JP2005514941A - 熱ショックタンパク質に基づく免疫治療の調節 - Google Patents

熱ショックタンパク質に基づく免疫治療の調節 Download PDF

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Abstract

細胞表面CD40が、哺乳動物の熱ショックタンパク質（HSPS）受容体である知見に基づいて抗原に対する免疫応答を調節するための、方法及び組成物を提供する。細胞表面のCD40が、結合、細胞のシグナリング、及びhsp及びそれに結合した抗原を伴う特定hspの摂取に介在する。CD40の発現を変化させることにより、抗原の摂取及びそれに対する免疫応答を調節するため、及びCD40発現細胞に抗原を標的とするために哺乳動物のhspのCD40の結合断片及びその変異体の利用するための方法が、提供される。さらにCD40-hspのアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング法が、提供される。

Description

発明の背景
熱ショックタンパク質(「HSPS」)は、突然の温度上昇又はグルコースの喪失などのストレスの状態に基づき、細胞に選択的に誘発される高く保守された種からのタンパク質を構成する。極めて多様な他のタンパク質に非天然状態で結合できることは、熱ショックタンパク質が、合成、折りたたみ、組み立て、分解及び転位を含むタンパク質の生成に関与している(Freeman and Morimoto,1996,EMBO J.15:2969-2979;Lindquist and Craig,1988,Annu,Rev.Genet.22:631-677;Hendrick and Hart,1993,Annu.Rev.Biochem.62:349-384)からである。これらが、生物合成経路を通して他のタンパク質を誘導することから、熱ショックタンパク質は、「分子シャペロン」として機能すると言われている(Frydmanら、1994,Nature 370:111-117;Hendrick and Hartl,Annu.Rev.Biochem.62:349-384;Hartl,1996,Nature 381:571-580)。
ストレス中の誘導が、シャペロン機能と一致し、たとえば大腸菌(Eschrichia coli)のhsp70と相同するdnaKが、熱に活性されないRNAポリメラーゼを再活性化できる(Ziemienowiczら、1993,J.Biol.Chem.268:25425-25341)。
小胞体におけるタンパク質の複数のサブユニットの組み立において、gp96が支援できることが提示されている(Wiechら、1992,Nature 358:169-170)。実際にgp96が、ヘルペス単純ウイルス(Herpes simplex virus)から組み立てられていない免疫グロブリン鎖、主要組織適合クラスII分子、及び糖タンパク質Bの変異体と会合(associate)することが、観察されてきた(Melniclkら、1992,J.Biol.Chem.267:21303-21306;Melnickら,1994,Nature 370:373-375;Schaiffら、1992,J.Exp.Med.176:657-666;Ramakrishnanら、1995,DNA and Cell Bio.14:373-384)。さらにgp96の発現が、小胞体に折り畳まれないタンパク質が蓄積することになる状態により誘発される(Kozutsumiら、1988,Nature 332:462-464)。pg96がATPアーゼ活性を有する(Li and Srivastava,1993,EMBO J.12:3143-3151)と見られるが、この観察が問題とされていることが、報告されていた(Wearsch and Nicchitta,1997,J.Biol.Chem.272:5152-5156)。
実験動物の腫瘍から調製された熱ショックタンパク質にて接種することにより、腫瘍に特異的な方法における免疫応答を誘発することが示されている。すなわち特定腫瘍から精製された熱ショックタンパク質gp96が、同定された元の腫瘍からであるが、関連性と関係なく他の腫瘍ではない細胞の増殖を阻害する免疫応答を誘発する可能性がある(Srivastava and Maki,1991,Curr.Topics Microbiol.167:109-123)。腫瘍から単離された熱ショックタンパク質の免疫原の部分が、熱ショックタンパク質に結合された免疫原ペプチドに、そしてそこに存在する特異的な免疫原性に帰属されていた(Srivastava,1991,Curr.Opinion Immunol.3:654-658)。この知見は、gp96(idem)を伴うペプチド・エピトープライブラリーをスクリーニングングすることにより裏付けられた。さらに、in vitroにおける熱ショックタンパク質に対する種々のペプチドの結合親和性が、確立されてきた(たとえば、Flynnら、Science 245:385-390(1989))。
熱ショックタンパク質をコードする遺伝子が、腫瘍特異的DNAの多型性を呈することに、これまで見出されていない(Srivastava and Udono,1994,Curr.Opin.Immunol.6:728-732)。高解度ゲル電気泳動では、腫瘍由来のgp96が、分子レベルで異種性(heterogeneous)であること、つまり実証したことが、異種遺伝子の源が、幾百もの数の熱ショックタンパク質に小ペプチドの接着集団となる可能性のあることを、示唆している(Feldweg and Srivastava,1995,Int.J.Cancer 63:310-314)。実際的に小胞性口内炎ウイルスの抗原ペプチドを、ウイルス感染細胞においてgp96との関連性を示していた(Nielandら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:6135-6139)。このペプチドの蓄積が、小胞体におけるgr96の局在化に関係し、それが、ペプチド受容体として、そして主要組織適合複合体クラスI分子を負荷するペプチドにアクセサリー(accessory)として作用できる(Li and Srivastava,1993,EMBO J.12:3143-3151;Suto and Srivastava,1995,Science 269:1585-1588)。
熱ショックタンパク質は、免疫応答を刺激するためのアジュバントとして使用されてきた(たとえば、Edgington,1995,Bio/Technol.13:1442-1444;PCT Application International Publication Number WO94/29459 by the Whitehead Institute for Biomedical Research Richard Young inventor,and references infraを参照)。最も知られたアジュバントの１つで、Freund'sの完全アジュバントが、マイコバクテリア(結核を引き起こす細菌属)由来の熱ショックタンパク質の混合物を含む、Freund'sの完全アジュバントが、非マイコバクテリア抗原に免疫応答を追加免疫(boost)するために多年にわたり、使用されてきた。とりわけ多くの文献では、結核菌自体に対するワクチン化を含む、同様の目的のため単離されたマイコバクテリア熱ショックタンパク質の使用を示唆している(Lukacsら、1993,J.Exp.Med.178:343-348;Lowrieら、1994,Vaccine 12:1537-1540;Silva and Lowrie,1994,Immunology 82:244-248;Lowrieら、1995,J.Cell.Biochem.Suppl.o(19b):220;Retzlaffら、1994,Infect.Immun.62:5689-5693;PCT Application International Publication No.WO 94/11513 by the Medical Reserch Council,Colstonら、inventors;PCT Application International Publication No.WO 93/1771 by Biocine Sclavo Spa,Rappuoliら、inventors)。
他の文献では、古典的なアジュバントの活性よりむしろ、熱ショックタンパク質が抗原ペプチドと関連した天然に形成できることを中核としている(たとえば、PCT Application No.PCT/US96/13233 by Sloan-Kettering Institute for Cancer Biology 6:349-355;PCT Application International Publication No.WO 95/24923 by Mount Sinai School of Medicine of the City University of New York,Srivastava et al.,inventorsを参照)。欧州臨床試験の第一期におけるSrivastavaにより使用される１つの手順において、外科的に切り取られた腫瘍から調製された細胞を使用して、gp96を調製し次ぎに同じ患者に再接種した(Edgington,1995,Bio/Technol.13:1442-1444)。PCT Application International Publication No.WO 95/24923(supra)では、熱ショックタンパク質複合体におけるペプチドが単離され、さらにin vitroにおける熱ショックタンパク質複合体に、再度組み込まれたことを示唆している。
熱ショックタンパク質及び分子シャペロンの免疫原の可能性が、明らかに実証され(reviewed by Schild H.et al.,Current Opinion in Immunology(1999)11:109 113)たが、これにより熱ショックタンパク質が、MHCクラスI又はクラスII分子(これによりT細胞の応答を生成)を後に表示するため、抗原提示細胞に結合された抗原を移送すると考えられ、おおくの抗原が、有効に移送するようにこれらに対し熱ショックタンパク質、又は分子シャペロンに十分に上手く結合されていない。
この制限を迂回する試みにおいて、熱ショックタンパク質は、選択した抗原ペプチドに共有的に結合されてきた。たとえば、グルタルアルデヒド固定のマイコバクテリア(mycobacterial)熱ショックタンパク質hsp65又はhsp70に化学的に架橋された哺乳動物の抗原として、NANP(Asn Ala Asn Pro;配列番号2)の複数の反復を含む合成ペプチドが、さらなるアジュバントの無い状態でマウスに体液性(抗体を基盤とした)免疫応答を誘発することができることが報告されており；同様の効果が、細菌類としての大腸菌 (Eschrichia coli(Del Guidice,1994,Experientia 50:1061-1066;Barrios et al.,1994,Clin.Exp.Immunol.98:224-228;Barrios et al.,1992,Eur.J.Immunol.22:1365-1372))からの熱ショックタンパク質を用いて観察された。熱ショックタンパク質に合成ペプチドを架橋させ、そしてできればグルタルアルデヒドにて固定することが、抗体の誘発に必要とされる(Barriosら,1994,Clin.Exp.Immunol.98:229-233)、そして細胞の免疫性が、誘発されるように見えない。別の例においてYoung et al.,in PCT Applicatuon International Publication Number WO 94/29459により、抗原タンパク質が、熱ショックタンパク質に結合される融合タンパク質を開示している。PCT Application No.PCT/US96/13363(WO97/06821)by Sloan-Kettering Institute for Cancer Research,Rothman et al.,inventorsでは、熱ショックタンパク質の結合ドメインを使用し、抗原の免疫原ドメインに結合され、熱ショックタンパク質にその結合を増大させ、従って抗原に免疫応答を惹起するためにその免疫系に移送することが、記載されている。
抗原提示細胞を含む、細胞上の熱ショックタンパク質に対する特異的細胞表面受容体を同定することは、熱ショックタンパク質と熱ショックタンパク質との複合体、及び関連抗原の細胞内の処理過程(processing)に、さらに理解を深めることになり(Binder et al.,2000,J.Immunol.165:2582-2587;Sondermann et al.,2000,Biol.Chem 381:1165-1178;Castellino et al.,2000,J.Exp.Med,191:1957-1964)、そして最近幾つかの前に周知の細胞表面受容体分子が、免疫系においてこれらの役割についた再解釈することになっている。たとえば、hso70に対するCD14依存経路が記載され(Asea et al.,2000,Nature Medicine 6:435-442)そしてCD91は、特定の熱ショックタンパク質に対する受容体としても示唆された(Basu et al.,2001,Immunity 14:303-313;Binder et al.,2000,Nature Immunology 1:151-155)。さらに最近では、CD36が、熱ショックタンパク質受容体として提示された(PCT/US01/31401;US2002/0086276A1)。
熱ショックタンパク質に、特に哺乳動物の熱ショックタンパク質に対し、そしてより特定的に抗原又は他の分子とその複合体に特異的細胞表面受容体分子を同定することに向け、そして熱ショックタンパク質と関連する免疫原分子に免疫応答を変更させ、細胞を発現する分子を標的とするためその間の相互作用を利用する目的としてこうした受容体の活性を調節することに向けられ、又はこうした受容体を発現するよう誘発でき、及びこうした受容体と熱ショックタンパク質と抗原の複合体の相互作用から細胞シグナリング及び摂取特性の利点を取る方向に向けられ、そのため本発明が対象とされる。
発明の要約
最初の観点において、１の方法としては、細胞によりCD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも１の物質(agent)にその細胞を暴露することにより、哺乳動物の熱ショックタンパク質、及び好ましくは抗原などの分子との複合体における哺乳動物の熱ショックタンパク質に細胞を結合する能力を増大させることである。細胞によるCD40の発現を誘発又は増大させることは、たとえば、発現可能なCD40又はその細胞内の熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチドを移入することにより、又はCD40の発現を引き起こし、又はその発現を増大させる物質(agent)にその細胞を暴露することにより、例えばその物質(agent)が、A23187又はイオノマイシンなどのカルシウム・イオノホア；IL-1α,INF-γ,IL-3又はGM-CSFなどのサイトカイン；又はリポポリ多糖類(LPS)を含むが限定されない前記物質(agent)により実現することができる。
1又は組み合わされた物質(agents)又は方法を使用して前記目的を実現することができる、その目的とは、たとえば構成プロモータ、又は誘発性プロモータの制御下で、CD40をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを種々の手段のいずれかにより細胞に導入し、そしてそれに付随し又はその結果としてその細胞を誘発剤に暴露し、そのことが誘導されたポリヌクレオチドにコードされるCD40の発現を増大させる、ことを含むがそれに限定されない。本明細書の例の全てのうち、発現されるCD40が、天然のCD40の断片又はその配列の修飾したもので良く、ここでコードするポリヌクレオチドが発現することで、CD40様熱ショックタンパク質結合親和性、シグナリング、又は内在化特性、及び前記のいずれかの組み合わせを呈する細胞となる。
これら細胞への結合が、本発明のこの観点により増強され又は増大される熱ショックタンパク質又はその断片が、好ましくは天然の、又は天然の断片にて、hsp70,hsc70BiPなどの哺乳動物のhsp70ファミリー群であり、より好ましくは哺乳動物のhsp70で、最も好ましくは、ヒトhsp70である。しかしながら、本発明は、CD40に結合する何れかの熱ショックタンパク質に、好ましくはヒトの熱ショックタンパク質に適用できるがそれに限定されない。他の選択肢として、熱ショックタンパク質が、修飾された熱ショックタンパク質又はCD40に対する親和性を促進するその断片で良い。限定しない１の例において、その断片が、ATP結合ドメインを含むhsp70のN末端ドメインであり、たとえば、アミノ酸の数が約1-5より、アミノ酸数約381に伸張する残基を含むがそれに限定されない。別の例において、hsp70のN-末端又はATP-結合ドメインの断片が、少なくとも約6のアミノ酸からの、そしてCD40に結合できる断片を使用することができる。
好ましくは、本発明の前記観点、及び本発明の以下の観点における細胞に強く結合される、熱ショックタンパク質又はそのCD-結合断片が、予め選択された分子と、熱ショックタンパク質に共有的結合又は非共有的結合の何れかとの関連したものとして、複合されたものとして提供される。１の限定されない例において、その複合体が、熱ショックタンパク質とハイブリット分子との、in-vitroにて調製された非共有結合の複合体で良く、前記ハイブリット分子が、抗原と熱ショックタンパク質の結合成分との共有結合体を含む。熱ショックタンパク質の結合成分が、非限定の実施例による、ペプチド又は有機分子で良い。
別の例において、その複合体が、抗原と熱ショックタンパク質又はその断片との間の天然の親和性を基盤とする、抗原と熱ショックタンパク質、又はその断片との間を関連する非共有結合体である。こうした複合体が、１又は複数の定義された抗原及び熱ショックタンパク質から、in vitroにて調製される又はこうした複合体が提示される又は提示されるように作成される細胞、組織又は生物的な物質より単離される。前記例において、好ましい熱ショックタンパク質、又はその断片は、CD40結合ドメインを加えてペプチド結合ドメインを含む。３番目の例において、熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片が、予め選択された分子と共有的に結合され、それが抗原又はエピトープで良いか、或いは含むことができる。上記共有結合による複合体は、化学的に合成されても、又は融合ペプチドとして組み換え的に発現されても良く、そして短いペプチド等のリンカーがその間に挿入されても良い。本例において、熱ショックタンパク質又はCD40の結合断片は、抗原がそこに共有的に結合されることから、ペプチド(抗原)結合ドメインを含む必要がない。
上記例の何れかにおける抗原が、たとえば、ペプチド、タンパク質、カルボハイドレート、核酸、脂質、糖タンパク質、ウイルス性粒子、又はいずれかの前記組み合わせにて良い。その抗原が、腫瘍関連の抗原、又は感染性疾患関連の抗原、又は病態関連の抗原にて可能である。本明細書の例の全てにおいて熱ショックタンパク質の複合体にて、特に非共有結合の複合体にて含まれるものは、アデノシンジホスフェイト(ADP)など、本実施例に限定されない方法により、熱ショックタンパク質又は断片に予め定められた分子を、非共有的な結合を維持し又は促進する１又は複数の付加物質(agent)を含むことができる。好ましくは、熱ショックタンパク質と非共有的に結合された抗原を含む生成物は、ADPを含む。熱ショックタンパク質に予め選択された分子の結合を維持し、そして/又は促進するという同じ活性を有する、たとえ天然による生成又は人工的合成のいずれにしても、他のヌクレオチ又はヌクレオチド類似体が、それだけにより又はそれを含めて使用することができる。
上記細胞は、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は好中球などの専用の(professional)の食細胞にて良く、その抗原提示細胞の選択には、骨髄系樹状細胞又はリンパ系樹状細胞などの樹状細胞を含む。その細胞は、内皮細胞、上皮細胞、又は線維芽細胞などの非専用(non-professional)食細胞を、本例を含むが限定されない方法により可能である。これらは、動物から、好ましくは哺乳動物から、より好ましくはヒトから誘導され、そしてそこに存在することができ、又は組織培養から得ることができる。
上記方法は、前記にin vitro,in vivo,ex vivo,又は前記の組み合わせのいずれかにて、少なくとも１のこうした物質(agent)に、上記細胞を暴露することにより行はれる。次ぎにin vitro又はex vivoに暴露された細胞を、哺乳動物に投与することも、哺乳動物に戻すこともそれぞれ可能である。その細胞を、ex vivo又はin vitroにて少なくとも１の物質(agent)に暴露され、そしてその後哺乳動物に導入後、その哺乳動物に同じ又は異なる物質(agent)を投与し、その細胞によりさらにCD40の発現を高めることができる。これらの方法は、単に例示的でありそして非限定的である。本明細書に記載されている哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、その発明が、霊長類、飼いならされた家畜類、及び他の哺乳動物中で類似の哺乳動物も含んでいるが、全てに限定することを意図しているものではない。
本発明の観点による、in vitroにおける非限定の例において、組織培養から、又は細胞が時々投与される哺乳動物以外の動物などの動物から、又はCD40の発現を誘発又は増強できる物質(agent)に暴露される賦形剤以外の何らかの資源から誘導される細胞が、以下のように記載される。暴露した後、所望によりその細胞を、追加物質(agents)に暴露することができ、その中に、以下に詳細に記載されるように、in vitroにおいて調製され、又は細胞又は組織から単離された熱ショックタンパク質と関連する、少なくとも１の予め選択され、又は混合した分子で可能である。その混合物を、哺乳動物の患者に投与することができ、細胞及びそこに結合された何らかの分子だけが投与されるように、所望によりその細胞を、投与する前に洗浄することができる。患者に戻した後、所望によりその患者に、熱ショックタンパク質及び抗原の混合体を投与することができる。したがって、患者が、前記の細胞又は何らかを組み合わせて投与する前、投与中、投与後に、熱ショックタンパク質、好ましくは抗原又は他の分子との複合体を投与することができる。
非限定のex vivoにおける例において、食細胞が、哺乳動物から取り出され、CD40の発現を誘発し、又は増大できる少なくとも１の物質(agents)に暴露される。所望により暴露した後その細胞を、熱ショックタンパク質又はその断片と関連する予め選択された分子を含む付加物質(agents)に、以下記載のように暴露することができる。その後その細胞を、哺乳動物の患者に戻すことができ、所望によりそこに結合された細胞及び分子だけが投与されるように、投与前にその細胞を洗浄することができる。患者は、細胞又は前記の何かを組み合わせて、投与前、投与中、投与後に熱ショックタンパク質を投与することができる。
非限定のin vivoにおける例において、食細胞におけるCD40の発現を誘発又は増大することのできる少なくとも1の物質(agent)を、哺乳動物の患者に投与することができ、所望により、投与前、投与中、投与後に、熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片、好ましくは前述の分子と複合化されたいずれか、前述のように好ましくは哺乳動物の熱ショックタンパク質、より好ましくはhsp70、そして最も好ましくはヒトhsp70と組み合わせて投与することができる。その投与では非経口又は経口にて通すことができ、そして非限定の例による方法にて、局所的に又は体系的に投与することができる。投与では、好ましくはその後熱ショックタンパク質又はその断片と関連した少なくとも1の予め選択された分子が投与される。
第二の観点において、１の方法が、熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片を、好ましくは抗原である分子とさらに複合して、細胞に移送するため、又はその移送を増大させるため提供され、それが、前記のように細胞によりCD40の発現を誘発出来る又は増大できる少なくとも１の物質(agent)に暴露し、その後哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片、好ましくはヒトの熱ショックタンパク質、より好ましくはhsp70、そして最も好ましくはヒトのhsp70に、その細胞を暴露すること含む。好ましい断片は、本明細書に前に記載されたように、hsp70のN-末端又はATP-結合(ATPase)ドメイン、又はそのCD40-結合部分を含む。細胞によるCD40の発現の誘発又は増大は、たとえば、発現可能なCD40をコードするポリヌクレオチドの幾つかの何らかの手段にて細胞内に導入することにより、又は1又は複数のカルシウム・イオノホア、サイトカインズ、又はLPSに上記のような暴露によるなどの、CD40の発現を生じさせる又はその発現を増大させる物質(agent)に細胞を暴露することにより、実現することができる。上記の注意すべきこととして、幾つかの物質(agents)を組み合わせて使用し、CD40の発現の誘発又は増大を実現することができる。
熱ショックタンパク質は、非限定の例による方法にて、gp96,hsp70,hsp90,hsc70,hsp110,又はBip,又は前記群(member)の何れかを含む熱ショックタンパク質ファミリーの何れかの群(member)にて可能である。哺乳動物の熱ショックタンパク質が好ましく、哺乳動物のhsp70がより好ましく、そしてヒトhsp70が最も好ましい。好ましくは、本発明の前記観点及び下記の観点において、熱ショックタンパク質又はその断片が、抗原又はそのエピトープなど予め選択された分子で、熱ショックタンパク質に共有的か、非共有的のいずれかにて結合された分子と関連して、又はその分子との複合体にて提供される。こうした複合体の例は、本明細書に記載されている。
複合体が非共有結合の場合、CD40結合熱ショックタンパク質又はその断片は、好ましくは予め選択された分子結合ドメインを含む、そして複合体が共有結合の場合、熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片は、予め選択された分子に天然に結合させる必要がない。限定のない例の１つにおいて、その複合体が、熱ショックタンパク質又はその断片、及びハイブリット分子の非共有結合体で良く、そのハイブリット分子が、抗原などの分子、好ましくはエピトープ、そして最も好ましくはペプチドエピトープ、と熱ショックタンパク質の結合成分(又は熱ショックタンパク質結合ドメインとして本明細書に言及)との間の共有結合を含む。熱ショックタンパク質の結合成分が、非限定の例の方法により、ペプチド又は有機分子にて可能である。別の例において、複合体が、熱ショックタンパク質又は断片、と抗原又は別の分子との間の天然の親和性に基づいて、抗原などの分子と、熱ショックタンパク質又はその断片の間を非共有結合の関係である。
こうした複合体を、in vitroにおいて調製され、又は細胞、組織又はこれらを含む他の生物的な物質から単離することができ、或いはこれらを含むように生成することができる。3番目の例において、熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片が、予め選択された分子に共有的に結合され、それが抗原又はそのエピトープで良く、又は含むこともできる。前記共有結合の複合体を、化学的に合成することもでき、又はポリペプチドの場合、融合ポリペプチドとして組み換え的に発現することができ、所望により短いペプチドなどのリンカーは、その間に挿入することもできる。前記例のいずれかにおける抗原は、たとえば、ペプチド、タンパク質、カルボハイドレート、核酸、脂質、糖タンパク質、糖脂質、又はウイルス性粒子、又は前記のいずれかの組み合わせにて可能である。その抗原が、腫瘍に関連する抗原、又は感染性疾患に関連する抗原、又は何れかの病態に関連する抗原にて可能である。本明細書の何れかの例において、熱ショックタンパク質複合体を特に非共有結合の複合体にて含まれるものは、限定にない例により、アデノシンジホスフェート(ADP)により、熱ショックタンパク質へ、又は熱ショックタンパク質に選択された分子を非共有結合的に結合する又はその親和性を維持又は促進する1又は複数の付加的な物質(agent)にて可能である。
好ましくは、熱ショックタンパク質及び非共有結合的に結合される抗原を含む生成物は、ADPを含む。熱ショックタンパク質に対し予め選択された分子の結合を維持し、そして/又は促進する同じ活性を有する、天然に生成しても人工的に合成したとしても、他のヌクレオチド又はヌクレオチド類似物が、単独にて使用される又はそれと共に含めることができる。
前記実施例において、熱ショックタンパク質が、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの、そして最も好ましくはヒトのhsp70である。別の選択肢として、熱ショックタンパク質が、CD40に結合する熱ショックタンパク質の断片又は1部でも良い。非限定の1例において、その断片が、アミノ酸約1-5から、アミノ酸の数が約381に伸長した残基を含むが限定されないなどのATP-結合ドメインを含むhsp70のN末端ドメインである。別の例において、hsp70のN-末端又はATP結合ドメインが、CD40に結合できる断片として使用される。当業者は、CD40に結合できるhsp70の断片を容易に同定することができる。
こうした断片は、少なくとも6個のアミノ酸が好ましい。前記例において、熱ショックタンパク質の断片が、好ましくは共有結合的に、又はもしその断片が結合の親和性を有する場合、上記の様に抗原などの予め選択された分子と非共有する又は複合体であることが好ましい。抗原が、化学的手段により、又は融合ポリペプチドとしての合成によるなどの、断片に対して共有的に結合することができる。リンカーペプチドが、所望によりその間に提供することができる。さらに発明が、本発明の方法により、又は他のいずれかの目的のため望ましく誘導される熱ショックタンパク質、及びペプチド又はタンパク質抗原のCD40の結合断片を含むポリペプチドをコードする変性配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。別の例において、予め選択された分子が、熱ショックタンパク質の断片と非共有結合的に関連しても良い。
上記細胞は、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は好中球などの専用の(professional)の食細胞で良く、抗原提示細胞の選択には、骨髄系樹状細胞又はリンパ系樹状細胞などの樹状細胞を含む、あるいはその細胞は、非限定の例を用いることで、内皮細胞、上皮細胞、又は線維芽細胞などの非専用(non-professional)食細胞にて可能である。これらは、哺乳動物、好ましくはヒトから、又は培養組織から由来するもので良い。
上記方法が、上記CD40の誘発、CD40の発現、又はCD40の上限調節物質(agents)の少なくとも１つ、及び熱ショックタンパク質又はその断片を、好ましくは予め選択された分子と関連させて、in vitro,in vivo又はex vivoのいずれかにて、又は前記のなんらかの組み合わせに、細胞を暴露することにより行うことができる。次ぎにin vitro又はex vivoにて暴露された細胞を、それぞれ哺乳動物に投与する又は哺乳動物に戻してやることができる。熱ショックタンパク質又はその断片に、そして好ましくは分子を関連付けて暴露することが、in vitro,in vivo又はex vivoにて可能であり、さらにCD40の発現を増大させるために物質(agent)に暴露すること、及び熱ショックタンパク質と分子の複合体に暴露することは、独立的に選択され、そして行はれる。好ましくは、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質又はその断片と、上記のような予め選択された分子の複合体である。前記例において、熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、そして最も好ましくはヒトのhsp70である。
従って好ましい例において、熱ショックタンパク質に細胞を並列的に又はその後に暴露することにより進められる、細胞によりCD40の発現を誘発又は増大させることができる少なくとも１の物質(agent)に細胞を暴露することを含む、哺乳動物の熱ショックタンパク質又はその断片、及び最も好ましくはヒトhsp70の移送剤を、細胞に移送又はその移送剤を増大させるための方法が提供される。熱ショックタンパク質が、前記のように本発明の方法により所望により誘導される別の分子と好ましくは複合体を、又は別の分子と関係付けられる。細胞によるCD40の発現の誘発又は増大が、たとえば細胞に発現可能なCD40ポリヌクレオチドをコードするベクターを誘導することにより、又は限定のない例による1又は複数のカルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSに暴露させることによるなど、CD40の発現を起こす又は発現を増大させる物質(agent)に細胞を暴露することにより、行うことができる。なを上の注記として、物質(gent)の組み合わせが、CD40の発現の誘発又は増大を行うために用いることができる。
限定のないin-vitroにおける例において、組織培養から、又は細胞が投与される哺乳動物以外の哺乳動物から、又は賦形剤より他の何らかの資源から誘導される細胞が、CD40の発現を誘発又は発現を増大することのできる少なくとも１の物質(agent)に暴露される。暴露した後、その細胞を、前記のような熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片と関連した抗原又は他の予め選択された分子に暴露する。細胞が受容体に導入された後に、こうした暴露が、in vitro,又はin vivoにおいて可能である。熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物のもの、より好ましくはヒトのもの、そして最も好ましくはヒトのhsp70である。ADPなどの付加物質(agent)を含むことができる。天然による生成でも、人工的に合成にしても、熱ショックタンパク質に予め選択された分子を、非共有的な結合を維持し、そして/又は促進するという同じ活性を有する他のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が、単独にて使用できる又はそれと共に含むことができる。その混合物を、哺乳動物の患者に投与することができ、所望によりその細胞を、投与する前に洗浄することができる。熱ショックタンパク質が、細胞を投与する前、又は後に受容体に投与することができる。
非限定のex-vivoの例において、食細胞を哺乳動物から取り出し、そしてCD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも１の物質(agent)に暴露することができる。暴露した後、その細胞を、熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片と、好ましくは上記のようにそれに複合化された分子と関係する予め選択された分子に暴露される。次ぎにその細胞を、哺乳動物の患者に戻され、所望によりその細胞を、細胞と結合された分子のみ投与されるように、投与する前に洗浄することができる。他の物質(agent)を、投与される時の細胞に含むことができる。他の選択肢としての例において、哺乳動物の患者が、その細胞を投与する前又は投与した後に、熱ショックタンパク質又は本明細書に記載のような複合体を投与することができる。
非限定のin-vivoの例において、食細胞におけるCD40の発現の誘発又は増大をすることのできる少なくとも１の物質(agent)を、哺乳動物の患者に投与することができ、その投与は、熱ショックタンパク質を、好ましくは本明細書にて記載のように分子との複合形態にて投与することと一時的に関連する。投与は、並列的又はいずれか一方が、もう一方が投与される前に与えることができる。好ましい例において、CD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも1の物質(agent)が、最初に哺乳動物に投与され、そしてCD40の発現が増大した後に、熱ショックタンパク質が投与された。熱ショックタンパク質は、好ましくは熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片と予め選択された分子との複合体で、そしてより好ましくは抗原又は免疫原である。熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物であり、そしてより好ましくはヒトである。ヒトのhsp70は最も好ましい。投与では、非経口、経口、局所的又は全身系にて可能であり、そして本明細書記載のように非限定の例によれば皮下又は皮内が好ましい。
熱ショックタンパク質を好ましくは分子との複合状態にて、CD40の発現を誘発又は増大することにより細胞に結合できる能力を増大させる方向に向けられた本発明の前記観点において、熱ショックタンパク質をCD40への結合が付随して増大することは、種々の目的のために有効である。非限定例により、熱ショックタンパク質をCD40への結合が増大することは、熱ショックタンパク質と共有結合、又は非共有結合にて複合化された、抗原又はエピトープなどの分子の細胞に、導入又は摂取を提供または増大するために有益である。こうした摂取が増大すると、多くの目的として有益である。1例において、摂取が増大することで、抗原に対する免疫応答の誘発のための抗原及び付随する抗原提示のプロセスの増大を容易にする。他の非限定例において、発現するため誘発された細胞上にて熱ショックタンパク質をCD40に結合する又はCD40の発現を増大させることが、細胞のシグナリングとなり、それが、たとえば抗原を組み合わせてより健全な免疫応答が生成されるように樹状細胞などの抗原提示細胞の熟成を調節するために有益である。特定の条件下にて抗原に対する寛容(tolerization)性を、自己抗原又は移植抗原又はアレルゲンに対する免疫応答の誘発の減少又は阻害を目的として、本発明の方法により誘発することができる。
熱ショックタンパク質又はその断片の摂取が増大すれば、発現可能な配列、およびアンチセンス配列などのポリペプチドを、細胞の現象化の変更又は変更のない場合でも、その細胞の遺伝子型における変更の目的にために、ポルヌクレオチドを導入するためにも使用される。細胞の熱ショックタンパク質の増大した結合特性を使用することが、本発明の方法により可能であることが、単なる例示的であり、限定することをまったく意図していない。前記例において、熱ショックタンパク質が、好ましくは哺乳動物で、より好ましくはヒトで、最も好ましくはヒトのhsp70である。
細胞の型、熱ショックタンパク質又はその断片及び少なくとも１の関連する分子、そして細胞の選択が、本明細書に記載されているものである。上記のように、少なくとも１の分子に、又は発現可能な配列、又はアンチセンス配列などのポリヌクレオチドの移送剤に免疫応答を誘発する目的もため、細胞の遺伝子型、及び可能な現象型を変更させる目的のため、こうした摂取を増大させることが可能である。これらの使用を単に例示的に示し、限定するものでない。
従って、本発明のこの観点におけるさらに別の例において、哺乳動物の食細胞におけるCD40の発現を誘発又は増大させ、その後熱ショックタンパク質及び少なくとも1の抗原を含む複合体に食細胞を暴露することにより、1又は複数の抗原に対する免疫応答を哺乳動物動物における生成を高めるための方法が、提供される。CD40発現の調節は、in vitro,in vivo又はex vivo、又はその組み合わせにて行はれ、そして熱ショックタンパク質の複合体の暴露は、in vitro,in vivo又はex vivoにて独立的に可能である。使用される熱ショックタンパク質抗原複合体の量、そして共-刺激性分子又は細胞の存在又は非存在に依存して、細胞溶解性又は体液性免疫応答又はその両方が惹起される又は抗原に寛容性を誘発することができる。こうした条件を、当業者により容易に決定することができる。前記例において、抗原に関連する熱ショックタンパク質が、好ましくは哺乳動物で、より好ましくはヒトで、そして最も好ましくはヒトのhsp70である。
食細胞を、CD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも1の物質(agent)に暴露することができる。その物質が、CD40をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで良く、又はそれは、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、LPS、又は他の何れかの物質(agent)にてよく、たとえばCD40発現を増大できる上記いずれかに言及されているが限定するものでない。選択した熱ショックタンパク質が、以下記載のようである。
従って、本発明のこの観点の1のin-vitroの例において、少なくとも以下の工程が行はれる：
(i) 培養細胞から、又は動物から、好ましくは受容体の哺乳動物以外の哺乳動物から食細胞試料を得る工程；
(ii)食細胞によりCD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも1の物質(agent)に、食細胞を暴露する工程；
(iii)少なくとも熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片と抗原を含む複合体の有効な免疫応答の誘発量に、工程(ii)の食細胞を暴露する工程；そして
(iv)その食細胞を哺乳動物に投与する工程、
を含む。
所望により哺乳動物に投与する前に、工程(ii)又は工程(iii),又はその両方の後にて、その食細胞を洗浄することができる。他の選択肢としての例において、工程(iii)が、in vitroにて行はれ、そしてその複合体への暴露が、食細胞が哺乳動物に投与される前、又は後に、哺乳動物にその複合体を投与することにより、in vivoにおいて提供される。もちろん、in vitroもin vivoの両方の複合体への暴露を、行うことができる。
1のex-vivoの例において、本発明は、少なくとも以下の工程から行うことができる、
(i)哺乳動物から食細胞の試料を取り出す工程；
(ii)食細胞によりCD40の発現を誘発又は増大できる少なくとも1の物質(agent)に、食細胞を暴露する工程；
(iii) 少なくとも熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片と抗原を含む複合体の有効な免疫応答の誘発量に、工程(ii)の食細胞を暴露する工程；そして
(iv)その食細胞を哺乳動物に戻す工程、
にて行はれる。
所望により食細胞は、哺乳動物に細胞を投与する前にて、工程(ii)又は工程(iii)、又はその両方の後に洗浄することができる。別の選択肢における例において、その複合体の暴露は、哺乳動物に食細胞を戻す前、又は戻した後に哺乳動物に複合体を投与することにin vivoにおいて提供される。もちろん、ex vivoとin vivoの両方の複合体に対する暴露を、行うことが出来る。
本発明のこの観点のin vivoの例は、少なくとも以下の工程により行はれる：
[(i)動物の食細胞によりCD40の発現を増大できる物質(agent)を、動物に投与する工程；そして
(ii)哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片と抗原の結合体の有効な免疫応答誘発量を、並行して、その後にて又はそのいずれかを組み合わせて動物に投与する工程]、
にて行うことができる。
前記例において、その複合体における熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、そして最も好ましくはヒトのhsp70である。熱ショックタンパク質のCD40の結合断片が、さらに本明細書に記載されている。
本発明のin vivoにおける手順及び方法のいずれか、および全てにおいて、哺乳動物は、いずれの哺乳動物、好ましくはヒト哺乳動物でよく、さらには飼いならされた家畜やそれに伴う動物が好ましい。食細胞は、抗原提示細胞、マクロファージ、B細胞、又は好中球などの専用(professional)な食細胞、骨髄樹状細胞、又はリンパ球樹状細胞などの樹状細胞を含む選択による抗原提示細胞、非限定の例により内皮細胞、上皮細胞、又は線維芽細胞などの非専用(non-professional)食細胞にて可能である。上記細胞によりCD40の発現を増大させることができる少なくとも１の物質(agent)が、CD40をコードするポリヌクレオチド、又はたとえば上記のようなカルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSを含むベクターで可能である。
少なくとも熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片と抗原を含む有効な免疫応答誘発量の複合体は、上記のように抗原又はその免役原の断片、と熱ショックタンパク質又はその断片にて可能である。熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、そして最も好ましくはヒトのfsp70であるがそれを限定するものでない。
1の非限定例において、その断片はhsp70のN末端ドメインであり、それが、たとえばヒトのhsp70のアミノ酸約1-5番から、そして約381まで伸びている残基を含むが限定されないATP結合ドメインを含む。別の例において、hsp70のN-末端又はATP結合ドメインの断片をCD40に結合できる断片に使用することができる。当業者が、先に記載されたものであるが限定されないような方法により、CD40を結合できるhsp70の断片を、容易に同定することができる。こうした断片が、本明細書記載のように抗原に共有的に結合されることが好ましい。複合体が、熱ショックタンパク質と、ハイブリット抗原の非共有的な複合体で良く、そのハイブリット複合体が、選択された抗原又はその免疫原の断片、と熱ショックタンパク質の結合断片との間を共有的に結合されるものを含む。
熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子にて可能である。その複合体が、熱ショックタンパク質と抗原との間を天然の親和性に基づく熱ショックタンパク質と抗原の非共有複合体にて可能であり、その複合体がin vitroにおいて、こうした複合体が存在し、又は存在するよう作成できる細胞、組織、又は他の生物的物質により調製又は単離される。1又は複数の付加物質(agent)が、上記複合体に、そして特にADPなどの熱ショックタンパク質に予め選択された分子を、非共有的な結合を維持又は促進する非共有結合の複合体にて、含むことができる。天然に形成されても、合成的でも熱ショックタンパク質に予め選択された分子の非共有結合を維持し、そして/又は促進するという同じ活性を有する他のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が単独にて使用可能であり、あるいはそれらを含むことができる。
好ましくは抗原は、感染性疾患又は腫瘍抗原にてよいが、高い免疫応答が所望されれば、それを限定するものではない。こうした抗原が、ペプチド、タンパク質、カルボハイドレート、脂質、糖タンパク質、糖脂質、及び核酸を含むが限定されない例である。その他のもののうち自己免疫性抗原、移植抗原、及びアレルゲンに対する寛容性が誘発することが、さらに所望され、そしてそうした抗原が、本明細書に十分包含されている。本発明の明細書におけるこの観点及びいずれかの観点において、熱ショックタンパク質及び関係する分子又は抗原が、記載されているようにin vitroにおいて調製でき、又はこうした複合体又は関連物質が、疾患細胞などの細胞から単離することができ、それは、熱ショックタンパク質及びそれに天然に結合される抗原の複合体を含む。さらに他の例において、非疾患細胞を修飾し、熱ショックタンパク質をコードするDNAそして/又はそこへの抗原をコードするDNAを導入し、そして次ぎに本明細書を目的とした有益な複合体を単離するすることにより、こうした特定複合体を修飾することができる。
熱ショックタンパク質と複合される抗原に免疫応答を誘発するような、細胞に対する熱ショックタンパク質及び関連分子の結合及び摂取を誘発又は強化するための先行方法に加えて、本発明の他の例において、細胞に対する熱ショックタンパク質の結合及び摂取が、熱ショックタンパク質とCD40の間の結合を干渉することにより減少又は阻害することができる。こうした阻害が、in vitro,ex vivo,又はin vivoにおいてそして先行する何らかの方法にて行うことができる。種々の細胞の種類、熱ショックタンパク質複合体、及び本発明のこの観点の他の共通する特徴は、上記のようである。
従って本発明のさらなる観点において、細胞により発現されるCD40に熱ショックタンパク質の結合を干渉できる物質(agent)に、in vitro又はex vivoにて前記細胞を少なくとも暴露することにより、CD40を発現する細胞、又はCD40を発現するために誘発される細胞により、熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片の結合、シグナリング、そして/又は摂取を、減少させるための方法が、提供される。その物質(agent)が、たとえば非アゴニストな抗体又はCD40のリガンドなどのシグナリング又は摂取を誘発しないCD40結合の相手物質(partner)にて可能である。好ましくはそのリガンドが、熱ショックタンパク質、熱ショックタンパク質の断片、又はCD40L(CD40リガンド又はCD154)である。例示的な非アゴニストな抗CD40モノクロナール抗体は、５D12である。
食細胞は、抗原提示細胞、マクロファージ、B細胞又は好中球、などの専門とする(professional)食細胞、骨髄性樹状細胞、又はリンパ球樹状細胞などの樹状細胞を含む選択性抗原提示細胞；又は非限定の例により、内皮細胞、上皮細胞、又は線維芽細胞などの非専門(non-professional)の食細胞にて可能である。
従って、本発明のさらなる観点において、哺乳動物における免疫応答の生成を減少させるための方法は、少なくとも：
[(i)哺乳動物から食細胞の試料を取り出す工程；
(ii)細胞によりCD40の発現を減少させることができる物質(agent)に食細胞を暴露する工程；そして
(iii)その哺乳動物に食細胞を戻す工程]
を行うことにより提供される。
この物質(agent)は、CD40アンチセンス・オリゴヌクレオチドにて可能である。食細胞は、上記にて可能である。
CD40が、哺乳動物の熱ショックタンパク質に結合し、さらにそれが、hsp70のN-末端又はATP-結合(ATPアーゼ)を介して結合するということを、本発明者が、驚くべきことで、そして予期されないことであるとわかった。従って哺乳動物の熱ショックタンパク質が発見され、1)C末端ドメインを通りペプチド結合ポケットを介しペプチドに結合、そしてさらに2)N-末端ドメインを介してCD40を結合するという、2の重要な機能を示すことができる。
そのため熱ショックタンパク質が、ペプチドに対し、そしてCD40を介し細胞に対し共に結合することができる。より具体的には、本発明者は、CD40に哺乳動物の熱ショックタンパク質の結合が、ペプチドが熱ショックタンパク質のペプチド結合ドメインに結合された時に、促進され、そして付加的にその結合が、CD40とN-末端とN-末端の間、又はhsp70のATP結合ドメインのみに生成する。これらの知見により、CD40を発現する又は発現するために誘発できる細胞に対し、予め選択された分子を標的とするための物質(agent)、及び方法を提供する。従って本明細に基づく上記方法及び使用に加え、なお本発明のさらなる観点において、たとえば、CD40を発現する、又はCD40を発現するため修飾できる細胞に、免疫原ペプチドの他にエピトープ、抗原、抗原の断片を含むがそれに限定され分子を標的とするための方法が、分子と哺乳動物熱ショックタンパク質、又は好ましくはCD40に特異的に結合する哺乳動物の熱ショックタンパク質の間の複合体、又はその関連物を利用することにより提供される。
1の例において、その断片は、hsp70のN-末端ドメインを含み、それがhsp70のヌクレオチド結合(ATPアーゼ)ドメインである。別の例において、その断片は、hsp70のCD40結合ドメイン又は断片を含むが、たとえば哺乳動物のhsp70、好ましくはヒトのhsp70のアミノ酸約1乃至5から、そしてアミノ酸約381に伸張した断片であｒが限定されない。その他の例において、少なくとも6アミノ酸のhsp70のN末端ドメインのCD40の結合断片が、こうした標的分子として提供される。こうした複合体が、共有結合又は非共有結合の複合体で良く、そしてCD40と哺乳動物の熱ショックタンパク質との間の新たに所望する親和性の利点をとることにより、CD40発現細胞に予め選択された分子を有効に導入するために他の成分を含むことができる。こうした方法が、所望により上記のように暴露する前に細胞のCD40レベルを調節することを含むことができる。さらにこうした標的は、抗原の導入以外の目的として、たとえばCD40発現細胞の生理的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法薬剤、又は調節剤を細胞内に導入することなどかのうである。
CD40を結合するために標的とされる分子が、スクリーニングを介してCD40の結合断片を同定することにより、hsp70又は他のネツショックタンパク質の断片から誘導できる又はこれらは、CD40と熱ショックタンパク質の間を相互作用する最初の同定部位に基づいて同定され、それが分子モデル化を含め当業者に知られたX-線結晶写真による検査、部位指向突然変異、写真によるクロス・リンク(photo-cross-linking)、及び他の手段により行うことができる。CD40と熱ショックタンパク質の間の相互作用により干渉するこれらの能力により同定されるCD40結合活性を有する熱ショックタンパク質の断片又は小有機分子は、本明細書に全体に包含されている。
１の例において、標的手段が、熱ショックタンパク質のペプチド断片であり、CD40への結合を促進するため修飾される修飾された熱ショックタンパク質及び熱ショックタンパク質断片を含む、こうした断片が、後者の結合活性を、さらにはペプチドとCD40の両方に非共有結合的な結合が保持されると、所望により熱ショックタンパク質又はペプチドへの断片を非共有的な結合を促進する修飾化を含むことができる。こうした修飾化を、hsp70のN-末端ドメインにて作成され、それがhsp70のヌクレオチド結合ドメイン、又は他の熱ショックタンパク質の相当するドメインである。
CD40を結合を促進するこうした修飾化が、約1-5から約381に伸びたアミノ酸の間の1又は複数のアミノ酸残基にて、hsp70の分子のドメインにて作成される。こうした修飾化が、アミノ酸の置換、欠失、挿入、1又は複数のアミノ酸の化学的誘導化したものに限定されないが含むことができ、そして1又は複数のD-アミノ酸に限定されないが非天然に生成するアミノ酸を含むことができる。こうして変更された熱ショックタンパク質又は断片が、組み換え的に発現することができ、そして必要であれば修飾された後、又はこれらが標準的なペプチド合成方法及び必要とされる合成後の修飾により合成的に調製することができる。本発明は、こうして変更された熱ショックタンッパク質、ムテイン、および抗原ペプチド又は同じポリペプチド鎖のタンパク質を含むいずれかをコードする変性体の配列を含むポリヌクレオチド配列を包含する。分子のアミノ酸鎖の修飾を有する熱ショックタンパク質又はその断片を、熱ショックタンパク質のムテイン又は熱ショックタンパク質断片のムテインとして本明細書に言及し、その野生型アミノ酸配列の他に1又は複数の変異化の存在、及びムテインを組み換え型的に発現できることを表している。
加えて、本発明は、リガンド-受容体の相互作用として、CD40とhsp70のN-ドメインの間のここに発見された親和性を使用することにより、哺乳動物の熱ショックタンパク質の断片を含むがそれに限定されないそうしたCD40-標的物質(agent)としてスクリーニングすることを対象とし、これら相互作用の程度を、CD40を競合的的に、又は非競合的に増大、又は競合できる物質(agent)の活性として監視することができる。
天然の熱ショックタンパク質分子又はCD40の結合断片が、たとえば本明細書に記載されているもの；外形質ドメインなどの全長のCD40分子又はその熱ショックタンパク質結合断片を使用することができ、結合相手の溶解性を考慮に入れて、全液相、固相-液相などのいずれかを、特定のアッセイ形式として利用することができる。高性能スクリーニング含む種々の自動化、半自動化、又は手動の何れかによるスクリーニング方法は、治療として極めて有益な物質(agents)を同定するために、上記結合相手との間の基本的な相互作用を用いて確立することができる。熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片が、本発明の上記多くの観点において、又は当業者により容易に明らかにされる免疫的調節又は他の目的のためCD40をアゴニスト、又はアンタゴニストする手段として使用できる使用物のいずれ又は全てに対し、こうした物質(agent)が、上記のようなCD40標的物質(agent)として使用することができる。
CD40をアゴニストすることは、たとえば選択肢として、たとえば5D12などの特定のモノクロナール抗体を使用すること、などによるCD40のアンタゴニストが、自己疾患又は異種移植を起こすような免疫応答を阻害又は下限調節するために有益である。CD40と哺乳動物熱ショックタンパク質の間の相互作用の調節に基づいて、本発明の方法により同定される化合物が、これらの典型的な使用及び容易に実証されるその他のものを包含する。
従って、熱ショックタンパク質とCD40との間の相互作用、及びCD40アゴニスト及びアンタゴニストを調節する小分子化合物が、上記のようなアッセイを介する活性をスクリーニングすることにより同定され、そして熱ショックタンパク質と、より具体的に上記のようにヒトのhsp70とCD40間を相互作用する部位のモデリング(modeling)に基づいて合理的に設計又は開発することができる。これにより同定されるこうした化合物が、本明細書に全て包含している。
上記熱ショックタンパク質とムテインとの間の複合体の断片、ムテイン断片、又はその修飾体、及びCD40に標的とされるような予め選択された分子が、熱ショックタンパク質又は断片、及び予め選択された分子を共有的に結合することにより、又はこうした分子が親和性を有する非共有結合による関係により調製することができる。共有結合に関連する例において、その複合体の2の群(member)が、カルボジイミド、ホモ２機能性、又はヘテロ２機能性架橋剤などの架橋剤を使用して、共有的に架橋することができ、又は両群(member)が、アミノ酸鎖を含む場合、これらは、共-直線性の合成(たとえば固相ペプチド合成)により調製され、又は単一の融合又は単一鎖ポリペプチドとして、所望によるその間をペプチドリンカーを伴い、組み換え手段により発現することができる。
この群(member)のリンクが、CD40に対する複合体の熱ショックタンパク質又は断片部分の親和性を維持することになる。CD40と熱ショックタンパク質との間に新たに記載された親和性の利点を取り入れることにより、CD40と発現細胞にそれを有効に導入するために、他の成分を、こうした標的とされる、予め選択された分子の形成に含むことができる。
上記のように、好ましくは予め選択された分子が、惹起される体液性そして/又は細胞免疫応答であっても、そこへの免疫系の寛容化であっても、抗原の処理、提示及び付随するそれへの免疫応答を目的として望ましく導入される抗原、又は免疫原である。よりこのましくは、予め選択された分子が、HLAクラスI又はHLAクラスIIのペプチド(エピトープ)である又はその配列内に含む。熱ショックタンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、そして最も好ましくはヒトhsp70であるが、CD40を結合する又はCD40に対する結合親和性を有する何れかの熱ショックタンパク質、好ましくは哺乳動物の熱ショックタンパク質にて可能である。好ましい例において、上記方法は、抗原又は免疫原とCD40の結合断片又は熱ショックタンパク質の、より好ましくはhsp70の、そして最も好ましくはヒトのhsp70のCD40結合増強断片の間の共有的な結合を利用する。細胞プロテアーゼにより攻撃され、クラスI又はクラスIIのペプチドを生成できる容易に切断可能な配列を、含むことができる。別の例において、抗原又は免疫原がタンパク質又はペプチドである場合の例において、その結合が、熱ショックタンパク質のCD40の結合断片、と抗原又は免疫との間の組み換え型発現可能な融合ポリペプチドである。その細胞が、CD40の発現を誘発又は増大させるため、本明細書に記載されているように、誘発されるかそうでなければ修飾することができ、そして熱ショックタンパク質のCD40の結合断片により複合化された抗原に細胞を暴露すると共に、組み合わせにて発現を増大するためのこうした手段は、さらに本明細書包含される。さらに抗原がCD40を発現する細胞に望ましいように導入され、又はCD40を発現するため修飾される上記方法のいずれかが、有効に導入するために、抗原と、熱ショックタンパク質のCD40結合部分との間の上記結合を用いて行うことができる。
上の注記のように本発明の方法により熱ショックタンパク質と関係付けることにより、導入するための予め選択された分子が、抗原などの1又は複数の予め選択分子、及び1又は複数の熱ショックタンパク質から、vitroにおいて調製される1又は複数の定義された分子にて可能である。別の選択肢として本発明の方法によりCD40を介して導入される分子が、内在性タンパク質又はペプチドと、細胞又は他の生物的物質から単離された熱ショックタンパク質との天然に生成する複合体として、定義されないが単離することができる。
治療目的として好ましい資源は、熱ショックタンパク質、と疾患に対し免疫応答を惹起することができる抗原との間の免疫原複合体を含む疾患している細胞である。別の例において、正常な細胞又は組織又は有益な複合体を含まないもの、又はその一方か両方のいずれかが、必要な成分又は成分類を発現するために修飾することができ、従って修飾された細胞が、上記複合体に対する有益な資源となる。従って細胞は、1又は複数の抗原、又は1又は複数の熱ショックタンパク質を発現するため、修飾されることの他に、トランスフェクトすることができる。こうした修飾が、遺伝子修飾と、そして/又は所望の複合体を効果的に表すための増殖又は環境条件の変更を伴う。
上記方法と類似した方法において、in vitro,ex vivo and in vivoにおける方法が用いられる。抗原、発現可能なポリヌクレオチド、抗センスオリゴヌクレオチドなどを含むCD40を介して導入されるよう予め選択された選択分子が、本明細書に包含される。
予め選択された抗原に対し哺乳動物における免疫応答の発症を促進するための上記方法は、少なくとも以下の工程を行うことにより、ex-vivoの手順にて提供することができる：
[(i) 哺乳動物からCD40を発現する食細胞の試料を取り出す工程；
(ii) 哺乳動物のその熱ショックタンパク質のCD40結合部分と抗原の複合体の免疫を誘発する有効な量に食細胞を暴露する工程；そして
(iii) 哺乳動物に食細胞を戻す工程]、
を含む。
上記方法は、試料を得る前にin vivoにおいて、又は複合体に暴露する前にin vitroにおいて、本明細書に記載されている方法により、特定細胞にCD40の発現を最初に増大させることにより促進することができる。従って、予め選択された抗原に哺乳動物における免役応答の発症を高めるための上記方法は、少なくとも以下の工程を行うことにより提供することができる：
[(i) 哺乳動物から食細胞の試料を取り出す工程；
(ii) 食細胞によりCD40の発現を誘発又は増大できる物質(agent)に食細胞を暴露する工程；
(iii) 哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40結合部分と抗原の複合体を免役
応答を誘発する有効量に、工程(ii)の食細胞を暴露する工程；そして
（iv） 哺乳動物に食細胞を戻す工程；
又は以下の工程により：
(i) 前記哺乳動物の食細胞においてCD40発現を誘発する又は増大することのできるの物質(agent)を哺乳動物に投与する工程；
(ii) 哺乳動物から食細胞の試料を取り出す工程；
(iii) 哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40結合部分と抗原の複合体を免役
応答を誘発する有効量に、工程(ii)の食細胞を暴露する工程；そして
（iv） 哺乳動物に食細胞を戻す工程；]
を含む。
さらに上記方法は、哺乳動物にCD40の上限調節の物質(agent)投与し、そして次に複合体を併用して、又はその後に投与するという両方によりin vivoにて十分に行うことができる。別の例において、予め選択された抗原に対し寛容性のある哺乳動物における発症を高めるための方法が提供され、以下の工程を行うことにより実現することができる：
[(i) 前記哺乳動物から食細胞の試料を取り出す工程；
(ii) 前記細胞によりCD40の発現を増大できる物質(agent)に食細胞を暴露する工程；
(iii) 哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40結合部分と抗原の複合体を免役
応答を誘発する有効量に、工程(ii)の食細胞を暴露する工程；そして
（iv） 哺乳動物に前記食細胞を戻す工程；
又は前の方法におけるように、ex vivoにて複合体に暴露するための食細胞を採取する前に、哺乳動物にCD40を発現を増大させる物質(agent)を投与することを含む。
従って、予め選択された抗原に対し哺乳動物における免役応答の発症を高めるための方法を対象とされる本発明は、少なくとも以下の工程にてin vivoにておこなはれる：
[(i)哺乳動物の食細胞によりCD40の発現を増大できる物質(agent)を動物に投与する工程；そして
(ii) 哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40結合部分と抗原の複合体を免役応答を高める有効な量を動物に投与する工程]、
を含む。
前記そして前の例において、哺乳動物に細胞を投与する順序、及びin vitro又はex vivoにおける細胞に、又はin vivoにおける哺乳動物熱ショックタンパク質複合体を投与する順序は、本発明の精神から逸脱することなく、変更することができる。
上記方法において、さらに得られる免疫応答を高めるために、共-刺激分子又は細胞を投与することができる。、
本発明の上記観点において、本発明の結合体には、hsp70のN-末端ドメインに、より好ましくはアミノ酸約1乃至5からアミノ酸約381に伸張するhsp70の部分、そして最も好ましくはヒトhsp70(配列番号１)のアミノ酸5からアミノ酸381までのドメインに共有的に結合される抗原又は他の予め選択された分子を含むことができる。選択肢として、hsp70の有意に小さい断片にて、CD40の結合断片として容易に同定できる長さが少なくとも約６のアミノ酸が、同様に使用することができる。hsp70の代表的部分及び断片が、以下に記載されている。
上記のようにCD40発現上限調節物質と複合体又は結合体の両方を含む組成物が、さらに本明細書に包含される。CD40発現上限調節物質は、上記のようにカルシウム・イオノホア、サイトカイン又はLPS、そして導入するために予め選択分子、及び熱ショックタンパク質又はそのCD40結合タンパク質、又はそのムテインを含む複合体又は結合分子にて良い。
本発明者は、CD40と熱ショックタンパク質、そして特に結合、p38のNF-κB経路を介してシグナリングできるようにペプチドにて負荷される熱ショックタンパク質との間の相互作用、及び熱ショックタンパク質-抗原の複合体の内在化を同定した。熱ショックタンパク質だけによるシグナリングの誘発は、T細胞の支援を提供し、そしてまとめて取られるこれらのデータは、熱ショックタンパク質と抗原の複合体だけが、抗原提示細胞に抗原を導入し、さらに免疫応答を誘発する形質導入のシグナリングの引き金となることができることを明示している。従ってさらにこうしたT細胞の支援を提供する分子を、免疫応答を惹起するために含むことができるが、免疫応答を誘発するための前記方法は、1又は複数のアジュバント、T細胞ヘルパー・エピトープ(たとえばテタナス・トキソイド)、CpG又は他の免疫調節配列、CD40L又はアゴニスト抗CD40抗体、サイトカイン、又はその他のアジュバントなどの、T細胞の支援という別の資源に依存する必要がない。熱ショックタンパク質のこうした支援を提供する能力が、幾つかの観点において都合良く利用することができる。
従って本発明のさらに別の観点において、樹状細胞又は他の抗原提示細胞の変異化を誘発する手段が、CD40に対するリガンドとして、そしてそれによるCD40発現抗原提示細胞に対する変異化シグナルとして、哺乳動物の熱ショックタンパク質のCD40の結合断片又はCD40結合を増強する断片を利用することにより提供される。CD40を結合し、そしてCD40介在シグナル形質導入を誘発する哺乳動物の熱ショックタンパク質断片が好ましい。熱ショックタンパク質が、好ましくはヒトで、そしてより好ましくはヒトのhsp70である。
その断片は、hsp70のN-末端又はATP結合ドメインで良く、より好ましくはヒトのhsp70のアミノ酸の約1乃至5からアミノ酸約381まで伸張するポリペプチドで、そして最も好ましくはヒトのhsp70(配列番号1)のアミノ酸の5からアミノ酸約381までを有するポリペプチドである。さらに上記分子のムテインは、増強されるシグナリングと共に本明細書に包含される。こうしたシグナリングにて増強される熱ショックタンパク質の断片又はムテインは、共有的に結合、又は非共有的に関係付けられる抗原を導入する目的として、CD40に対し最適に結合するものと同じでも、同じでなくても良い。当業者は、シグナリング及び抗原導入を容易に評価することができ、そして本明細書の実施例に記載された方法、又はたとえば高性能スクリーニングとして修飾される方法によるなどの、こうした断片及びムテインの独立した活性を容易に決定することができる。
好ましくは、免疫応答を誘発する抗原導入のための最適な熱ショックタンパク質の断片が、シグナリングと抗原導入の両方に対し促進され、そしてN-末端ドメインにおける1又は複数の修飾されたアミノ酸(又は挿入、欠失、変更など)、及びC末端ドメインにおける1又は複数の修飾されたアミノ酸(又は挿入、欠失、変更など)を有することができる。その他の例において、たとえば非免疫的な導入のため、又は免疫応答を減少させるため、シグナリング活性を減少させることにより増強された抗原担体分子が要望され、そしてこうした独立的に変動可能なシグナリング及び導入活性を有するこうした熱ショックタンパク質の断片は、本発明により全て包含する。
加えて、熱ショックタンパク質又はその断片が、CD40と相互作用でき、そしてCD40を発現する細胞によりサイトカインの産生を誘発できることは、本発明の他の有益な観点である。
本発明の他の観点において、哺乳動物の熱ショックタンパク質とCD40との相互作用は、免役刺激又は免疫抑制特性を有することを含め多くの用途を有する哺乳動物の熱ショックタンパク質の新たな成分、及び前に詳細に記載されているように、CD40を発現する細胞、又はCD40を発現するために修飾される細胞に、抗原及び他の生物分子を対象として有益な新たなCD40を標的とする物質(agent)を同定するために都合よく利用することができる。こうした擬症性(mimetic)が、小さい有機分子又はペプチドが好ましく、そしてたとえばそこに免役応答を誘発するため別の分子との結合に使用されるものが、天然の熱ショックタンパク質のペプチドの断片以外であるが、本発明ではそれに限定されない。
熱ショックタンパク質-CD40の相互作用を利用するスクリニング法は、その相互作用を促進又は阻害する化合物又は物質(agent)を生成、又は同定するための方法のいずれかにて使用でき、好ましくは小分子化合物であるがそれに限定されない化合物の同定に使用するために、抗原又は免疫原に結合される場合、CD40に結合及び摂取を、又はCD40介在のシグナリングを促進し、前記免疫応答の誘発を促進するため、又は対照的に免疫応答に下限調節する目的として、CD40を発現する細胞により熱ショックタンパク質及びそこに結合されるいずれかの抗原の摂取を阻害し、又はCD40のシグナリングを阻止するために、抗原を標的とするものとして有益となろう。本発明は、上記スクリーニング法、及び1又は複数の活性を有する化合物を包含する。熱ショックタンパク質の擬態物質は、天然の熱ショックタンパク質分子、又は天然の熱ショックタンパク質の断片ではない。
こうしたスクリーニング方法は、全長のCD40分子、及び哺乳動物の熱ショックタンパク質分子、又は一方又は両方の相互作用する断片、又はCD40を発現する細胞、又は発現させる細胞、又はCD40の細胞外形質ドメインを使用することができる。CD40の場合スクリーニングは、細胞外形質ドメインの分子(CD40のアミノ酸約20からアミノ酸約212；配列番号318)だけにて、又は融合ペプチドとして、たとえばグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)と共に使用することができる。ヒトCD40が好ましい。hsp70が、スクリーニングにおいてのみ利用でき、又はN-末端又はATP結合ドメインが、hsp70のアミノ酸約1乃至5から始まりアミノ酸約381まで伸張するポリペプチド、又はhsp70のアミノ酸約5から始まりアミノ酸約381までを有するポリペプチド(配列番号１)などを使用することができる。上記のように哺乳動物のhsp70,好ましくはヒトのhsp70、そして最も好ましくはヒトのhsp70、及びその相当する断片が使用される。上記のように、スクリーニング・アッセイの形式は、適切な結合相手の選択を案内する。
上記の様にさらに本発明は、CD40に結合するための親和性の増大をもたらす1又は複数のアミノ酸への修飾を伴い、哺乳動物のhsp70などの修飾された熱ショックタンパク質分子を対象としたものである。こうした修飾は、哺乳動物のhsp70とCD40との間、特に哺乳動物のhsp70のN-末端又はATP-結合ドメイン、とCD40の細胞外形質ドメインとの間の相互作用する部位を決定した後に、得ることができる。
さらに上記に対し、熱ショックタンパク質のN-ドメイン又はCD40に結合するN-ドメインの断片における1又は複数のアミノ酸への修飾に関し、本発明者は、単離されたhsp70のN-ドメインが、いずれも結合されたペプチドを有しない場合、全長分子よりCD40に対しより高い親和性を有し、そのために本発明のさらなる観点が、修飾された熱ショックタンパク質又はそのムテインを対象としており、C-末端又はペプチド結合ドメイン(ヒトhsp70のアミノ酸382からアミノ酸約641まで)において修飾を有するCD40の結合が増強されていることを見出した。傷のないhsp70のC-ドメインの、特に負荷されるペプチドない無傷のhsp70のC-ドメインの存在は、CD40の結合を干渉すると見られ、発明者がそれに結び付けられない理論に従って、全長のhsp70におけるC-ドメインの阻害的な影響が、そこに1又は複数のアミノ酸を修飾することにより減少させることができる。
従って、こうした熱ショックタンパク質C-ドメインのムテインが、C-ドメインにおける修飾を有し、そしてCD40に対する親和性の増大を呈する。C-ドメインのムテインがペプチドの結合活性を保持する例において、こうした分子が、上記のように抗原の導入のため用いることができる。好ましい例において、熱ショックタンパク質のムテインが、CD40の結合とペプチドの結合の両方を増大させるCドメインにおける1又は複数の変更にて提供される。選択肢として、熱ショックタンパク質ムテインが、CD40の結合を増大させるため少なくとも1のN末端の修飾を有し、さらにCD40の結合を増大させるためであるが、C-ドメインの阻害活性を減少させることにより提供そして少なくとも1のC-末端の修飾を有する。好ましいC-ドメインのムテインが、組み換え的に発現することができ、他の分子が、その後発現されそして化学的に修飾することができる。本発明は、こうしたムテインをコードする変性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。
さらなる例において、ムテインが、CD40の結合を高めるため、N-ドメインにおける少なくとも1の修飾された部位、及びペプチドの結合を高めるため、そして/又はCD40の結合するN-ドメインの阻害化を減少させるためにC-ドメインにおける少なくとも1の修飾された部位を有することができる。
上記のように、さらに本発明は、小分子及びペプチドを含む、たとえば、CD40の活性を調節することにより、免疫刺激又は免疫抑制物質(agent)として有益な化合物を同定するという目的のために、熱ショックタンパク質とCD40の間の相互作用を調節する化合物のスクリーニング法を対象とする。
こうしたスクリーニング法は、CD40又はその熱ショックタンパク質と相互作用する断片、と熱ショックタンパク質又はそのCD40との相互作用する断片の間の相互作用を調節することにより行うことができ、そしてin vitroで、又は細胞レベルにて行うことができ、そしてシグナル形質導入の経路に沿う工程を含むがそれに限定されない、種の相互作用及びその細胞における下流の生物的影響の調節を測定するとして、タンパク質とタンパク質の相互作用、結合、シグナリングの誘発、及び上に記載され、そして技術的に周知な他の活性を基盤とすることができる。こうしたアッセイ又はスクリーニングを軽快に読み出すことは、上記相互を促進又は阻害する候補化合物を同定するため、高性能スクリーニングを可能にする当業者により容易に工夫することができる。
熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片を、記載される種々の目的のいずれかにて、単独又は少なくとも別の分子と結合させるかの一方を用いる本明細書の全体にわたる手順及び方法のいずれかにおいて、熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片が、CD40とhsp70との相互作用、又はその相互作用点を調節する特性を有するような、上記CD40結合分子又はhsp偽物(mimetic)として同定されるペプチド、小分子、又は他の分子と置き換えることができる。
Prior provisional applications 60/342,570(filed 12/26/01);60/343,884(filed 12/28/01);60/372,620(filed 4/12/02),60/399,342(filed 7/29/02),and 60/414,834(filed 9/28/02)が、これらの全体に引用により本明細書に組み入れられ、そして本出願は、35 USC§119 and §120下にてそこにプライオリテイをクレームする。本明細書の他の記事や他の引用の全ては、これら全体において本明細書の引用に十分に組み入れられる。
これら及び本発明の他の観点が、本発明の図面の以下の説明、及び本発明の正確で詳細な説明により理解されるであろう。
本発明の詳細な説明
細胞表面受容体タンパク質分子CD40に、哺乳動物の熱ショックタンパク質、そして特にヒト熱ショックタンパク質hsp70及びhsc70(通常hsp70又はhsp70ファミリー・群と言及される)を特異的に結合することは、ここに本発明者にとって予想されない、そして驚異的な発見であった。さらにhsp70を結合することにより介在されるシグナリング、そして結合されたhsp70の摂取が同定された。ペプチドがhsp70・ペプチド結合ポケットに結合され、それがhsp70分子のC-末端ドメインに配置される場合に、CD40の細胞外形質ドメインにhsp70の結合が有意に増強され、そしてCD40にhsp70の結合では、hsp70分子のN-末端(ATPを結合又はATPアーゼ)ドメインを介し、そしてその分子のC-末端ドメインをペプチド結合によることなく介在されることが見出された。実際にhsp70の単離されたN-末端ドメインだけが、CD40の細胞外形質ドメインにしっかり結合できると見出された。
従って出願者の知見によれば、CD40の結合断片又はhsp70のドメインと関連つけるペプチド及び他の分子を細胞による摂取を容易にする際に、哺乳動物の熱ショックタンパク質とCD40の結合特性を取り入れることができる。CD40に結合するhsp70のドメインが、ペプチドを結合するドメインでないため、CD40に結合することと哺乳動物のhsp70に天然に結合されるペプチドの移送の両方が、マイコバクテリアhsp70(DnaK)に対照的に起こり、それは、そのペプチドとの結合(C-末端)ドメイン(Wangら、2001,Immunity 15:971-983)、そしてマイコバクテリアル熱ショックタンパク質が、そのペプチド結合ポケットに結合されるペプチドを有する場合、CD40にこれらの結合が阻害される。
さらに本明細書の知見によれば、哺乳動物のhsp70の分子が、C-末端(ペプチド結合ドメイン)に結合されたペプチドを、CD40発現細胞に移送し、そしてさらにNF-κBの活性を誘導するCD40発現細胞におけるシグナル形質導入経路を創始できることは、哺乳動物の熱ショックタンパク質が、T細胞の支援のない状態でその移送された抗原に特異的な免疫応答の誘発におけるその免疫的機能を行うことができることを明示している。
従って、本発明の特定の観点において、CD40に結合する天然の又は修飾された哺乳動物の熱ショックタンパク質分子、あるいは天然の又は修飾されたその断片と共有結合による結合又は非共有結合的な会合により、移送される分子に、免疫応答(又は何れか他の生物的応答)を調節するため、in vitro,ex vivo及びin vivoにおける細胞のCD40のレベルの調節に向けられている。
さらにそれは、哺乳動物の熱ショックタンパク質とCD40との間の相互作用を調節することにより、哺乳動物の熱ショックタンパク質の小分子擬態物、及び哺乳動物の熱ショックタンパク質の介在される免疫の調節剤を同定するための手段に向けられている。さらに本発明は、CD40発現細胞に抗原の移送を増強するために、CD40を結合する能力が高められた修飾された熱ショックタンパク質分子及びこれらの断片を同定、及び調製するための手段を提供する。
対照的にさらに本発明は、これが所望される例において、特に明白な、又は隠れた自己免疫疾患、そしてその他のうちアレルゲン及び移植抗原などの強い免疫毒性に不適切な露出における、熱ショックタンパク質により介在される免疫応答を減少させることに向けられている。CD40に熱ショックタンパク質の結合が、この活性を停止させる化合物を同定するために取り入れることができ、従って熱ショックタンパク質介在の不適切な免疫的事象を無くすために使用することができる。こうした方法及び物質(agent)が、疾患を防止するため予防的に、又は疾患を治療するため治療的に適応することができる。
免疫的目的として哺乳動物の熱ショックタンパク質とCD40との間の相互作用の使用は、本発明の方法及び物質(agent)として好ましい使用であるが、他の観点が本明細書記載から明らかになろう。たとえば、細胞の移送として所望され、そしてCD40を介し介在されるペプチド又は他の予め選択された分子が、共有結合、又は非共有結合によりCD40との結合ドメイン又はhsp70の断片にて関連付けられる。さらにCD40の発現の調節は、本発明の観点であり、それは移送を調節するために使用することができる。
CD40は、種々の細胞種に発現される膜貫通の糖たんぱく質であり、種々の非リンパ球細胞種の中から樹状細胞、Bリンパ球、特定の上皮細胞を含むが、それに限定されない。それは、病態中に他の細胞に発現される。それは、神経増殖因子の群(member)/腫瘍壊死因子ファミリーである。シグナル導入分子としてCD40の特性は、多くの研究により確立されてきた。CD40に対する天然のリガンドが、CD40リガンド又はCD40L(CD154としても知られる)と称して同定され、そして樹状細胞、及び他の抗原提示細胞などの食細胞を含む種々の免疫細胞、とCD40L及びCD40を介しT細胞及びB細胞との間の相互作用が、免疫応答に重要な役割をはたす。
そのリガンドに結合することにより、CD40の多様化(multimerization)の変更を介しこうした結合が、他の影響中に接着分子、サイトカイン、マトリックス変性酵素、プロトロンビン活性及びアポトーシス媒体の発現を介在する。このようにして、CD40シグナリングが、慢性炎症疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、移植変対ホスト疾患、ガン及びアテローム動脈硬化症を含む病態的過程と関連している。たとえば、(Diehlら、J.Mol.Med.2000;78(7):363-71,及びvan Kooten and Banchereau,J.Leukoc.Biol.2000 Jan;67(1):2-17,そして記事がCD40を検討するため本明細書に引用される)を参照。それが、本発明の観点が、対象とされるCD40と熱ショックタンパク質との間の相互作用から得られるシグナリングの調節する方向である。
従って、本発明は、こうした細胞におけるCD40の発現又は結合活性を変更させることにより、熱タンパク質の結合を、そしてこのましくは種々の細胞種による熱ショックタンパク質とこれらと関連付けるいずれかの分子の複合体の結合の調節するために広く対象とする1の観点である。一つの例において、哺乳動物の熱ショックタンパク質が、ヒトのhsp70である。さらにシグナリング及び内在化などの、CD40に対する熱ショックタンパク質-分子複合体の結合に付随する事象が、本発明の組成物および方法により調節することができ、そして細胞の生理的変化を誘発するため、及びCD40を発現するために誘発され、又はCD40の発現を増大させるために誘発されるよう発現する細胞に、抗原分子及びエピトープなどのある種の分子の移送を容易にするため有益である。
こうした移送は、遺伝子型及び細胞の可能性のある現象型を変更させるため、又は好ましくは熱ショックタンパク質に結合され、又は熱ショックタンパク質と会合される抗原分子に、哺乳動物の免疫を惹起するを目的とする。本発明のさらなる観点において、熱ショックタンパク質の結合により誘発され、さらには熱ショックタンパク質に起因するCD40のシグナリング特性は、CD40が介在するシグナリングが所望される手順及び方法を都合よく利用することができる。本発明が、哺乳動物の熱ショックタンパク質、より好ましくはヒトの、及び最も好ましくはヒトのhsp70に向けられることが好ましいが、それらを限定をするものでない。
さらに本発明は、ここに発明者により発見されたように、CD40と熱ショックタンパク質、及び特に哺乳動物の熱ショックタンパク質、そしてより特異的な哺乳動物の熱ショックタンパク質、好ましくはヒトのhsp70のN-ドメイン(ATP-結合又はATPアーゼ・ドメイン)との間の良好な親和性を取ることにより、CD40を発現する細胞に抗原又は他の予め選択された分子を移送する新たな移送分子を対象としている。
こうした新しい移送分子が、CD40を結合する熱ショックタンパク質の断片を含む、従って熱ショックタンパク質のペプチド結合ポケットに非結合的に結合するか、CD40と結合する熱ショックタンパク質断片に予め選択された分子を共有的に結合するかいずれかにより、MHC/HLAクラスIのペプチドなどの予め選択された分子を移送することができる。さらにこうした移送分子が、全長の熱ショックタンパク質又はその断片の修飾を含む、こうした修飾がCD40に対する熱ショックタンパク質又は断片の親和性の親和性の増大し、所望により付加され/移送されるペプチドに対し熱ショックタンパク質又は断片の親和性の親和性の増大を含む。
これは、本明細書の目的として有益な哺乳動物の熱ショックタンパク質分子、好ましくは哺乳動物のhsp70のファミリー群、よりこのましくはヒトのhsp70のファミリー群が、C-末端(ペプチド結合)ドメイン又はその断面でないが、N-末端又はATPアーゼ(ATP結合)ドメイン、及びその断片で、ペプチドに結合しないN-ドメインである。特にhsp70の断片は、それがhsp70分子のアミノ酸１からアミノ酸約381に伸びた、N-ドメイン部分の全てである。
従って本発明は、さらに熱ショックタンパク質の上記N-ドメイン、好ましくは哺乳動物のhsp70,そしてより好ましくはヒトのhsp70、又はそのCD40の結合断片、及び別の分子、好ましくはタンパク質又はペオウチド、より好ましくは少なくとも１の抗原又はペプチド、そして最も好ましくは少なくともガン又は感染性疾患のエピトープを含む結合及び融合ポリペプチドを対象とする。組成物は、いずれか一方より大きい、少なくとも1のCD40結合ドメイン及び少なくとも1の免疫原又は抗原のドメインを含む。好ましい例において、本発明の組成物は、CD40結合ドメイン及び複数の抗原又はエピトープ、好ましくはその組成物が、標的疾患に対し有効な免疫応答を惹起できるように、共線形に発現されることが好ましい。
当業者が周知にように、要因となる生体の中の抗原の変動、又は疾患細胞における自己抗原の標的の細胞発現パターンの変動があり、さらに個体のHLAハプロタイプが、免疫原として特に有効なエピトープを示す場合、多くの異なる抗原又はエピトープが、有効な治療に又は特定疾患を防止するため特に必要とされる。HLA型の個体の種々の治療に対し、本発明の組成物が、疾患に特異的な複数のエピトープを有し、そしてさらにHLAに特異的な複数のエピトープを有し、本発明の単一の免疫原組成物にて所望のように治療される患者のスペクトラム(spectrum)に依存する。さらに本発明は、こうした結合体をコードするポリヌクレオチドを包含し、その変性配列及びそうしたポリヌクレオチドの組み換え型発現を含む。こうしたポリヌクレオチドが、目的とするものを製造するためin vitroにおいて組成物の組み換え型発現のため使用することができる又はエピトープ関連疾患の予防又は治療のためワクチンとして治療に使用することができる。従って本発明の組成物に基づくDNAワクチンが、本明細書に十分包含される。
本明細書に使用される「断片」という用語は、親分子と比較して一つのアミノ酸を喪失した程度の小ささのもの又は少なくとも約6個のアミノ酸の有意に小さい断片で可能であるが、そうしたものに限定されない。
上記と対照的に、熱ショックタンパク質の細胞により、又は熱ショックタンパク質、特に内在性熱ショックタンパク質、及びそれに結合したペプチドにより、結合、シグナリング、又は内在化の減少を行うためのCD40の発現の調節が、本発明の他の観点である。こうした調節が、移植抗原などに免疫応答を自己免疫疾患の治療のため、他の目的の中内在性又は環境的な抗原に望ましくない免疫応答の誘発又は再発生をうまく干渉することがでっきる。
腫瘍及びウイルス抗原が、MHC(ムリン)クラスI分子(ヒトのHLA クラスI)により後の明示する抗原ペプチドの抗原提示細胞による熱ショックタンパク質-依存性の摂取による強力な免疫応答を惹起する。哺乳動物の熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を特に結合、シグナル、及び内在化する抗原提示細胞上の受容体が、前に同定されていなかった。本発明者は、CD40を発現する細胞が、結合されたペプチドを伴うヒトhsp70を特に結合、及び内在化することを見出した。CD40の細胞外形質ドメインにhsp70-ペプチド複合体の結合が、ADP状態においてhsp70のN-末端分子結合ドメインにて介在される。Hsp70共シャペロンHipであるが、hsp70-CD40の複合体の生成で競合するうが、細菌hsp70相同Dnakが競合しない。上記のように、hsp70ペプチド基質の存在において、CD40にhsp70-ADPの結合を有意に増大し、さらにはp38を介しシグナリングを誘発する。CD40が試料としてマクロファージ、及び樹状細胞により外在性hsp70-ペプチド複合体の摂取を介在する共-シャペロン様受容体であることが、これらの研究により明示された。
これらの結果により、端部に加えられるヒトhsp70とペプチド複合体に対する受容体として細胞表面たんぱく質CD40が確立された。CD40とhsp70の相互作用の機能的な特性は、hsp70と会合するペプチドの表面結合、及び摂取を保証する。出願者には、本発明が操作する機構を開示するように求められておらないが、そしてこうした開示により結びつけられない。
図7は、腫瘍細胞におけるHsp70にペプチド抗原を結合し、次ぎに壊死細胞を溶離し、そして抗原提示細胞(APC)によりHsp70-ペプチド複合体のCD40介在される摂取の代表例を記載する。細胞内の高濃度のATP、そしてペプチドの負荷を触媒するHsp70と共シャペロンのHsp40の活性により(Minamiら、1996,J.Biol.Chem.271:19617-19624)、Hsp70へのペプチドの結合が容易となるであろう。細胞の壊死中に、ADPに対するATPの内在する濃度が、顕著に低下する(Bradburyら、2000,J.Jmmunol.Methods 240:79-92)。ATPのさらなる希釈(及びHsp70の共シャペロンの)物が溶離により生成し、細胞ソル含有物を細胞外の媒体に放出しすることになる。
結果として、ペプチドに結合されたHsp70が、ADPの状態にてHsp70とペプチドの複合体の半減期を決定する安定性を維持する。重要なことは、Hsp70上に負荷するペプチドが、効率の低いヌクレオチドのない状態で可能であるが(Minamiら、1996,idem)、低濃度のヌクレオチドが、細胞外の空間にHsp70-ADP-ペプチド複合体の再形成を阻害することになろう。従って、Hsp70-ADP-ペプチドに対するCD40の有意に優先されることが、ペプチドと負荷されるHsp70の結合を確実にするばかりか、細胞内ペプチド抗原がプライミング交差のため利用できることも保障できるであろう。従って、
循環する細胞外ペプチドの摂取、自己免疫反応を有意に引き金を引くことは避けるべきである。出願者は、上記理論により束縛されない。
CD40に熱ショックタンパク質の結合が、hsp70のATPアーゼのドメインにより介在され、そしてシャペロンのADPの負荷状態において高められ、それがペプチドをしっかりと結合する。さらに、CD40とhsp70との間の複合体の形成は、hsp70のペプチド基質の存在により強く高められる。従って、CD40とhsp70の相互作用が、hsp70とHipなどの特定の細胞内共シャペロンとの間の相互作用による重要な機能的特性を共有する。上記のように、CD40に結合するhsp70が,hsp70のC-末端ドメインに結合される基質ペプチドの相互作用により、高められる。本明細書に記載される研究では、ADPの存在下にCD40が、Hsp70のATPアーゼドメインと相互作用する。
上記のように、CD40とHsp70との相互作用の機能的と特性を、クロス・プライミングのためAPCにHsp-ペプチド複合体の摂取における役割に、適用させることができる。従って免疫応答を増強するために対象とされる本発明の種々の例が対象とされる。
本発明の種々の観点が、哺乳動物の熱ショックタンパク質を、好ましくは熱ショックタンパク質のhsp70ファミリーを、より好ましくはヒトの、そして最も好ましくはヒトのhsp70を対象とし、それを限定するものではない。CD40を結合できる他の熱ショックタンパク質が、含む。hsc70,Bip,hsp110,hsp72及びhsp73などのhsp70ファミリーの他の群を、並びにhsp40,hsp60,hsp90,gp96,カルレチクリン,grp170,PDI,hsp100,smhsp,及びhsp27などの他の熱ショックタンパク質を含むが、しれに限定されない。通常hsp70ファミリーo及び他の熱ショックタンパク質が、Rothman,1989,cell 59:591-601、及びPelham,1986,Cell 49:959-961,及びそこに引用される文献に見出すことができる。当業者が、天然の熱ショックタンパク質又はその断片を容易に同定することができる。
熱ショックタンパク質の、そして本明細書において特にhsp70の有用性の全ての好ましい例であるがそれに限定されない例において、熱ショックタンパク質と言う用語は、上記典型的な熱ショックタンパク質又は融合ポリペプチドのいずれかのCD40の結合部分を含む断片、又は熱ショックタンパク質のCD40の結合部分を少なくとも含む他の分子を包含する。熱ショックタンパク質又はCD40の結合断片が、熱ショックタンパク質又はその断片に非共有結合的に結合するための親和性を有するもの、熱ショックタンパク質に結合するための親和性を有するようにすることのできるもの、そして熱ショックタンパク質又はその断片に共有結合的に結合されるもの、など予め選択された生物分子との共有結合的、又は非共有結合的な複合体において可能である。上記のように、生物分子又は抗原が、本明細書提示の熱ショックタンパク質との複合体として、天然の複合体として疾患細胞から単離することができ、又はそれらをin vitroにて調製することもできる。好ましい例において、熱ショックタンパク質が、ハイブリット抗原に非共有結合的に結合され、そのハイブリット抗原が、予め選択分子を含み、たとえば抗原又は免疫原のドメイン、及び熱ショックタンパク質結合ドメインでも良い。ADPがこうした調製物に存在する。
こうした熱ショックタンパク質結合ドメインの選択の非限定の例は、Moroiら、2000,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.97:3485-3490;PCT/US96/13363(WO9706821);PCT/US98/22335(WO9922761);PCT/US01/12567(WO0179259);PCT/US01/12568(WO0178772);and PCT/US01/12449(WO0178655),及びその引用文献、特にGragerovら、J.Molec.Biol.235:848-854(1994),Flynnら、Science 245:385-390(1989),Augerら、Nature Medicine 2:306-310(1996),Blond-Elbuindiら、Cell 75:717-728(1993)、その他において記載されている。細胞から単離される又はin vityoにおいて調製される熱ショックタンパク質、及び抗原又はエピトープの他の共有結合的、及び非共有結合的な複合体が、米国特許5,997,873;6,168,793;5,710,119;5,961,979;6,048,530;5,935,576;6,030,618;5,837,251;6,017,544;6,335,183;6,338,952;6,410,028;6,447,781;PCT/US96/14556(WO9710000),PCT/CA98/00246(WO9907860),PCT/CA97/00897(WO9823735);and PCT/US02/03460(WO0262959)に記載され、これらの全てが、そのままの形にて引用により本明細書に組み入れらている。哺乳動物の、そしてより好ましくはヒトの熱ショックタンパク質を含む上記複合体が好ましい。ヒトのhsp70を含む複合体が最も好ましい。
非限定の例により、本明細書の種々記載の用途として、哺乳動物熱ショックタンパク質、好ましくはhsp70ファミリーの1群、そして最も好ましくはhsp70に、予め選択されたの結合を増強するために、以下の熱ショックタンパク質・結合ドメインペプチド(1文字のコードにて明示される)が、予め選択された分子に結合することができる。
Hy(W/Xaa)HyXaaHyXaaHy(配列番号２)、ここで各Hyは、トリプトファン、ロイシン、及びフェニルアラニンなどを含むが限定されない、独立した疎水性アミノ酸、そしてXaaはいずれかのアミノ酸；HWAFAWPW(配列番号３);NLLRLTGW(配列番号４);FYQLALTW(配列番号５);RKLFFNLRW(配列番号６);QKRAA(配列番号７);RRRAA(配列番号８);LFWPFEWI(配列番号９);FTYGSRWL(配列番号１０);FWGLWPWE(配列番号１１);DGVGSFIG(配列番号１２);KRQIYTDLEMNRLGK(配列番号１３);PLSQETFSGLWKLLPPEDG(配列番号１４);YVDRFIGW(配列番号１５);VGIDLGTTYSC(配列番号１６);THCDGFQNE(配列番号１７);EGMIDGWYGFRHQNC(配列番号１８);CIRCQLSGNS(配列番号１９);SQKVPTSQIKC(配列番号２０);
KGLRNMELDTYIQRK(配列番号２１);SKYIPRRKPRFLSSL(配列番号２２);KPRFLSSLVGILK(配列番号２３);RFHAMGVDSKYIPRR(配列番号２４);GKWVYI(配列番号２５);AKRETK(配列番号２６);KWVHLF(配列番号２７);RLVLVL(配列番号２８);WKWGIY(配列番号２９);SSHASA(配列番号３０);WGPWSF(配列番号３１);AIPGKV(配列番号３２);RVHDPA(配列番号３３);RSVSSF(配列番号３４);LGTRKG(配列番号３５);KDPLFN(配列番号３６);LSQHTN(配列番号３７);NRLLLT(配列番号３８);YPLWVI(配列番号３９);LLIIDR(配列番号４０);
RVISLQ(配列番号４１);EVSRED(配列番号４２);SILRST(配列番号４３);PGLVWL(配列番号４４);VKKYI(配列番号４５);NNRLLD(配列番号４６);SKGRWG(配列番号４７);IRPSGI(配列番号４８);ASLCPT(配列番号４９);DVPGLR(配列番号５０);RHREVQ(配列番号５１);LARKRS(配列番号５２);SVLDHV(配列番号５３);NLLRRA(配列番号５４);SGISAW(配列番号５５);FYPWVR(配列番号５６);KLPXaaLPL(配列番号５７);TPTLSD(配列番号５８);THSLIL(配列番号５９);LLLLSR(配列番号６０);
LLRVRS(配列番号６１);ERRSRG(配列番号６２);RMLQLA(配列番号６３);RGWANS(配列番号６４);RPFYSY(配列番号６５);SSSWNA(配列番号６６);LGHLEE(配列番号６７);SAVTNT(配列番号６８);KWVHLFG(配列番号６９);NRLLLTG(配列番号７０);LRRWSLG(配列番号７１);ARLLLTG(配列番号７２);NALLLTG(配列番号７３);NRLALTG(配列番号７４);NLLRLTG(配列番号７５);NRLWLTG(配列番号７６);NRLLLAG(配列番号７７);MQERITLKDYAM(配列番号７８);NDLLLTG(配列番号７９);RGYVYQGL(配列番号８０);
KFERQ(配列番号８１);HTTVYGAG(配列番号８２);TETPYPTG(配列番号８３);LTTPFSSG(配列番号８４);GVPLTMDG(配列番号８５);KLPTVLRG(配列番号８６);CRFHGNRG(配列番号８７);YTRDFEAG(配列番号８８);SSAAGPRG(配列番号８９);SLIQYSRG(配列番号９０);DALMWPXaaG(配列番号９１);SSXaaSLYIG(配列番号９２);FNTSTRTG(配列番号９３);TVQHVAFG(配列番号９４);DYSFPPLG(配列番号９５);VGSMESLG(配列番号９６);FXaaPMIXaaSG(配列番号９７);APPRVTMG(配列番号９８);LATKTPKG(配列番号９９);KPPLFQIG(配列番号１００);
YHTAHNMG(配列番号１０１);SYIQATHG(配列番号１０２);SSFATFLG(配列番号１０３);TTPPNFAG(配列番号１０４);ISLFDPRMG(配列番号１０５);SLPLFGAG(配列番号１０６);NLLKTTLG(配列番号１０７);DQNLPRRG(配列番号１０８);SHFEQLLG(配列番号１０９);TPQLHHGG(配列番号１１０);APLDRITG(配列番号１１１);FAPLLAHG(配列番号１１２);SWIQTFMG(配列番号１１３);NTWPHMYG(配列番号１１４);EPLPTTLG(配列番号１１５);HGPHLFNG(配列番号１１６);YLNSTLAG(配列番号１１７);HLHSPSGG(配列番号１１８);TLPHRLNG(配列番号１１９);SSPREVHG(配列番号１２０);
NQVDTARG(配列番号１２１);YPTPLLTG(配列番号１２２);HPAAFPWG(配列番号１２３);LLPHSSAG(配列番号１２４);LETYTASG(配列番号１２５);KYVPLPPG(配列番号１２６);APLALHAG(配列番号１２７);YESLLTKG(配列番号１２８);SHAASGTG(配列番号１２９);GLATVKSG(配列番号１３０);GATSFGLGG(配列番号１３１);KPPGPVSG(配列番号１３２);TLYVSGNG(配列番号１３３);HAPFKSQG(配列番号１３４);VAFTRLPG(配列番号１３５);LPTRTPAG(配列番号１３６);ASFDLLIG(配列番号１３７);RMNTEPPG(配列番号１３８);KMTPLTTG(配列番号１３９);ANATPLLG(配列番号１４０);
TIWPPPVG(配列番号１４１);QTKVMTTG(配列番号１４２);NHAVFASG(配列番号１４３);LHAAXaaTSG(配列番号１４４);TWQPYFHG(配列番号１４５);APLALHAG(配列番号１４６);TAHDLTVG(配列番号１４７);NMTNMLTG(配列番号１４８);GSGLSQDG(配列番号１４９);TPIKTIYG(配列番号１５０);SHLYPSSG(配列番号１５１);YTLVQPL(配列番号１５２);TPDITPK(配列番号１５３);TYPDLRY(配列番号１５４);DRTHATS(配列番号１５５);MSTTFYS(配列番号１５６);YQHAVQT(配列番号１５７);FPFSAST(配列番号１５８);SSFPPLD(配列番号１５９);MAPSPPH(配列番号１６０);
SSFPDLL(配列番号１６１);HSYNRLP(配列番号１６２);HLTHSQR(配列番号１６３);QAAQSRS(配列番号１６４);FATHHIG(配列番号１６５);SMPEPLI(配列番号１６６);IPRYHLI(配列番号１６７);SAPHMTS(配列番号１６８);KAPVWAS(配列番号１６９);LPHWLLI(配列番号１７０);ASAGYQI(配列番号１７１);VTPKTGS(配列番号１７２);EHPMPVL(配列番号１７３);VSSFVTS(配列番号１７４);STHFTWP(配列番号１７５);GQWWSPD(配列番号１７６);GPPHQDS(配列番号１７７);NTLPSTI(配列番号１７８);HQPSRWV(配列番号１７９);YGNPLQP(配列番号１８０);
FHWWWQP(配列番号１８１);ITLKYPL(配列番号１８２);FHWPWLF(配列番号１８３);TAQDSTG(配列番号１８４);FHWWWQP(配列番号１８５);FHWWDWW(配列番号１８６);EPFFRMQ(配列番号１８７);TWWLNYR(配列番号１８８);FHWWWQP(配列番号１８９);QPSHLRW(配列番号１９０);SPASPVY(配列番号１９１);FHWWWQP(配列番号１９２);HPSNQAS(配列番号１９３);NSAPRPV(配列番号１９４);QLWSIYP(配列番号１９５);SWPFFDL(配列番号１９６);DTTLPLH(配列番号１９７);WHWQMLW(配列番号１９８);DSFRTPV(配列番号１９９);TSPLSLL(配列番号２００);
AYNYVSD(配列番号２０１);RPLHDPM(配列番号２０２);WPSTTLF(配列番号２０３);ATLEPVR(配列番号２０４);SMTVLRP(配列番号２０５);QIGAPSW(配列番号２０６);APDLYVP(配列番号２０７);RMPPLLP(配列番号２０８);AKATPEH(配列番号２０９);TPPLRIN(配列番号２１０);LPIHAPH(配列番号２１１);DLNAYTH(配列番号２１２);VTLPNFH(配列番号２１３);NSRLPTL(配列番号２１４);YPHPSRS(配列番号２１５);GTAHFMY(配列番号２１６);YSLLPTR(配列番号２１７);LPRRTLL(配列番号２１８);RSTLLWK(配列番号２１９);TSDMKPH(配列番号２２０);
TSSYLAL(配列番号２２１);NLYGPHD(配列番号２２２);LETYTAS(配列番号２２３);AYKSLTQ(配列番号２２４);STSVYSS(配列番号２２５);EGPLRSP(配列番号２２６);TTYHALG(配列番号２２７);VSIGHPS(配列番号２２８);THSHRPS(配列番号２２９);ITNPLTT(配列番号２３０);SIQAHHS(配列番号２３１);LNWPRVL(配列番号２３２);YYYAPPP(配列番号２３３);SLWTRLP(配列番号２３４);NVYHSSL(配列番号２３５);NSPHPPT(配列番号２３６);VPAKPRH(配列番号２３７);HNLHPNR(配列番号２３８);YTTHRWL(配列番号２３９);AVTAAIV(配列番号２４０);
TLMHDRV(配列番号２４１);TPLKVPY(配列番号２４２);FTNQQYH(配列番号２４３);SHVPSMA(配列番号２４４);HTTVYGA(配列番号２４５);TETPYPT(配列番号２４６);LTTPFSS(配列番号２４７);GVPLTMD(配列番号２４８);KLPTVLR(配列番号２４９);CRFHGNR(配列番号２５０);YTRDFEA(配列番号２５１);SSAAGPR(配列番号２５２);SLIQYSR(配列番号２５３);DALMWPXaa(配列番号２５４);SSXaaSLYI(配列番号２５５);FNTSTRT(配列番号２５６);TVQHVAF(配列番号２５７);DYSFPPL(配列番号２５８);VGSMESL(配列番号２５９);FXaaPMIXaaS(配列番号２６０);
APPRVTM(配列番号２６１);IATKTPK(配列番号２６２);KPPLFQI(配列番号２６３);YHTAHNM(配列番号２６４);SYIQATH(配列番号２６５);SSFATFL(配列番号２６６);TTPPNFA(配列番号２６７);ISLDPRM(配列番号２６８);SLPLFGA(配列番号２６９);NLLKTTL(配列番号２７０);DQNLPRR(配列番号２７１);SHFEQLL(配列番号２７２);TPQLHHG(配列番号２７３);APLDRIT(配列番号２７４);FAPLIAH(配列番号２７５);SWIQTFM(配列番号２７６);NTWPHMY(配列番号２７７);EPLPTTL(配列番号２７８);HGPHLFN(配列番号２７９);YLNSTLA(配列番号２８０);
HLHSPSG(配列番号２８１);TLPHRLN(配列番号２８２);SSPREVH(配列番号２８３);NQVDTAR(配列番号２８４);YPTPLLT(配列番号２８５);HPAAFPW(配列番号２８６);LLPHSSA(配列番号２８７);LETYTAS(配列番号２８８);KYVPLPP(配列番号２８９);APLALHA(配列番号２９０);YESLLTK(配列番号２９１);SHAASGT(配列番号２９２);GLATVKS(配列番号２９３);GATSFGL(配列番号２９４);KPPGPVS(配列番号２９５);TLYVSGN(配列番号２９６);HAPFKSQ(配列番号２９７);VAFTRLP(配列番号２９８);LPTRTPA(配列番号２９９);ASFDLLI(配列番号３００);RMNTEPP(配列番号３０１);KMTPLTT(配列番号３０２);ANATPLL(配列番号３０３);TIWPPPV(配列番号３０４);QTKVMTT(配列番号３０５);NHAVFAS(配列番号３０６);LHAAXaaTS(配列番号３０７);TWQPYFH(配列番号３０８);APLALHA(配列番号３０９);TAHDLTV(配列番号３１０);NMTNMLT(配列番号３１１);GSGLSQD(配列番号３１２);TPIKTIY(配列番号３１３);SHLYRSS(配列番号３１４);HGQAWQF(配列番号３１５);NLLRLTG(配列番号３１６)及びFHWWW(配列番号３１７)である。
別の例において、熱ショックタンパク質結合ドメインが、哺乳動物の熱ショックタンパク質結合ドメインが、哺乳動物の熱ショックタンパク質結合ドメインの異なる部位に結合することを対象とし、本発明の上記のもの及び熱ショックタンパク質結合ドメインが、熱ショックタンパク質分子の任意の特定部分に結合することに、限定されない。限定されない例において、ペプチドIFAGIKKKAERADLIAYLKQATAK(Greeneら、1995,J.Biol.Chem.270:2967-2973;配列番号331)、又はこのペプチドの熱ショックタンパク質結合断片が、熱ショックタンパク質又はそのCD40-結合断片に予め選択された分子の結合を容易にするために、本発明の任意の結合体に使用される。上記ペプチド及びその断片が、特に天然のペプチド結合ドメイン又はポケットを欠失しているCD40-結合熱ショックタンパク質断片に、予め選択された分子を結合するため、特に有益である。
熱ショックタンパク質に結合する上記ペプチドに加えて、その結合が、熱ショックタンパク質結合活性を有する有機分子又は化合物の使用を介し行うことができる。たとえば適切な分子が、ハービマイシンA、ゲルタナマイシン、マクベシンI、ミノサマイシン及びクワイチマイシンなどのベンゾキノンアンサマイシン構成物質の一群(Omuraら、1979,J.Antibiotic 32:255-261),又は構造的に関連する化合物、及びその類似体又は誘導体を含む。これらの分子は、熱ショックタンパク質又はそのCD40結合断片に分子の結合を容易にするため、本明細書を通して記載される予め選択された分子に、化学的手段を行うことにより結合することができる。
本明細書に記載され本発明の種々の観点において使用するため、CD40調節物質(agent)及び熱ショックタンパク質分子又は断片、及びこれら関連分子が、当業者によりモデルに又は患者において容易に決定することができる。特異的免疫応答を誘発するため免疫学的なアッセイが、十分に確立されそして定められたように行はれる。本発明により形成した哺乳動物の投与物としての物質(agent)及び熱ショックタンパク質及び断片の処方物が、医薬的生成物に対する標準的な処方方法により、医薬的に受け入れ可能な賦形剤、希釈剤、担体などを調製することができる。
以下の項は、通常本発明の種々の観点を記載している。これらは、単に簡便のため単に異なる見出し部により説明されているが、これにより使用される多くの方法及び組成物が、その観点において共通であり、そして有益なように互いに交換することができる。種々の例における好ましい観点が、哺乳動物の熱ショックタンパク質、より好ましくはヒトの熱ショックタンパク質、そして最も好ましくはヒトのhsp70に対してであるが、それが限定されるものでない。これは、当業者に明らかになろう。
CD40の発現を増大させることにより熱ショックタンパク質/抗原複合体の摂取を増強
上記のように、本発明者は、哺乳動物の熱ショックタンパク質結合分子(すなわち、哺乳動物の熱ショックタンパク質、好ましくはヒトの熱ショックタンパク質、より好ましくは哺乳動物のhsp70ファミリー群、そして最も好ましいのはヒトhsp70に対する細胞表面受容体)として同定した。さらには、CD40がペプチドに結合することができ、そして実際にペプチドがそこに結合される時シグナリングを誘発し、実際にそれは、ペプチドが結合される時に有意に増強される。
この観点においてCD40に結合する熱ショックタンパク質の1部分を含む(本明細書では熱ショックタンパク質のCD40結合部分、又はその合成変異体)を含む哺乳動物の熱ショックタンパク質の摂取を又は断片、融合ポリペプチド、又は他の分子の摂取を高めるため、in vitro,ex vivo,in vivoのいずれ又は上記何れかの組み合わせにおける細胞において、CD40の発現を誘発することができ、又は細胞において増大することができる。1の観点において、増大したCD40の発現が、増大されたCD40の発現が、熱ショックタンパク質のペプチド結合ポケットを介し熱ショックタンパク質に結合される、ペプチド抗原などの熱ショックタンパク質と関連抗原の内性の(すなわち天然に存在)複合体の摂取及び処理(proceesing)を増強する。
好ましくはこうした条件下にて、摂取される熱ショックタンパク質又は断片が、共有結合的、又は非共有結合的に抗原又は免疫原分子に結合し、そのため、そこへの免疫応答が、摂取下に所望により誘発されるか、選択肢として寛容化される。その免疫応答が、イフェクター・T細胞を惹起し、体液応答の誘発、又はその両方、又は他の条件下に特定抗原又は抗原類に細胞系応答、体液系応答、又はその両方の応答への寛容性、又はそれを廃棄することも可能である。上記は、本発明の免疫治療的な利用の単なる代表的な例であり、さらに本発明に関係する非免疫治療の使用に関与する本発明のさらなる利用は、以下の基づいて行はれたように、CD40を発現する細胞又はCD40を発現するために誘発される細胞に分子の熱ショックタンパク質介在移送を増強することを含むが、限定されないなど、本明細書に十分に包含される。
実施例により、血液全体に、又は全血液から単離されたものなど、哺乳動物から、好ましくは限定されないヒト患者から食細胞の試料を、ex vivoにてCD40を誘発、又は増大することのできる物質(agent)に暴露することができる。上の注記のようにこうした物質(agent)が、CD40をコードするベクターを含むがそれに限定されず、又は前記のようにカルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSなどの物質(agent)が、食細胞に暴露するとCD40の発現を誘発し、そして/又は上限調節する。
少なくとも1の物質(agent)が使用できるが複数に物質(agent)が、たとえばCD40をコードする発現可能なポリヌクレオチドを最初に使用し、そしてその後、ポリヌクレオチドの発現を増大させる(agent)を使用することができる。誘発可能なプロモータを含むCD40の構造が、標的細胞にトランスフェクトすることができ、その後その細胞を、誘発剤に暴露することができる。
さらに1の物質(agent)を、ex vivoなど1方の設定にて使用され、そしてもう一方の物質(agent)が、in vivoにて使用され、たとえば、個体から単離される食細胞は、ex vivoにてCD40をコードするポリヌクレオチドを導入することによりCD40を発現するために誘発することができ、そして個体に投与した後、サイトカインを、全体的に又は局所的に投与して、さらにCD40の発現を増大させる。暴露した後、過剰な物質(agent)を除去するため、食細胞を洗浄することができ、そしてその食細胞を個体に戻される。別の例において、細胞培養、ドナーの個体から、又は他の資源からなどの同種異型の食細胞が、in vitroにおいて処理され、その後に投与される。
上記のように本明細書の例の全てにおいて、CD40をコードするポリヌクレオチドを用いる方法にて、ポリヌクレオチドが、天然のCD40の断片、又はそのアミノ酸配列と配列の修飾をコードすることができ、ここでコードするポリヌクレオチドの発現が、CD40様熱ショックタンパク質の結合親和性、シグナリング、又は内在化特性、及び上記のいずれかの組み合わせを示す細胞となる。幾つかの場合において、3のCD40の活性の全てが、別において；他のものにおいて、3つのうち2又は丁度の結合が、特定方法の所望の結果として十分である。さらに熱ショックタンパク質の増強された結合親和性を有する修飾されるCD40タンパク質が、本明細書に所望される種々の方法として本発明に包含される。
哺乳動物の熱ショックタンパク質を細胞に少なくとも結合できるようにする、CD40又はその断片をコードする上記発現可能なポリヌクレオチドの移送は、技術的に周知の多くの方法により行うことができる。たとえば、裸のDNAベクター(たとえば、Ulmerら、1993,Science 259:1745-1749を参照)、DNAベクター移送物質(vector transpoter)(たとえば、Wuら、1992,J.Biol.Chem.267:963-967;Wu and Wu,1988,J.Biol.Chem.263:14621-14624;Hartmutら、Canadian Patent Application No.2,012,311,filed March 15,1990)、又は所望のexp遺伝子を含むウイルスベクターを、細胞又は組織内に注入することができる。
適切なウイルスベクターが、ヘルペス単純ウイルス(HSV)(たとえば、Kaplittら、1991,Molec.Cell.Neurosci,2:320-330を参照),乳頭腫ウイルス、Epstein Barr virus(EBV)、アデノウイルス(たとえばStratford-Perricaudetら、1992,J.Clin.Invest.90:629-630を参照)、アデノ随伴ウイルス（AAV)(たとえば、Samulskiら、1987,J.Virol.61:3096-3101;Samulskiら、1989,J.Virol.63:3822-3828)などを含むがそれに限定されない、両親媒性ホスト範囲(Miller,1990,Human Gene Ther.1:5-14;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,§9を参照)、及び弱毒化された、又は欠陥性DNAウイルスを伴う細胞に包含されたレトロウイルスを含む。全体にわたり、又はほぼ全体にわたり欠失したウイルス遺伝子である欠陥ウイルスは、1に実施例である。欠陥ウイルスは、細胞に導入後感染しない。
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、技術的に周知の方法により、たとえばトランスフェクｓトン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質転換、細胞融合、DEAEデキストラン、燐酸カルシウム沈降法、リポフェクション(リポソーム融合)、遺伝子ガムの使用、又はDNAベクタートランスポータ(たとえばWuら,1992,J.Bio.chem.267:963-967;Wu and Wu,1988,J.Biol.Chem.263:14621-14624;Hartmutら、Canadian Patent Application No.2,012,311,fild March 15,1990を参照)。
どちらの形式が用いられたとしても、前記ポリヌクレオチドの投与が、筋肉内、腹腔内、静脈内などを含むが限定されないいずれかの非経口経路により行はれる。直接に、又は標的又はウイルスベクターの選択により、リンパ組織に、たとえばリンパ節又は脾臓に間接的に投与することが、1の例である。
CD40のトランスフェクト、発現の誘発又は増大に使用される物質(agent)の量が、物質(agent),細胞の群及び種類、又は所望のように処理される細胞の混合、及びex vivo暴露の希釈などの処理条件に依存し、当業者により容易に決定することができる。
抗原と内在性の熱ショックタンパク質複合体の摂取及びプロセスが、樹状細胞などの食細胞の望ましい増大の例において、本発明の方法は、CD40の発現を増大し、次に熱ショックタンパク質の摂取及びプロセシングを増大するために、食細胞にin vitro,in vivo又はex vivoに適用できる。こうした方法を行う行うための手順の例は、上記本発明の要約に記載されて、そして単に例示的であり、それを限定するものでない。
内在性熱ショックタンパク質の摂取及びプロセシングを増強することに加え、上記操作プラスex-vivo又はin vivoのいずれかの内在性熱ショックタンパク質/抗原複合体に暴露することを含む方法は、同様ここに包含される。
ex vivoの観点において、方法は、細胞によりCD40の発現を増大できる物質(agent)に、ex vivoにおける細胞を暴露することにより熱ショックタンパク質の摂取を増強するために提供される。この観点において、免疫応答を誘発するという後の目的のため、MHC/HLA分子上抗原又はその断片を提示するという目的のため、熱ショックタンパク質との複合体における、抗原又は免疫原を摂取するため同定される細胞が、本明細書に包含される。細胞は、好ましくは食細胞であり、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞などを含むがそれに限定されないなどの専用(professional)及び非専用(non-professional)の食細胞を含む。樹状細胞は、リンパ系由来又は骨髄系由来で可能である。好ましくは、本発明のex vivoの観点として、血液全体(抹消血液単核細胞、又はPBMCｓ)に存在する又は所望により単離される抗原提示細胞が好ましい。抗原提示細胞、本提示細胞が、本発明のex-vivo法が考えられる個体から単離されることが好ましいが、別の例において、細胞が別の個体から又は細胞株から由来でよく又は保存されたコード(cord)血液を含む保存血液、又は個体から増殖した細胞でも可能である。
もちろん上記のように、非免疫治療目的として増強された熱ショックタンパク質の摂取が、本明細書に十分に包含されている。これは、たとえばアンチセンス・オリゴヌクレオチド、ベクター、裸のDNA,および細胞の遺伝子型、及び所望による細胞の現象型の急性又は慢性的な変化を行うため、医薬物質を含む他のマクロ分子移送剤を含む。
CD40発現の増大を伴う細胞が、熱ショックタンパク質、又はそのCD40結合断片の摂取の増強を示し、それは、上記のようにその他の、予め選択された分子との複合体にて可能である。本明細書に示されているように、抗原及び種々の共-刺激分子の量と、又は特定分子の非存在とを組み合わせてこうした摂食を高めることは、有効な細胞系そして/又は体液系の免疫応答をそこに誘発することができ、又は抗原に免疫系を寛容化することになる。
たとえば熱ショックタンパク質に対する天然の親和性、上記のように熱ショックタンパク質結合ペプチドに結合、又は熱ショックタンパク質又はその断片に共有的に結合される
などの熱ショックタンパク質又はその断片により移送される抗原が、限定のない例により、感染性疾患抗原又は腫瘍抗原にて可能である。感染性疾患抗原は、寄生虫、真菌、酵母菌、細菌、マイコプラズマ及びウイルス疾患など、非限定試料によりウイルス、細菌、原生生物、及び寄生的抗原を含む、この場合細胞の特定種(ckass)が、感染性生物を棲家ととしているものとして同定することができる。
例えば限定されない方法として、処理される細胞が、２−３命名されているようにヒトの乳頭腫ウイルス、ヘルペス単純又はヘルペスゼロスターなどのヘルペスウイルス、ヒトの免疫欠陥ウイルス1又は2などのレトロウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸性シンシテイルウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、マイコプラズマ・ニウモニア、遺伝性サルモネラ菌、スタピロコュカス、ストレプトコッカス、エンテロコッカス、クロストリジウム、エスケリチア、クレベシエラ、ビブリオ、マイコバクテリウム等により感染されることがある。プロテスタン抗原が、クルース・トリパノソーマから由来するものなどアメーバ、マラリア、及びトリパノソーマ抗原を含む。パラサイト抗原は、住血吸虫抗原を含む。ガン抗原は、たとえば肉腫、リンパ腫、ガン腫、白血病、及び黒色腫を含み、そして胸部ガン腫、卵巣ガン腫、前立腺ガン腫、頚部ガン腫、結腸ガン腫、肺ガン腫、グリア芽細胞腫、及び星状細胞腫を含むがそれに限定されない例による。
疾患特異的エピトープは、MHC Ligands and Peptide Motifs,by H.G.Rammensee,J.Bachmann and S.Stevanovic,Landes Bioscience,1997;and in Rammensee H,Bachmann J.Emmerich NP,Bachor OA,Stevanovic S.SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptide motifs.Immunogenetics.1999 Nov;50(3-4):213-9より見出すことができる。これらは単なる疾患関連の抗原及びエピトープの単なる例であり、いかなる点においても限定していることを意図していない。
上記のように、特定疾患に対する効果的な予防、又は治療としての免疫化が、複数のエピトープ又は抗原を必要とし、そして本発明は、上記のようなハイブリット・ペプチドを含むペプチドなど複数の抗原のin vitroの調製された非共有結合の複合体、及び1又は複数の熱ショックタンパク質の種、そしてほぼ限定されない例を命名するためhsp70のCD40結合ペプチド断片とペプチドなどの複数の抗原の共有結合の結合体を、上記のようなCD40調節方法と組み合わせて投与するため、疾患の細胞から単離された熱ショックタンパク質など複数のエピトープ又は抗原を含むいずれかの方法又は組成物を包含する。
さらに上記方法は、熱ショックタンパク質の細胞内移送を増大させる目的として、CD40の発現を上限調節するためにin vivoにて処理するために適応することができる。
上記ex vivo及びin vivoの方法は、熱ショックタンパク質、又は熱ショックタンパク質、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトの熱ショックタンパク質を含む複合体と共にCD40の発現を増大させるための組成物又は医薬的組成物を用いて行うことができる。本発明は、CD40発現調節成分及び熱ショックタンパク質成分を含むこうした組成物を包含し、それが、個体から単離された細胞に、又は生体内に投与することができる。
上記方法のいずれかに使用される哺乳動物は、任意の哺乳動物、好ましくは哺乳動物のうちのヒトであるが、家にて飼われた、同伴する(companion)又は家畜としての哺乳動物を限定することなく含むことができる。
少なくとも熱ショックタンパク質及び予め選択された抗原を含む複合体の効果的な免疫応答調節量が、予め選択された抗原又はその免疫原断片、及び熱ショックタンパク質を含む共有結合又は非共有結合の複合体にて可能である。熱ショックタンパク質は、好ましくは好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの、最も好ましくはヒトhsp70であるがそれに限定されるものでない。複合体が熱ショックタンパク質とハイブリットの非共有結合による複合体であり、そのハイブリット抗原が、予め選択された抗原又はその免疫原断片、と熱ショックタンパク質の結合成分との間の共有結合の結合体を含む。熱ショックタンパク質の結合成分が、上の詳細な記載のように、ペプチド又は有機分子にて可能である。
通常抗原に寛容化を誘発するために提供される複合体の量が、それに効果的な免疫応答を誘発するために提供される量より有意に多い。これらの目標を実現するための対応する投与量を容易に決定することができる。予め選択された抗原が、免疫系に寛容性のある抗原が好ましく、それが、自己免疫抗原、移植抗原、アレルゲンなどであるがそれに限定されない。
さらなる観点において、動物の細胞によりCD40発現を増大できる物質(agent)を動物に少なくとも投与することによりin vivoにて動物における細胞により熱ショックタンパク質の摂取を増大するための方法が、提供される。1の非限定例において、物質(agent)が、CD40をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで良い。DNAが、たとえば外因的に供給されるDNAを哺乳動物の細胞に導入するために十分に確立された種々の手段の例としてむき出しにされたDNA又はウイルスベクターを使用して、投与することができる。
誘発でき、又は構成としての発現のためこうしたベクターの構成は、技術的にも周知である。別の非限定例において、抗原が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン又はLPSで良い。転写因子レベル又は活性、そして/又はCD40の発現を特に増大させるため(又は減少させるため、下記を参照)設計された小分子物質(agent)の使用の調節を含む他の方法により、CD40発現の他の手段が、本明細書に十分に包含される。疾患組織又は器官、又は固形腫瘍の近辺に投与することを含む、局部的に又は全体的に本発明の全ての観点のIn vivoにおける方法および例を、行うことができる。
CD40の発現の減少又はCD40に熱ショックタンパク質の結合により熱ショックタンパク質/抗原複合体の摂取の減少
本発明のさらなる観点において、又は細胞により発現されるCD40に熱ショックタンパク質の結合を干渉できる物質(agent)にex vivoに前記細胞を少なくとも暴露することにより、CD40を発現する細胞により、又はCD40を発現するために誘発される細胞により熱ショックタンパク質の摂取を減少するための方法が提供される。物質(agent)が、たとえばCD40に対する抗体又はリガンドなどのCD40の結合相手となることができる。好ましくはリガンドは、CD40Lの可溶な形状などCD40Lを含む。別の例において、リガンドが、熱ショックタンパク質のCD40結合部分にて可能である。
好ましくはこうしたCD40リガンドは、アゴニストでなく、すなわちこれらは、CD40によりシグナルを誘発されない。限定されない例において、CD40とCD40Lのアンタゴニスト・モノクロナール抗体5D12が、Boonら、2002、Toxicology 174:53-65にて記載され、そして in U.S.Patents 5,397,703;5,677,165 and 6,315,998が使用される。他の例において物質(agent)は、CD40アンチセンスオリゴヌクレオチドで可能である。好ましくは、本発明のこの観点として、熱ショックタンパク質のCD40結合部分がシクナルしない。修飾されたCD40Lなどシグナルされない上記物質(agent)の修飾された形状の使用に、使用することができる。
哺乳動物の熱ショックタンパク質又は断片、偽物(mimetics)、及び結合の増強された熱ショックタンパク質及び断片を用いるCD40発現細胞に対する標的分子
本発明のさらなる観点において、CD40を発現するか、CD40に発現するために修飾することができる細胞に、抗原又は薬剤などの生物分子を標的するための方法が、提供される。 1例において、こうした抗原のターゲテングが、熱ショックタンパク質の必要性をバイパスし、熱ショックタンパク質のCD40結合部分、又はCD40と熱ショックタンパク質との間の相互作用を調節できることにより同定される分子を利用することにより抗原を移送し、これは、熱ショックタンパク質がそれ自体の役割がないが、その過程に天然の有効な役割を有する、抗原提示における第一の工程としてCD40と抗原を天然による会合を実現する。
ターゲテングは、特にCD40に結合する生物分子と熱ショックタンパク質の断片との間の結合体又は複合体を利用することにより達成される。こうした結合体は、共有結合又は非共有結合の結合体にて可能であり、そしてCD40の発現細胞に生物分子を効果的に移送するために他の成分を含むことができる。天然の哺乳動物の熱ショックタンパク質の断片として、天然の熱ショックタンパク質の断片とCD40にターゲッテングされる分子との間の好ましくは非共有結合による複合体が、その断片の結合活性を保持する場合、提供される。別の例において、CD40結合熱ショックタンパク質断片と所望するように移送される分子との間の共有結合による複合体が好ましい。好ましくは、その分子が、抗原提示を目的とし所望にて移送される抗原又は免疫原であり、惹起された体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答又はその抗原に免疫応答を減少又はそこに免疫系を寛容化させたとして、そこに付随する免疫応答を惹起する。
好ましい例において、上記方法が、抗原又は免疫原と熱ショックタンパク質のCD40結合断片、より好ましくは多くのhsp70ファミリー群の断片、そして最も好ましくはヒトのhsp70との間の共有結合による結合体を利用する。その断片は、好ましくはhsp70ファミリー群のN-末端ドメイン(ATPアーゼドメイン)から誘導される。その細胞が、CD40の発現を増大させるため、上記ののように修飾される他に誘発することができ、そして熱ショックタンパク質のCD40結合断片と複合化される抗原に細胞を暴露すると共に組み合わせによる発現を増大するためのこうした手段が、本明細書にさらに包含される。
上記のように、熱ショックタンパク質の適切なCD40結合断片、そして特定のhsp70ファミリー群が、ヒトhps70のアミノ酸が約1乃至5からアミノ酸約381に伸長した、N末端又はATP結合(ATPアーゼ)ドメインである。適切であるが単に典型的な分子が、配列番号1に示され、それが44kDaのヒトhsp70の断片で、アミノ酸が約5からアミノ酸約381に伸長し、そして配列番号319であり、それがヒトhsp70のアミノ酸1からアミノ酸381に伸びている。
さらに本発明は、非限定の例により6程度の短い断片を含むCD40に結合するN-ドメインの断片を包含する。さらに本発明は、抗原又は免疫原と哺乳動物の熱ショックタンパク質のCD40結合断片、上記使用のため好ましくはhsp70、より好ましくは哺乳動物のhsp70、そして最も好ましくはヒトhsp70との間の共有結合又は非共有結合の結合体又は複合体を含む組成物、そして特に医薬的組成物を対象としている。その結合体が、カルボジイミド、ホモ2官能基又はヘテロ2官能基剤(Pierce Chemical Co.,Rockford Illinoisにて販売されているものなど)などの化学的架橋剤を用いて、二種類の種を共有結合的に架橋することにより調製することができる。
抗原又は免疫原が、ペプチド又はタンパク質で、そしてペプチド結合のCD40の断片に、所望により干渉リン又はスペーサー配列とリンクすることができる場合、それは、共に直線的(co-lineay)合成により調製することができ(固体ペプチドの合成)、又はポリペプチドの長さに基づいて可能であれば、発現ベクター又は類似の構造体を用いて、単一鎖(又は融合の)のポリペプチドとして結合体を発現することにより、調製することができる。選択肢として、これらは、化学的に結合された(たとえばカルボジイミド)ペプチドにて可能である。
抗原は、CD40結合部位に対してN-末端の位置かC-末端の位置に配置することができ、こうした構造の活性は、その構造体を調製しそして定まった方法にてこれらを評価することにより容易に決定することができる。上記単一鎖ポリペプチドとその変性の変異体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、同様に本明細書に包含される。こうしたポリヌクレオチドが、哺乳動物への投与のため分子の産生を目的として、又はその位置での(in situ)遺伝子治療を目的として結合体を発現すべき細胞を遺伝的に変更させるため治療として利用することができる。
試料により、融合ポリペプチドは、gp100:209-217(210M),(IMDQVPFSVGSGNLLRLTGW;配列番号324)、又はチロシナーゼから:その他の末端で368-376(370D)(YMDGTMSQVGSGNLLRLTGW;配列番号325)から誘導される黒色腫抗原にGSGペプチドリンカーを介し結合される、N-又はC-末端で配列番号１又は配列番号319を含む。配列番号:326,327,328および329が、それぞれHsp70(1-381)-GSG-gp100:209-217(210M);gp100:209-217(210M)-GSG-hsp70(1-381):hsp70(1-381)GSG-チロシナーゼ:368-376(370D);及びチロシナーゼ:368-376(370D)-GSG-hsp70(1-381)を示す。配列番号330は、hsp70(1-381)-GSG-gp100:209-217(210M)-GSG-チロシナーゼ:368-376(370D),単一CD40-結合ドメイン及び2つの黒色腫エピトープを有する組成物を示す。これらは、本明細書に記載される目的として有益な本発明の組成物を単に例示的であるが限定するものでない。
さらに上記哺乳動物熱ショックタンパク質及び断片、特にN-ドメイン及びその断片が、CD40に結合を最適に又は増強するために、アミノ酸及び/又は翻訳後のレベルにて変更可能である。たとえばアミノ酸の置換、挿入、欠失、及び単なる例によりアセチル化、リン酸化、カルバモイル化、糖化など翻訳後の修飾に限定されないがアミノ酸配列における種々の変異化を、増強されたCD40-結合分子を提供するために行うことができる。本発明は、熱ショックタンパク質及びその断片を、増強されたCD40結合活性にてそうした修飾のすべて、及びそうしたCD40結合-増強熱ショックタンパク質及びその断片をコードする変性配列を含む核酸を包含する。さらにペプチド結合ドメインを含むそうした修飾された熱ショックタンパク質が、結合ポケットにおける増大する親和性を有することができる。
さらに上記のようにCD40発現上限調節剤と結合体の両方を含む組成物が、摂取を増強するために本明細書に包含される。カルシウム・イオノホア、サイトカイン、及びLPSなどのこうした上限調節剤が、上に記載される。
CD40を発現する細胞においてシグナリングの誘発
本発明のさらに他の観点において、樹状細胞又は他のCD40発現細胞において、CD40のシグナリングを誘発するための手段が、提供される。本発明の本観点の実際において、哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40結合断片(又は上記のような増強されたCD40結合断片)が、CD40に対するリガンドとして、さらにこうした細胞におけるCD40を介在するシグナリングの開始剤として使用される。こうしたシグナリングが、樹状細胞の熟成を調節するために、他の使用のうちアゴニスト抗CD40抗体により誘発されるものと同様の方法にて、免疫応答の発生を高めるために使用することができる。免疫応答を高めるために、又は特定の条件下寛容性を誘発するため他のワクチン又は免疫原と組み合わせて使用することができる。加えて熱ショックタンパク質又はその断片が、CD40を発現する細胞によりCD40と相互作用できること、及びサイトカインの産生を誘発できることが、本発明の他の有益な観点である。配列番号1と319が、こうした組成物の限定されない例である。
上記目的のために本明細書に包含される分子では、哺乳動物のhsp70ファミリー群などの無傷の熱ショックタンパク質、好ましくは哺乳動物のhsp70、より好ましくはヒトhsp70ファミリー群、そして最も好ましくはヒトhsp70が含まれる。選択肢として、哺乳動物hsp70ファミリー群の断片、より好ましくはヒトhsp70ファミリー群の断片、そして最も好ましくはヒトhsp70の断片などの熱ショックタンパク質のCD40シグナリング断片を、使用することができる。断片がCD40シグナリングを誘発できることが、in vitroにおいて容易に
決定される。好ましくは、その断片が、ATP-結合(ATPアーゼ)ドメインのN-末端から誘導され、そしてより好ましくはhsp70のアミノ酸約5からアミノ酸約381まで誘導される。最も好ましくは、その断片は、hsp70のN-末端ドメインの上記断片の1部分である。実施例では、配列番号1と319を含む。
熱ショックタンパク質の擬態物(mimetics)の同定
本発明の他の観点において、哺乳動物の熱ショックタンパク質のN-ドメインとCD40の細胞外形質ドメインの間の相互作用が、多くの用途を有する熱ショックタンパク質の新しい擬態物(mimetics)を同定するために、都合良く使用することができ、アジュバント特性を有すると共にCD40を発現する細胞又はCD40を発現するため修飾できる細胞に、抗原及び生物分子を向けるため有益な新しいCD40へのターゲテング剤であることを含むがそれに限定されない。そのため哺乳動物の熱ショックタンパク質70特にそのN-ドメイン、とCD40の細胞外形質ドメインの間における予期せぬ相互作用を利用するスクリーニング方法が、相互作用を促進又は阻害する化合物又は物質(agents)を同定するためのいずれかの形状にて使用でき、そのため、化合物、好ましくは小分子化合物を同定に使用するためであるがそれに限定されなく、たとえば、抗原又は免疫原に結合される場合にCD40への結合及び摂取を促進し又はCD40で介在される前記シグナリングを誘発し、免疫応答を誘発し又は対照的に免役応答を下限調節する目的として、CD40を発現する細胞により、熱ショックタンパク質及びそこに結合されるいずれかの抗原の摂取を阻害し、CD40のシクナリングを廃止するターゲッテング物質（agent）として有益となる。 本発明は、上記方法及び上記化合物を包含する。
スクリーンは、天然のCD40(配列番号323)、及びhsp70(配列番号1)又は相互作用する領域を含むいずれかの断片を用いることができる。CD40の断片は、アミノ酸約20から、アミノ酸212まで伸張したポリペプチドの部分、そして好ましくはアミノ酸約20から、アミノ酸212まで伸張したポリペプチドの部分のCD40の細胞外形質ドメインを含む。スクリーンが、天然の哺乳動物のhsp70のファミリー群、好ましくはヒトhsp70ファミリー群、より好ましくはヒトhsp70ファミリー群、及び最も好ましくはヒトhsp70、又は上記いずれかのCD40結合断片、好ましくはN-末端又はATP-結合(ATPアーゼ)ドメイン、より好ましくはヒトhsp70のアミノ酸約5から、アミノ酸約381のポリペプチド、最も好ましくはヒトhsp70のアミノ酸約5から、アミノ酸約381のポリペプチド(配列番号1)により行うことができる。親和性を保持するいずれかの有意に小さい断片を使用できる。何れ又は両方の群は、単離又は結合の同定を容易にするために標識(tag)を有する融合ポリペプチド又は構成体として、又はhsp70とCD40の間の相互作用を、促進又は阻害する化合物を検出するための他のいずれかの形成(format)部分として発現することができる。
上記のように、熱ショックタンパク質のCD40結合断片、及び少なくとも1の免疫原ペプチド又は抗原を含むポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び細菌又は真核細胞において発現するための配列を含むベクターが、哺乳動物に投与するため上記組成物のin vitroにおける調製、又は本発明のその他の例において、治療目的にて投与するため、共に有益である。配列番号326-330の何れかをコードするDNAなど、上記組成物をコードする従って剥き出しのDNA、又はベクターが、免疫応答を惹起する目的のため、黒色腫の治療を必要とする哺乳動物の患者に投与することができる。従って、本発明は、熱ショックタンパク質のCD40結合断片と免疫原との間の接合体をコードするこうしたポリヌクレオチド配列、及び免疫応答又は疾患の治療を誘発するための方法を包含する。
ヒトhsp70のアミノ酸1-381のアミノ酸配列(配列番号319)、及びヒトのアミノ酸5-381のアミノ酸配列(配列番号1)は、ヒトの全長熱ショックタンパク質の種々の遺伝子多型及び変異配列を単に例示的であり、そして本明細書記載では、ヒトの集団のこうした変動を包含する。さらにアミノ酸20から212に伸張するCD40の断片(配列番号318)がさらに集団の中の配列において遺伝子多型及び他の変動を包含し、そして本発明のこの観点が、こうした変動分子を十分に包含する。
本発明は、以下の実施例により理解することができ、それは本発明の特定の観点を単に図示するもので、限定するものではない。
材料及び方法
プラスミド及びタンパク質の調製。ヒトHsp70にて、そのN-末端(N70)及びC-末端(C70)ドメイン、Hip,及びBag-1が、His-taggedタンパク質として発現され、そして精製される(Scheuflerら、2000,Cell 101,199-210)(Sondermannら、2000,Biol Chem 381,1165-74;Hoheldら、1995,Cell 83,589-98)。マイコバクテリアル hsp70相同性DnaKが、記載のように発現された(Szaboら、1994,Proc Natl Acad Sci USA 91,10345-9)。ウマのグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を、SIGMA(Germany)から購入した。ビオチン化した組み換えHsp70及びウマのGSTを、FluoReporter Biotin XX Protein Labeling Kit(Molecular Probes)にて標識化して調製した。ヒトCD40のcDNAを、ヒトの一次マクロファージcDNAライブラリー(Invitrogen)から、PCRにより増幅され、そしてpcDNA3.1/Zeo及びpIRES2-EGFPベクター(Invitrogen)に挿入した。
CD40の細胞外形質ドメインとしてのcDNA(アミノ酸20-212；配列番号318)を、上記のヒトCD40のｃDNAからPCRにより増幅し、そしてpGEX-2Tベクター(Amersham Pharmacia)に挿入した。GST及びGST-CD40融合タンパク質を、グルタチオン親和性クロマトグラフィ(Glutathione Sepharose 4 Fast Flow,Amersham Pharmacia)により精製した。ペプチドC(GCEVFGLGWRSYKH:配列番号320)、ビオチン化ペプチドC(ビオチン-GCEVFGLGWRSYKH;配列番号322)及びペプチドC-FITC(FITC-GCEVFGLGWRSYKH;配列番号322)を、R.Piepkorn(Deutsches Krebsforschungs Zentrum,Heidelberg)により慣習的に合成された。
Hsp70/ペプチド複合体の形成のため、Hsp70を、5倍過剰なペプチドC,ビオチン化ペプチドC、又はペプチドC-FITCに、37℃にて30分間、結合緩衝液(10mMのMOPS/KOH,pH7.2,150mMのKCl,2mMのADP及び3mMのMgCl2)にてインキュベートした。結合されない過剰なペプチドC-ビオチンを、Sephadex G-50(Amershan Pharmacia)でのゲルろ過法により除去した。ストレプトアビジン-パーオキシダーゼ結合体(Molecular Probes)を用いてELISAによりHsp70複合体生成物の定量では、収率が20-30%を示した。
集塊物を除去するため、実験を行う前に全てのタンパク質を、100,000gにて、1時間遠心分離した。
細胞培養及び蛍光顕微鏡。ネズミ(murine)のマクロファージ細胞株ANA1が、H.Wagner(Munich,Germany)により親切にも提供してもらう。ANA-1細胞株を、10%のFCS,2Mmlのグルタミン及び抗体を補充し、VLE-RPMI 1640(Biochrom)にて培養した。蛍光顕微鏡に対し、ANA1の細胞は、LPS(20μg/ml,Sigma,Germany)にて刺激されるか、LPS遊離媒体(mock処理)に7時間保持するかいずれかであった。刺激した後細胞を採集し、100nMのビオチン化したHsp70,ビオチン化したGST,又はHsp/ペプチドC-ビオチン複合体にて、VLE-RPMI 1640にて0℃で30分間インキュウベートした。インキュベートした細胞を、ストレプトアビジン-TRITC(Sigma,Germany)にて染色するため処理し、パラホルムアルデヒドで固定し、記載のように(Sondermannら、2000)蛍光顕微鏡(Axiovert 35,Zeiss)により分析した。Cos-7細胞を、10%のFCS,2mMのL-グルタミン及び抗生物質(Biochrom)にて補充し、DMEMにて培養し、24ウエル-プレートのカバースリット上にて増殖させ、そして燐酸カルシウム法(Chen及びOkayama,1987)によりヒトCD40ｃDNAにて一過性にトランスフェクトした(pIRES2-EGFPベクター(Invitrogen;実施例3を参照))に挿入)。
トランスフェクション24時間後の細胞を、250nMのビオチン化Hsp70、ビオチン化GST又はHsp70/ペプチドC-ビオチン複合体にてDMEMにて、0℃で30分間インキュウベートし、固定し、ストレプトアビジン-TRITC(Sigma,Germany)にて染色し、そして記載のように(Sondermannら、2000,idem)蛍光顕微鏡により分析した。HEK293T細胞を、コラーゲンで被覆した皿、又はカバースリップで増殖し、そしてDMEMに培養し、10%のFCS,2mMのL-グルタミン及び抗生物質にて補充される。HEK293T細胞を、CD40ｃDNAにて安定にトランスフェクト(Chen and Okayama,1987,Mol Cell Biol 7,2745-52)され、pcDNA3.1/ZEO(Invitrogen)にクローン化され、そしてZeocin(Invitrogen)にて選択された。安定にトランスフェクトされた細胞株を、抗-CD40抗体(CSA180,Stressgen)を用いてCD40発現のための免疫ブロッテングにより分析した。pcDNA3.1/Zroベクターにクローン化されるネズミの正イオンのアミノ酸移送物質(MCAT)を発現するHEK293T-MCAT細胞が、W.Nickel(Heidelberg,Germany)により親切にも提供された。S-Hela細胞を、8%FCS,L-グルタミン及び抗生物質にて補充される、α-MEMにて培養し、そしてスピナーフラスコにて増殖した。
Hsp70/ペプチドC-FITC複合体の摂取を研究するための実験として、HEK293T-CD40及びHEK293T-MCAT細胞を、実験前にコラーゲン被覆カバースリップ上に種付けした。Hsp70の複合体形成として、そのN-末端ドメイン(N70)又はそのC-末端ドメイン(C70)を、ビオチン化タンパク質のため上記のように、10倍モル過剰なペプチドC-FITCにて、37℃にて30分間前インキュウベートした。HEK293T-CD40及びHEK293T-MCATを、2mMのADP及び5μMのペプチドC-FITC,又は5μMのペプチドC-FITCだけを、氷上30分間前インキュベートし、5μMのHsp70,N70又はC70にてインキュベートした。その後その細胞を、培養液にて3回洗浄し、37℃にて30分間培養し、そして固定し、フルオロマウント-Gに埋め込みそしてコンフォカル顕微鏡(LSM510,Zeiss)により分析した。
CD40の発現の分析：免疫ブロット分析として、上記のようにANA1細胞が、LPSにて刺激される又はモック処理(mock treated)され、プロテアーゼ阻害剤(Complete,EDTA free,Roche)の存在下で、繰り返し通路に針を通して(0.4-0.8mm,Braun)溶離され、そして遠心分離機により。100,000g,4℃にて1時間分画された。ペレットを、0.1%Triton X-100/PBSに再懸濁し、そしてタンパク質濃度を、Bradford assay(Biorad)により全溶離体、上澄み及びペレット画分を決定した。タンパク質の等量を、SDS-PAGEにかけそして抗CD40抗体(CSA180,Stressgen)で免疫ブロッテングで分析した。
GST-CD40による結合アッセイ：Hela細胞溶離物から内因性Hsp70およびHsc70を結合するため、Hela細胞を上記のように胞溶し、そして100,000gで4℃にて1時間遠心分離した。試料あたり20μlのベット量(bed volume)のGlutathione Sepharose 4 Fast Flose(Amersham Pharmacia)を、50μ結合緩衝液に80pmol又は400pmolのGST又はGST-CD40融合タンパク質にて前インキュウベートした。結合されないタンパク質を、PBSで3回洗浄することにより除去する。ビーズは、非特異的結合を避けるため1%のBSA/PBSにて処理され、その後2mMのDDTの存在下で150μlのHela細胞にて、16℃にて20分間インキュベートした。固定されたタンパク質を、1mlのPBSにて3回洗浄し、そして20μ溶離緩衝液(50mMのTris/HCl,pH8.0,10mMの還元グルタチオン)にて37℃で10分間溶離した。10μlの溶離物を、SDS-PAGEにかけ、そして抗Hsc/Hsp70抗体及び抗Hsp90抗体(SPA822 and SPA835,Stressgen)を用いて、免役ブロッチングすることにより分析した。
組み換え型Hsp70及びそのドメインによる結合アッセイに対し、3μMのHis6-Hsp70又はそのHis6のtaggedドメインを、2MのATP,2MのADP又は、及び28μMのペプチドC で、50μ結合緩衝液(10mMのMOPS/KOH,pH7.2,150mMのKCl,及び3mMのMgCl2)にて37℃で30分間インキュウベートした。競合実験において、結合には、10倍過剰なHsp70,の2のドメインにて、又はDnaK,か5倍過剰なHip又はBag1のいずれかで、0℃で10分間プローブ化した。この目的のため、Hsp70,N70,C70及びDnakを、上記のようにADP,ATP及びペプチドCにて前インキュベートした。Hsp70とそのN末端ドメインとを結合するCD40の比較のため、Hsp70を30倍過剰なペプチドCの存在又は非存在(モック処理)にて前インキュベートした。
3μMのGST又はGST-CD40をその試料に加え、16℃にて20分間インキュベートした。ペプチドCの滴定のため、5乃至50倍過剰のペプチドC(15-150μM)を、Hsp70の前インキュベーションに加えた。その後試料を20μの1%BSA-処理glutathione Sepharose 4 Fast Flowと組み合わせて、そして2mMのDDTの存在下さらに16℃にて20分間インキュベートした。結合されないタンパク質を、1mlのPBSにて3回ビーズを洗浄することにより除去し、そして固定されたタンパク質を、30μlの溶離緩衝液にて22℃にて20分間溶離した。10μlの溶離物を、SDS-PAGEにかけて、Penta-His抗体(quiagen)を用いて免役ブロッテングにより分析した。BlotシグナルをQuantitity One(Biorad)により定量した。
His6で標識化したHsp70とNi-NTAアガロースによる結合アッセイ；ANA1-細胞が上記のようなLPSにより刺激され、溶離緩衝液にて(150mMのTris/HCl,ph7.5,1%CHAPS)4℃にて45分間溶離した。細胞溶離物を、4℃にて15分100,000gで遠心分離した。500μの上澄み液を、10μgのHis6にて標識化されたHsp70にてインキュベートし、ADP及び30倍過剰なペプチドC、又はビオチン化タンパク質として上記のように処理されたモック(mock treated)により4℃にて30分間前インキュベートした。その後その試料を、20μの1%BSAにて処理されたNi-NTA-アガロース(Quiagen)に加え、そして4℃にて30分間前インキュベートした。結合されないタンパク質を、1mlの溶離緩衝液にて3回ビーズを洗浄することにより除去し、そして固定化したタンパク質を、95℃にて5分間インキュベートすることにより、10μのSDS-PAGE-試料緩衝液にて溶離した。溶離物を抗-CD40抗体(CSA-180,Stressgen)を用い、免疫ブロッテングすることにより分析した。
P38Kinaseアッセイ：P38キナーゼアッセイの24時間前に、HEK293T-CD40
及びHEK293-MCAT細胞を、コラーゲンにて被覆された24-ウエル・プレートに植え付けし、そして100nMのCD40L(Alexis)HSP70,N70-ドメイン、C70-ドメイン、又はDnaKにて、37℃にて20分間インキュベートした。DnaK,Hsp70,N70及びC70を、2mMのADP及び30μMのペプチドCか40μMのAMPPNP(Sigma)のいずかにより前インキュベートした。細胞を刺激下にて、氷冷のPBSにて2回洗浄し、そしてSDS試料緩衝液にて溶離した。等量のタンパク質を、燐酸化されたP38(Promega)に対し向けられた抗体にて、及びモノクロナール抗ツブリン抗体(J.Wehland,Braunschweig,Germany)にて免疫ブロッテングすることにより分析した。
ANA-1細胞に(Sondermannら、2001,Science 291,1553-7)ヒトHsp70を結合するための基礎となる分子を決定するために、細胞を、ADPの存在下ビオチン化HSP70か、ビオチン化したペプチドC(GCEVFGLGWRSYKH;配列番号320;flynnら、Science 245,385-90)にて負荷されたHsp70のいずれかにインキュベートした。結合されたタンパク質が、蛍光ストレプトアビジン(実施例1を参照)と反応後、蛍光顕微鏡により検出された、刺激されない細胞が、Hsp70とHsp70-ペプチド複合体の両方と明確であるが弱い検出可能な結合を示したが、一方コントロールタンパク質(図1A、パネル上部)としてビオチンにて標識化したグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)にて結合が、全く観察されない。対照的にLPS-の刺激による、Hsp70とHsp70ペプチドとの結合の有意な増大するようになったが、GSTからはならなかった(図１A低部パネル)。
図1の詳細にて、ANA1細胞のリポ多糖(LPS)の治療が、Hsp70の結合を刺激し、そしてCD40の発現を誘発する。細胞を、実施例1.AのアウトラインとしてLPS又は処理されたモック(mock)にてインキュベートした。細胞を、ビオチン化Hsp70,ビオチン化ペプチドCにて負荷されたHsp70,又はコントロールとしてビオチン化GSTのいずれかをインキュベートした。4℃30分後、細胞を洗浄しTRITCにて標識化したストレプトアビジンにてインキュベートし、再度洗浄し、蛍光顕微鏡のための処理をした。
パネル上部：モック処理したANA1細胞、パネル下側：LPSにて処理した後のANA1。注記することは、ペプチドCが単一のビオチンを含むため、注意Hsp70が平均5のビオチンを移送することである。B.細胞を採集し、溶離し、遠心分離にかけて全膜ペレットが得られた。試料の同定タンパク質量を、CD40に向けられた抗体を免役ブロッチングすることにより分析した。レーン1及び４：総細胞溶離物、レーン2及び5：膜画分、レーン3及び6:上澄み物。
モック(Mock)処理及びLPS-刺激ANA-1細胞を、CD40のこれらの発現を分析した。図１Bに示すように、LPS刺激細胞であるが、コントロール細胞でなく、免役ブロッチング(Toneら、2001,Proc Natl Acad Sci USA 98,1751-6)により検出されるように、高レベルの膜結合のCD40を発現する。CD40が実質的にHsp70受容体として利用できる可能性を評価するために、Cd40を発現しないCos-7細胞を、ヒトCD40のcDNAを、次に内部リボソーム侵入部位、そしてEGFPに対するcDNA含むcDNA構造にてトランスフェクトした。チョランスフェクトされた細胞が、これらGFPの蛍光性によって同定され、そしてビオチンで標識化されたHsp70
又はHsp70-ビオチン-ペプチド複合体を結合できることを分析した(図2)。
実際に、Hsp70及びそのペプチド複合体は、トランスフェクトされた細胞の表面に結合されるが、トランスフェクトされない細胞に結合されないが、それに反し上記バックグラウンドの結合が、ビオチン化GST又はビオチン化ペプチドしか検出されなかった(図2)。
図２の詳細について、ヒトのCD40-cDNAでのトランスフェクションにより、Cos-7細胞にヒトHsp70結合の活性が与えられる。Cos-7細胞が、ヒトCD40-cDNAを、つぎに内因性リボソーム侵入部位、及びEGFPに対するcDNAを含む融合構造にて一過性にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞から緑色の蛍光を発光する。次ぎに細胞を、ビオチン化Hsp70(A)、コントロール(B)としてビオチン化GST,ビオチン化ペプチドC(C)を含むHsp70-ペプチド複合体又はビオチン化ペプチドCだけ(D)により、0℃30分間インキュベートした。その後細胞を洗浄しTRITC-ストレプトアビジンにてインキュベートし、そして図1に記載のように蛍光顕微鏡のために処理した。左手のパネルが、ストレプトアビジン-蛍光を示し、右手パネルがEGFP-蛍光を示す。
結合の実験が、CD40とHsp70とが直接に相互作用するかどうかを決定するため、in vitroにて行はれた。この目的のため、ヒトCD40の細胞外形質(アミノ酸残基20-212)ドメインが、大腸菌(E.coli)において可溶性GST-融合タンパク質として発現され、そしてHela細胞の溶離体の熱ショックタンパク質とその相互作用を研究するために用いられる。GST-CD40の増大量を、溶離体を伴いインキュウベートし、そして結合されたタンパク質を、glutathion-Sepharodeに吸着し、次ぎに、Hsc70,Hsp70及びHsp90に対して向けられた抗体により免疫ブロッテングする。図3に示されるように、濃度依存方法におけるGST-CD40に結合されたHsc70とHsp70が相互作用するが、一方でHsp90が相互作用しない。あとに示されるように、CD40とHsp70の相互作用は、ADPの存在において促進される。負のコントロールとして使用されるGSTのみは、Hsc70/Hsp70を結合しなかった。これらの実験は、哺乳動物のHsp70ファミリー群とCD40の直接及び特異的相互作用を実証している。
ヒトHsp70が、そのATPアーゼのドメインを介して結合する。次ぎに発明者が、CD40-Hsp70の複合体の形成のための生物化学的要件を研究した。特に発明者が、Hsp70が、そのC-末端基質結合ドメインを介しCD40に結合するか、N-末端ヌクレオチド結合ドメインを介し
CD40に結合するかどうかの問題に取り組んでいた。この内容において、その関連性が、Hsp70の特異的ヌクレオチドの結合状態に依存したかどうかに関心があった。組み換え型Hsp70を、基質ペプチドの有する場合と、有しない場合にて、ADP又はATPの存在下にGST-CD40を伴いインキュベートした(図３B)。CD40に結合するHsp70は、ATPの存在下わずかに検出することができ、ADPの存在下しか見られなかった。注意することは、Hs70より過剰モルのペプチドCの付加は、C末端Hsp70ドメインが、Hsp70をCD40に結合する媒体である場合に想定されるような、相互作用と競合しなかった。GSTだけがコントロールとして分析される場合、背景シグナルだけが観察された。さらに、組み換え型としてHis標識化Hsp70は、Ni-NTAアガロースに複合体を吸着させることにより、そしてCD40抗体と免疫ブロッテングにより検出されるように、LPSにて刺激されたANA1-細胞の抽出物内因性CD40を伴い、ADP依存方法において相互作用した(図3C)。特にこれらの結果を併せてHsp70がそのATPアーゼ・ドメインを介してCD40に結合することを示唆
図3に対する詳細：CD40に対するHsp70の結合が、ADPを対象とし、そしてADPに依存する。A.Hela細胞溶離体を、指示された量にてGST(コントロール)又はGST-CD40を伴いインキュベートした。その後試料を、実験方法のアウトラインとしてグルタチオン・セファローズ(glutathione-Sepfarose)上にて親和性により精製され、SDS-PAGEにかけられ、そしてHsc70とHsp70に対し(上部レーン)、及びHsp90に対し(下部レーン）に対して指示される抗体にて免疫ブロッテングにより分析される。B.ヒト組み換え型His6の標識によるHsp70を、ATP,ADP,又は過剰なペプチドCを伴いインキュベートし、その後GTS-CD$又はGSTだけを付加することによりインキュベートした。親和性による精製の後試料を、His6標識に対し指示される抗体を用いて、A.に記載されたように免疫ブロッテング分析した。C.組み換え型ヒトHis6-標識Hsp70を、ADPが存在するかしないかのいずれかにて、ペプチドCを伴いインキュベートした。次ぎにその反応が、実験方法に記載にようにANA1-細胞溶離体を伴いインキュベートした。Hsp70に結合されるタンパク質が、Ni-NTA-アガロース上にて親和性精製により、そしてCD40に対して指示される抗体による免疫ブロッテングにより分析した。
細菌のHsp70相同のDnaKが、C末端のペプチドプ結合ドメイン(Wangら、20001,Immunity 15,971-83)を介すCD40と関連する最近の知見にて照らして、実験を行い、ヒトHsp70のドメインに対し特異的なCD40を直接に決定する。組み換え型の全長のHsp70を、ADPの存在下、そして組み換え型Hsp70のN-末端ドメイン(残基5-381)(Sondermannら、2001,idem)又はC-末端ドメイン(残基382-641)(Scheuflerら、2000,Cell 101,199-210)、又は込み変え型の全長DnaKのいずれかを、5倍モル過剰にしてインキュベートした。Hsp70のN末端ドメイン(N70)が、組み替え型Hsp70(図4A)上N末端6His-tagに対する抗体により検出されるように、CD40に全長Hsp70を結合するため効果的に競合した。ATPアーゼドメイン自体、ADPに存在するが、ATPに存在しない(図4B)CD40に結合した。
対照的に、C末端Hsp70ドメイン(C70)もDnaKも、結合に有意に影響を及ぼさない(図4Aを参照)。この条件下にDnaKがCD40に直接結合するかどうか分析するために、プルダウン実験を、DnaKにて行った。図4Bに示すように、DnaKが実際にCd40に結合し、そしてATPと比較する場合に、この相互作用がAdPの存在下に増強される。これは、Hsp70とDnsKが、CD40の異なる部位に結合すことを確立し、そしてDnaKが、最初に記載されているようにそのC末端ドメインを介し結合することを確認した。この結合が、CD40との相互作用を介在するDnaKの基質結合部位であることを、強く示唆する。
この可能性を求めるため、競合実験が、過剰なペプチドCを伴い行われた。図4Bに示すように、10倍過剰なペプチドCが、CD40にDnaKの結合を完全に廃止した。従って、それは、哺乳動物の熱ショックタンパク質のATP結合ドメイン(ATPアーゼドメイン)と対照的に、CD40に相互作用するDnaKの基質結合部位である。要約すると、その細胞抽出物中の内在性タンパク質に、そしてvitroにおける組み換え型タンパク質にて示されるように、Hsp70は、ADPに依存しそしてそのATPアーゼ・ドメインを介しCD40と相互作用する。対照的にDnaKは、その基質に結合する適切な部位を介しCD40に結合する。
図４の詳細：Cd40に結合するHsp70は、N-末端ATPアーゼドメインにより介在され、そしてHipにより競合される。A.ヒトHis6-標識化Hsp70、そのN-又はC-末端ドメイン又は組み替え型細菌Dnakを、GST-CD40又はGSTのいずれかを伴いインキュベートした。B.組み換え型DnaKが、ATP,ADP又は過剰なペプチドCを伴い、その後GST-CD40又はGSTだけを付加しインキュベートした。C. Hsp70(N70)のHis6による標識化したN-末端ドメインを、ATP又はADPの存在下インキュベートし、その後ADP又はATPの存在下10倍モル過剰なHsp70によりインキュベートした。D:組み換え型His6-標識Hsp70タンパク質を、組み換え型Hipタンパク質又はBag-1のいずれかの5倍モル過剰にて、次にコントロールとしてGST-CD40かGSTを伴いインキュベートした。N-末端His6−標識に対し向けられた抗体、又はDnaKに対し向けられた抗体による免役ブロッテングによりglutathione-Sepharose上にて親和性により精製した後、結合タンパク質を分析した。
CD40に結合するHsp70は、Hsp70共シャペロンHipにより競合され、そしてペプチド基質により増強される。Hsp70のN-末端ドメインが、調節共シャペロン及びBag-1との相互作用するために良く知られている。Hipは、基質をしっかり結合する(Hohfeldら、1995,ibid)Hsp70のADP状態を安定にするが、Bag-1は、ADP-ATPの交換因子として機能し、そして基質をHsp70からの放出を起こす(Hohfeld and Jentsch,1997,EMBO J 16,6209;Sondermannら、2001、idem)。観察された-依存性と照らして、Hsp70に結合するCD40が、HipとHsp70との間の相互作用による共通した特定の特徴を有する。CD40へのHsp70の結合は、Hsp70より5倍モル過剰な組み換え型Hip又はBag-1の存在下にて分析した(図4D)。Hipは、Bag-1と対照的に相互作用の有効な競合剤として作用し、それは、Hsp70のADP-ステイト(Hohfeld,1998,Biol Chem 379,269-74;Sondemannら、2001,idem)と比較的わずかに弱く相互作用する。従って、CD40とHipは、Hsp70のATPアーゼドメインの類似する結合領域を共有することができる。
基質に結合されるADP状態(Hohfeldら、1995,idem)におけるHsp70を安定にする際、Hipの周知の共シャペロンの機能は、CD40とHsp70との間の相互作用が、ADPで調節されるばかりかHsp70の基質にも依存するという興味ある可能性が高まっている。Hsp70-ADPのCD40への顕著に結合すると、ペプチドCの存在下劇的に増大した(図5A及びB)。ペプチドのHsp70に対するペプチドCの親和性に相当する範囲において(5-10μM、Greeneら、1995,J Biol Chem 270,2967-73)、飽和できることである(Ka〜30μM)。これらの結果により、CD40により好ましく認識されるペプチド及びADPとHsp70の結合状態であることが実証され、そして類似するHipに対するCD40の結合状態が、Hsp70と基質複合体を安定にする共シャペロン様調節機能を有するを示唆している。この効果は、ペプチドと複合体である場合、CD40が有意にHsp70を結合することを保証するであろう。
図5の詳細：ペプチド基質がCD40に結合するHsp70を刺激する。A.His6にて標識化したHsp70が、図に示されるようにペプチドCの濃度を増大させながらインキュベートし、そしてHis6の標識に向けられる抗体を伴う免疫ブロッテングにより分析されるGST-CD40に結合した。パネルの下部分は、定量置のデータである。B.等濃度(3μM)のHis6にて標識化されたHsp70(30倍モル過剰なペプチドCの存在)又はHis6にて標識化されたN70を、GST-CD40を伴いインキュベートし、そして結合タンパク質を上記のように分析した。
ペプチド基質の存在下に観察されるADP-付加Hsp70のCD40結合の顕著な増大が、Hsp70の遊離C-末端ドメインが、ATPアーゼドメイン上に阻害効果を有し、CD40を認識する後者の能力を減少するかどうかという問題を提起した。この可能性が、基質に飽和されるHsp70の結合効率とN-末端ドメインの結合効率とを、両方のこれらのADP状態において比較することにより検討された。図5Cに示すように、基質と付加されるHsp70、及びN末端ドメインが、同様の効率にてCD40に結合し、ペプツドとHsp70の遊離C-末端ドメインが、直接又はアロステックな立体構造変化を引き起こすことによるかのいずれかで、CD40に結合するためのN-ドメインをマスクする。
CD40にHso70-ペプチド複合体を結合により、細胞内のシグナリング及びペプチドを摂取することになる。CD40にCD40リガンドを結合させると、活性化CD40とNF-κBとの間のシグナル・カスケードの成分で、結局はTNF-αを放出し、その後インターフェロン-γを分泌する(Pullenら、1999)、p38のリン酸化を介しシグナルの形質導入を誘発する。CD40にDnaKのC-末端ドメインを結合することが、同様の影響(Wangら、1999,idem)を有すると記載されている。
そのため発明者が、さらにCD40にヒトHsp70-ペプチド複合体を結合することにより、このシグナリング経路を刺激するかどうかを研究した。これらの実験を、ヒトCD40にて安定にトランスフェクトされるHEK293T細胞にて行こなった。ADP又は非加水分解性ATP類似物としてAMPPNPの存在下、Hsp70-ペプチド複合体、組み換え型Hsp70ドメイン、又はDnaKのいずれかにより、インキュベートした後、細胞を溶離し、そしてその溶離物を、活性化(すなわちリン酸化)したP38に向けられた抗体により免疫ブロッテングすることにより分析した。
実際にヒトHsp70及びそのATPアーゼドメインは、DnaKにて観察された(図6A、パネルの上部)物と比較できる程度にて、リン酸化されたp38の増大が起こる。控えめに考えるが、Cd40リガンドの等モル濃度により誘発されるシグナルと比較した場合、Hsp70によるp38の活性化が重要で、そしてADPの存在に依存した。関連性のない膜タンパク質(ネズミ(murine)正荷アミノ酸移送物質、MCAT)に対するcDNAを含むこと以外、同じベクターにて安定にトランスフェクトされるコントロールとしてのHEK293T細胞が、種々の刺激に種々の刺激に検出可能に応答することを示していない。従って後者が、そのC末端ドメインを介してCD40に結合(Wangら、2001,idem)するが、Hsp70-ペプチド複合体及びHsp70のATPアーゼドメインが、ADPの存在によりCD40を介したシグナリングを、そしてDnaKの効果に比較できる方法にて活性化する、
次ぎに、Hsp70-ペプチドをCD40に結合することが研究され、それが、ペプチドの摂取となる。この目的のために、HEK293T-CD40細胞及びHE293T-MCAT細胞(CD40を発現しない)を、ペプチドCの蛍光(FITC)誘導体にて、ADPの存在下で、Hsp又はその２つのドメインの有する場合と有しない場合にて、0℃で30分間インキュベートした。過剰な物質を除去した後、細胞を37℃にて15分間インキュベートし、固定し、その後蛍光顕微鏡により分析した。典型的な画面を、図6Bに提示し、37℃にて15分間インキュベートした後、蛍光ペプチドが、CD40を発現する細胞にのみ中断された細胞内構造にのみ、そしてHsp70が、結合するため0℃でインキュベーション中に存在する時のみに観察された(図6B、パネル1)。
Hsp70が除外された時(図6B、パネル2) 、上のバックグランドの染色が検出されなかった。さらには、組み換え型C70かN70のいずれかにより、HEK293T-CD40細胞、及びペプチドのインキュベーションが、上の背景のペプチド・シグナルを生じない(図6B、パネル3及び4)。HEK293T-MCATコントロールが、試験されたいずれかに基づいてシグナルを生じない(示されない)。Hsp70-ペプチド複合体とCD40の特異的相互作用が、ペプチドの摂取を介在することを、発明者が決定した。
図６の詳細：CD40-発現HEK293T細胞にHsp70複合体を結合すると、p38を介してシグナリングが誘発され、そしてペプチドの摂取を引き起こす。ヒトCD40をコードするcDNA、又は非関連膜タンパク質ムリン正イオンアミノ酸転移物質(MCAT)にて安定にトランスヘクトされえるA.HEK293T-細胞が、ADP又はAMPPNP,又は緩衝液だけ、のいずれか存在したCD40L又はHsp70、C70、N70,細菌DnaKを伴い、37℃にて20分間インキュベートした。その後細胞を洗浄し、SDS-試料緩衝液に溶離し、そしてリン酸化した(活性化した)p38に向けられた抗体を用い免役ブロッテングにより分析した。
さらに等量の負荷を制御するため、ツブリンに対し向けられた抗体により、ブロットをを生成した。B.細胞を、FITCによる標識化ペプチドの全て存在下、組み換え型ヒトHsp70,N70又はC70を伴い、又は FITCによる標識化ペプチドだけにより、0℃にて30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、37℃にて15分間インキュベートし、そして蛍光顕微鏡用に処理した。上部左側パネル：Hsp70,上部右側パネル：FITC-標識化ペプチドだけ、下部左側パネル：C70,下部右側パネル：N70である。CD40にて安定にトランスフェクトされた細胞だけを示している。細胞の境界が、破線にて強調されている。MCAT-発現コントロール細胞は、上の背景蛍光を示していない。
ヒトCD40-IRES-EGFPの構成
CD40全長cDNAを、PCRによりクローン化した。RNA資源(Invitrogen)としてヒトのマクロファージによる予め作成されたcDNAライブラリーを、PCRの鋳型として使用される。PCR作成物を、5’-Nhelと3’-Xhol制限部位にて作成された。PCR生成物を、pcDNA3.1ベクター(Invitrogen)に配列決定するため、そしてpIRES2-EGFPベクター(Clontech)に哺乳動物の発現研究のためクローニングした。図8がpIRES2-EGFPベクター情報を示す。
全体にわたり引用される全ての資料が、これらの内容を引用により本明細書に組み入れられる。
図１のＡ乃至Ｂは、ANA1-細胞をリポ多糖類(LPS)にて処理すると、Hsp70の結合を刺激すると共に、CD40の発現を誘発するを示している。
図２のＡ乃至Ｄは、ヒトCD40-cDNAにてトランスフェクトすると、ヒトHsp70の結合にCOS-7細胞の活性を与えることを示している。
図３のＡ乃至Ｃは、CD40にHsp70を結合がADPを対象とし、そしてADPに依存することを示している。
図４のＡ乃至Ｄは、CD40に結合するhsp70が、N末端ATPアーゼドメインにより介在され、そしてHipにより完了されることを示す。
図５のＡ乃至Ｂは、ペプチド基質の存在が、CD40に結合するHsp70を刺激することを示す。
図６のＡ乃至Ｂは、CD40発現HEK293T細胞にHsp70複合体を結合することが、p38を介してシグナリングを誘導し、そしてペプチド摂取を起こすことを示している。
図７は、壊死性腫瘍細胞からHsp70ペプチド複合体を放出し、その後抗原提示細胞により結合され、そして摂取するための方法を明示する。
図８は、CD40の全長をコードするpIRES2-EGFPベクターを示す。

Claims (114)

  1. 哺乳動物の熱ショックタンパク質とそれに結合される分子を含む複合体における細胞への結合を増強するための方法において、前記細胞によるCD40の発現を増大させることを含む前記方法。
  2. 前記哺乳動物の熱ショックタンパク質が、hsp70ファミリー群である請求項１記載の方法。
  3. 前記細胞が、CD40又はCD40の熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターのCD40発現の増大量に暴露される請求項１記載の方法。
  4. 前記細胞が、CD40の発現を増大させる量のカルシウム・イオノホア、サイトカイン又はLPSに暴露される請求項１記載の方法。
  5. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3,GM-CSFである請求項４記載の方法。
  6. 哺乳動物の熱ショックタンパク質及びそれに結合される分子を含む前記複合体が、抗原と前記熱ショックタンパク質を含む共有結合、又は非共有結合の複合体である請求項１記載の方法。
  7. 前記非共有結合の複合体が、熱ショックタンパク質とハイブリット抗原を含み、前記ハイブリット抗原が、前記抗原と熱ショックタンパク質の結合成分との間を共有結合的に結合することを含む請求項６記載の方法。
  8. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項７記載の方法。
  9. 前記細胞は、専門(professional)の抗原提示細胞、又は非専門(non-professional)の抗原提示細胞である請求項１記載の方法。
  10. 前記専門(professional)の抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１記載の方法。
  11. 前記抗原が感染性疾患抗原又は腫瘍抗原である、請求項６記載の方法。
  12. 前記増大させることがin vitro,ex vivo又はin vivoにて行はれる、請求項１記載の方法。
  13. 細胞によりCD40の発現を増大させる物質(agent)に前記細胞を暴露させ、そして前記予め選択された分子と哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片を含む複合体に、前記細胞を暴露させることを含む、予め選択された分子を前記細胞への摂取を高めるための方法。
  14. 前記哺乳動物の熱ショックタンパク質が、hsp70ファミリー群である請求項１３記載の方法。
  15. 前記物質(agent)が、CD40を又はその熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである請求項１３記載の方法。
  16. 前記物質(agent)が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSである請求項１３記載の方法。
  17. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3、又はGM-CSFである請求項１６記載の方法。
  18. 前記熱ショックタンパク質が、前記予め選択された分子及び前記熱ショックタンパク質を含む共有結合又は非共有結合の複合体である請求項１３記載の方法。
  19. 前記非共有結合の複合体が、熱ショックタンパク質及びハイブリット抗原を含み、前記ハイブリット抗原が、前記予め選択された分子と熱ショックタンパク質の間を共有結合的な結合を含む請求項１８記載の方法。
  20. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項１９記載の方法。
  21. 前記細胞が、専用の(professional)抗原提示細胞、又は非専用の(non-professional)抗原提示細胞ある請求項１３記載の方法。
  22. 前記専用の(professional)抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項１３記載の方法。
  23. 前記予め選択された分子が、感染疾患抗原又は腫瘍抗原である請求項１８記載の方法。
  24. 前記物質(agent)に前記暴露すること、そして前記複合体に前記暴露することが、in vitro,ex vivo及びin vivoから成る群から独立的に選択された請求項１３記載の方法。
  25. 予め選択された抗原に対する哺乳動物における免疫応答の発生を増強するための方法において：
    [(i) 前記哺乳動物から抗原提示細胞の試料を取り出す工程；
    (ii) CD40発現を有効に増大させる物質(agent)の量に、前記抗原提示細胞を暴露する工程；
    (iii) 哺乳動物の熱ショックタンパク質と前記抗原を含む複合体の免疫応答を有効に誘発する量に、工程(ii)の前記抗原提示細胞を暴露する工程；そして
    (iv) 前記哺乳動物に前記抗原提示細胞を戻す工程]、
    を含む方法。
  26. 前記哺乳動物の熱ショックタンパク質が、hsp70ファミリー群である請求項２５記載の方法。
  27. 前記物質(agent)が、CD40又は熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチド含む発現ベクターである請求項２５記載の方法。
  28. 前記物質(agent)が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSである請求項２５記載の方法。
  29. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3、又はGM-CSFである請求項２８記載の方法。
  30. 前記複合体が、前記予め選択された抗原又はその免疫原の断片、と前記哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片とを含む共有結合的又は非共有結合的な複合体である、請求項２５記載の方法。
  31. 前記非共有結合の複合体は、熱ショックタンパク質及びハイブリッド抗原を含み、前記ハイブリッド抗原が、前記予め選択された抗原又はその免疫原の断片、と熱ショックタンパク質の結合断片との間を共有結合的に結合することを含む、請求項３０記載の方法。
  32. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項３１記載の方法。
  33. 前記細胞が、専用(professional)の抗原提示細胞、又は非専用(non-professional)の抗原提示細胞である請求項２５記載の方法。
  34. 前記専用(professional)の抗原提示細胞が樹状細胞である請求項33記載の方法。
  35. 前記抗原提示が、工程(ii)又は工程(iii)の後、単離される請求項２５記載の方法。
  36. 前記抗原が、感染性疾患抗原又は腫瘍抗原である請求項２５記載の方法。
  37. 予め選択された抗原に対する寛容性を、哺乳動物への形成を増進させる方法において：
    [(i)前記哺乳動物から抗原提示細胞の試料を取り出す工程；
    (ii)前記細胞によりCD40発現の増大を可能にする物質(agent)に、前記抗原提示細胞を暴露する工程；
    (iii)哺乳動物の熱ショックタンパク質と前記抗原を含む複合体の免疫応答を有効に寛容化にする量に、工程(ii)の前記抗原提示細胞を暴露する工程；そして
    (iv)前記哺乳動物に前記抗原提示細胞を戻す工程]、
    を含む方法。
  38. 前記熱ショックタンパク質が、hsp70ファミリー群である請求項３７記載の方法。
  39. 前記物質(agent)が、CD40を、又はその熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチド含む発現ベクターである請求項３７記載の方法。
  40. 前記物質(agent)が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSである請求項３７記載の方法。
  41. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3、又はGM-CSFである請求項４０記載の方法。
  42. 前記熱ショックタンパク質が、予め選択された抗原又はその免疫原の断片、及び前記熱ショックタンパク質を含む共有結合的又は非共有結合的の複合体である請求項３７記載の方法。
  43. 前記非共有結合の複合体が、熱ショックタンパク質及びハイブリッド抗原を含み、前記ハイブリッド抗原が、前記予め選択された抗原又はその免疫原の断片、と熱ショックタンパク質の結合成分との間を共有結合的な結合を含む、請求項４２記載の方法。
  44. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項４３記載の方法。
  45. 前記細胞が、専用(professional)の抗原提示細胞、又は非専用(non-professionalの抗原提示細胞である請求項３７記載の方法。
  46. 前記専用(professional)の抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項４５記載の方法。
  47. 前記抗原提示細胞が、工程(ii)又は工程(iii)の後に単離される、請求項３７記載の方法。
  48. 前記抗原が、自己免疫抗原、移植抗原、又はアレルゲンである請求項３７記載の方法。
  49. 細胞によりCD40の発現を増大させる物質(agent)を、動物に投与することを含む、in vivoにおける前記動物の前記細胞により、哺乳動物の熱ショックタンパク質と予め選択された分子との複合体の摂取を高めるための方法。
  50. 前記物質(agent)が、CD40又はその熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチド含む発現ベクターである請求項４９記載の方法。
  51. 前記物質(agent)が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSである請求項４９記載の方法。
  52. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3、又はGM-CSFである請求項５１記載の方法。
  53. 前記複合体が、前記分子及び前記熱ショックタンパク質を含む共有結合的又は非共有結合的な複合体である請求項４９記載の方法。
  54. 前記非共有結合の複合体が、熱ショックタンパク質及びハイブリッド抗原を含み、前記ハイブリッド抗原が、前記分子と熱ショックタンパク質の結合成分との間を共有結合的に結合することを含む、請求項５３記載の方法。
  55. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項５４記載の方法。
  56. 前記分子が、感染性疾患抗原又は腫瘍抗原である請求項４９記載の方法。
  57. 予め選択された抗原に対する免疫応答の哺乳動物ヘの発生を高める方法において：
    [(i) 前記哺乳動物の細胞により、CD40の発現を増大させる物質(agent)を前記哺乳動物に投与する工程；そして
    (ii)哺乳動物の熱ショックタンパク質と前記予め選択された抗原を含む複合体の免疫応答を有効に誘発する量を前記哺乳動物に投与する工程]、
    を含む方法。
  58. 前記物質(agent)が、CD40又はその熱ショックタンパク質の結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである請求項５７記載の方法。
  59. 前記物質(agent)が、カルシウム・イオノホア、サイトカイン、又はLPSである請求項５７記載の方法。
  60. 前記サイトカインが、IL-1α、TNF-α、INF-γ、IL-3、又はGM-CSFである請求項５９記載の方法。
  61. 前記複合体が、前記予め選択された抗原又はその免疫原の断片、と前記熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片を含む共有結合又は非共有結合の複合体である請求項５７記載の方法。
  62. 前記非共有結合の複合体が、熱ショックタンパク質及びハイブリッド抗原を含み、前記ハイブリッド抗原が、前記予め選択された抗原又はその免疫原の断片、と熱ショックタンパク質の結合成分との間を共有結合的に結合することを含む、請求項６１記載の方法。
  63. 前記熱ショックタンパク質の結合成分が、ペプチド又は有機分子である請求項６２記載の方法。
  64. 前記抗原が、感染性疾患抗原又は腫瘍抗原である請求項５７記載の方法。
  65. 細胞により発現されるCD40に哺乳動物の熱ショックタンパク質の結合を干渉する物質(agent)に前記細胞を暴露することを含み、CD40を発現する前記細胞に又はCD40を発現するために誘発される前記細胞により、哺乳動物の熱ショックタンパク質とそれに結合される分子との複合体の摂取を減少させる方法。
  66. 前記物質(agent)がCD40を結合する相手物質(partner)を含む、請求項６５記載の方法。
  67. 前記CD40結合の相手物質（partner）が抗体である、請求項６６記載の方法。
  68. 前記結合相手物質（partner）がそのCD40の結合断片のCD40Lである、請求項６６記載の方法。
  69. 前記結合相手物質（partner）がその熱ショックタンパク質のCD40の結合断片である、請求項６６記載の方法。
  70. 熱ショックタンパクの前記CD40の結合断片は、アミノ酸が約1乃至5から始まり、そしてアミノ酸が約381まで伸張したヒトhsp70の断片、又はそのCD40の結合断片のいずれかを含む請求項６９記載の方法。
  71. 前記物質(agent)が、CD40アンチセンス・オリゴヌクレオチドである請求項６１記載の方法。
  72. 前記細胞が、専門(professional)の抗原提示細胞、又は非専門(non-professional)の抗原提示細胞である請求項６５記載の方法。
  73. 前記専門(professional)の抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項７２記載の方法。
  74. 前記暴露処理が、in vtro,ex vivo,又はin vivoにて行はれる請求項６５記載の方法。
  75. 哺乳動物の免疫応答の発生を減少させる方法において：
    [(i) 前記哺乳動物から抗原提示細胞の試料を取り出す工程：
    (ii) 前記細胞によりCD40の発現を減少させる物質(agent)に抗原提示細胞を暴露する工程：そして
    (iii) 前記哺乳動物に前記抗原提示細胞を戻す工程]、
    を含む方法。
  76. 前記物質(agent)がCD40アンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項７５記載の方法。
  77. 細胞によりCD40の発現を減少させる物質(agent)を、前記動物に投与することを含み、vivoにおいて動物の前記細胞で熱ショックタンパク質の摂取を減少させる方法。
  78. 前記物質(agent)がCD40アンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項７７記載の方法。
  79. CD40の細胞外形質ドメインに結合できる分子を同定する方法において、哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片、とCD40又は哺乳動物のその熱ショックタンパク質の結合断片との間の結合度を検出可能に測定する有効な条件を提供し、前記分子を前記条件にて暴露し、そしてCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子に起因する前記結合の前記程度の変化を相互に関連付けることを含む方法。
  80. 前記分子が、前記熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片に対する親和性を有しない請求項７９記載の方法。
  81. 前記熱ショックタンパク質がhsp70ファミリー群である、請求項７９記載の方法。
  82. 哺乳動物の熱ショックタンパク質の前記CD40の結合断片は、アミノ酸が約1乃至5から始まり、そしてアミノ酸が約381まで伸張するヒトhsp70、又はその断片を含む請求項７９記載の方法。
  83. CD40の熱ショックタンパク質を結合する断片が、CD40のアミノ酸約20からアミノ酸約212である請求項７９記載の方法。
  84. 前記分子が、小さな有機分子又はペプチドである請求項７９記載の方法。
  85. 哺乳動物の熱ショックタンパク質のCD40の結合断片及び予め選択された分子を含む組成物。
  86. 前記CD40の結合断片が、前記哺乳動物熱ショックタンパク質のペプチド結合ドメインを含まない請求項８５記載の組成物。
  87. 前記CD40の結合断片が、哺乳動物の熱ショックタンパク質のN-ドメインである請求項８５記載の組成物。
  88. 前記CD40の結合断片が、前記予め選択された分子に共有結合的に結合される請求項８５記載の組成物。
  89. 前記予め選択された分子が、抗原又はその免疫原の断片である請求項８４記載の組成物。
  90. 前記抗原が、ガン抗原、感染性疾患抗原、自己免疫抗原、又は移植抗原である請求項８９記載の組成物。
  91. 哺乳動物の熱ショックタンパク質の前記CD40の結合断片が、ヒトhsp70の1-381のアミノ酸、又はヒトhsp70の5-381のアミノ酸、又はそのCD40の結合断片である請求項８５記載の組成物。
  92. 熱ショックタンパク質又はその断片以外のCD40の細胞外形質ドメインに結合する分子、及び予め選択された分子を含む、哺乳動物の熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片、とCD40又は哺乳動物のその熱ショックタンパク質の結合断片との間の結合の程度を検出可能に有効に測定する条件を提供し、前記分子を前記条件により暴露し、そしてCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子により生ずる前記結合の前記程度の変化を相互に関連付けることにより同定されるCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子を含む組成物。
  93. 前記分子が、前記熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片に対し親和性を有しない請求項９２記載の方法。
  94. CD40の外形質ドメインに結合する前記分子が、前記予め選択された分子に共有結合的に結合される請求項９２記載の組成物。
  95. 前記予め選択された分子が、抗原又はその免疫原の断片である請求項９２記載の組成物。
  96. 前記抗原が、ガン抗原、感染性疾患抗原、自己免疫抗原、又は移植抗原である請求項９５記載の組成物。
  97. 哺乳動物の熱ショックタンパク質のCD40を結合する断片を、前記免疫原を有する患者に共投与することを含む哺乳動物の患者の免疫原に対する免疫応答を増大させるための方法。
  98. 哺乳動物の熱ショックタンパク質の前記CD40を結合する断片が、ヒトhsp70の1-381のアミノ酸、又はヒトhsp70の5-381のアミノ酸、又はその任意のCD40の結合断片を含む請求項９７記載の方法。
  99. 哺乳動物内の食細胞、前記哺乳動物からの食細胞又は前記哺乳動物に熱ショックタンパク質のCD40の結合断片と抗原との結合体を投与されると考えられる食細胞に暴露すること含む、予め選択された抗原に対する前記哺乳動物における免疫応答を誘発させる方法。
  100. 前記抗原が、感染性疾患抗原、腫瘍抗原、又は免疫部分又はその断片である請求項９９記載の方法。
  101. さらに食細胞によりCD40の発現を増大させる工程を含み、前記工程が、in vitro,ex vivo,又はin vivoにて行はれる請求項９９記載の方法。
  102. 哺乳動物の熱ショックタンパク質の前記CD40の結合断片が、ヒトhsp70のアミノ酸1-381、又はヒトhsp70のアミノ酸5-381、又はその任意のCD40の結合断片を含む請求項９９記載の方法。
  103. 前記哺乳動物内の、前記哺乳動物からの、又は前記哺乳動物に投与されると考えられる食細胞に、CD40の細胞外形質ドメインと前記予め選択された抗原又はその免疫原の部分に結合する天然の熱ショックタンパク質又はその断片以外の分子の結合体を暴露することを含み、哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片、とCD40又はその哺乳動物の熱ショックタンパク質の結合の断片との間における結合度を検出できるよう測定する有効な条件を提供し、前記分子を前記条件により暴露し、そしてCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子に起因する前記結合における前記程度の変化の相互に関係付けることにより同定されるCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子で、予め選択された抗原に哺乳動物の免疫応答を誘発する方法。
  104. 前記分子が、前記熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片に親和性を有しない請求項１０３記載の方法。
  105. 前記抗原が感染性疾患抗原又は腫瘍抗原である、請求項１０３記載の方法。
  106. 食細胞によりCD40の発現を増大させる工程をさらに含み、前記工程がin vitro,ex vivo,又はin vivoにて行はれる請求項１０３記載の方法。
  107. 天然の哺乳動物の熱ショックタンパク質又はその天然のCD40の結合断片と比較されるCD40の親和性の増大により、修飾された哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片を同定する方法において、天然の哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片とCD40又はその哺乳動物の熱ショックタンパク質の結合断片との間における結合度を検出できる測定するため有効な条件を提供し、前記修飾された熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片を前記条件により暴露し、そしてCD40に結合するための親和性の増大による前記天然の哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片により呈示される過度な程度と、前記修飾される哺乳動物の熱ショックタンパク質、又はそのCD40の結合断片による前記結合程度との相互に関係付けることを含む前記方法。
  108. 前記抗原に対し免疫応答を誘発するための医薬剤を調製するため、抗原又はその免疫原の部分と結合し、又は複合体におけるCD40と結合する哺乳動物の熱ショックタンパク質の断片を使用。
  109. 前記CD40と結合する哺乳動物の熱ショックタンパク質の断片が、ヒトhsp70のアミノ酸1-381、又はヒトhsp70のアミノ酸5-381、又はそのいずれかのCD40の結合断片を含む請求項１０８記載の使用。
  110. 予め選択された分子が抗原又はその免疫原の断片である、請求項１０８記載の使用。
  111. 前記抗原が、ガン抗原、感染性疾患抗原、自己免疫抗原、又は移植抗原である請求項１０８記載の使用。
  112. 前記抗原に対し免疫応答を誘発する医薬剤を調製するため、抗原又はその免疫原の部分との結合体又は複合体において、天然の熱ショックタンパク質又はその断片以外のCD40と結合する分子の使用。
  113. 前記CD40と結合する分子が、哺乳動物の熱ショックタンパク質又はそのCD40との結合断片、とCD40又はその哺乳動物の熱ショックタンパク質との結合断片との間における結合程度を検出できるように測定するための有効な条件を提供し、前記分子を前記条件により暴露し、そしてCD40の細胞外形質ドメインに結合する前記分子に起因する前記結合の前記程度の変化を相互に関連付けることにより同定される請求項１１２記載の使用。
  114. 前記分子が、前記熱ショックタンパク質又はそのCD40の結合断片に親和性を有しない請求項１１２記載の使用。
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