於美國專利第5,057,540號和EP 0 362 279 B1中。在彼等參考文獻中也有敘述的是QS7的使用（Quil A的非溶血性部份），其係作為一種用於系統性疫苗中的有效力的佐劑。QS21的使用進一步述於Kensil et al· (1991· J. Immunology vol 146， 43 1-437)之中。QS21和聚山梨酸酯或環糊精的組合也為已知者。包括Quil A部份體，例如QS21和QS7，的粒狀佐劑系統係載於WO 96/3373 9和WO 96/11711之中。業經用於全身接種研究中的其他皂素包括從其他植物物種，例如石竹屬（Gypsophila)和肥皂草屬（Saponaria)衍生者 (Bomford et al·，Vaccine, 10(9) : 572-577，1992)。皂素係已知被用於黏膜施用疫苗接種研究中者，此研究在免疫反應的謗導中取得多種成功。Quil A皂素係在先前經證明當抗原係經鼻内給藥時對免疫反應的謗導沒有影響 -6- —__ 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1232753 A7 B7 五、發明説明（4 ) (Gizurarson et al. 1994，Vaccine Research 3，23-29)。而其他作者則成功地使用過這種佐劑（Maharaj et al·，Can J. Microbiol，1986，32(5) : 414-20; Chavali and Campbell， Immunobiology, 174(3): 347_59)。包括 Quil A 皂素的 ISCOMs已用於胃内和鼻内用的疫苗調配物中並展示出佐劑活性（Mcl Mowat et al.，1991，Immunology，72，317-322 ; Mcl Mowat and Donachie，Immunology Today，12， 383-385) 〇 QS21，Quil A的無毒部份，也經述及作為一種經口或鼻内用佐劑（Sumino et al·，J.Virol·，1998，72(6) : 4931-9 ; WO 98/56415)。其他皂素在鼻内疫苗接種研究中的使用已有述及。例如，藜屬（Chenopodium quinoa)皂素業經用於鼻内和胃内疫苗中（Estrada et al·，Comp· Immunol. Microbiol. Infect. Dis·，1998, 21(3) : 225-36)。本發明係有關下述驚人的發現，即免疫刺激性低聚核：y：酸（CpG)和皂素組合物是極端有效的佐劑。於是乃提出佐劑組合物’其包括含素和免疫刺激性低聚核甞酸的組合物。較佳者，本發明佐劑可能更包括一載體。在本發明一較佳形式中，在佐劑和疫苗的組合物中的皂素和低聚核甞酸在抗原特異性抗體的謗導中協同地起作用並在傳統上與 Thl型免疫系統有聯繫的免疫反應的謗導中有效力。因此’該佐劑組合物不但適合疾病的免疫預防，而且驚人地適於疾病的免疫治療例如持續性病毒，細菌或寄生蟲的感本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（5 ) 染，及慢性疾病例如癌症。用於本發明佐劑或疫苗的較佳低聚核甞酸較佳地包括兩個或更多被至少三個，更佳地至少六個或更多的核嘗故分隔開之二核甞酸CpG型主。.本發明低聚核甞酸典型者為去氧核甞酸。於一更佳實例中，低聚核苷酸中的介核甞酸 (internucleotide)是二硫代磷酸醋，或更合適地是硫代磷酸酯鍵，不過磷酸二酯和其他介核甞酸键都在本發明範圍内，其更包括有混合的介核甞酸鍵聯的低聚核甞酸。製造硫代磷酸酯低聚核甞酸或二硫代磷酸酯的方法在美國專利第5,666，153，美國專利第5,278,302和W0 95/26204中有述及0 較佳的低聚核甞酸的實例具有以下的序列。彼等序列較佳地含有經硫代磷酸酯改質的介核甞酸鍵聯。 OLIGO l(SEQEDNO:l):TCC ATGACGTTCCTGACGTT(CpG 1826) OLIGO 2(SEQ IDNO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758) OLIGO 3(SEQ IDNO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4(SEQ ID NO:4): TCG TCG ΊΤΓ TGT CGT TTT GTC GIT(CpG 2006) OLIGO 5(SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668) 可代用的CpG低聚核甞酸可包括以上較佳的序列，其中彼等另外具有不影響的缺失或添加。本發明所採用的CpG低聚核甞酸可用此技藝中已知的任何一種方法合成（如EP 468520)。方便地，彼等低聚核答酸可以經由使用自動合成器合成。本發明採用的低聚核替酸典型地是去氧核菩酸。於一較 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（6 ) 佳的實施例中在低聚核甞酸内的介核甞酸鍵是二硫代磷酸酯，或更佳者硫代磷酸酯键，雖則磷酸二酯是在本發明範圍内。含有不同的介核甞酸键結的低聚核甞酸，例如混合的硫代磷酸酯磷酸二酯，亦涵蓋在内。其他可使低聚核苷酸穩定的介核甞酸键也可使用。可用於本發明佐劑組合物中的皂素包括從皂樹樹皮取得，稱為Quil A和其部份體者，其載於美國專利第 5,057,540號和 n Saponins as vaccine adjuvants (作為疫苗佐劑的皂素）f’，Kensil，C. R.，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，1996，12(1-2) : 1-55 ;和EP 0 362 279 B1之中。特別較佳的Quil A部份體為QS21，QS7和QS17。 /3 -七葉皂钻是另一種可在本發明佐劑組合物中使用的較佳溶血性皂素。七葉皂芬在Merck index (12th ed :項目 3737)中說明為出現在七葉樹，拉丁語：歐七葉樹 (Aesculus hippocastanum)種子裏的皂素混合物。其分離據稱是由層析術和淨化法（Fiedler，Arzneimittel-Forsch. 4， 213 (1953))和離子交換樹脂（Erbring et al·，美國專利第 3,238，190號）完成的。七葉皂苷部份體，α和冷，已被純化出並證明有生物活性（Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996， Aug ; 44(8) : 1454-1464))。/3-七葉皂甞也稱為七葉皂甞。另一種用於本發明較佳溶血性惠素是毛地黃琶甞。毛地黃皂甞在Merck index (12th ed :項目3204)中經說明為一種皂素，源自於紫花毛地黃（Digitalis purpurea)的種子並根據 Gisvold et al.，J. Am. Pharm. Assoc·，1934，23，664 ; -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

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1232753 A7 B7 五、發明説明（7 ) 和，Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem.，1995，301，621 中所述程序予以純化。其用途經敘述為一種用於膽固醇測定中的臨床試劑。本發明佐劑組合物可以更包括載體，使得皂素或CpG，或兩者，可與一粒狀載體實體缔合以增強組合物的佐劑性。特別較佳的系統性疫苗包括，例如，一載體分子。於本發明佐劑組合物中使用的CpG可在自由溶液中或與粒狀載體複合，例如礦物鹽（例如，但不限於，铭或躬鹽）、微微脂粒、ISCOMs、乳液（水包油、油包水、水包油包水（water in oil in water))、聚合物（例如，但不限於，聚乳酸、聚乙醇酸、聚鱗胼（polyphosphazine)、聚胺基酸、藻酸鹽和聚葡萄胺糖）或者微粒子。較佳者，彼等載體是陽離子性者。本發明疫苗更包括一抗原，其可與CpG-載體複合物缔合，或者可不與CpG-載體複合物缔合。在這種情況下，此抗原可以是自由的懸浮液或與分離的載體缔合者。構成本發明一部分的皂素可經分離成膠微粒形式，或在與膽固醇或脂質調配時呈大有序構造例如ISCOMs (EP 0 109 942 B1)或者微脂粒（WO 96/33739)的形式中，或者呈一種水包油乳液的形式（WO 95/17210)。彼等皂素可以較佳地與金屬鹽，例如氫氧化鋁或磷酸鋁缔合（WO 98/15287)。另外皂素可與粒狀載體，例如聚葡萄胺糖缔合。該皂素也可以呈乾燥狀態，例如粉末。呈要給到接種疫苗者的黏膜表面形式之最後調配物在本質上是較佳者係 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7

發明較佳疫苗是用於在經由系統途徑對個體給藥後產生系統性免疫反應者。溶血性者。此皂素鍵結或經由與同樣的：狀= =與抗原經由直接 ⑽; W0 98/=;:::互作用而物理地缔合 CdG和*去太直在本發明佐劑或疫苗中的素可：1=可以是獨立或經綠合者。例如，CPG和息鹘例：洋液裏或可經由載體，更較佳者粒狀載絲化㈣者㈣—種陽離予性微脂粒或isc〇m而根據本發明-較佳佐劑組合物包括—種或以上的在兩淨相近的CG型王間含有至少3個，較佳地至少6個核加 CpG低聚核^:酸’連同QS21和—種從包括水包油乳液^ DQ的組合中選出的粒狀載體一起。最佳者，該佐劑組4 物包括與QS21混合的CpG 2〇〇6 (SEQ m n〇 4)，或 1758 (SEQIDN〇:2)或 CpG 1826 (SEQIDNO:l)，和一選！包括水包油乳液或DQ的組合中之粒狀載體。因此，特另較佳的疫苗為，例如，含有彼等佐劑組合物和抗原者。4 本發明佐劑組合物可作為系統性或黏膜型佐劑使用。在本發明一特別形式中提出一種系統性疫苗，用以經由系統或非經腸途徑給藥，例如肌内、皮内、透皮、皮下、腹膜内或靜脈内的給藥。一較佳給藥途徑是經由透皮途徑，例如經由皮膚貼片。本發明系統性疫苗製劑可用來保護或治療易感染或已患上疾病的哺乳動物，其係經由肌内，腹膜内，皮内，透 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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線 1232753 A7 B7 五、發明説明（9 ) 皮’靜脈内或皮下給藥來給用該疫苗。此疫苗製劑的系統性給藥方法可包括傳統的注射筒和針，或經設計用來彈道輸送固體疫苗的裝置（W0 99/27961),或無針壓力液體噴射裝置（美國專利第4,596,566號；美國專利第5,993,412 號）’或透皮貼片（WO 97/48440 ; W0 98/28037)。本發明也可用于增強施加到皮膚（透皮或透皮輸送W〇 98/2〇734 ; WO 98/28037)的抗原之免疫性。因此本發明提出供系統性給藥所用的預先填充本發明疫苗或佐劑組合物的輸送裝置。從而提出一種在個體内謗發免疫反應的方法，其包括對磁個體給用一包括一抗原和免疫刺激性低聚核甞酸，皂素和載體的疫苗，其中該疫苗是經由非經腸或系統性途二給藥的。誘發免疫反應的較佳方法包括給用疫苗，該疫苗包括-SEQIDNO:l，2，3，4或5低聚核芬酸，連同^: 衍生的息素例如QS21，和載體’例如水包油乳液固醇的微脂粒或明礬。口屠、本發明疫苗製劑另外可用來保護或治療易感病的哺乳動物，其中係經由黏膜途徑，例如口腔^ 鼻内的途徑給用該疫苗。可替代的黏膜途徑為降:邵或腸内。較佳的黏膜給藥途徑是經由鼻内途徑，:k和直㊣接種。鼻内疫苗接種的方法係技藝中熟專為鼻内疫滴、噴霧或乾粉形式的疫苗給料要免疫的^括^小内。贺霧或霧化的疫苗調配物也構成本發明鼻咽解調配物例如經口給藥的抗胃性膠囊劑和粒南4分。腸溶道給藥所用的栓劑也構成本發明一部分。^直腸或陰 -12 :297公釐） 1232753 A7 B7

五、發明説明（1〇本發明佐劑組合物代表一類適合在人類中使用的經由黏膜疫苗接種取代系統性接種的黏膜佐劑。在本發明一較佳形式中可用純皂素例如Quil A或其衍生物，包括QS21 ;七

葉皂菩；毛地黃皂甞；或石竹屬或皂樹皂素與免疫刺激性低聚核苷酸的組合作為將抗原黏膜給藥的佐劑以性免疫反應。 I 本發明佐劑組合物係於疫苗調配物使用，該等疫苗可經由全身性或黏膜性途徑給藥。較佳者，當疫苗用於黏膜給藥時’該佐劑組合物包含一溶血性皂素。用於黏膜給藥時，本發明組合物較佳地包括一溶血性皂素。溶血性皂素，或皂素製劑，在本發明意義内係參考= 下的檢定測定的。 1 ·將取自天竺鼠的新鮮血液在桌面型離心機中用磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)洗滌三次。於再懸浮到原來的體積後: 將血液用PBS再稀釋1〇倍。 2.取50微升的此血液懸浮液加到8〇〇微升的含有兩倍稀度的界面活性劑或皂素之PBS内。 3·八小時後目視地或經由測量上澄液的光密度來評估溶血作用。在570奈米吸收光線的紅色上澄液的存在顯示有溶血作用存在。 4.將結果表為不再有溶血作用出現的第一次皂素稀釋的濃度。對本發明目的而言，皂素佐劑製劑若在低於〇1%的濃度落裂紅血球即為溶血性者。作為參比意義者，實質純的 -13-

1232753 A7 _________B7 五、發明説明（11 )

Quil A、QS21、QS7、毛地黃皂甞和；3_七葉皂甞樣品依此檢疋所定義者全是溶血性皂素。在彼等生物檢定的固有實驗變異性之内’本發明皂素較佳地具有在約〇 5-〇.〇〇〇〇1〇/。之間’更佳者在〇.〇5-〇·〇〇〇〇ι〇/〇之間，甚至更佳者在〇⑽ 〇_〇〇〇01%之間，且最佳者在0·001-0_0004%之間的溶血活 f生理想地’違皂素應有與Q S 2 1相似的溶血活性（亦即在 10倍差異内）。本發明疫苗也可以經由口腔途徑給藥。在彼等情況下，醫藥可接受的賦形劑也包括鹼性緩衝劑，或腸溶解膠囊或微粒子。本發明疫苗也可經由陰道途徑給藥。在彼等情況下，醫藥可接受的賦形劑也可包括乳化劑、聚合物例如 CARBOP〇L@和其他已知的陰道乳劑和栓劑之穩定劑。本發明疫苗也可經由直腸途徑給藥。在彼等情況下，賦形劑也可包括在此技藝中已知用以形成直腸栓劑的蠟和聚合物。在本發月佐以組合物中超過一種急素的製劑也構成本發明一部分。例如至少兩種以下包括QS21、QS7、Quil A 、沒-七葉皂苷或毛地黃皂菩的組合之組合物。此外，本發明組合物可包括超過一種免疫刺激性低聚核甞酸的組合。在本發明一類似實施例中用於系統性和黏膜兩種給藥的 CpG/4素組合物更可與包括單磷醯基脂質a和其無毒的3_ 去-0-醯基化單磷醯基脂質A之其他佐劑組合。另外，該皂素凋配物可與疫苗賦形藥組合，此賦形藥包括聚葡萄胺糖或其他多陽離子性聚合物，聚乳交酯（p〇lylactide)和聚^ -14-

1232753 A7 五、發明説明（ιΤ~7 ~--——— 叉酯-共·乙交酯粒子，以聚Ν-乙醯基葡萄糖胺_為基的聚合物基質，由多醣類或化學改質多醣類構成的粒子，微脂粒和以脂質為基的粒子，以甘油單酯構成的粒子等。皂素也在詹口醇的存在下调配以形成粒狀構造例如微脂粒咬 ISCOMs。再者，皂素可與聚乙二醇醚或酯一起調配成無粒狀溶液或懸浮液，或例如少層微脂粒或ISCOM的粒狀構迨。皂素也可與賦形劑例如Carb〇p〇1R調配以提高黏度，或可與粉狀賦形劑例如乳糖調配成乾粉形式。 3脫醯基化單磷醯基脂質A是由Ribi Immimochem， Montana製造的熟知佐劑。其可用在GB 21222〇4]5中講授的方法製備。3脫醯基化單磷醯基脂質a較佳的形式有直徑少於0.2微米的小粒度之乳液的形式（Ep 〇 689 454 B1)。特別較佳的佐劑是3D_MPL和Q21的組合（Ep 〇 671 948 B1) ’包括3D-MPL和QS21的水包油乳液（W0 95/1721〇， W〇 98/56414)，或與其他載體調配的3D-MPL (EP 0 689 454 B1)。本發明疫苗調配物較佳地包括能夠引出對人類病原的免疫反應之抗原或抗原性組合物，其抗原或抗原組合物係衍生自 HIV-1，（例如，tat，nef，gpl2〇或 gpl6〇)，人類皰疹病毒，例如gD或其衍生物或緊早期蛋白質例如來自HSV1 或HSV2的ICP27 ;巨細胞病毒（特別是人類的，例如⑼或其衍生物）；輪狀病毒（包括活性減弱病毒）；埃貝二氏病母（例如gp 3 5 0或其付生物），水痘帶狀皰療病毒（例如， II和IE63);或者來自肝炎病毒者例如b型肝炎病毒（例如b -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232753 A7 ____B7 五、發明説明（13 ) 型肝炎表層抗原或其衍生物）、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒和E型肝炎病毒，又或來自其他病毒病原者，例如副黏液病毒：呼吸道合胞肺病毒（例如F和G蛋白質或其衍生物）、曰流行性感冒病毒、麻療病毒、流行性|思腺炎病毒 '人類乳頭瘤病毒（例如HPV6，11，16，18，…）、黃熱病病毒（例如黃熱病病毒、登革熱病毒、壁虱媒腦炎病毒、日本腦炎病毒）或流行性感冒病毒（全活的或不活性病毒、在雞蛋或MDCK細胞中生長的分裂流行性感冒病毒，或全流行性感冒病毒脂蛋白體（如R. Giuck，Vaccine，1992, 1 Ο，9 1 5 · 9 2 0中所述者）或其經純化或重組的蛋白質，例如 HA、ΝΡ、ΝΑ或Μ蛋白質或其組合物）；或者衍生自細菌病原者例如奈瑟氏球菌屬（Neisseria spp)，包括淋病奈瑟氏球菌（N· gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏球菌（Ν· meningitidis)(例如莢膜菌多醣類和其拼合物、轉鐵蛋白結合性蛋白質、乳膽鐵質結合性蛋白質、pilc、植物血凝素），化膿鏈球菌（S· py0genes)(例如μ蛋白質或其片段， C5A蛋白酶，脂肪磷壁酸），無乳鏈球菌（s· agaiacUae)、笑變鏈球菌（S. mutans);杜克雷嗜血桿菌（H ducreyi);莫拉克氏菌屬（Moraxella spp·)，包括黏膜炎莫拉克氏菌 catarrhalis)，也叫卡他布蘭漢球菌（BranhameUa catarrhaUs) (例如高和低分子量的植物血凝素和玻尿酸酶）；波德氏菌屬（Bordetella spp.)，包括百日咳波德氏菌（B pertussis) (例如穿孔假胞菌素、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血球統集素、腺甞酸環化酶、細毛）、副百日咳波德氏菌. -16- 本紙張尺度適用中關家標準(CNS) A4規格(21GX297公复) 1232753 A7 ______B7 五、發明説明（14 ) parapertussis)和支氣管敗血性波德氏菌（B br〇nchiseptica) ，分枝桿菌屬（Mycobacterium spp·)、包括結核分枝桿菌（μ. tuberculosis)(例如ESAT6、抗原 85Α、_Β或_C)、牛分枝桿 fe(M. bovis)、麻風分枝桿菌（μ· leprae)、禽分枝桿菌（M. avium)、副結核分枝桿菌（μ· paratuberculosis)，包皮垢桿菌（M· smegmatis);軍團桿菌屬（Legi〇neUa卿），包括嗜肺性軍團桿菌（L· pneumophila);大腸桿菌屬（Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌（例如菌落因子、不耐熱毒素或其衍生物、耐熱毒素或衍生物）、腸出血性大腸桿菌、致腸病性大腸桿菌（例如類志賀毒素毒素或其衍生物）；弧菌屬（Vibrio spp.)，包括霍亂弧菌（ν· eholera)(例如霍亂毒素或其衍生物）；志贺桿菌屬（Shigella spp )，包括索尼氏志賀桿菌（S· sonnei)、痢疾志賀桿菌（s dysenteriae)、弗莱司氏志賀菌（S· flexnerii);耶爾森氏菌屬（Yersinia spp.)，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌（γ· enter〇c〇litica)(例如蛋白質）、鼠疫耶爾森氏菌（γ· pestis)、假結核耶爾森氏菌（γ· ?“11(1(^^1^1〇士）；彎曲桿菌屬（(^1111^1〇1)如6门卯），包括空腸’考曲桿菌（C. jejuni)(例如毒素、植物血凝素和侵襲素）和大腸彎曲桿菌（c. coli);沙門氏菌屬（Salm〇nella SPP·)，包括傷寒沙門氏菌（S· typhi)、副傷寒沙門氏菌（s paratyphi)豬崔亂砂門氏適（s ch〇ieraesuis)、腸炎沙門氏菌（S. enteritidis);李斯特氏菌屬（Listeria spp )，包括單細胞增多性李斯特氏菌（L· m〇n〇eyt〇genes);螺桿菌屬 (Helicobacter spp·)，包括幽門螺桿菌（H pyl〇ri)(例如尿 -17-

1232753

醃、過虱化酶、空泡狀毒素）；假單孢菌屬 spp_)，包括綠膿桿菌（P. aerugin〇sa);葡萄球菌屬 (StaPty\〇C_US Spp·)，包括金黃色葡萄球菌（S. aureus)、表皮匍萄球菌（S· epidermidis);腸球菌屬（Enter〇c〇ccus SPP·)，包括糞腸球菌（E. faecaHs)、糞腸道球菌 faecium);梭菌屬（cl〇stddium spp )，包括破傷風梭狀菌 (C. tetani)(例如破傷風毒素和其衍生物）、肉毒梭菌（c· b〇tunnum)(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物），艱難梭菌（c· difficile)(例如梭菌毒素A*B和其衍生物）；芽孢桿菌屬 (Bacillus spp.) ’包括炭疽桿菌（Banthracis)(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物）；棒狀桿菌屬（c〇rynebacterium spp )，包括白喉桿菌（C. diphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物）；波雷爾氏螺旋體類（Borrelia spp·)，包括Β· burgdorferi (例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、Β· garinii (例如 0spA、 OspC、DbpA、DbpB)、Β· afzelii (例如〇spA、〇spC、

DbpA、DbpB)、B. andersonii (例如 OspA、OspC、DbpA、 D b p B )、赫氏蜱疏螺旋體（b . h e r m s i i);埃里希氏體類 (Ehrlichia spp.)，包括馬埃里希氏病原體（E equi)和人類顆粒性白血球埃里希氏症的病原體劑；立克次氏體類 (Rickettsia spp·)，包括立氏立克次氏體（R. rickeUsii);披衣菌屬（Chlamydia spp.)，包括砂眼披衣菌（c trachomatis)(例如MOMP、肝素結合性蛋白質）、肺炎披衣菌（C. pneumoniae)(例如MOMP、連結肝素蛋白質）、鸚鵡熱披衣菌（C. psittaci);端螺旋體類（Leptospira spp.)，包括 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（16 ) 問號鉤端螺旋體（L· interrogans);密螺旋體類（Treponema spp·)，包括梅素密螺旋體（Τ· pallidum)(例如稀有外膜蛋白質）、齒密螺旋體（T. denticola)、T. hyodysenteriae ;或者衍生自寄生蟲者例如癔原蟲屬（Plasmodium spp·)，包括鐮狀癔蟲（P. falciparum);弓形體屬（Toxoplasma spp.)，包括鼠弓型體（Τ· gondii)(例如SAG2，SAG3，Tg34);内阿米巴屬（Entamoeba spp.)，包括溶組織内阿米巴（E. histolytica) ;巴貝蟲屬（Babesia spp·)，包括田藏巴貝蟲（B. microti); 錐蟲屬（Trypanosoma spp·)，包括克魯士氏錐蟲（Τ· cruzi); 賈第鞭毛蟲類（Giardia spp·)，包括蘭氏賈第鞭毛蟲（G· lamblia);利什曼原蟲類（Leshmania spp·)，包括大型利什曼原蟲（L. major);肺囊蟲屬（Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲（P_ carinii);滴蟲屬（Trichomonas spp.)，包括陰道滴蟲（Τ· vaginalis);血吸蟲屬（Schisostoma spp.)，包括曼森氏血吸蟲（S· mans oni);或者衍生自酵母菌者例如念珠菌屬（Candida spp.)，包括血色念珠菌（C. albicans);隱球菌屬（Cryptococcus spp·)，包括腦膜炎隱球菌（C· neoformans) ° 結核桿菌的其他較佳特異性抗原為，例如Tb Ral2，Tb H9，Tb Ra35，Tb38-1，Erd 14，DPV，MTI，MSL， mTTC2和hTCCl (WO 99/51748)。結核桿菌的蛋白質也包括融合蛋白質和其變異體，其中至少兩個，較佳地三個結核桿菌多經融合成一較大的蛋白質。較佳的融合蛋白質包括 Ral2-TbH9-Ra35，Erdl4_DPV-MTI，DPV-MTI-MSL， -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（17 )

Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2 ， Erdl4-DPV-MTI-MSL ， DPV-MTI-MSL-mTCC2，TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)。披衣菌的最佳抗原包括例如高分子量蛋白質（HWMP) (WO 99/17741)，ORF3 (EP 366 412)，和假定膜蛋白質 (Pmps)。此疫苗調配物中的其他披衣菌抗原可以選自WO 99/28475中所述的組合中。較佳的細菌疫苗包括從鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌（例如莢膜多醣和其拼合物，PsaA，PspA，鏈球菌溶素，膽驗結合性蛋白質）衍生的抗原；和蛋白質抗原，肺炎球菌自溶解素（Biochem Biophys Acta，1989，67，1007; Rubins et al·， Microbial Pathogenesis, 25，337-342)，及其突變的脫毒衍生物（WO 90/06951 ; WO 99/03 884)。其他較佳細菌疫苗包括從嗜血桿菌屬，包括流行感冒嗜血桿菌B型（例如PRP和其結合物）、無型的流行感冒嗜血桿菌衍生的抗原，例如 OMP26，高分子量植物血凝素，P5，P6，蛋白質D和月旨蛋白D ’及細毛素（fimbrin )及細毛素衍生的（US 5, 843,464)或其多複本變異體或融合蛋白質。 B型肝炎表面抗原衍生物係技藝中熟知者並包括，與其他一起者，載於歐洲專利申請EP-A-414 374 ; EP-A-0304 578和EP 198-474中的彼等PreSl，PreS2 S抗原。於一較佳部份中，本發明疫苗調配物包括HIV-1抗原，gpl20，尤其是當在CHO細胞中表現出時。於另一實施例中，本發明疫苗调配物包括如上所定義的gD2t。在本發明一較佳實施例中，含有本發明申請專利的佐劑 -20- _ _____ 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) Α4規格(21〇Χ 297公釐） 1232753 A7 B7 五、發明説明（18 ) 之疫苗包括從經認為促成生殖器疣的人類乳頭瘤病毒（HP V) 衍生的抗原（HPV6或HPV11和其他）和從促成子宮頸癌的 PHV病毒衍生的抗原（HPV16，HPV18和其他）。用於生殖器疣的預防和治療的疫苗之特別較佳形式包括 L1粒子或殼粒，及包括一或更多種選自HPV6和HPV11蛋白質E6、E7、L1和L2中的抗原之融合蛋白質。融合蛋白質的最佳形式為在W0 96/26277中揭示的L2E7 和在GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285)中揭示的蛋白質 D(l/3)-E7。一較佳的HPV子宮頸感染或癌症的預防或治療疫苗組合物可包括HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體，或呈類病毒粒子（VLP)—起呈現的L1或L2抗原，或以VLP或殼粒構造單獨呈現的L1單一蛋白質。彼等抗原、類病毒粒子和殼粒本身皆為已知者。參閱例如WO 94/00152，W0 94/20137，WO 94/05792和 WO 93/02184。額外的早期蛋白質可單獨地包含入或以融合蛋白質形式例如E7、E2或較佳的E5包括在内。特別較佳的此實施例包括含有L1E7融合蛋白質的VLP (WO 96/1 1272)。特別較佳的HPV16抗原包括由早期蛋白質E6或E7與蛋白質D載體融合形成的蛋白質來自HPV16的E6或E7融合物，或其組合物；或E6或E7與L2的組合物（WO 96/26277)。另外，HPV16或18的早期蛋白質E6和E7可呈現於一單獨分子内，較佳者於一蛋白質D-E6/E7融合物中。彼等疫苗可以視需要包括一種或兩種來自HPV18的E6和E7蛋白質， -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（19 ) 較佳地係呈蛋白質D-E6或蛋白質D-E7融合蛋白質或蛋白質 D E6/E7融合蛋白質的形式。本發明疫苗可額外地包括來自其他HPV株的抗原，較佳的是來自HPV31或33株者。本發明疫苗更包括從引起瘧疾的寄生物中衍生的抗原。例如，來自惡性癔原蟲（Plasmodia falciparum)的較佳抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一種雜合蛋白質，其實質上包括經由B型肝炎表面抗體的前S2部分所含四個胺基酸與 B型肝炎病毒的表面（S)抗原聯結的惡性瘧原蟲環形生殖芽孢（CS)蛋白質的所有C端部分。其整體構造揭示於國際專利申請第PCT/EP92/02591號中，其係以申請自UK專利申請第9124390.7號的優先權之WO 93/10152公開者。當在酵母菌中表現時，RTS係以一脂蛋白粒子之形式生成，而與來自HBV的S抗原共表現出時，其產生一種名為RTS，S的混合粒子。TRAP抗原載於以WO 90/01496公開的國際專利申請第PCT/GB89/00895號中。本發明一較佳實施例是瘧疾疫苗，其中抗原的製劑包括RTS，S和TRAP抗原的組合物。其他可能成為多階段瘧疾疫苗成分的候選者之癔原蟲抗原為惡性瘧原蟲 MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP， RAP1，RAP2，Sequestrin，PfEMPl，Pf332，LSA1， LSA3，STARP，SALSA，PfEXPl，Pfs25，Pfs28， PFS27/25，Pfsl6，Pfs48/45，Pfs230和彼等在瘧原蟲類中的類似物。此調配物也可包括一種抗腫瘤抗原並可用於癌症的免疫 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 療性治療中。例如，該佐劑調配物可利用腫瘤排斥抗原例如對前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胰癌、腎癌或黑瘤癌者。典型的抗原包括MAGE 1和MAGE3或其他MAGE 抗原(Robbins and Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8 ，pps 628-636 ; Van den Eynde et al.

International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997) ； Correale et al.(1997)? Journal of the National Cancer Institute 89，p293)。實際上彼等抗原可在廣範圍的腫瘤類型例如黑色瘤癌、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表現出。其他腫瘤特異性抗原也都適合與本發明佐劑使用，且包括，但不限於腫瘤特異性神經節糖甞，前列腺特異性抗原（PSA)或 Her-2/neu，KSA(GAT33) ，PAP， mammaglobin，MUC-1，癌胚抗原（CEA)。因而在本發明一部份中提出一種含有本發明佐劑組合物的疫苗和一種腫瘤排斥抗原。於本發明包含腫瘤抗原的疫苗之一特別較佳的部份中，彼等疫苗在治療癌症，例如前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胰癌、腎癌、卵巢癌或黑瘤癌中有驚人的效力。因此彼等調配物可含有腫瘤相關性抗原和與腫瘤支援機制（例如血管生成、腫瘤侵入）相關聯繫的抗原。此外，與癌症治療中的疫苗特別相關的抗原也包括前列腺特異性膜抗原（P+SMA)、前列腺莖細胞抗原（PSCA)、酪胺酸酶，殘存素（survivin)，NY-ES01，前列腺酶（prostase)，PS108 (W0 98/50567)，RAGE，LAGE，HAGE。此外該抗原可以 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7

疋U激素例如全長親性腺激素釋放激素（G祕，獨 /20600) *的十胺基酸長之肽，可用的治療，或免疫閹割中。本么月、、且口物可預期能用來調配含有衍生自波雷爾氏螺旋體類的抗原之疫苗。例如，該抗原可包括核酸，病原衍生的抗原或抗原製備物，重組產生的蛋白質或肽，及嵌合型融合蛋白質。特別者該抗原為〇spA。〇spA可以為有宿主、田胞（大腸桿菌）的脂化形式特徵稱為（Lip_〇spA)的完全成熟蛋白質或為非脂化衍生物。彼等非脂化衍生物包括擁有机仃性感冒病毒的非構造蛋白質（NS1)所含前8i N•端胺基酸芡非脂化NSl-〇spA融合蛋白質和全〇spA蛋白質，和另 T有3個額外N-端胺基酸的〇spA非脂化形式的MDP-OspA 〇本發明疫苗可用於過敏的預防或治療。彼等疫苗含有過敏原特異性抗原（例如Der pl)和過敏原非特異性抗原（例如人歲IgE竹生的肤’包含但不限於肤（ep 〇 477 231 B1))。本發明疫苗也可用於除過敏、癌症或傳染病外的慢性病之預防和治療。彼等慢性病為諸如動脈硬化和阿茲海默氏症的疾病。適合預防和治療易感染或已患上阿茲海默氏神經變性病的病人所用抗原為，特別者，類澱粉蛋白前體蛋白質的N-端39-43的胺基酸片段（a冷）和更小的片段。該抗原揭於國際專利申請第 WO 99/27944-號（Athena Neurosciences)之 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

裝訂

線 A7 B7 1232753 五、發明説明（22 中。在每一疫苗劑量中的蛋白質含量係經選擇成可引發免疫保護反應而無典型疫苗中的明顯不良副作用之量。彼等量會依所用特異性免疫原和其如何呈現而變異。一般預計每一劑量含有1_ 1000微克的蛋白質，較佳的是1-5〇〇微克，更佳的為1-100微克，最佳者為2至50微克。一特定疫苗的最適1可經由包括觀察在接種對象中的恰當免疫反應之標準研％來確足。於起始接種之後，該對象可以接受充分間隔的一次或數次加強免疫處理。彼等疫苗調配物可在初給或加強接種階段施加到哺乳動物的黏膜表面；或另行地經由系統性給藥，例如經由透皮、皮下或肌肉内的途徑者。在本發明佐劑或疫苗中的CPG或免疫刺激性低聚核甞酸的含量一般是很少的，但依疫苗調配物而定，可在每劑卜 1000微克的範圍内，較佳的是每劑1-5〇〇微克，且更佳者在每劑1至100微克之間。用於本發明佐劑中的急素含量可在每劑卜…㈧微克的範圍内’較佳的是每劑L微克，更佳的是每^_250微克且最佳的是每劑丨至丨⑼微克之間。因而CPG:息素比（w/w) 係在1 : 1〇〇〇到1000: i的範圍内，典型者為在1: 1〇〇至 1〇〇 : 1之間’且較佳的是在i : 10到i :…：⑶1〇: i的範圍内，而最佳的是1 : 1，4 : 1或10 : i。本發明調配物可用於預防和治療兩種目的。因此，乃提出包素和CpG分子的組合在製造預防和治療病毒、細菌= 寄生蟲的感染、過敏、癌症和其他非慢性疾病所用疫苗之

裝玎

線 -25-

1232753 A7 B7 五、發明説明（23 ) 用途^據此，，本發明提出—種治療易感染或已患上傳染疾病或癌症，或過敏，或自體免疫病的哺乳動物之方法。在本發月另部份中’提出一種如本文所述疫苗或佐劑組合物’其包括扈素和CpG，作為醫藥品之用途。疫苗製備係概括地載於New Trends and Devel〇pments 比 Vaccines (疫苗的新趨勢和發展），edited by v〇ller et al ,以M Press，Baltimore，Maryiand，匕心八，1978，之中。本發明組合物預期可用於調配含有源自廣多種來源的抗原之疫田。例如，該抗原可包括人類、細菌或病毒核酸、病原何生的抗原或抗原製備物，腫瘤衍生的抗原或抗原製備物、宿主衍生抗原，包括從IgE衍生的肽，例如igE的組織胺釋放性十肽（名為Stanw〇rth十肽），重組合產生的蛋白質或肽和嵌合型融合蛋白質。本發明提出系統性疫苗組合物，其包括一抗原，一惠素和一免疫刺激性低聚核甞酸。因而提出一種治療易感=或已患上疾病的個體的方法，其包括經由該個體的系統性途徑給用本文實質說明過的組合物。此外，也提出防止個體感染選自下列之中的疾病之方法··傳染性細菌和病毒疾病、寄生物病、前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胰癌、腎癌、卵巢癌或黑瘤癌；非癌症慢性疾病、過敏、阿炫海默氏病、動脈硬化，該方法包括經由該個體的系統途徑給用本文實質說明過的組合物。另行地，本發明提出一種黏膜疫苗組合物其包括一抗原和一么血性皂素。因此，提出一種治療易感染或已串、上疾 -26- 本紙張尺度適用巾賴家鮮(CNS) M規格(⑽X 297公石 1232753 A7 •丨丨 ______B7 五、發明説明（24 ) 病的個m之方法，包括用本文實質說明過的組合物施用於該個體的黏膜表面。、在再者，亦述及一種誘發哺乳動物系統性抗原特異性免疫反應的方法，包括對該哺乳動物的黏膜表面給用含有抗原和洛血性皂素的組合物。更提出一種製造疫苗或佐劑的方法’其包括取得一皂素和取得一 CpG分子並將彼等與一抗原混合。可用於本發明組合物中的適當醫藥可接受賦形劑之例子包括水、磷酸鹽緩衝食鹽水，等張性緩衝溶液。附圖說明：凰丄：鼻内強化接種14天後〇spA特異性IgG滴定度。凰鼻内強化接種14天後〇spA特異性LA2滴定度。凰2 ·鼻内強化接種14天後血清流行性感冒株特異性IgG 滴定度。凰_i_:鼻内強化接種14天後血清的流行性感冒株特異性血清血球凝集抑制（HAI)滴定度。凰.5 :小鼠體内OspA特異性LA2滴定度。凰五：得自已免疫小鼠的脾細胞所具gp 120-特異性淋巴組織增生活性。該抗原特異性活性係以所有4實驗組於不同抗原濃度下的刺激指數（SI)表示。 Μ 7 :得自已免疫小鼠的脾細胞所具HBsAg-特異性CTL活性。效應細胞活性係經由檢驗P815細胞（空心圓）或經s-轉染P815細胞（實心圓）的51Cr釋放予以評估。圖8 :免疫小鼠體内的HBsAg-特異性抗體反應。特異性 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（25 ) 抗體滴定度（以EU/愛升表示）和同型全貌係經由ELISA檢測予以評估。合併血清所得值係顯示於表中，而同型分佈也繪示在圖中。遍1 :得自免疫小鼠的脾細胞所具HBSAg-和gpl20-特異性淋巴組織增生活性。抗原特異性活性係以所有4實驗組於不同抗原濃度下的刺激指數（SI)表示。 8LJ〇 :得自免疫小鼠的脾細胞所具HBsAg-和gpl20-特異性CTL活性。效應細胞活性係經由檢驗對照p815細胞（空心符號）或顯示出HBsAg或gp120 CTL抗原決定部位P815細胞 (實心符號）的51 Cr釋放予以評估。圖1 〇 a及1 〇 B分別表以肽gp 120刺激及以肽Hbs Ag刺激

Mil :在免疫小鼠體内的Gpl20-特異性和HbsAg-特異性抗體反應。特異性抗體滴定度（以微克/毫升表示圖ΗA) 和同型全貌係經由ELISA檢測予以評估。合併血清所得值係顯示於表中，而同型分你也緣示在圖中。圖11B顯示出 gpl20-特異性抗體的同型圖型。麗_11 :數組各含10隻動物的平均腫瘤成長隨時間之演〇本發明要由下面的例子予以闡明，但不受其所限。貫施例1用QS2 1和CpG經鼻内強化接種Lip〇-〇spA的系統性抗體在此實施例中我們探討溶裂性皂素例如QS21的和免疫刺激劑例如CpG疋否能夠以協同方式於小鼠的鼻内強化接種中增加系統的免疫反應。雌性Balb/c小鼠（每組五隻），年齡為8星期，用調配到明礬（5〇微克）上的lip〇-〇spA(1微克） -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232753 A7 ____ B7 五、發明説明（26 ) 進行肌肉内接種免疫。三個月後，對小鼠經鼻内強化接種 (在麻醉下）10微升溶液（每個鼻孔5微升，用吸液管以小滴輸送），該溶液包括在下列中任一者中的5微克1丨？〇-〇3?八： A : PBS ; B ·· 20微克 CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT ’ Krieg 1826) ; C : 5 微克 QS21 (得自 Cambridge Biotech, USA) ; D ·· 20微克 CpG 1001+5微克 QS21 ;或E ·· 經由肌肉内注射1微克吸附到明礬（50微克）上的lipo-OspA。圖1和2顯示出鼻内強化接種14天後OspA特異性IgG 滴定度和LA2滴定度。方法进1定小鼠· OspA特異性血清IgG所用的ELISA : 將Maxisorp Nunc免疫板在4°C下用已在PBS中稀釋的1微克/毫升OspA以50微克/洞予以塗覆一整夜（在平板的B到Η 列），或用50微升在PBS中的5微克/毫升經純化山羊抗小鼠 Ig(Boerhinger)予以塗覆一整夜（A列）。平板上的空白部位用含有1%BSA，0.1%聚氧乙晞脫水山梨糖醇單月桂酸鹽 (TWEEN 20)和4%正常牛血清（NBS)的飽和緩衝液：PBS予以封阻（1小時，37°C )。然後加入系列2倍稀釋的經稀釋在飽和緩衝液中之IgG同型混合物（50微升每洞）作為標準曲線（得自Sigma的小鼠單株抗體IgGl，IgG2a和IgG2b，以 200奈克（n g) /毫升開始並置於A列中），和血清樣品（以 1 /100稀釋度開始且置於B列到Η列中）在37 °C下保溫1小時 30分鐘。然後用洗滌緩衝液（pbs，0.1%的聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸鹽（TWEEN 20))洗滌平板（3次）。然後加入 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（27 ) (50微升/洞）在飽和緩衝液中稀釋1/5000的生物素基化的山羊抗小鼠I g G並在3 7 °C下保溫1小時3 0分鐘。於洗務三次和緊接著加入鏈抗生物素蛋白-辣根過氧化酶拼合物 (Amer sham)後，洗條平板5次並在室溫下與50微升/洞的顯露緩衝液（OPDA 0.4毫克/毫升（Sigma)和H202 0.03%於 50mM pH值4.5的檸檬酸鹽緩衝液中）保溫二十分鐘。加入 50微升/洞的2NH2SO4停止顯露。用Biol：ad 35 50 免疫讀取器讀取492和630奈米（nm)處的光密度。經由使用 SoftMaxPro軟體以4參數數學方法計算抗體滴定度。測量血清中對抗lipo-OspA的似LA2抗體之滴定度所用的抑制檢定在疫苗中的抗體滴定度係針對彼等的似LA2特異性予以研究。LA2是一種小鼠單株抗體，其可辨識在細菌表面的構像（conformational) OspA抗原決定部位並經證明能在試管内殺死B. burgdorferi，且能保護小鼠對抗實驗室培養的螺旋體的侵害（Schaible UE et al.1990，Proc Natl Acad Sci USA 87 : 3768-3772)。還有，LA-2 mab業經證明與殺菌的抗體是相關的，並且對人類血清的研究也顯示在總抗-〇3?八4〇滴定度與1^-2滴定度（以£1^18八測定）之間有良好的相互關聯性。將Maxisorp Nunc免疫板在4°C下用已在PBS中稀釋的0.5 微克/毫升lipo OspA以50微克/洞予以塗覆一整夜。平板上的空白部位用飽和緩衝液在37°C下予以封阻1小時（100微升/洞飽和緩衝液：PBS/BSA 1%/Tween 20 0.1%/NBS 4%。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7

五、發明説明（況 ) 在飽和緩衝液（50微升每洞）中從4微克/毫升起始以系列刑 2-倍稀釋率將LA2單株Ab (mAb)稀釋以形成標準曲線/也加入得自受接種者的血清樣品稀釋液（以1/1〇稀釋度起始）並將諸板置於37。(：下保溫2小時。溫置後用pbs/Tw^enW2() (〇·1%)洗滌諸平板3次。然後於各洞中加入（5〇微升/洞）在飽和緩衝液中稀釋（1/1〇5〇00)的LA2 mAb-過氧化酶拼合物並在37°C下保溫1小時。於洗滌五次後，在室溫下與5〇微升/洞的顯露緩衝液（0PDA 〇·4毫克/毫升和H2〇2 〇〇3%於 50mM pH值4.5檸檬酸鹽緩衝液中）保溫二十分鐘。加入 HJO4停止反應與顏色形成。用Bi〇ra(j 355〇免疫讀取器讀取492和630奈米（nm)處的光密度。經由使用s〇ftMaxPr(^ 體以4參數數學方法計算似lA2 Ab滴定度。由標準曲線的比對來測定似LA2抗體滴定度。結果

CpG和QS21可明顯改良對Lipo_〇spA的系統性抗體之鼻内強化接種。並且，當兩種佐劑組合時，清楚地顯示出對彼等反應有協同效用，尤其就LA2抗體而言。在QS21和 CpG的存在下引出的體液反應顯著地高於用非經腸強化接種謗發者。合起來看，彼等結果清楚地顯示包括溶裂性皂素和免疫刺激劑的鼻内調配物所具潛力。實施例2·增強對流行性感冒病毒的系統性抗體之鼻内強化接種所用的協同性qS21和CpG組合在此實施例中我們要探討諸如qS2 1 (參閱實施例）的溶血性惠素和諸如CpG的免疫刺激劑是否能夠以協同方式增強 -31 - 本紙張尺度通财關家標準(CNS) A4規格(謂〉〈297公羡) 1232753 A7 ^___B7 五、發明説明（29 ) 在用經抑活化的全流行性感冒病毒鼻内初給的小鼠體内之系統性抗體的鼻内強化接種。雌性Balb/c小鼠（每組1〇隻），年齡為8星期，用冷丙内酯抑活化的三價全流行性感冒病毒（A/北京/262/95 ; A/約翰尼斯堡/33/94 ; B/帕拿馬/45/90 ; 5微克HA/株）鼻内初給以模仿發生在人類的天然初給。28天後，將小鼠鼻内強化接種（在麻醉下）20微升含有1.5微克HA/株的冷_丙内酯抑活化三價全流行性感冒病毒（與初給免疫相同的株）在下列之中的一者内之溶液（1 0微升每個鼻孔，用吸液管以液滴輸送）：A : PBS ; B : 50 微克 CpG(TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT，Krieg 2006);<：:4.5微克(^21(得自 Cambridge Biotech，USA) ; D : 50微克 CpG + 4.5微克 QS21 ;或E :經由肌内注射1.5微克HA/株的三價分解流行性感冒病毒（與初給免疫相同的株）。流行性感冒抗原由SSD GmBH製造商（Dresden，Germany)提供出。圖3和4顯示出鼻内強化接種14天後血清中流行性感冒菌株特異性IgG滴定度和血球凝集抑制（HAI)滴定度。顯示鼻内加強接種14天後。方法測哥小鼠體内抗-流行性感冒IgG滴定唐所用的F丄ISA : 將Maxisorp Nunc免疫板在4°C下用已在PBS中稀釋的1微克/毫升全流行性感冒病毒抗原以5 0微克/洞予以塗覆一整夜（在平板的B到Η列），或用50微升在PBS中的5微克/毫升經純化山羊抗小鼠Ig(Boerhinger)予以塗覆一整夜（Α列）° -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（30 ) 平板上的空白部位用含有1 % BSA，0.1%聚氧乙婦脫水山梨糖醇單月桂酸鹽（TWEEN 20)和4%正常牛血清（NBS)的飽和緩衝液：PBS予以封阻（1小時，37°C )。然後加入系列 2-倍稀釋的經稀釋在飽和緩衝液中之IgG同型混合物（50微升每洞）作為標準曲線（得自Sigma的小鼠單株抗體IgGl， IgG2a和IgG2b，以200奈克（ng)/毫升開始並置於A列中），和血清樣品（以1/100稀釋度開始且置於B列到Η列中）在37 °C下保溫1小時30分鐘。然後用洗滌緩衝液（PBS，0.1%的聚氧乙婦脫水山梨糖醇單月桂酸鹽（TWEEN 20))洗滌平板 (3次）。然後加入（50微升/洞）在飽和緩衝液中稀釋1/5000的生物素基化山羊抗小鼠IgG並在37°C下保溫1小時30分鐘。於洗滌三次和緊接著加入鏈抗生物素蛋白-辣根過氧化酶拼合物（Amersham)後，洗務平板5次並在室溫下與50微升/ 洞的顯露緩衝液（OPDA 0.4毫克/毫升（Sigma)和H202 0.03% 於50mM pH值4.5的擰檬酸鹽緩衝液中）保溫二十分鐘。加入50微升/洞的2N H2S04停止顯露。用Biorad 3550免疫讀取器讀取492和630奈米（nm)處的光密度。經由使用 SoftMaxPro軟體以4參數數學方法計算抗體滴定度。塗覆所用經/3丙内酯（BPL)抑活化的全流行性感冒病毒（株A/北京 /262/95)係由 SSD GmBH 製造商（Dresden，Germany)提供。小鼠體内流行性感冒特異性血清Abs的血球凝集抑制（HAI) 活性血清（25微升）先用100微升的硼酸鹽0.5M緩衝液（pH 9)和 -33- ___-______ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1232753 A7 B7 五、發明説明（31 ) 125微升購自Dade Behring高嶺土在室溫（RT)下處理20分鐘。離心沈澱後（30分鐘，3000 RPM或860克），將100微升的上澄液（相當於1/10稀釋度的血清）取出並與0.5%難血紅血球在4°C下保溫1小時。在3200 RPM (970克）的離心沈澱 10分鐘後收集上澄液。兩次操作是為了消除血清中的自然血球凝集因子而進行的。然後，將25微升已處理血清稀釋在96洞Greiner平板中的25微升PBS内（始於1/20的系列2倍稀釋）。以4個血球凝集單位的濃度（亦即低於最後一次引起紅血球凝集的稀釋度4倍者）加入經BPL抑活化之全病毒 (25微升/洞）並在室溫下攪動30分鐘。在讀取前平板最後係在4°C下保存一整夜。HAI滴定度係對應於抑制病毒謗發血球凝集的最後血清稀釋度。結果

CpG和QS2 1沒有提高對抗流行性感冒株的IgG或HAI抗體之鼻内加強接種。但是，當兩種佐劑組合時，清楚地顯示出對彼等反應的協同效應。由QS21和CpG引出的HAI反應甚至比那些由非經腸強化接種謗發者更相似。彼等結果肯定了組合溶血性皂素和免疫刺激劑的鼻内調配物所具潛力。彼等也顯示出有數種CpG序列在此範疇中有效用。（在本實施例中的Krieg 2006和在實施例3和5中的Krieg 1826)。實施例3.用於增強Lipo-OspA系統性抗體的鼻内加強接種之/3-七葉皂甞/CpG協同組合物在本實施例中我們評估用其他溶血性皂素例如沒-七葉皂 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1232753 A7 __B7 五、發明説明（32 ) 芬能獲得與在QS21和CpG之間觀察到的相似協同效應之可能性。此外也試驗非溶血性惠素，甘草酸。雌性Balb/c小鼠（每組6隻），年齡為8個星期，用調配到明蓉上的lipo_OspA (1微克）鼻内初給。三個月後，對小鼠鼻内加強接種（在麻醉下）10微升的溶液（5微升每鼻孔，用吸液管以液滴方式注入）其中含有5微克在以下其中一種之内的 lipo-OspA ·· A : PBS ; B : 50微克 CPG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT，Krieg 1826) ; C ·· 5微克 -七葉皂嘗（購自Sigma)，D: 50微克CpG 1001+5微克/3-七葉皂芬；E : 5微克甘草酸（購自Sigma) ; F : 50微克CpG 1001+5 微克甘草酸，或G :經由肌肉内注射1微克吸附到明蓉（5〇微克）上的lipo-OspA。圖5顯示出鼻内加強接種14天後的 OspA特異性-LA2滴定度。方法彼等方法與在實例1中詳細者相同。結果冷-七葉皂甞和CpG在增強系統性la2 Abs的鼻内加強接種中協同地起作用。此組合物比非經腸的加強接種引發出更南的Ab反應。另一方面，由組合CpG和甘草酸不能獲得彼等協同效應。彼等和此專利先前的結果一起顯示CpG和諸不同溶血性皂素以協同方式佐助免疫反應的能力。實例4.使用與CpG及/或DQS21調配的惡性瘧原蟲rts，S 和HIV-1 gpl20致免疫性研究 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公羞·) 1232753 A7 B7 五、發明説明（33 ) 1 · 實驗大綱進行兩隻小鼠的致免疫性研究以評估CpG低聚核甞酸 (CpG)和QS21單獨的潛在添加或協同效應。將多組小鼠用與CpG和QS21單獨或組合地調配的RTS，S和gpl20予以免疫化。彼等佐劑組合物也在載體A1(0H)3或水包油乳液（o/w) 存在中測試。經過兩次非經腸免疫處理後檢驗調配物的致免疫力。針對抗原特異性抗體的存在和抗體同型分佈分析血清。用脾細胞來評估細胞媒介的免疫反應。對彼等細胞檢驗細胞毒性T型淋巴球（CTL)和淋巴組織增生性（淋巴組織增生）細胞的存在。表1 :實驗1中的小鼠分組組抗原佐劑 1 RTS，S/gpl20 CpG/DQS21 2 RTS，S/gpl20 DQS21 3 RTS，S/gpl20 CpG/DQS21/Al(OH)3 4 RTS，S/gpl20 CpG/Al(OH)3 表 2 ·· 1 f驗2中的小鼠分組組抗原佐劑 1 RTS，S/gpl20 CpG 2 RTS，S/gpl20 CpG/DQS21 3 RTS，S/gpl20 CpG/DQS21/o/w 乳液 2. 調配物 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（34 ) 2.1.實驗1 調配程序：在每次注射二天製備調配物。在需要時，將rts S (10 微克）和gpl20 (10微克）吸附在100微克AL(〇H)3上。於需要時’於加入MPL (5微克）並溫置3 0分鐘後才加入1 〇倍濃繪的PBS，pH 7.4和仏0的混合物之緩衝液，但對不含Dq 者，其缓衝液是P〇4，NaCl 10/150 pH 6.8。三十分鐘後，若需要時，將以1/5重量比的QS21/膽固醇與微脂粒混合的 QS21 (5微克）（稱為DQ)加到調配物中。30分鐘後，在有 oligo的調配物中，於加入作為防腐劑的5〇微克/毫升硫柳汞（thiomersal)之前30分鐘加入1〇〇微克的CpG。

Al(OH)3+RTSS+gpl20_l 小時 _MPL_30 分鐘·預混合料-30 分鐘-D Q - 3 0 分鐘-C p G - 3 0 分鐘· T h i 〇所有溫置皆在室溫下振盧進行。 2.2 實驗2 調配程序：對兩注射同時調配。一隻小鼠的注射量是1〇〇微升。加入50微克/亳升的硫柳汞作為防腐劑。 I·一組：將RTS，S (10微克）和gpi2〇 (1〇微克）用h20和 PBS pH 6.8稀釋使呈等張性。5分鐘後，將調配物吸附在 CpG 1856 (1〇〇微克）上。、组：-將RTS，S (10微克）和gpl20 (10微克）用H20和 ?68卩117.4稀釋使呈等張性。5分鐘後，將111^，8和§{)12〇吸

1232753 A7 B7 五、發明説明（35 ) 附到DQ (5微克）上。三十分鐘的吸附後，將調配物吸附在 CpG 1856 (100微克）上。差三組：將RTS，S (1〇微克）和gpl20 (1〇微克）用H20和 PBS pH 6.8稀釋使呈等張性。5分鐘後，將調配物吸附到 o/w乳液上。經5分鐘的吸附後，將調配物在加入CpG (100 微克）前吸附到QS21 (5微克）上。 3. 免疫方法每組九隻（Balb/.C X C57B1/6) F1小鼠以兩星期的間隔接種 2 X 50微升的疫苗於後腳板中。兩星期後，取得血清以評估抗體反應，且採取脾細胞以測定細胞媒介的免疫反應。對於淋巴組織增生的分析，係在96洞圓底的微滴定平板中以每毫升2 X 106的濃度四重複地接種細胞。在含不同濃度的RTS，S或gpl20抗原下，於增補抗生素、穀胺醯胺和 1%(ν/ν)正常小鼠血清的RPMI-1640中培養彼等細胞72或96 小時。對照組細胞係於無抗原之下培養。然後用1微居/洞 [3H]-胸腺核茹脈衝彼等細胞一整夜後，收集並在沒粒子計數器中測定摻入的放射性。結果以平均計數每分鐘（cpm) 表出。對於CTL分析，在1〇微克每毫生的對應於HBsAg CTL抗原決定部位（Schirmbeck et al·, 1995)或代表gpl20 CTL抗原決定部位（Casement et al·， 1995)的 pCMI007 (GIHIGPGRAFYAARK)之合成 pCMI003 (IPQSLDSWWTSL) 的存在下，於6洞平板中培養細胞7天。在培養期末，使用對照組和S-轉染P815細胞以標準[51Cr]-釋出檢定二重復地 -38 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1232753 A7 B7 五、發明説明（36 ) 評估效應細胞的HBsAg-特異性溶細胞活性。Gpl20-特異性細胞毒害性係經由使用未處理的或經用PCMI007脈衝處理1 小時的P8 1 5目標細胞予以測定。最小和最大釋出率係用目標細胞而非效應細胞並分別添加3% (v/v) Triton X-100測定的。結果係表為％ [51Cr]-釋放率（實驗室培養的cpm-自然釋放的cpm/最大釋放的cpm_自然釋放的cpm)。合併血清的滴定分析和同型分析係以酵素·聯結免疫吸著檢定（ELISA)的方式使用經HbsAg塗覆的平板進行的。將血清在PBS/BSA中以1 : 400起始稀釋。使用對Ig或同型物 IgGl，IgG2a和IgG2b具特異性的生物素基化次級抗體接著辣根過氧化酶-鏈抗生物素蛋白拼合物來偵檢經結合的抗體。用SoftmaxPro從參比值中計算ELISA滴定度並以ELISA 單位（EU/毫升）表出。Gp 120-特異性抗體滴定度係使用以 gp 120蛋白質覆蓋的平板以標準ELISA測定的。將血清在 PBS/Tween20/BSA中自1 : 100開始稀釋。使用對Ig或同型物IgGl，IgG2a和IgG2b具特異性的生物素基化次級抗體接著辣根過氧化酶-鏈抗生物素蛋白拼合物來偵檢經結合的抗體。相對於標準小鼠Ig計算滴定度並以微克/毫升表出。 4.結果實驗1 淋巴組織增生反應的分析未顯示出在組間對RTS，S的反應性有任何顯著差異。相反地，包括CpG和DQS21兩者的第1組和第3組顯示出比含有單獨CpG或DQS21的組較佳的 gp 120-特異性淋巴組織增生反應（圖6)。 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝玎

1232753 A7 B7 五、發明説明（37 ) 在這實驗中只測量HBsAg-特異性CTL。在接受組合CpG 和DQS21的第1和第3組與只用這兩種佐劑成分其中一種免疫的第2和第4組之間在CTL謗發中沒有明顯的不同，而 A1(0H)3的存在會減少含CpG和DQS21組合的第1組中觀測到的CTL活性（圖7)。但是，卻有一種趨勢出現，即CpG和 DQS21比單獨的DQS21較佳，且此組合物比單獨的CpG在 A1(0H)3的存在下會謗發更多的CTL。小鼠的免疫反應只針對HBsAg-特異性抗體的存在檢驗。除了第3組顯示出約三倍的增加之外，在所有組中皆有相似的滴定度，徵明在A1(0H)3的存在下DQS21和CpG的組合物比單獨的CpG更具致免疫性。含有A1(0H)3的第3和第4組的同型分佈相似，而不含A1(0H)3時，CpG和DQS21的組合物比單獨的DQS21謗發更強的似TH1的同型樣式（圖8)。實驗2 於此實驗中對RTS，S和gp 120具特異性的淋巴組織增生反應非常相似。數據顯示DQS2 1的添加（單獨者或在水包油乳液中者）可增強兩種抗原的淋巴組織增生反應（圖9)。CTL 反應係經由使用HBsAg和gp 120 CTL兩者的抗原決定部位來評估。在兩種情況下，第1組以單獨的CpG免疫後能探測到CTL (圖10)。而，加入DQS21會導致對兩種抗原的 CTL之明顯增加（圖10)。水包油乳液的存在會中和DQS21 (gp 120)的正面效應或會提高試管内檢定的背景（HBsAg)。經添加DQS21到CpG佐劑中會增加對HBsAg和gp 120的抗體反應（圖11A)。當調配物中包括水包油乳液時可觀察到 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 B7 五、發明説明（38 ) 進一步的提高（圖11A)。將DQS21加到CpG會使gpl20同型分佈向更明顯的丁則偏向偏移（圖11B)，同時在這實驗中對 HBsAg同型分佈的衝擊較不顯著。 5.結論用以CpG和DQS21組合物調配的RTS，S和gpl20來免疫會導致強大的抗原特異性免疫反應。佐劑成分CpG和DQS21 的組合物相對於單一的成分會 - 增強淋巴組織增生反應 - 提高CTL活性 - 擴大抗體滴定度和TH1同型樣式實施例5. CpG及/或DQS21調配物在TC1腫瘤模型中的治療潛能 1.實驗設計各含10隻C57bl/6小鼠的四組在第0天於協腹裏皮下接受 10e6 (200微升）TC1細胞（E7表現性腫瘤細胞）接種。然後在腫瘤挑激後第14和21天用5微克調配好的PD1/3E7 HPV16注入腳板間對小鼠接種兩次。一星期兩次個別測定腫瘤生長。小氣組別： 1. 無疫苗 2. PD1/3E7 + CPG (10微克 ODN 2006) 3. PD1/3E7+DQS21 (0.5微克） 4. PD1/3E7 + CPG+DQS21 一星期兩次經由測量個別腫瘤來監測腫瘤的生長。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1232753 A7 ______ Β7 五、發明説明（39 ) 在注射天進行調配。一隻小鼠的注射量是100微升。若需要時，用H20和pH 7·4的PBS稀釋PD1/3E7 (5微克）成等張性。5分鐘後，若有需要時，將以1/5的QS21/膽固醇重量比與微脂粒混合的QS21 (0.5微克）加到調配物中。30分鐘後’對有oligo的調配物在加入作為防腐劑的1微克/毫升破柳汞之30分鐘前加入1〇微克的CpG (ODN 2006)。 H20+PBS pH 7.4+PD1/3E7-5 分鐘+DQ-30 分鐘+CpG-3〇分鐘-Thio 結果圖12顯示出每1〇隻小鼠一組的平均腫瘤生長隨時間的演變。接受10e6 TC1細胞腫瘤挑激的動物有100%漸進地發展出增長的腫瘤。 70-80%的無接種動物或以在DQS21中的E7蛋白質接種的動物在第35天死亡。以調配到DQS21内的E7蛋白質之兩種接種幾乎沒有影響腫瘤的生長。相反，以在CPG佐劑中的5微克protD 1/3 E7 HPV16 IFP (第14和21天）的兩次接種都引發彼等已長成腫瘤的消退並保護小氣免於死亡：70-80%的小鼠仍在第3 5天生存。這兩種免疫刺激劑CPG和DQS21的組合物顯示出比單獨使用CpG較稍有益的效應。 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) $ 訂

線 1232753 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) 序列表 <101〉 Friede，Martin

Garcon，Nathalie Hermand Philippe <120> 佐劑調配物 <130> B45181 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210〉 1 <211〉 20 <212> DNA <213> 人類 <400> 1. 20 tccatgacgt tcctgacgtt <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> 人類 <400> 2 tctcccagcg tgcgccat <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213〉人類 <400> 3 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> 人類 <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213〉人類 <400> 5 tccatgacgt tcctgatgct 18 30 24 20 -43-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims

123^^107209 號專利申請案 B8 中文申請專利範圍替D81 _ 相翻g Hi 1· 一種佐劑組合物，其包括Q S 2 1 ' 3 D - Μ P L及免疫刺激性寡核苷酸，其中該免疫刺激性寡核甞酸包括一嘌呤、 p票吟、C、G、σ密淀、喃淀序列。 2.根據申請專利範圍第1項之佐劑組合物，其中該免疫刺激性寡核甞酸係包括一段選自由TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO: 1) ； TCT CCC AGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO: 2) ； ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO: 3) ； TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(SEQ ID NO: 4) ； TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO: 5)所組成之群之序列。 3·根據申請專利範圍第1項之佐劑組合物，其中該免疫刺激核甞酸係為選自由TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO:l) ； TCT CCC AGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO: 2) ； ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO: 3) ; TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(SEQ ID NO: 4) ； TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQIDNO:5)所組成之群之序列。 4·根據申請專利範圍第1項之佐劑組合物，其中該免疫刺激性寡核苷酸含有被至少三個核嘗酸分開的至少兩個未甲基化CG重複體。 5·根據申請專利範圍第1項之佐劑組合物，其中該免疫刺激性寡核荅酸含有被6個核甞酸分開的至少兩個未甲基化CG重複體。 6·根據申請專利範圍第1至5項中任一項之佐劑組合物，其 63708-940117.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公董)

裝訂

Ϊ232753 申請專利範圍 7 :進—步包括一載劑。 :據申請專利範圍第6項之選自水知奶，、〒及載劑係體。以硬、含微脂粒之膽固醇或明蓉的粒狀載 8.利：圍第7項之佐劑組合物，其中該含微脂 9 膽固醉之載劑係含有QS21。 •根據中請專利範圍第8項之固醇之比例為1:5。 -中QS2!與膽根據申凊專利範圍第7項之佐劑組合物乳液之載劑係含有Q S 2 1。 11·根據申請專利範圍第8項之佐劑組合物括金屬鹽顆粒。 12.根據申請專利範圍第10項之佐劑組合物括金屬鹽顆粒。 13·根據申請專利範圍第11項之佐劑組合物粒為氫氧化鋁或磷酸鋁。 14·根據申請專利範圍第12項之佐劑組合物粒為氫氧化鋁或鱗酸鋁。 15·根據申請專利範圍第…項中任—项之佐劑組合物，其 2用於製備預防或治療病毒性、細菌性、寄生蟲性感染、過敏、癌症或其他慢性病症。 16*種疫苗組合物，其包括根據申請專利範圍第1至5項中任項之佐劑組合物，且進一步包括一腫瘤抗原。 17·根據申請專利範圍第丨6項之疫苗組合物，其中該抗原係其中該水包油裝其係進一步包其係進一步包其中金屬鹽顆其中金屬鹽顆玎 63708-940117.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1232753 - C8 D8 六、申請專利範圍選自 MAGE、BAGE、GAGE、MUC-1、Her-2 neu、 CEA、PSA、KSA、PRAME或 GnRH。 18. 根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其中該腫瘤抗原為 MAGE。 19. 根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其中該腫瘤抗原為 Her-2 neu ° 20. 根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其中該抗原係選自PSMA、PSCA，酶胺酸酶、生存素（survivin)、NY-ES01、前列腺酶（prostase)、PS108、RAGE、LAGE 或 HAGE。 21. —種疫苗組合物，其包括根據申請專利範圍第1至5項中任一項之佐劑組合物，並進一步包括類澱粉蛋白前體蛋白質的N端的3 9 - 4 3胺基酸片段或其小片段。 22. 根據申請專利範圍第16項之疫苗組合物，其安全有效量係用於治療罹患癌症或易罹患癌症之個體。 23. —種根據申請專利範圍第22項之疫苗組合物，其中癌症係選自包括下列所組成之群：前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胰癌、腎癌、卵巢癌、或黑色瘤癌。 24. 根據申請專利範圍第1 6項之疫苗組合物，其中該組合物係經系統性給藥。 25. 根據申請專利範圍第1 6項之疫苗組合物，其中該組合物係經黏膜給藥。 63708-940117.DOC ~ 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)