KR20040064688A - 암 또는 전염병 치료에 유용한 열 충격 단백질 또는알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물 제조 방법 - Google Patents

암 또는 전염병 치료에 유용한 열 충격 단백질 또는알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 또는 전염병 치료에 유용한 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로빈을 포함하는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 항원 세포 또는 바이러스 입자에서 온 일 군의 항원 단백질 또는 항원 펩타이드를 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질과 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 항원 펩타이드를 생산하는데 사용된 상기 일 군 또는 상기 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질들 또는 항원 세포나 바이러스 입자의 적어도 50종류의 다른 단백질들을 포함한다. 항원 펩타이드를 만드는 방법은 항원 세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하는 것을 포함하거나 그 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드 및/또는 산성 조건에 노출시키는 것을 포함한다.

Description

암 또는 전염병 치료에 유용한 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물 제조 방법{Methods for preparing compostions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin useful for the treatment of cancer and infectious disease}
2.1 열 충격 단백질
열 충격 단백질들(HSP)은 또한 스트레스 단백질들이라고 하고 열 충격에 반응하여 세포에 의해 합성된 단백질로 처음 동정되었다.
HSP는 분자량에 따라 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 및 SMHSP의 5 족으로 분류되었다. 이들 족들의 많은 멤버들은 그 후에 영양 결핍, 대사 이상, 산소 래디컬 및 세포내 병원체의 감염을 포함한 다른 스트레스 자극에 대해 유도된는 것으로 알려졌다(Welch 1993년 5월, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, SCIENCE 260 : 1902-1903; Gething 등 1992, Nature 355: 33-45; and Lindquist 등 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677 참조).
열충격 및 다른 생리적인 스트레스에 대한 세포 반응에 대한 연구는 HSP가 이들 해로운 조건에 대한 세포 보호뿐 아니라 스트레스 없는 세포에서 필수적인 생화학적 면역학적 작용에도 관여한다는 것을 밝혔다. HSP는 다양한 종류의 기능 보호(chaperoning)를 달성한다.
예를 들어, 세포 원형질, 핵, 미토콘드리아, 또는 세포질 망상 구조(Lindquist 등 1988, Ann. Rev. Genetics 22 : 631(677)에 위치하는 HSP70 멤버들은 면역계의 세포들에 항원 제공 및 정상 세포의 단백질 전달, 폴딩, 어셈블리에도 관여한다.
HSP는 단백질 또는 펩타이드을 결합할 수 있고, 그 결합된 단백질 및 펩타이드들을 ATP 또는 산성 조건( Udono와 Srivastava(1993), J. Exp Med.178: 1391-1396)에서 분비할 수 있다.
Srivastavar등은 태어난 마우스들의 메틸크로란트렌 유도된 육종(sarcomas)에 대한 면역 반응을 보였다(1988, Immunol. Today 9: 78-83). 이들 연구들은 이들 종양의 개인적으로 독특한 면역성에 관여하는 분자들은 96kDa 당단백질들(gp96), 84에서 86kDa의 세포내 단백질들이었다( Srivastava 등 1986, Proc . Natl . Acad. Sci USA 83 : 3407(3411) ; Ullrich 등 1986 Proc . Natl . Acad. Sci USA 83:3121-3125). 특정 종양으로 부터 분리된 gp96 또는 p84/86을 마우스에 면역화하면 항원적으로 특이한 종양에 대해서는 아니고 특정 종양에 대해 마우스 면역을 만든다. gp96 및 p84/86을 코딩하는 유전자의 분리 및 특성화는 그들 사이에 중요한 호모로지가 있고 gp96 및 p84/86는 각각 그 동일한 열 충격 단백질들의 세포질 망상 구조(ER) 및 원형질 카운터파트이다(Srivastava 등 1988, Immunogenetics 28 : 205(207) ; Srivastava 등 1991, Curr. Top, Microbiol . Immunol. 167: 109-123).
게다가 HSP70는 항원적으로 특이한 종양에 대해서는 아니고 그것이 분리된 종양에 대한 면역성을 유도하는 것을 보인다. 그러나 HSP70 결핍된 펩타이들은 그것의 면역적 활성을 상실한다는 것이 밝혀졌다(Udono와 Srivastava(1993), J. Exp Med.178: 1391-1396). 이들 관찰은 열 충격 단백질들은 면역성 그 자체는 아니고 항원 펩타이드들과 비공유 복합체를 형성하고, 그 복합체는 항원 펩타이드들에 대한 특이적인 면역성을 유도할 수 있다(Srivastava, 1993, Adv. Cancer Res. 62: 153-177; Udono 등 1994, J. Immunol., 152: [5398-5403] ; Suto 등 1995, Science 269: 1585-1588).
HSP와 암세포에서 정제된 단백질과의 비공유 복합체는 암 치료 및 예방에 사용될 수 있고, PCT 공개번호 WO 96/10411, 1996년 4월 11일 및 WO 97/10001, 1997 3월 30일(미국 특허번호 5,750, 119. 1998, 5월 12일 특허 및 미국특허번호 5,837, 251 1998년 11월 17일 특허, 레퍼런스에 의해 각각은 여기에 삽입)에 기재되어 있다. HSP-펩타이드 복합체의 분리 및 정제는 예를 들어 병원체 감염된 세포로부터 기재되어 있고 바이러스와 같은 병원체 및 박테리아 포로토조아, 곰팡이 및 기생충을 포함하는 다른 세포내 병원체에 의해 일어나는 감염의 예방 및 치료에 사용될 수 있다(예를 들어 PCT 공개번호 WO 95/24923, 1995년 9월 21일 참조). 면역 스트레스 단백질-항원 복합체는 스트레스 단백질과 항원 펩타이드들을 인 비트로 복합체화하여 제조될 수 있고 그러한 복합체를 암 및 전염병의 예방 및 치료에 사용된 것이 PCT 공개번호 WO 97/10000, 1997년 3월 20일(미국 특허번호 6,030, 618. 2000년 2월 29일)에 기재되어 있다. 채택된 면역치료에 사용에서 인 비트로 항원 제공 세폴를 민감화하는 스트레스 단백질-항원 복합체의 사용은 PCT 공개번호 WO 97/10002, 1997년 3월 20일(미국 특허번호 5,985, 270. 1999년 11월 16일 특허)에 개재되었다.
2.2. 알파-2-마크로글로불린
알파-마크로글로불린은 구조적으로 보체성분 C3, C4 및 C5를 포함하는 단백질과 구조적으로 관련된 단백질 상과에 속한다. 인체 플라즈마 단백질 알파-2-마크로글로불린(α2M)은 프로테이네이즈 억제제, 플라즈마 및 염증성 유체 프로테이네이즈 청소 분자로 처음 알려진 720 kDa 호모테트라메릭 단백질이다(Chu and Pizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792 참조). α2M은 1474 아미노산 잔기를 갖는 전구체로부터 합성된다. 최초 23 아미노산은 분열된 신호서열로 기능하여 1451 아미노산 잔기와 함께 성숙한 단백질을 생산한다(Kan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2282-2286).
α2M은 공유결합으로 친핵성 아미노산 사이드 체인과 함께 단백질과 펩타이드에 무작위로 결합하고(Chu et al., 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307),이들을 α2M 수용체(α2MR)를 발현할 수 있는 세포로 타게팅한다(Chu and Pizzo, 1993, J. Immunol. 150:48). α2M 수용체에 대한 α2M의 결합은 α2M의 카르복시-말단 부분에 의해 매개되어(Holtet et al., 1994, FEBS Lett. 344:242-246), 키 잔기가 동정된다(Nielsen et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912).
프로테이즈 활성을 억제하는 것으로 일반적으로 알려진 바와 같이, α2M은 여러 결합좌석을 통하여 다양한 프로테이즈에 결합한다(Hall et al., 1981, Biochem. Biophys. Res. Commun. 100(1):8-16 참조). α2M과 프로테이즈의 상호작용은 변형이라 불리우는 복잡한 구조적 재배열을 가져오는데, 이는 프로테이네이즈가 티오에스테르에 의해 "트랩(trapped)된 후에 α2M의 "베이트(bait) 영역 내에서 분열된 결과이다. 변형된 변화는 수용체 결합을 위해 요구되는 잔기를 노출시키며, α2M-프로테이네이즈 컴플렉스가 α2MR에 결합되도록 한다. 메틸아민은 프로테이네이즈로부터 유도된 유사한 변형된 변화와 분열을 유도한다. 수용체로부터 인식되지 않는 미분열 α2M 형태는 종종 "슬로우" 폼(s-α2M)로 불리운다. 분열된 형태는 "패스트" 폼이라고 불리운다(Chu et al., 1994, Ann. N.Y. Acad. Sci. 737:291-307). 최근에는 α2MR이 gp96, hsp90, hsp70 및 칼레티큘린과 같은 HSPs에 결합할 수 있는 것으로 나타났다(Basu et al., 2001, Immunity 14(3):303-13).
프로테이네이즈-억제 기능 외에도, 항원에 컴플렉스되는 경우 α2M은 대식세포와 같은 항원 제공 세포에 의해 이용되는 항원의 능력을 증대시키고, 인 비트로적으로 T 세포 히브리도마스에 2 단위까지 제공하며(Chu and Pizzo, 1994, Lab. Invest. 71:792), T 세포 증식을 유도한다(Osada et al., 1987, Biochem. Biophys.Res. Commun. 146:26-31). 실험적으로 α2M과 컴플렉스된 항원이 크루드 스플린 세포(crude spleen cell)에 의한 항체 생산을 증대시키고(Osada et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:883), 실험적으로 토끼(Chu et al., 1994, J. Immunol. 152:1538-1545)와 쥐(Mitsuda et al., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:1326-1331)에서 항체 반응을 이끌어낸다는 다른 증거가 제시되었다. α2M-항원 펩타이드 컴플렉스는 또한 인 비트로적으로 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타났다(Binder et al., 2001, J. Immunol. 166:4698-49720).
본 발명은 전염병 및 일차 및 전이성 종양의 치료 및 예방용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
전염병 및 암의 치료 및 예방에서 항원 세포의 원형질 또는 막 유래 단백질 및/또는 그것의 다이제스쳔 산물을 포함하는 조성물은 종양 및 전염체에 대한 면역 반응을 증가시키기 위해 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로빈과 복합체가 된다.
발명의 요약
본 발명은 암 또는 전염병의 예방 및 치료에 유용한 항원 단백질 및 펩타이드들과 열 충격 단백질(HSP) 또는 알파-2-마크로그로불린(α2M)의 복합체를 제조하는 방법을 포함한다.
일 실시예에서 본 발명은 HSPs 및 일 군의 항원 세포 또는 바이러스 입자의 항원 단백질의 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 방법은 일 군의 항원 세포 또는 바이러스 입자에서 온 항원 단백질을 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질들과 복합체화하는 것을 포함한다. 여기서 상기 일군은 적어도 50%의 다른 단백질들 또는 상기 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 상기 항원 세포의 세포 분획에 존재하는 적어도 50종류의 다른 단백질이다.
또 다른 실시예에서 본 방법은 단백질 조제물에 있는 단백질들이 상기 열 충격 단백질들과 복합체를 형성할 조건하에서 상기 단백질 조제물을 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질에 접촉하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서 본 발명은 HSPs와 항원 세포 또는 바이러스 입자의 일 군의 항원 펩타이드를 포함하는 복합체를 제공한다. 여기서 일 군의 항원 펩타이드는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 하나 또는 복수개의 프로테이즈로 별도로 처리하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 상기 일 군의 항원 펩타이드는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 그 단백질 조제물에 존재하는 단백질 복합체에서 항원 펩타이드를 낼 수 있기에 충분한 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산성 조건에 노출하는 것을 포함하는 방법에 의해서도 제조될 수 있다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 α2M과 일 군의 항원 세포의 항원 단백질의 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 항원 세포 또는 바이러스 입자의 일 군의 항원 단백질들을 인 비트로에서 α2M과 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 여기서 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 그 항원세포의 세포 분획의 적어도 100종의 다른 단백질을 포함한다. 또 다른 실시예에서 상기 방법은 상기 단백질 조제물을 상기 단백질 조제물내의 단백질이 α2M과 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서 인 비트로에서 α2M과 접촉하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 α2M과 항원 세포 또는 바이러스 입자의 일 군의 항원 펩타이드들을 포함하는 복합체를 제공한다. 여기서 상기의 일군의 항원펩타이드들은 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 하나 또는 복수개의 프로테이즈로 별도 처리하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.. 상기 항원 펩타이드들은 또한 항원세포, 그 항원세포의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드 및/또는 산성 조건에 노출하는 것을 포함하는 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 하나 또는 양 방법들에 의해 제조된 항원 펩타이드들은 인 비트로에서 α2M과 복합체화될 수 있다.
여러 실시예에서, 항원 세포는 암세포 또는 병원체 또는 전염체에 전염된 세포 및 바람직하게는 인간 세포들일 수 있다. 그 항원 세포는 병원체 또는 전염체의 세포 또는 그것의 변이체(variants)일 수 있다. 항원 세포의 조제물은 원형질 단백질, 막 유래 단백질들 만이거나 또는 원형질 단백질과 막 유래 단백질들 모두를 포함할 수 있다. 그 단백질 조제물은 조, 분획되지 않은 세포 파쇄물일 수 있다. 특정 실시예에서 그 단백질 조제물은 당업계에서 공지된 방법으로 항원 세포를 파쇄하고 세포 찌꺼기 및 비 단백질성 물질들을 제거하고, 단백질을 선택적으로 정제하여 제조될 수 있다. 일 실시예에서 상기 단백질 조제물은 상기 항원 세포이 다른 단백질로부터 하나 이상의 특정 단백질을 선택적으로 제거하거나 유지하는 제조의 어느 방법에 종속되지 않는다.
일 실시에에서 상기 항원 세포 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 조제물은 효소 반응에 적당한 조건 하에서 트립신, 스타필로코코스 펩티데이즈 I(프로테이즈 V8으로도 알려짐), 카이모트립신, 펩신, 카뎁신 G, 써모라이신, 에라스테이즈 및 파파인과 같은 다양한 프로테이즈에 의해 잘릴 수 있다.
상기 프로테이즈 처리의 양은 펩타이드의 길이를 결정하는 공지된 방법에 의해 샘플을 취하고 그것을 분석하여 모니터할 수 있다. 프로테이즈 처리 단계는 항원 펩타이드을 포함하는 펩타이드의 군이 약 7 아미노산 잔기에서 약 20 아미노산 잔기의 평균 크기를 갖는 조건 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 여러 프로테이즈 처리물로부터 온 펩타이드들은 HSP 또는 α2M과 복합체화하기 전에 혼합될 수 있다. 항원 펩타이드를 포함하는 일 군의 펩타이드들을 HSP 또는 α2M과 복합체화하기 전에 상기 군의 펩타이드들에서 프로테이즈를 분리하거나 불활성화하고 상기 일 군의 펩타이드를 선택적으로 정제하는 것이 바람직하다.
일 실시예에서, 항원 세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 처음에 HSP 복합체를 분리할 필요 없이 항원 펩타이드가 분리될 수 있는 조건에서 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드 및/또는 산성 조건에서 접촉한다. 이 방법에 의해 분리된 항원 펩타이드들은 내생적으로, HSPs 및 MHC 클래스 I 및 II 분자와 관련있는 펩타이드들을 포함한다.
여러 본 발명의 실시예에서, 일 군의 항원 펩타이드들과 HSP 또는 α2M의 복합체화에 사용되는 방법에 따라서, 반응은 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 상기 HSP 또는 α2M과 복합체된 항원 펩타이드를 야기한다. 복합체화에 예상할 수 있는 열 충격 단백질들은 HSP 60, HSP 70,HSP 90, gp96, 칼레티쿠린(calreticulin)), grp78, 단백질 다이설파이드 아이조머레이즈(PDI), HSP 110, 및 grp 170을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 인간 HSPs 및 인간 α2M이 일반적으로 바람직하다.
HSP와 항원 펩타이드들의 복합체는 치료 또는 예방용 조성물로서 또는 조성물내에 사용되기 전에 더욱 더 정제될 수 있다. 그러한 조성물은 아쥬반트를 더욱 포함할 수 있다. HSPs 및/또는 α2M, 항원 세포, 단백질 조제물, 및/또는 프로테이즈를 포함하는 키트 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서 제2 항원 세포 또는 바이러스 입자로부터 제조된 일 군의 항원 단백질들 및/또는 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 면역원(immunogen) 양의 복합체를 포함하는 조성물을 인간에 투여하는 단계를 포함하는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 대한 대상(subject) 내의 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 항원 펩타이드들은 항원 세포 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 하나의 프로테이즈로 처리하거나 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산성 조건에 노출하여 얻을 수 있다. 제1 및 제2 항원 세포 또는 바이러스 입자는 적어도 하나의 공통된 항원 결정을 발현한다.
또 다른 실시예에서 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 일 군의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 또는 전염병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 단백질들/펩타이드들은 암세포 또는 상기 암 또는 전염병과 항원적으로 연관된 병원체와 전염된 세포들로부터 제조될 수 있다. 바이러스 입자를 포함하는 병원체 또는 전염원 또한 상기 항원 펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 상기 항원 펩타이드들은 상기 항원 세포, 그것의 세포 분획, 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물을 프로테이즈로 처리하거나 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 후루로아세틱 산과 같은 산성 조건에 노출하여 얻을 수 있다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 일 군의 항원 단백질들/펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린의 복합체로 민감화(sensitize)된 항원 제공(presenting) 세포의 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 또는 전염병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 민감화된 항원 제공 세포외에 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린 및 일 군의 항원 펩타이들의 복합체도 상기 대상에 투여 될 수 있다.
여러 실시예에서, 대상에 상기 복합체의 투여는 같은 자리에 예를 들어 주 간격(weekly interval)과 같이 주기적으로 반복될 수 있다. 상기 조성물은 피내 또는 피하내와 같은 여러 경로로 투여될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 암 또는 전염병의 예방 및 치료에 유용한 열 충격 단백질(HSP) 또는 알파-2-마크로그로불린(α2M)의 복합체를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 HSP 또는 α2M 및 항원 세포의 항원 단백질 및 펩타이드의 인 비트로 복합체를 제조하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 본 방법은 일 군의 항원 단백질을 포함하는 조제물의 항원 세포의 단백질 조제물을 만들고 상기 일 군의 항원 단백질들을 HSP 또는 α2M과 인 비트로 복합체를 형성하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서 본 방법은 HSP 또는 α2M과 인 비트로 복합체를 형성하기전에 항원 세포의 단백질 조제물을 적어도 하나 이상의 프로테이즈를 처리하는 것을 더욱 포함한다. 본 발명은 항원 세포의 전체 항원 잠재력을 이용한다.
본 발명의 치료 및 예방 방법은 전염병 또는 암의 치료 또는 예방이 기대되는 대상에서 면역 반응을 유발하는 것에 기초한다. 상기 면역 반응은 암 세포, 전염병을 야기하는 전염원에 의해 전염된 세포 또는 상기 전염원의 항원 결정에 대해 특이적으로 반응한다. 항원 세포의 펩타이드들과 복합체화된 HSP 또는 α2M의 복합체를 포함하는 조성물을 인간에게 투여하여 항원 펩타이드들과 복합체화된 HSP 또는 α2M의 복합체를 포함하는 조성물은 세포독성 T 세포 반응과 같은 면역 반응을 유발할 것이다. 항원 세포는 암세포 또는 전염된 세포 또는 암 세포 또는 전염된 세포와 유사한 항원성을 나타내거나 항원 결정을 공유하는 세포일 수 있다. 면역 반응의 결과로 인간의 여러 면역 작동체(effector) 작용 기작이 그러한 질병의 치료 또는 예방을 이끄는 암 세포 또는 전염된 세포에 대해 작용할 것이다.
바람직한 전염병 또는 암의 치료 또는 예방의 대상 또는 개체는 동물이고 바람직하게는 포유류, 인간을 제외한 영장류 및 더욱 바람직하게는 인간이다. 여기에 사용된 동물은 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 말, 닭 등의 농장 동물 또는 반려(companion) 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 치료 약제 및 치료 조성물은 싸이토카인 INF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 , IL-6 , TNF 또는 면역 세포에 영향을 주는 다른 싸이토카인을 포함하나 이에 한정되지 않는 부가적인 면역 반응 증강제 또는 생물학적 반응 변형제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법들은 암 또는 전염병을 치료 또는 예방하는 자연 발생적인 HSP-항원 펩타이드 복합체를 사용한 다른 조성물 및 방법에 배하여 개량된 것이다. 그러한 다른 방법에서 특이적 HSP와 항원 펩타이드와 그것의 복합체는 암 세포 또는 전염된 세포에서 분리되고 암 세포 또는 전염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 인 비보에서 환자에게 투여된다(미국 특허 번호 제5,750,119 및 5,961,979 참조). 자연 발생적인 복합체는 바람직한 HSP 타입에 의해 지시된 방법들에 의해 분리된다. 따라서 하나의 타입의 HSP 및 항원 펩타이드의 자연 발생적인 복합체는 그 타입의 HSP와 항원 세포의 구역(compartment)내에 같이 위치하는 항원 펩타이드들만을 포함한다. 일부 타입의 HSP들은 한 세포 구역에서만 독특하게 발견되고 일부 항원 펩타이드들은 항원 세포의 일부 구역에서만 발견된다. 예를 들어 HSP70과 HSP90은 원형질에서만 발견된다. 따라서 그들은 원형질에 존재하는 항원 펩타이드들과 만 복합체를 형성할 것이고, 예를 들어 세포질 세망(endoplasmic reticulum)과 같은 곳에 있는 항원 펩타이드과는 형설할 수 없을 것이다. 즉 항원 세포의 항원 펩타이드 서브세트 만이 각 특정 HSP에 결합할 수 있다. 따라서 암 또는 전염된 세포의 항원 결정의 최대 수로 면역반응을 촉진하기 위해서는 모든 타입의 HSP들과 그들의 항원 펩타이드 복합체는 분리의 그들 각각의 방법들에 의하여 암 세포 또는 전염된 세포로부터 분리되어야 할 것이다. 이 접근은 매우 소모적이고 일부 상황에서는 유용하지 않은 많은 양의 항원세포를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 방법은 인 비트로에서 항원 세포의 사실상 모든 항원의 펩타이드 프로화일을 생성하고 환자의 면역 반응을 촉진하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 다른 HSP및/또는 α2M과 그 펩타이드를 복합체화시켜서 이러한 문제를 해결한다. 본 발명의 방법을 사용하여 심지어는 한 항원 세포의 같은 구역 내에 같이 존재하지 않는 항원 펩타이드와 HSP는 복합체를 형성할 수 있다. 본 발명의 방법들은 특정 타입의 HSP를 항원 세포의 대부분 또는 심지어 모든 항원 펩타이드로 복합체를 형성하는 가능성을 제공한다. 따라서 항원 세포에 대한 더 효과적인 면역 반응이 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물에 의해 유도될 수 있다. 게다가 이 방법은 HSP 복합체 및 그 관련된 펩타이드의 전(prior) 분리를 필요로 하지 않아서 공급이 매우 제한된 아주 소량의 시작 물질의 사용을 가능케한다.
게다가 암 세포, 전염된 세포 또는 병원체의 항원 프로화일은 일정 기간의 시간(예를 들어 심지어는 치료의 과정 중)에서 변화할 수 있다. 많은 병원균은 면역 세포 또는 항체에 의해 인식되지 않는 돌연 변이 또는 돌연변이 단백질을 합성하여 호스트 면역 계를 피할 수 있다. 암 세포는 그들의 일부가 면역계에 의해 인식될 수 없는 돌연변이 단백질을 합성을 야기하는 돌연변이를 통하여 일부 약제에 저항할 수 있는 것으로 알려졌다. 본 발명의 일 실시예 중 하나을 사용하는 방법은 암세포, 전염된 세포 또는 병원체의 원형질 및/또는 막 유래 단백질을 다이제스트하여 더 넓은 범위의 항원 단백질 및 따라서 더 다양한 항원 펩타이드가 HSP 및/또는 α2M과 복합체를 형성한다. 결론적으로 면역반응은 따라서 암세포 또는 전염된 세포와 같은 항원 세포가 면역계에 의한 인식 및 작용을 회피하게 만드는 항원 세포에 대해 다수의 항원 결정에 지시된다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 자연에서 발견되지 않는 α2M펩타이드 복합체를 생성한다. α2M 은 여러 세포외 단백질들에 결합하고 특히 그것들을 불활성화하는 프로테이즈는 그것들을 세포내 환경으로 이동하는 것으로 알려졌다. α2M 은 일반적으로 액세스를 가지고 있지 않아서 항원 세포의 전 항원 펩타이드 레퍼토리와 복합체가 되지 않는다. 본 발명의 방법은 α2M 이 원형질 또는 막 유래 또는 항원 세포의 원형질 또는 막 유래 단백질의 인 비트로 다이제스쳔에 의해 생성되는 많은 넓은 범위의 펩타이드와 복합체를 형성하게 한다.
4.1에서 기재한 것이 단백질 조제물을 만들 수 있는 항원 세포의 소스이다. 4.2절에서는 항원 세포의 여러 타입의 단백질 조제물을 만드는 방법 및 단백질 조제물을 다이제스트하는 방법을 제공한다. 4.3절 및 4.4절은 각각 항원 펩타이드와 복합체를 형성하는데 사용될 수 있는 HSP 또는 α2M의 분리 및 생산에 대해 기재된다.
HSP 및 항원 펩타이드의 인 비트로 복합체는 4.5절에 기재되어 있다. 제4.6절에는 암 및 전염병의 치료 및 예방에서 본 발명의 복합체의 용도의 방법 및 치료될 암 및 전염병이 기재되어 있다. 제4.7절에는 채택된 면역치료에서 본 발명의 방법에 의해 제조된 상기 조성물의 용도가 개재되어 있다. 제5절에는 암 세포 성장으로부터 동물을 예방적으로 보호하는 본 발명의 복합체의 효과를 보여주는 실험 데이터를 제공한다.
작성자:차형석, 11 페이지부터 19페이지 상단까지
4.1 항원성 세포의 근원(Source of antigenic cells)
본 발명의 항원성 세포는 어떤 과제(in a subject)에서 면역 반응(immuneresponse)이 요구되어지는 항원 결정기(antigenic determinant)를 구비한다.
암 또는 감염성 질병의 처치 또는 예방을 위하여 본 발명의 방법은 암세포로부터 유래된 항원성 단백질/펩타이드, 바람직하게 인간의 암, 예를 들면, 특이-종양 항원(tumor-specific antigens)과 항원과 관련된 종양의 조각들(fragments)과 화합물이 된(complexed) α2M과 HSPs 의 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드들은 암세포로부터 단백질(예를 들면, 세포질 및/또는 막-유도 단백질(membrane-derived proteins))의 분해 소화로부터 생성된다. 또는 상기 펩타이드들은 상기 암세포와 비슷한 항원성(antigenicity)을 보이는 것과 항원 결정기(antigenic determinant)를 공유(share)하는 항원성 세포들의 단백질 분해 소화로부터 생성된다. 상기 항원성 펩타이드(antigenic peptides)는 또한 상기 펩타이드들을 ATP, 구아니디움 하이드로클로라이드(guanidium hydrochloride) 및/또는 산성 조건(acidic conditions)에 노출됨으로써 생성될 수 있다. 여기서 사용하고 있듯이, "같은 형태의 암" 세포 또는 조직이라는 용어는 같은 조직 형태의 암을 가진 세포 또는 조직을 뜻하거나, 같은 조직 형태의 암으로부터 전이된 조직 또는 세포를 뜻하는 것으로 한다.
감염성 질병의 처치 또는 예방을 위해서, 본 발명의 방법은 병원체(pathogen) 또는 감염성 질병을 일으키는 감염체(infectious agent), 또는 바이러스, 곰팡이, 원생동물, 기생충 등을 포함하지만 이러한 것에 한정되지는 않는 것을 포함하는 병원체(pathogen)에 의하여 감염된 세포들로부터 유래된 항원성 펩타이드(antigenic peptides)와 화합물이 된(complexed) α2M과 HSPs 의 조성물을 제공한다.
바람직하게, 상기 병원체(pathogen)는 인간을 감염시키는 것이다. 상기 항원성 펩타이드(antigenic peptides)는 감염된 세포들과, 감염된 세포들과 비슷한 항원성(antigenicity)을 보이는 것과 항원 결정기(antigenic determinant)를 공유(share)하는 항원성 세포들, 또는 바이러스 입자를 포함하는 병원체들(pathogen)로부터 얻어지는 단백질들의 단백질 분해 소화(proteolytic digestion),(예를 들면, 세포질 및/또는 막-유도 단백질(membrane-derived proteins))로부터 생성된다. 또한, 상기 항원성 펩타이드들(antigenic peptides)들은 ATP, 구아니디움 하이드로클로라이드(guanidium hydrochloride) 및/또는 산성(acid)에 노출됨으로써 생성될 수 있다. 또한, 상기 항원성 펩타이드들(antigenic peptides)은 감염성 질환을 일으키는 항원성 인자(antigenicity of an agent)(병원체(pathogen))를 보이는 항원성 세포들(antigenic cells) 또는 그러한 인자들의 변형들로부터 생성될(generated) 수 있다.
전체 암세포들, 감염된 세포들, 또는 다른 항원성 세포가 본 방법에 사용되기 때문에, 본 방법을 사용하기에 앞서 이러한 항원성 펩타이드들(antigenic peptides)을 격리하거나(isolate) 특정지우거나 심지어 정체(identities)를 알거나 할 필요가 없다. 상기 항원들이 연관되어(associated) 있는 질병의 특성에 따라서 상기 항원성 세포들의 출처(source)가 선택되어 진다. 본 발명의 일 실시예(embodiment)에서, 어떠한 조직들 또는 다양한 부위들(sites)로 전이된 암을 포함한 암(cancer)으로부터 분리된(isolated) 세포들이 본 발명의 방법에서 항원성세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈액을 순환하고 있는 백혈병 세포, 림프액 또는 다른 체액이 사용될 수 있다. 고체 종양 조직(solid tumor tissue)(예를 들면, 생검(biopsy)로부터의 1차 조직(primary tissue)이 사용될 수 있다. 여기에서 사용하고 있듯이, 암세포라는 용어는 또한 정상 상태에서 종양 형태(neoplastic form)으로 전이(transition)되고 있는 세포인 종양전 세포(preneoplastic cell)도 포함한다. 비종양성의 세포 증식으로부터 종양(neoplasia)으로의 전이(transition)는 대개 과형성(hyperplasia), 이형성(metaplasia), 및 형성 이상(dysplasia)로 구성된다.(이런 종류의 비정상인 증식 조건의 재검토를 위해서는 Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79를 볼 것). 여기서 사용될 수 있는 세포들을 가진 암들의 무제한의 리스트(a non-limiting list)가 아래의 섹션 4.5.2에 제공된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 병원체 또는 감염성 인자(infectious agent)로 감염된 어떠한 세포, 예를 들면, 감염된 세포가 항원성 펩타이드들(antigenic peptides)의 조직 표본을 위한 항원성 세포로서 사용될 수 있다. 특히, 바이러스, 박테리아, 진균류(fungus), 기생 생물, 원생동물(protozoan)과 같은 균체내 병원체에 의하여 감염된 세포들이 바람직하다. 여기에서 사용될 수 있는 세포들을 감염시킬 수 있는 감염성 인자(infectious agents)의 예시적 리스트가 섹션 4.5.1에 제공된다.
또 다른 실시예에서는, 감염성 질병을 일으킬 수 있는 어떠한 병원체 또는 감염성 인자도 항원성 펩타이드들의 조직 표본(preparation)을 위한 항원성 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (그러나 이러한 예에 제한되지는 않음) 복제에 결함이 있는 변이주, 비병원성 또는 독성이 약화된(attenuated) 변이주, 비감염성 변이주와 같은 병원체 또는 감염성 인자의 변이들이 이러한 목적을 위하여 항원성 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 감염된 물질(materials)로부터 분리되거나, 또는 시험관 내에서 배양될 수 있는 많은 바이러스, 박테리아, 균류, 기생 생물, 그리고 원생동물은 항원성 세포의 공여원으로서 도움이 될 수가 있다.
바이러스 입자를 포함하고 있는 이런 종류의 병원을 전파하기 위해서 공지 기술의 방법이 사용될 수가 있다.
또한, 암 조직들, 암 세포들 또는 감염된 세포들로부터 유래된 세포계도 항원성 세포로서 사용될 수가 있다. 암 또는 감염된 조직들, 세포, 또는 인간 오리진(origin)의 세포계는 선호된다.
암 세포들, 감염된 세포들, 또는 항원성 세포는 식별될 수가 있고, 공지 기술의 어떠한 방법에 의하서도 분리될 수가 있다. 예를 들면, 암 세포들 또는 감염된 세포들은 형태(morphology), 효소 앗세이(enzyme assays), 증식 앗세이(proliferation assays), 또는 병원체 또는 암을 유발하는 바이러스의 존재에 의해 식별될 수가 있다.
만약, 관심의 대상인 항원의 특성이 알려지면, 항원성 세포들은 식별될 수가 있거나, 또는 공지 기술의 어떤 생화학 또는 면역 학문적인 방법에 의하여 분리될 수가 있다. 예를 들면, 암 세포 또는 감염 세포는 수술, 내시경 검사, 다른 생검 기술, 아피니티 크로마트그라피(affinity chromatography) 및 형광 활성화의 세포선별에 의해 분리될 수가 있다(e.g. 항원에 대하여 형광 물질에 의해 표시된 항체가 상기 세포들 옆에서 표현된다)(with fluorescently tagged antibody against an antigen express by the cells). 유사한 항원성을 표시하는 항원성 세포는 대상(subjects)에서의 면역 반응에서 요구되는 것에 대하여 하나 이상의 항원 결정기를 공통으로 가진다. (예를 들면, 치료적 또는 예방의 목적).
만약, 대상(subjects)로부터 얻을 수 있는 항원성 세포의 수가 불충분한 경우, 상기 세포는 현재의 방법에 사용되기 전에 세포의 수를 확장하기 위한 표준 방법에 의하여 시험관 내에서 배양될 수 있다. 한무리의(clonal), 균일한(homogeneous), 또는 정제된 모집단(purified population)의 항원성 세포가 사용될 필요는 없다. 만약, 혼합액 속에 상당한 세포의 상당한 수가 관심 대상인 항원을 포함한다면, 세포의 혼합액이 사용될 수가 있다. 특정의 실시예에서, 상기 항원성 세포 및/또는 면역 세포는 정화된다.
병원체-감염 세포를 제조하기 위해서, 질병을 일으키는 병원체 또는 감염성 인자에 의해 감염되기 쉬운 세포형(cell type)의 비감염 세포가 시험관 내에서 감염될 수 있다.
전염(transmission)의 모드 및, 병원체 또는 감염 인자의 생물학(biology)에 따라, 병원체 또는 감염 인자에 의한 감염 및 감염 세포의 전파(propagation)를 촉진하게 하기 위해서 표준 기술이 이용될 수가 있다. 예를 들면, 인풀루엔자 바이러스는 통상의 인간의 섬유아세포를 감염시키기 위해서 이용될 수가 있다.; 그리고, 마이코바크테리아는 통상의 인간의 슈원 세포(Schwann cells)를 감염시키기 위해서이용될 수가 있다. 다양한 실시예에서, 복제-결함 바이러스, 비병원성 또는 독성이 줄어든 돌연변이체, 또는 온도 감수성 돌연변이체(temperature-sensitive mutants)와 같은 감염성 인자의 변이(variants)도 또한 세포를 감염시키거나 항원성 펩티드의 조직표본(preparation)을 위한 항원성 세포를 발생시키는 세포로 변환시키기 위하여 사용될 수 있다. 만약, 세포들을 감염시키기 위해서 많은 수의 병원체가 필요하다면, 또는 병원체가 항원성 세포로서 직접 사용되는 경우, 공지 기술의 어떠한 방법도 병원체를 전파하거나, 배양하기 위해서 이용될 수 있다. 이런 종류의 방법은 병원체 의하여 결정되고, 기주를 감염시키는 것을 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 많은 기술은 발달하는 대규모 발효를 포함해서 병원균, 균류 및 배양 중인 다른 비바이러스성 미생물을 배양하기 위한 많은 기술이 알려져 있다.
대안으로, 종양 항원을 코드화하는 유전자(gene)(예를 들면, 종양 특이성 항원, 그리고, 종양 관련 항원) 또는 병원체의 항원을 사용 가능하다면, 상기 의도된 받는 부위(intended recipient)로부터의 적절한 세포 형태의 정상 세포가 시험관 내부에서 전환되거나 전염(transfected)될 수 있어, 이러한 항원을 코드화하는 핵산(nucleic acid) 분자를 포함하는 표현 구조물을 나타낸다. 따라서, 상기 항원은 상기 받는 부분의 세포(recipient's cell)에 표현된다. 일 실시예에서, 종양 관련 항원은 정상 세포에 비하여 종양 세포 속에서 상대적으로 높은 레벨을 나타내는 항원이다.; 종양-특이 항원(tumor-specific antigen)은 단지 종양 세포 내에서만 표시되고, 정상 세포 내에서는 표시되지 않는 항원이다.
선택적으로, 상기 받는 부분의 세포(recipient's cell)에 하나 이상의 이러한 항원이 이러한 형태로 표현된다. 이 분야에서의 당업자에게 이해될 수 있는, 알려진 어떠한 기술, 예를 들어, Ausubel et al.(1989, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience)이 트랜스포메이션(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection) 및 받는 부분의 세포(recipient's cell)에서 항원 유전자의 계속되는 재조합 표현(subsequent recombinant expression)을 이루기 위하여 사용될 수 있다.
이런 종류의 세포에 대해 나타내질 수가 있는 적절한 단백질 및 펩타이드는 (처치 또는 암의 예방을 위한)항원성을 표시하는 것을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.：즉, tyrosinase, gp100, melan-A, gp75, 무틴을 포함한 종양 항원; 그리고, (감염증의 처치 또는 예방을 위한)：마이코바크테리아, 리케차, 미코플라스마, neisseria, 레지오네라, 라이시마니아, kokzidioa, trypanosoma, 크래미디어 및 리케차를 포함하지만 이것에 한정하지 않는 감염 인자의 단백질 또는 단백질 조각(fragment) 뿐만 아니라, 면역 부전 바이러스·타입 I(HIV-1), 사람 면역 부전증바이러스 typeII(HIV-I), 간염 A형, 간염 B형, 간염형 C, influenza, Varicella, 아데노위르스, 단순 포진 I형(HSV-1), 단순 포진형 II(HSV-ll), 우질, 라이노위르스, 메아리 바이러스, 로타위르스, RS바이러스, 파피로마위르스의 단백을 포함하고 있는 바이러스 단백질(파포바·바이러스, 사이트메가로위르스, echinovirus, 아르보위르스, 한타위르스, 코크삭키위르스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스를 포함한다.
4. 2. 항원 단백질 및 펩타이드의 제조(PREPARATION OF ANTIGENIC PROTEINSAND PEPTIDES)
본 발명에 의하면 본 발명의 조성은 항원 단백질이 관심의 대상인 항원 세포의 단백질의 준비로부터 유래하는 HSPs와 화합물을 이루는(complexed) 항원 단백질을 구비한다. 본 발명의 조성은, 또한, 항원 단백질이 관심의 대상인 항원 세포의 단백질의 조제물로부터 유래하는 α2M과 복합체를 이루는 항원 단백질을 구비한다.
본 발명의 조성은, 또한, HSPs 및 항원성 펩타이드의 복합체, 또는 α2M 및 항원성 펩타이드의 복합체로부터 완성된다. 그리고, 다음에는 HSP 또는 a2M에 펩타이드를 합성한다.
다양한 실시예에서, 항원 단백질 및 펩타이드의 다양성을 최대로 해 보존하기 위해서 항원성 세포의 단백질 제법을 조제하기 위해서 사용되는 방법은 항원성 세포의 다른 단백질 및 펩타이드로부터 선택적으로 제거하지 않거나, 또는 항원성 세포에서 다른 단백질 또는 펩타이드로부터의 어떠한 특정의 단백질 또는 펩타이드도 보유하지 않는다. 심지어 어떤 실시예에서는, 사이트졸릭 단백질(cytosolic proteins) 또는 멘브레인-유도 단백질이 사용될 때, 조직표본을 만들기 위해서 사용하는 방법은 선택적으로 사이트 콜로이드 용액의, 또는 멘브렌의 어떠한 특정의 단백질도 제거하지 않거나 보유하지 않는다. 따라서, 원형질(cytosol) 또는 멤브레인(membrane)에 존재하는 상기 단백질의 대부분은 또한 항원 단백질 또는 항원세포들로부터의 펩타이드의 각각의 조직 표본에 존재한다. 바람직한 실시예에서는, 실질적으로 항원 단백질 및 항원성 세포의 펩타이드의 모든 레퍼토리(repertoire), 그리고, 실질적으로 원형직(cytosol) 또는 멤브레인(membrane)에 존재하는 모든 항원성 단백질과 펩타이드 펩타이드는 컴플렉싱 반응(complexing reaction)에 존재하고, HSPs 및/또는 α2M와 콤플렉스(complex)를 형성한다.
4. 2. 1 항원성 세포의 단백질 조제물(PROTEIN PREPARATIONS OF ANTIGENIC CELLS)
본 발명의 일 실시예에서, 암 세포, 감염된 세포, 또는 병원체로부터 유래된 단백질 조직 표본이 제공된다. 예를 들면, 암의 치료를 위해서, 수술 후에 암 환자로부터 얻어진 종양 세포로부터 상기 단백질 조직표본이 준비된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 항원을 코딩하는 재조합형 발현계(recombinant expression system)의 도입에 의하여 수정된 세포계(cell lines)에서 관심 대상인 하나 또는 그 이상의 항원성 단백질이 합성된다. 그리고, 이러한 세포들이 상기 단백질을 제조하기 위하여 사용된다.
단백질은 하나 이상의 세포분획(cellular fraction)(s)(예를 들면, 항원성 세포의 원형질)로부터 얻을 수 있다. 또는, 그것들은 항원성 세포의 세포벽, 또는 멤브레인들로부터 추출될 수가 있거나, 가용화될 수 있다.
용균(cell lysis), 세포 함량의 분획(fractionation of cellular contents), 및 단백질 강화(protein enrichment), 또는 분리(isolation)을 위해서 알려진 어떠한 기술도 사용될 수 있다. 예를 들면, Current Protocols in Immunology, Vol.2, chapter 8. Coligan et al.(ed.), John Wiley&Sons, Inc.; Pathogenic and Clinical Microbiology: A Laboratory Manual by Rowland et al., Little Brown & Co., June 1994;를 참조하면 된다. 상기 문헌들은 여기에서 전체적으로 참조 문헌으로서 포함된다. 세포 함량을 분획하기 위해서 사용되는 기술에 따라, 세포분획(cellular fraction)은 적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 또는 20,000의 다른 단백질을 구비한다.
여기서 사용하고 있듯이, 단백질 조제물(protein preparation)은 항원성 세포, 항원성 세포의 세포분획, 또는 바이러스 입자로부터 얻어진 단백질의 혼합액을 뜻한다. 단백질은 세포분획(예를 들면, 원형질(cytosol))으로부터 얻을 수 있을 수 있다. 단백질은 또한, 비원형질 단백질(non-cytosolic proteins)(예를 들면, 세포벽, 세포막(cell membrane), 또는 기관(organelles))일 수도 있고, 또는 양자 모두일 수 있다.
세포분획은 핵, 미토콘드리아, 리소좀, 및 소포체로부터 유래한 분획(enplasmic reticulum-derived fractions)과 같은 원형질 분획(cytosolic fraction), 막분획(membrane fraction), 기관 분획(organelle fractions)을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 단백질 조직표본(preparations)은 유전적 조합의 결과를 나타내지 않는 세포(non-recombinant), 또는 재조합형(recombinant) 세포로부터 얻을 수 있을 수가 있다.
여기에서 이용되고 있는 용어인 "항원성 단백질(antigenic proteins)"은 조제물(preparation)에 존재할 수 있는 항원성(antigenic) 펩타이드 또는 항원성(antigenic) 폴리펩타이드도 또한 포함한다.
항원성 세포, 또는 세포 분획(cellular fraction), 또는 바이러스 입자로부터 얻어진 단백질 조직표본(protein preparation)은 다른 비단백성의 재료(othernon-proteinaceous materials)로부터 다양한 정도까지 공지 기술의 기술에 의하여 정화될(purified) 수 있다.
단백질 조직 표본(pretein preparation)은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 다른 단백질 및 바이러스 입자, 또는 항원성 세포의 분획, 또는 항원성 세포에 존재하는 펩타이드를 구비한다.
특정한 실시예에서, 단백질 조제물(protein preparation)은 항원성 세포에서 다른 단백질로부터 하나 이상의 특정 단백질(s)을 선택적으로 보유하거나 제거하는 어떠한 조제물(preparation)에 제한되지 않는다.
특정의 실시예에서, 단백질 조제물(protein preparation)은 분획되지 않고, 및/또는 정화되는 전체 세포 용액(total cell lysate)이다. 그리고, 단백질 조제물(protein preparation)은 세포의 다른 비단백성의 재료를 보유한다. 특정의 다른 실시예에서, 상기 단백질 조제물(protein preparation)은 더 이상의 분획 또는 정화에 제한되지 않는 세포 분획 내의 전체 단백질(total protein)이다. 그리고, 단백질 조제물(protein preparation)은 세포의 다른 비단백성의 재료를 포함할 수가 있다. 또 다른 실시예에서, 단백질 조제물(protein preparation)은 바이러스 입자의 조제물에서의 전체 단백질이다.
특정의 실시예에서 단백질 조제물(protein preparation)은 전체 세포 단백질, 전체 사이트졸릭 단백질, 또는 항원성 단백질(s)의 전체 멤브렌인-바운드 단백질(total membrane-bound proteins)을 구비한다. 다양한 실시예에서, 단백질 조제물(protein preparation)은 적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 또는20,000의 다른 단백질을 구비한다. 많은 다른 항원성 단백질아 항원성 세포의 단백질 조제물(protein preparation)에 존재한다. 게다가, 단백질 조제물(protein preparation)내의 단백질은 시험관 내에서 HSPs 또는 α2M와 반응하기 전에 프로테아제 소화의 단계를 거친다. 대안으로, 단백질 조제물(protein preparation)내의 단백질은 시험관 내에서 HSPs 또는 α2M와 반응하기 전에 프로테아제 소화의 단계를 거치지 않는다.
항원성 세포 또는 바이러스 입자의 단백질 조제물(protein preparation)을 만들기 위해서, 세포벽, 세포막 또는 바이러스 입자 구조를 파괴시키거나, 또는 항원성 세포를 용해시키는 것은 공지 기술의 표준 프로토콜을 사용해 실행될 수가 있다. 다양한 실시예에서, 항원성 세포는, 예를 들면, 기계적 비틈, 음파 처리, 응고 및 융해(thawing)에 의해 용해할 수가 있다. 그리고, 세포를 둘러싸고 있는 배양지(medium)의 삼투압 농도(osmolarity)를 조정한다. 보다 적게 바람직한 실시예에서, 항원성 세포는 데타젠트(detergent)와 같은 화학 약품에 의해 용해될 수가 있다.
일단 세포가 용해되면, 세포 찌꺼기(cellular debris), 비단백성인 재료 또는 사이트 콜로이드 용액을 포함하지 않는 재료(material), 및/또는 멤브레인으로부터 유래된 단백질(오르가넬라의 멘브렌의 단백질을 포함)을 포함하지 않는 재료를 제거하는 것은 바람직하다. 이러한 성분의 제거는 저속 원심분리기 또는 여과와 같은 기술에 의해 이루어질 수 있다.
세포 찌거기 및 생균(intact cells)을 제거한 후에 고속 원심분리기 단계가상등액(supernatant)에 있는 사이트졸릭 단백질, 및 pellet에 대해 모아지는 멤브레인 유도 단백질을 분리하기 위해서 이용될 수 있다. 당업계에서 일반적으로 알려진 표준 순서는 pellet로부터 멤브레인 유도 단백질을 한층 더 분리할 수 있게 한다. 당업계에서 일반적으로 알려진 표준 기술은 바이러스 단백질을 바이러스 입자로부터 추출하기 위해서 이용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 항원성 세포, 사이트 콜로이드 용액, 멤브레인에 존재하는 다른 단백질로부터 하나 이상의 특정 단백질을 제거하거나 보유하는 것을 설계되어 있지 않다.
다른 실시예에서, 선택적으로, 상기 단백질은 일반적인 생화학 및/또는 생물 물리학적인 특성(예를 들면 크기, 전하 또는 화합)에 의해 항원성 세포로부터 떼어질 수 있다. 공지 기술의 어떠한 기술도, 상기 분리를 실행하기 위해서 이용할 수가 있다.
적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 또는 20,000의 다른 단백질을 포함하는 단백질/펩타이드 분획, 또는 항원성 세포 또는 세포분획 또는 바이러스 입자에 존재하는 다른 단백직의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%를 포함하는 단백질/펩타이드 분획이 HSP 또는 α2M과 화합물(complex)을 형성하기 위해서 사용된다.
예시적으로, 사이토졸릭 단백질을 포함하는 단백질 조제물(protein preparation)을 제조하기 위해 사용되는 방법은 다음과 같다. 그러나, 본 발명이 이러한 예시에 제한되는 것은 아니다.
환자의 생검, 또는 시험관에서 배양된 종양 세포, 또는 병원체에 의하여 감염된 세포일 수 있는 세포가 20분 동안 얼음 위에서 배양된 pH 7.5, lmM PMSF, 30mM 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbinate)를 포함하는 1X Lysis 완충(buffer)의 3 개의 부피(volume)에 부유(suspended)된다. 그런 다음, 히포토닉컬리-스월런 셀(hypotonically-swollen cells)은 바운스 호모지나이저(bounce homogenizer)에서 ＞95% 세포가 라이즈드(lysed)될 때까지 균질화된다(homogenized). 비틈(shearing)에 대한 대안으로서, 세포는 얼음 위에서 ＞99% 세포가 라이즈드(lysed)될 때까지 초음파 처리될 수가 있다. 이것은 현미경 검사(microscopic examination)에 의하여 결정된다. 초음파 처리가 사용될 때에는, 세포는 1mM의 PMSF를 포함하는 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 완충 용액 내에서 서스펜디드(suspended)된다.
용균액(lysate)은 생균(intact cell), 핵 및 다른 세포 찌꺼기를 제거하기 위해서 10분동안 1,000 x g으로 원심분리(centrifuged)된다.
결과적으로 생기는 상등액(supernant)은 약 100,000 x g로 한 시간 동안 다시 원심분리(recentrifuged)된다. 그리고, 상등액(supernant)은 회수된다(recovered). 상기 100,000 x g 상등액(supernant)은 본 발명의 가용성 사이트졸릭 단백질을 제공하기 위해서 PBS 또는 다른 적절한 완충에 대해서 4℃에서 36시간 동안 (3 배(three times), 각 100배 부피(100 times volume)) 투석될 수가 있다. 필요하다면, 조제물(preparation)에서 불용성의 재료(material)는 여과 또는 저속 원심 분리기(centrifugation)에 의해 제거될 수가 있다.
예시적으로, 멤브레인으로부터 유래된 단백질을 포함하는 단백질조제물(protein preparation)을 제조하기 위한 방법은 아래와 같다. 그러나, 본 발명이 이러한 예시에 제한되는 것은 아니다.
환자의 생검, 또는 시험관에서 배양된 종양 세포, 또는 병원체 인자로부터 감염된 세포로부터 유래된 종양세포일 수 있는 세포가 20분 동안 얼음 위에서 배양된 pH 7.5, lmM PMSF, 30mM 소디움 바이카보네이트(sodium bicarbinate)를 포함하는 1X Lysis 완충(buffer)의 3 개의 부피(volume)에 서스펜드(suspended)된다. 그런 다음, 히포토닉컬리-스월런 셀(hypotonically-swollen cells)은 바운스 호모지나이저(bounce homogenizer)에서 ＞95% 세포가 라이즈드(lysed)될 때까지 호모지나이즈된다(homogenized). 비틈(shearing)에 대한 대안으로서, 세포는 얼음 위에서 ＞99% 세포가 라이즈드(lysed)될 때까지 초음파 처리될 수가 있다. 이것은 현미경 검사(microscopic examination)에 의하여 결정된다. 초음파 처리가 사용될 때에는, 세포는 1mM의 PMSF를 포함하는 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 완충 용액 내에서 서스펜디드(suspended)된다.
다음, 상기 용균액(lysate)은 세포막을 모으기(collect) 위해 10분 동안 100,000 x g으로 원심분리(centrifuged)된다.
멤브레인 유도 단백질은 지방질 이중층으로부터 제거될 수가 있고, 침전물(pellet)을 1% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)(Ca2+ 및 마그네슘 이온이 없음) 포함하고, 얼음 위에서 1시간 동안 배양된 PBS의 5개 체적(5 volumes)에서 상기 침전물을 재현탁(resuspending)함으로써 100,000g 침전물(pellet)(멤브레인 유도 단백질이 위치하는 곳)로부터 격리될 수 있다. 결과적으로 생기는 현탁(resulting suspension)은 20,000g에서 30분간 원심 분리된다. 그리고, 결과적으로 생기는 상등액(supernatant)은 수확(harvested)되고, 데타젠트(detergent)를 제거하기 위해서 PBS(Ca2+ 및 Mg2+가 없음)의 몇 개의 변화(changes)에 대해서 투석된다. 결과적으로 생기는 투석액은 90분 동안 100,000g에서 원심 분리되고(centrifuged), 상기 상등액(supernatant)은 더욱 정화된다. 다음, 상기 상등액(supernatant)을 최종적으로 2 mM로 하기 위해서 상기 상등액(supernatant)에 칼슘 및 마그네슘을 모두 추가한다.
만약, 필요하다면 불용성의 재료를 조직표본(preparation)으로부터기 위하여 여과 또는 저속의 원심 뷴리기를 사용할 수 있다.
특정의 실시예에서, 항원성 세포로부터 얻어지는 사이트 콜로이드 용액 및/또는 멤브레인-유도 단백질의 모집단(population)은 프로테아제 처치(protease treatment) 또는 어떠한 추가적인 추출 또는 선택(selection)의 과정이 없이도 직접 HSP 또는 α2M에 화학 결합될(complexed) 수 있다. 대안으로, 상기 단백질은 화학 결합(complexing)되기 전에 프로테아제 처치(protease treatment)를 받을 수가 있다.
4.2.2 항원세포로부터의 펩타이드
본 발명에 따르면, 항원세포로부터 얻어진 세포질 및 막-유도 단백질은 항원 펩타이드를 생성하도록 선택적으로 소화될 수 있다. 일실시예에서, 세포질 또는 막-유도 단백질은 소화에 사용된다. 다른 실시예에서, 세포질 및 막-유도 단백질은 소화반응에서 결합되어 항원 펩타이드를 생성한다. 바람직한 실시예에서, 단백분해효소 소화(protease digestion)에서 사용되는 단백질 제제는 항원세포 내의 다른 단백질로부터 하나 또는 그 이상의 특정 단백질을 선택적으로 제거 또는 유지하는 어떠한 준비방법이나 항원세포의 세포질 또는 막에 의존하지 않는다.
다양한 단백분해효소(proteases) 또는 단백질분해효소(proteolytic enzymes)가 항원 펩타이드를 구성하는 다수의 펩타이드를 항원세포의 단백질 제제로부터 생산하기 위해서 본 발명에 사용될 수 있다. 효소소화(enzymatic digestion)는 당해 분야에서 잘 알려진 트립신(trypsin), 포도알균 펩타이드분해효소 I(Staphylococcal peptidase I)(단백분해효소 V8로도 알려짐), 티모트립신(chymotrypsin), 펩신(pepsin), 카뎁신 G(cathepsin G), 써몰리신(thermolysin), 엘라스타아제(elastase) 및 파파인(papain)을 포함하는 단백질분해효소를 단독적으로 또는 다른 것과 적절히 혼합하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 트립신은 라이신(lysines) 및 아르지닌(arginines)의 카르복실 종말측부(carboxyl-terminal side)에서 분할되는 매우 특이한 세린 단백분해효소이다. 분할지점의 제한된 수 때문에, 많은 MHC-결합 항원결정인자(MHC-binding epitopes)가 비활성으로 남아있을 것으로 예상된다. 세린 단백분해효소인 포도알균 펩타이드분해효소 I (Staphylococcal peptidase I)는 글루탐산 및 아스파르트산 잔여물(glutamic and aspartic acid residues) 이후의 분할에 대해 특이성을 갖는다. 소화는 단일 단백분해효소 또는 단백분해효소 혼합물로 수행될 수 있다. 사용된 단백분해효소 또는 단백질분해효소는 특정 효소에 적합한 조건하에서 배양된다. 바람직하게, 효소는 정화된다. 브롬화 시아노겐 분할과 같은 비효소 방법이 또한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 소화될 단백질 제제는 각각 다른 효소를 이용하는 다수의 반응으로 나누어질 수 있고, 결과적인 펩타이드는 사용을 위해서 선택적으로 함께 고일 수 있다. 이러한 반응들은 단백질 제제 내에 존재하는 각 단백질을 위한 다양하고 다른 펩타이드 세트를 생성하게 한다. 다른 펩타이드 세트의 생산은 HSP 또는 α2M에 합성될 때 단백질 제제 내의 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 항원 펩터드의 생성 가능성을 더 높일 수 있게 한다. 바람직한 실시예에서, 소화될 단백질 제제는 두 개의 별도 반응으로 나뉘어지고, 두 개의 다른 단백질분해효소는 단백질 제제 내에 존재하는 단백질의 두 개의 다른 펩타이드 세트를 생산하는데 사용된다. 단백질, 효소 및 반응조건에 따라서, 소화되지 않은 단백질은 반응 내에 잔존할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 트립신(trypsin)과 포도알균 펩타이드분해효소 I(Staphylococcal peptidase I)는 단백질 제제를 소화시키기 위해 별개로 사용된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 사용되는 단백질분해효소는 프로테아좀(proteasome)에서 발견되는 단백질분해 활동과 유사한 활동을 보여준다. 프로테아좀(proteasome)은 세포 내에서 잘못 굴곡되거나 손상된 세포질 및 핵단백질의 리소솜외, 촉매내 분해(extralysosomal, endocatalytic degradation)를 담당한다. 프로테아좀(proteasome)은 단일 아미노산을 만들기 위해서 단백질을 완전분해할 수 있고, 최적의 주조직적합복합체 클래스 I-결합 항원결정인자(major histocompatibility complex class I(MHC I)-binding epitopes)를 생성할 수 있고, 세포독성 T 셀 항원결정인자(cytotoxic T cell epitopes)를 만들기 위해 세포 내의다른 위치에서 추가적인 마름질(trimming)을 격을 가능성이 있는 더 긴 펩타이드 전구체(precursors)를 생성할 수 있다. 프로테아좀(proteasome)의 분할선호(cleavage preference)는 기본, 산성 및 소수성 아미노산의 카르복실(COOH)-측에 존재한다. 프로테아좀(proteasome)에 존재하는 세 개의 공지된 단백질분해효소 활동은 키모트립신-유사 활동(chymotrypsin-like activity), 트립신-유사 활동(trypsin-like activity), 및 펩피딜글루타밀펩타이드-가수분해 활동(peptidylglutamylpeptide- hydrolyzing activity)이다. (Uebeland Tampe, 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:2 203-208). 이와 같이, 이러한 활동 및 특이성을 갖는 효소는 단백질 제제를 소화시키기 위하여 별개로 또는 복합적으로 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin) 및/또는 펩피딜글루타밀펩타이드(peptidylglutamylpeptide)가 사용되었다.
결과적인 펩타이드 소화는 항원 펩타이드, 비항원 펩타이드 및 단일 아미노산 잔여물을 포함한다. 반응은 또한 소화되지 않은 또는 불완전하게 소화된 항원 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질소화효소 소화는 원하는 길이 범위 내에 포함되는 단백질을 생성하기 위하여 감시된다. 바람직한 실시예에서, 생성된 펩타이드는 대략 7 내지 대략 20의 아미노산 잔여물이다. MHC class I 및 class II에 의해서 T 세포로 보내진 대부분의 항원 펩타이드는 이 범위 내에 포함된다. 다양한 실시예에서, 펩타이드 개체군은 6 내지 21, 8 내지 19, 10 내지 20의 크기 범위를 갖는 펩타이드를 포함하고, 또는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50의 아미노산 잔여물을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 항원 펩타이드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 아미노산 잔여물을 가진다. 단백질 소화의 진행과정을 감시하기 위해서 시험 반응이 수행될 수 있는데, 단백질 소화의 부분표본들이 반응 밖으로 취해지고, 트리신-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(tricine-polyacrylamide gel electrophoresis; "tricine-PAGE"), 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; "HPLC") 또는 질량분광법(mass spectrometry), 또는 펩타이드의 크기를 결정하기 위해 해당 기술분야에 공지된 다른 방법을 통해서 소화의 진행과정에 대한 감시가 수행된다. 이러한 시험 반응을 이용하여, 특정 크기 범위의 펩타이드 조각이 특정 효소 농도에서 언제 생성될 것인지가 결정될 수 있다. 조작 가능한 반응에서 다양한 변수들은 반응에서의 단백질의 양, 온도, 배양 기간, 보조 요인의 존재 등을 포함한다.
항원세포의 형태로부터 특정 크기 범위의 펩타이드 조각의 생성을 위한 적절한 조건이 설정되면, 효소반응조건은 고일 수 있는 항원 펩타이드를 생성하기 위해 다시 사용될 수 있다. 효소 소화는 펩타이드가 HSPs 또는 α2M에 합성되기 전에 종결되는 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서, 억제제가 효소 소화를 종결시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 효소 억제제는 단백질 소화에 사용되는 효소에 따라서 PMSF, 베스타틴(bestatin), 아마스타틴(amastatin), 류펩틴(leupeptin) 및 카스타틴(castatin)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 대부분 단백분해효소의 억제제는 해당 기술분야에 잘 공지되어 있다. 대안적으로, 효소 소화를 종결시키는 다른 방법은 반응으로부터 효소를 물리적으로 제거함으로서 달성된다. 이는 수지, 또는 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 반응으로부터 쉽게 제거될 수 있는 물질과 같은 고체상에 선택된 효소를 부착시킴으로서 수행될 수 있다. 단백질 제제는 소정 기간동안 고체상과 접촉하거나 고체상을 통해 흐를 수 있다. 이와 같이 운동억제된 효소는 상업적으로 구입 가능하고, 또는 해당 기술분야에 공지된 효소 운동억제 공정으로 생산될 수 있다.
소화 반응의 마지막에, 펩타이드는 제제 내에서 디펩타이드(dipeptides)와 같은 저분자량 물질 또는 단일 아미노산 잔기로부터 선택적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 Centriprep-3과 같은 막을 통해서 원심분리에 의해 분리될 수 있다. 선택적으로, 펩타이드는 크기, 전하 또는 이들의 조합과 같은 일반적인 생화학적 및/또는 생물리학적 특성에 의해서 분리될 수 있다. 해당분야의 공지기술이 분리를 수행하기 위해 사용되어, 적어도 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000의 다른 펩타이드를 포함하는 소화된 단백질 제제를 만들 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 항원세포에 내생적으로 존재하는 펩타이드는 본 발명에서 단독으로, 또는 세포질 또는 막-유도 단백질의 단백질분해 소화에 의해 생성된 펩타이드와 합성되어 사용될 수 있다. 항원세포 내에 내생적으로 존재하는 펩타이드는 생체 내에서 HSP 및/또는 MHC class I 및 II 분자에 결합되는 펩타이드를 포함한다. 본 발명에 따르면, 항원세포의 단백질 제제와 직접 분리되는 이러한 펩타이드는 HSPs 및/또는 α2M에 합성될 수 있다.
구체적인 실시예에서, 세포질 또는 막-유래 단백질은 분리공정에 사용된다. 다른 구체적인 실시예에서, 세포질 또는 막-유래 단백질은 분리공정에서 결합된다.바람직한 실시예에서, 분리에 사용되는 단백질 제제는 항원세포 내의 다른 단백질, 또는 항원세포의 세포질 또는 막으로부터 하나 또는 그 이상의 특정 단백질을 선택적으로 제거하거나 유지시키는 어떠한 준비방법에도 영향을 받지 않는다. 항원 펩타이드는 항원 펩타이드의 합성물 및 HSP 또는 MHC 분자를 우선 분리시키지 않고 세포의 단백질 제제로부터 직접 분리되지 않는다. 바람직하게, 단백질 제제는 적어도 20, 50, 100, 500, 1,000, 5,000, 10,000 또는 20,000의 다른 단백질을 포함하고, 적어도 다른 단백질의 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 및 99%가 항원세포 또는 그 세포조각, 또는 바이러스 입자 내에 존재한다.
다양한 실시예에서, 상기 방법은 단백질 제제를 ATP, 구아니듐 하이드로클로라이드(guanidium hydrochloride)로 처리하고, 및/또는 단백질 제제를 산성 조건에 노출시켜 단백질 제제 내의 HSPs 및 MHC class I 및 II 분자와 같은 단백질과 결합되는 항원 펩타이드가 녹아서 분리될 수 있게 한다. 트리후로로아세틱 산(trofluoroacetic acid)을 포함하는 많은 서로 다른 산이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 명세서에 참조를 위해 온전히 그대로 병합된 Menoret et al.(1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 262(3):813-8)과 같은, 펩타이드를 HSP-펩타이드 합성물로부터 분리하기 위한 방법이 해당 기술분야에 공지되어 있다. 해당 기술분야에 알려져 있는, 단백질 응집괴(protein aggregates)를 분리시키기 위한 Marston 및 Hartley(1990, Meth. Enzymol. 182:264-276)와 같은 방법이 또한 사용될 수 있다.
특히, 분리공정은 ATP로 항원세포의 단백질 제제를 예를 들어 한 시간동안 상온에서 노출시키고, 및/또는 트리후루오로아세틱 산(trifluoroacetic acid; TFA)으로 항원세포의 단백질 제제를 예를 들어 0.1% TFA로 처리하는 것을 포함한다. 이 처리는 바람직하게는 0.1% TFA에서 단백질 제제를 초음파처리하는 것을 포함한다. 가장 바람직한 실시예에서, 단백질 제제는 먼저 ATP에 노출되고, 이후 0.1% TFA에서 초음파처리된다. 다양한 단백분해효소 억제제가 세포용해 및 분리공정 이전에, HSPs 또는 α2M과 내생적으로 결합되지 않는 펩타이드를 생성할 수 있는 세포 단백질의 분할을 방지하거나 줄이기 위해서 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 14개의 단백분해효소 혼합물이 사용될 수 있다: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 2 mM, ethylenediaminetetreacedic acid (EDTA) 1 mM, ethylene glycolbis(P-aminoethyl ether)N,N,N'N'-tetraacetic acid (EGTA) 1 mM, (모두 Sigma(St. Louis, MO)로부터 얻어짐), 및 Antipain 20 mg/ml, Bestatin 5 mg/ml, Chemostatin 20 ptg/nil, E64 20 Jig/ml, Leupeptine 1 ttg/ml, Pepstatine 1 gg/ml, Pefabloc 40Ag/ml, 및 Apoprotein 10tkg/rnl (모두 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN)로부터 얻어짐). 단백질 제제로부터 유래된 펩타이드는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50으로부터의 범위를 갖는 다양한 크기의 항원 펩타이드 및 비항원 펩타이드를 포함한다. 이 공정의 마지막에, 펩타이드는 바람직하게 HSP 또는 α2M와 합성되기 전에 제제 내의 단백질로부터 분리됨으로써 회복된다. 예를 들어, 펩타이드는 Centriprep-3과 같은 막을 통한 원심분리에 의해, 진공건조에 의해, 또는 역상크로마토그래피(reverse phasechromatography), 즉 아세토니트릴(acetonitrile)에 의한 용리 및 물에서 0.1% TFA로 평형유지된 BioCad20 microanalytiocal HPLC Poros RH2 column (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) 내의 분할에 의해서 회복될 수 있다. 따라서, 항원세포 내에 내생적으로 존재하고 단백질 제제로부터 직접적으로 분리된 항원 펩타이드는 HSPs 및/또는 α2M에 합성될 수 있다. 대안적으로, 항원세포 내에 내생적으로 존재하는 펩타이드 및 소화된 세포질 및 막-유도 단백질로부터의 펩타이드를 포함하는 혼합된 펩타이드 개체군은 HSPs 및/또는 α2M에 합성될 수 있다.
4.3 HSPs 및 α2M의 제조
본 발명에 따라서, 항원세포로부터 유도된 항원 펩타이드는 HSPs 및/또는 α2M에 합성된다. 여기서는 본 발명에 사용하기 위한 HSPs 및 α2M을 분리 및 준비하기 위하여 사용될 수 있는 예시적인 방법이 설명된다.
여기서 스트레스 단백질(stress proteins)이라고도 언급되는, 본 발명의 실행에 유용한 열충격 단백질(heat shock proteins)은 다음의 기준을 만족시키는 세포 단백질 중에서 선택될 수 있다. 이 단백질은 세포가 스트레스가 많은 자극에 노출될 때 세포내 농도가 증가하고, 다른 단백질 또는 펩타이드를 결합시킬 수 있고, 아데노신 삼인산효소(adenosine triphosphate; ATP)의 존재하에 또는 산성 조건에서 결합된 단백질 또는 펩타이드를 방출시킬 수 있는 단백질이고, 또한 상술한 특성을 갖는 임의의 세포 단백질과 적어도 35%의 상동성(homology)을 보여주는 단백질이다.
식별되는 제1 스트레스 단백질은 열충격 단백질(HSPs)이다. 이름에서 암시하는 것처럼, HSPs는 열충격에 반응하여 세포에 의해 합성된다. 지금까지, 족 구성원(family member)의 분자량에 근거하여 다섯 개의 주요한 HSPs 클래스가 확인되었다. 이 클래스들은 sHSPs (소열충격 단백질; small heat shock proteins), HSP60, HSP70, HSP90 및 HSP100으로 불리고, 여기서 숫자는 HSPs의 대략적인 분자량을 킬로달톤(kilodaltons) 단위로 나타낸다. 주요한 HSP 족에 더하여, 세포질세망 상주단백질(endoplasmic reticulum resident protein), 즉 칼레티쿨린(calreticulin)은 또한 항원 분자에 합성될 때 면역 반응을 유도하기에 용이한 또 다른 열충격 단백질로서 인식된다(Basu and Srivastava, 1999, J. Exp. Med.189:797-202). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 스트레스 단백질은 grp78(또는, BiP), 단백질 디설파이드 아소메라제(protein disulphide isomerase; PDI), HSP110, 및 grpl70을 포함하지만(Linet al., 1993, Mol. Biol. Cell, 4:1109-1119; Wanget al., 2001, J. Immunol., 165:490-497), 이에 한정되지는 않는다. 이 족의 많은 구성원들은 영양소 박탈(nutrient deprivation), 대사붕괴(metabolic disruption), 산소라디칼(oxygen radicals), 세포내 병원체의 저산소증 및 감염(ypoxia and infection with intracellular pathogens)을 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, 다른 스트레스가 많은 자극에 대응하여 순차적으로 유도되는 것으로 발견되었다(본 명세서에 참조로서 병합된 개시물인 Welch, May 1993,Scientific American56-64; Young, 1990,Annu. Rev. Immunol.8:401-420; Craig, 1993,Science260:1902-1903; Gething,et al., 1992,Nature355:33-45; 및 Lindquist,et al., 1988,Annu. Rev. Genetics22:631-677 참조). 이 모든 족에속하는 HPSs/스트레스 단백질은 본 발명의 실행에 사용될 수 있다고 생각된다.
주요한 HSPs는 스트레스 받은 세포 내에 매우 높은 수준으로 축적될 수 있지만, 스트레스를 받지 않은 세포 내에서는 일반적인 수준으로 낮게 나타난다. 예를 들어, 고유도성 포유류(high inducible mammalian) HSP70은 정상 온도에서는 거의 검출되지 않지만, 열충격을 받으면 세포 내에서 가장 활발하게 합성되는 단백질 중 하나이다(Welch,et al., 1985,J. Cell. Biol.101:1198-1211). 대조적으로, HSP90 and HSP60 단백질은 정상 온도에서 전부는 아니지만 대부분의 포유류 세포 내에서 매우 많지만, 열에 의해서 더욱 유도된다(Lai,et al., 1984,Mol. Cell. Biol.4:2802-10; van Bergen en Henegouwen,et al., 1987,Genes Dev.1:525-31).
열충격 단백질은 현존하는 가장 잘 보존된 단백질에 속한다. 예를 들어,oli로부터의 HSP70인 DnaK는 찰상(excoriates)으로부터 얻은 HSP70 단백질과 대략 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는다(Bardwell,et al., 1984,Proc. Natl. Acad. Sci.81:848-852). HSP60 및 HSP90 족은 또한 유사하게 높은 수준의 족내 전환(intrafamilies conversion)을 보여준다(Hickey,et al., 1989,Mol. Cell. Biol.9:2615-2626; Jindal, 1989,Mol. Cell. Biol.9:2279-2283). 또한, HSP60, HSP70 및 HSP90 족은 예를 들어 35% 이상의 아미노산 동일성을 갖지만 그 발현이 스트레스에 의해 바뀌지 않는 서열상 스트레스 단백질에 관련된 단백질로 이루어지는 것으로 발견되었다. 그러므로, 여기서 사용된 열충격 단백질 또는 스트레스 단백질의 정의는, 세포 내에서의 발현 수준이 스트레스가 많은 자극에 반응하여 증가되는 삼족(three families)의 구성원과 적어도 35% 내지 55%, 보다 바람직하게는 55% 내지 75%, 가장 바람직하게는 75% 내지 85%의 아미노산 동일성을 갖는 다른 단백질, 뮤테인(muteins), 아날로그(analogs), 및 이들의 변형을 포함하는 것으로 간주된다.
HSP-항원 펩타이드 합성물의 HSP 부분이 세포로부터 정화되기를 원하는 실시예에서, 하기의 4.3.1 - 4.3.3 섹션에서 설명되는 것과 같은 예시적인 정화공정이 HSP-펩타이드 합성물에 사용될 수 있으며, 그 이후 항원 펩타이드 개체군과의 순차적인 생체외 합성(subsequentin vitrocomplexing)을 위해서, HSPs는 ATP의 존재하에 또는 산성 조건하에서 내생적인 HSP-펩타이드 합성물로부터 분리될 수 있다. 그 활동에 대해서 참조로서 본 명세서에 병합된 Peng, et al. , 1997, J. Immunol. Methods, 204:13-21; Li and Srivastava, 1993, EMBO J. 12:3143-3151 참조. 종양 세포에서 설명되겠지만, 하기에 설명되는 연구계획서(protocols)는 어떤 감염세포로부터, 또한 예를 들어 조직, 격리세포 또는 세포내 병원체(intracellular pathogen), 종양세포 또는 종양세포라인에 감염된 무한증식 진핵세포(immortalized eukaryote cell)와 같은 어떤 진핵세포로부터 HSPs를 분리하는데 사용될 수 있다.
4.3.1. HSP70-펩타이드 복합체의 제조 및 정제
HSP70-펩타이드 복합체 (HSP70-peptide complexes)의 정제(purification)는 이전에 기술되었다. 예를 들면, Udono et al., 1993, J. Exp.Med. 178:1391-1396을 참조하기 바란다. 여기서 사용되는 과정을 한정적이 아닌 예시적 방법에 의해 아래에 기술하기로 한다.
먼저, 종양세포는(tumor cells) 30mM 겹탄산나트륨(sodium bicarbonate) pH 7.5, 1mM PMSF를 구성하는 1X Lysis buffer의 3개의 체적안에 부유된다. 그리고나서, pellet는 99%이상의 세포가 세균검사에 의해 결정되는 것과 같이 용해될 때까지 얼음에 초음파처리된다. 초음파처리에 대한 대안으로서, 세포들은 95%이상이 용해될때까지 Dounce 호모제나이자(homogenizer)의 세포를 균질화하는 기계적인 전단과정(shearing)을 통해 용해될 수도 있다.
그리고, 용균액(lysate)은 완전한 세포, 핵과 다른 세포암설(cellular debris)을 제거하기 위해 10분 동안 1,000g으로 원심된다(centrifuged). 결과적으로 생기는 supernatant는 90분 동안 100,000g으로 재원심(recentrifuged)되어 추출되고, 2mM의 칼슘이온(Ca2+)과 2mM의 마그네슘이온(Mg2+)을 함유하는 인산완충식염수(PBS:phosphate buffered saline)로 평형화된 콘카나바린 A세파로스 (Con A Sepharose)와 혼합된다. 상기 세포가 기계적 분단과정을 통해 용해되는 경우에 있어서, 상기 supernatant는 콘카나바린 A세파로스(Con A Sepharose)와 혼합되기 이전에 2X lysis buffer와 동등한 체적으로 희석된다. 상기 supernatant는 4 에서 2 내지 3시간 동안 카나바린 A세파로스 (Con A Sepharose)와 결합된다. 결합되지 못한 물질은 추출되고, 36시간 동안 (3회, 각회마다 100 volumes) l0mM Tris-Acetate pH 7.5, 0.1mM EDTA,lOmM NaCl, 1mM PMSF에 투석된다. 이후에, 상기 투석물은 20분 동안 17,000rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 원심된다. 그리고, 결과적으로 생기는 supernatant는 추출되어 20mM Tris-Acetate pH 7.5, 20mM의NaCl, 0.lmM의 EDTA와 15mM의 2-mercaptoethanol에 평형화된 Mono Q FPLC column에 적용된다. 상기column은 20mM 내지 50mM의 NaCl gradient와 향상되며, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분류되고, 적절한 anti-HSP70 antibody (clone N27F3-4, StressGen 등과 같은)를 이용한 immunoboltting에 의해 특징지워지는 화분(fraction)으로 분리된다.
Anti-HSP70 antibody와의 면역반응성이 강한 화분(fractions)은 풀(pool)되고, HSP70-펩타이드 복합체 (HSP70-peptide complexes)는 황산암모늄에 의해, 특별히 50% 내지 70%의 황산암모늄 cut으로 침전된다. 결과적으로 생기는 침전물은 17,000rpm (SS34 Sorvall rotor)으로 원심됨으로써 추출되고, 70%의 황산암모늄에 의해 씻겨진다. 그리고, 씻겨진 침전물은 가용화되며, 잔여의 황산암모늄은 SephadexR G25 column(Pharmacia) 상의 겔 여과에 의해 모두 제거된다. 필요하다면, 이와 같이 얻을 수 있는 HSP70 제법이 상기의 Mono Q FPLC Column을 통하여 재정화될 수 있다.
HSP70-펩타이드 복합체 (HSP70-peptide complex)는 이 방법을 이용하여 균일하게 정화될 수 있다. 일반적으로 1mg의 HSP70-펩타이드 복합체는 1g의 세포/조직으로부터 정화될 수 있다.
HSP70의 정화를 위한 개량된 방법은 용균액의 HSP70이 ATP 또는 가수분해 저항성의 ATP 상사체와 결합할 수 있는 것과 같이, 세포 단백질을 ATP나 고체의 기질에 첨부되는 ATP의 가수분해 저항성의 ATP 상사체와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 고체의 배양기판 (예를 들면, ATP-agarose)에 첨부되는 ATP를 수반하는 카람크로마트그라피 (chromatography)를 사용한다. 결과적으로 생기는 HSP70 제법은 순도가 높고, 펩디드가 오염되는 것을 방지할 수 있다. 또한, HSP70 수율은 10 이상의 fold에 의해 현저하게 증가한다.
대안적으로, ATP 대신에, ADP의 가수분해저항성의 유사물을 가지는 크로마트그라피 (chromatography)가 HSP70-펩타이드 복합체의 정화를 위해 사용될 수 있다. 한정적이 아닌 예시적 실시예로서, ATP-아가로스 크로마트그라피(ATP-agarose chromatography)에 의한 펩타이드로부터 자유로운 HSP70의 정화는 다음과 같이 실행될 수 있다:
메세드린 A 육종세포(5억의 세포)는 저장성 완충액에 균질화되고, 용균액은 4 에서 90분동안 100,000g으로 원심된다. column은 완충액에서 씻겨지고, 3mM ATP의 5 column volumes으로 용해 분리된다. HSP70은 용출하는 총 15개의 화분(fraction)을 2 내지 10 화분으로 용출한다. 상기 HSP70은 이 과정을 이용하여 확실히 균일하게 정화될 수 있다.
4.3. 2. HSP90-펩타이드 복합체의 제조 및 정제
이하, 한정적 실시예가 아닌 예시적 실시예를 통하여 본 과정에 대해 상세히 설명하기로 한다.
먼저, 종양세포는(tumor cells) 30mM 겹탄산나트륨(sodium bicarbonate) pH 7.5, 1mM PMSF를 구성하는 1X Lysis buffer의 3개의 체적안에 부유된다. 그리고나서, pellet는 99%이상의 세포가 세균검사에 의해 결정되는 것과 같이 용해될 때까지 얼음에 초음파처리된다. 초음파처리에 대한 대안으로서, 세포들은 95%이상이 용해될때까지 Dounce 호모제나이자(homogenizer)의 세포를 균질화하는 기계적인 전단과정(shearing)을 통해 용해될 수도 있다.
그리고, 용균액(lysate)은 완전한 세포, 핵과 다른 세포암설(cellular debris)을 제거하기 위해 10분 동안 1,000g으로 원심된다(centrifuged). 결과적으로 생기는 supernatant는 90분 동안 100,000g으로 재원심(recntrifuged)되어 추출되고, 2mM 의 칼슘이온과 2mM의 마그네슘 이온을 함유하는 인산완충식염수(PBS:phosphate buffered saline)로 평형화된 콘카나바린 A세파로스 (Con A Sepharose)와 혼합된다. 상기 세포가 기계적 분단과정을 통해 용해되는 경우에 있어서, 상기 supernatant는 콘카나바린 A세파로스(Con A Sepharose)와 혼합되기 이전에 2X lysis buffer의 동등한 체적으로 희석된다. 상기 supernatant는 4 에서 2 내지 3시간 동안 카나바린 A세파로스 (Con A Sepharose)와 결합된다. 결합되지 못한 물질은 추출되고, 36시간 동안 (3회, 각회마다 100 volumes) l0mM Tris-Acetate pH 7.5, 0.1mM EDTA,lOmM NaCl, 1mM PMSF에 투석된다. 이후에, 상기 투석물은 20분 동안 17,000rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 원심된다. 그리고, 결과적으로 생기는 supernatant는 추출되어 세포용해완충액(lysis buffer)과 평형화된 Mono Q FPLC column에 적용된다. 상기 단백질은 200mM 내지 600mM 염화나트륨의 salt gradient와 함께 용출된다.
상기 용출된 화분(fraction)은 SDS-폴리아크릴 아미도겔 전기 영동(SDS-PAGE)과 3G3 (친화성 Bioreagents)와 같은 반HSP90 항체(anti-HSP90 antibody)를 사용하는 임노브롯팅에 의해 식별되는 HSP90-펩타이드 복합체를 포함하는 화분(fraction)에 의해 본획된다. HSP90-펩타이드 복합체는 이 과정을 통하여 확실히 균일하게 정화될 수 있다. 일반적으로, 150 내지 200 g의 HSP90-펩타이드 복합체는 1g의 세포/조직으로부터 정화될 수 있다.
4.3. 3. GP96-펩타이드 복합체의 제조 및 정제
이하, 한정적 실시예가 아닌 예시적 실시예를 통하여 본 과정에 대새 상세히 설명하기로 한다.
종양의 환약(pellet)은 30mM 겹탄산나트륨 완충액 (pH 7.5), 1mM PMSF로 구성된 완충액의 3개의 체적안에 부유된다. 상기 세포 환약은 세포의 95%이상이 용해될때까지 Dounce 호모제나이자(homogenizer)로 균질적으로 용해된다 (호모제나이자의 적절한 정화는 세포 유형에 따라 다양하다).
상기 용균액(lysate)은 완전한 세포, 핵과 다른 세포암설(cellular debris)을 제거하기 위해 10분 동안 1,000g으로 원심된다(centrifuged). 이러한 원심과정을 통해 생긴 supernatant는 90분 동안 100,000g으로 재원심된다(recentrifuged). gp96-펩타이드 복합체는 100,000의 환약(pellet)이나 상기 supernatant를 통해 정화될 수 있다.
상기 supernatant로부터 정화되는 경우에 있어서, 상기 supernatant는 2mM의 칼슘이온과 2mM의 마그네슘 이온을 포함하는 PBS와 평형화된 콘카나바린 A세파로스(Con A Sepharose)와 4 에서 2내지 3시간 동안 혼합된 supernatant와 2X세포 용해 완충액의 동등 체적으로 희석된다. 그리고, 상기 현탁액(slurry)은 수행기둥(column)에 둘러싸여 OD280이 baseline으로 떨어질 때까지 1X 세포 완충액으로 씻겨진다. 이어서, column은 2mM의 칼슘이온과 2mM의 마그네슘 이온을 포함하는PBS에 용해된 10%의 a-methly mennoside(a-MM)의 1/3 column bed volume으로 씻겨진다. 상기 column은 parafilm으로 봉해지고, 37 에서 15분 동안 부화된다. 그리고, 상기 column은 실온으로 차가워지고, 상기 parafilm은 column 바닥으로부터 제거된다. a-mm buffer의 5개 column volume들은 상기 column에 적용되고 상기 용출액은 SDS-폴리아크릴 아미도겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 분석된다. 일반적으로, 결과적으로 생기는 물질은 60 내지 90% 정도 순수하고, 이것은 세포형과 조직(tissue)-to-lysis 완충 비율에 의존한다. 이어서, 상기 샘플은 5mM의 인산나트륨(pH 7)을 포함하는 완충액으로 평형화된 Mono Q FPLC column (Pharmacia)에 적용된다. 상기 단백질은 0-1M 염화나트륨 gradient를 가지는 column으로부터 용출되고, gp96 화분은 400mM 내지 550mM 염화나트륨 사이에 용출된다.
그러나, 이러한 과정은 gp96-펩타이드 복합체를 지속적으로 만들어내기 위해 단독으로 사용되거나 결합에 의해 사용되는 두가지 선택적인 단계에 의해 수정될 수 있다. 하나의 선택적인 단계는 콘카나바린 A 순화단계 이전에 유안 침전을 포함하고, 다른 하나의 선택적인 단계는 콘카나바린 A 순화 단계 이후, Mono Q FPLC 단계 이전에 DESE-Sepharose 순화 단계를 포함한다.
첫 번째 선택 단계에 있어서, 100,000g의 원심 단계로부터 생기는 supernatant는 황산암모늄의 첨가에 의해 50%의 황산암모늄의 최종농도로 된다.
서서히 빙수의 트레이에 놓여지는 비커의 용액을 교반함과 동시에 황산암모늄은 천천히 더해진다. 상기 용액은 약 30분에서 12시간까지 4 에서 교반 된다. 그리고, 결과적으로 생기는 용액은 6,000 rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 원심된다.
이 단계로부터 생기는 supernatant는 제거되고, 황산암모늄 용액의 첨가에 의해70%의 황산암모늄 포화를 가져오며, 6,000rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 원심된다. 이 단계로부터 생기는 pellet는 추출되어 pellet를 씻어내기 위해 70%의 황산암모늄을 포함하고 있는 PBS안에 부유된다. 이 혼합액은 6,000rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 원심된다. 그리고, 상기 pellet는 2mM 의 칼슘이온과 마그네슘 이온을 포함하고 있는 PBS에 용해된다. 용해된 물질은 15,000rpm (Sorvall SS34 rotor)으로 짧은 원심에 의해 제거된다. 그리고, 용액은 콘카나바린 A 세파로스를 혼합할 수 있으며, 과정은 전과 같이 진행된다.
두 번째 선택적인 단계에 있어서, 콘카나바린 A 세파로스로부터 용출된 화분을 포함하는 gp96 화분은 pool되고, buffer는 5mM의 나트륨·인산 완충액(pH 7)과 300mM의 염화나트륨을 교환하고, 바람직하게는 Sephadex G25 column으로 교환한다. Buffer 교환 이후에, 상기 용액은 5mM의 나트륨·인산 완충액(pH 7)과 300 mM의 염화 나트륨으로 이미 평형화된 DEAE-Sepharose와 혼합된다. 상기 단백질 용액과 beads는 1시간 동안 서서히 혼합되고, column으로 스며들게 된다.
이후에, 상기 column은 흡광도(absorbance)가 280nm에서 baseline으로 떨어질 때까지 5mM의 나트륨·인산 완충액과 300mM의 염화나트륨으로 씻겨진다. 이어서, 결합된 단백질은 5mM의 나트륨·인산 완충액(pH7)과 700mM의 NaCI의 5 volume을 가지는 column으로부터 용출된다. 화분(fraction)을 포함하는 단백질은 175 mM까지 소금 농도를 낮추기 위해서 pool되고, 5mM의 나트륨·인산 완충액으로 희석된다.
여기서 생기는 물질은 나트륨·인산 완충액(pH 7)과 앞서 설명한 바와 같이 용출된 Mono Q FPLC column (Pharmacia)에 결합하는 단백질로 평형화된 Mono Q FPLC column (Pharmacia)에 적용된다.
그러나, 당업자가 반복적인 실험에 의해 두 번째 선택적 단계를 순화 프로토콜에 접목시킨 이점을 활용할 수 있게 된 것은 다행스러운 일이다. 또한, 각 선택적 단계를 합치는 이점은 시작시점의 물질에 의존된다는 것도 인정할 만하다.
gp96 화분9(fraction)이 100,000g pellet로부터 분리될 때, pellet는 1%의 데오키시코르산나트륨이나 1%의 oxtyl 그르코피라노시드 (그러나, 마그네슘이온과 칼슘 이온 없이)를 포함하는 PBS의 5 volumes에 부유 되어 1시간 동안 얼음에 부화된다. 상기 현탁액은 30분 동안 20,000g으로 원심되며, 결과적으로 생기는 supernatant는 detergent를 제거하기 위해서 PBS (마그네슘 이온과 칼슘이온 없이)의 몇몇 변화에 대해 투석된다. 상기 투석액은 90분 동안 100,000g으로 원심되며, 상기 supernatant는 추출되고, 칼슘과 마그네슘은, 각각 최종적인 농도를 2 mM로 하고자 supernatant에 더해진다. 이어서, 샘플은 gp96-펩타이드 복합체를 100,000g의 supernatant로부터 분리하기 위한 무개변이나 개변법에 따라 정화된다.
상기 gp96-펩타이드 복합체는 이러한 과정을 통하여 균일하게 정제될 수 있다. 10 내지 20 g의 gp96은 1g의 세포/조직으로부터 분리될 수 있다.
4.3. 4. α2M의 제조 및 정제
Alpha-2-macroglobulin은 상업적 공여원으로부터 구입되거나 인혈로부터 그것을 정화함으로써 조제될 수 있다. 혈액으로부터 α2M을 정제하기 위하여 다음의비한정적인 프로코콜이 한 방법으로서 사용될 수 있다:
혈액은 한 주체로부터 모아져 응고될 수 있다. 0.04m의 트리스 완충액(pH 7.6)에다가 0.3M의 염화나트륨으로 평형화되는 겔 여과 기둥 (Sephacryl S-300R)에 적용되는 혈청을 얻기 위하여 상기 혈액은 14,000 x g아래에서 30분 동안 원심된다. 65ml의 column이 약 10ml의 혈청을 위해 사용된다. 3ml의 화분이 모아지고, 각 화분은 α2M 특이항체를 사용하는 dot blot에 의해 α2M의 존재를 위해 시험된다. α2M 양성 화분은 pool되고, 상기 완충액을 PMSF를 따르는 0.1M Sodium Phosphate buffer pH 7.5와 교환하기 위하여 PD 10 column에 적용된다. 상기 pool된 화분(fraction)은 인산완충액과 평형화된 콘카나바린 A column(10ml)에 적용된다. 상기 column은 씻겨지고, 상기 단백질은 5%의 methylmannose pyranoside로 용출된다. 상기 용출제(eluent)는 완충액을 Sodium Acetate buffer (0.05M ; pH6.0)로 바꾸기 위해 PD10 column에 작동된다. DEAE column은 초산염 완충액과 평형화되고, 샘플은 DEAE column에 적용된다. 상기 column은 씻겨지고 단백질은 0.13M의 나트륨 초산염으로 용출된다. 이후에, 상기 α2M을 수반하는 분획(fraction)은 pool된다. 나트륨 도데실 sulfatepolyacrylamide 겔 전기 영동에 의해 검정되듯이, α2M은 이 과정을 통하여 확실히 균일하게 정화될 수 있다.
4.3. 5. 열 충격 단백질 및 α2M의 재조합 발현
본 발명의 한 실시예에 있어서, HSPs와 α2M은 재조합형 수단을 통해 HSPs와 α2M의 높은 레벨을 나타내는 세포로부터 조제될 수 있다. 많은 HSPs와 α2M의 아미노산 배열과 뉴클레오티드 배열은 GenBank와 같은 배열 데이터베이스에 일반적으로 이용할 수 있다. 상기 데이터베이스를 열람하기 위하여 Entrez와 같은 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있으며, 검색번호를 이용하여 관심있는 아미노산 배열과 유전자 배열 데이터를 검색할 수 있다.
이러한 데이터베이스는 다양한 등급의 배열들을 정렬 빈도와 통계학에 의해 유사한 배열을 서열매긴 FASTA와 BLAST 같은 프로그램을 이용하는 질의 배열과 유사하게 규정짓기 위해 사용될 수 있다. 그러한 조성물, 방법, 본 발명의 HSP-펩타이드 복합체의 조제를 위해 사용되는 HSP의 무제한적인 실시예인 뉴클레오티드 배열은 다음과 같다:
human HSP70, Genbank Accession No. M24743, Hunt et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82 : 6455-6489; human HSP90, Genbank Accession No. X15183, Yamazaki et al.,Nucl. Acids Res. 17: 7108; human gp96: Genbank Accession No.X15187, Makiet al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 5658-5562; human BiP: Genbank Accession No. M19645; Ting et al., 1988, DNA 7: 275-286 ; human HSP27, Genbank Accession No. M24743; Hickey etal., 1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45 ; mouse HSP70: Genbank Accession No.M35021, Hunt et al., 1990, Gene87 : 199-204; mouse gp96: Genbank Accession No. M16370, Srivastava et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:3807-3811 ; 및 mouse BiP: Genbank Accession No. U16277, Haas et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 2250-2254. HSP를 코드화하고 있는 퇴화동물(Degenerate) 배열 또한 사용될 수 있다.
여기서 사용되는 " α2M"이라는 용어는 다른 폴리펩타이드 조각(polypeptide fragments), 이와 유사한 물질(analogs)을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 α2M을 수반하는 최소한 35% 내지 55%, 바람직하게는 55% 내지 75%, 가장 바람직하게는 75% 내지 85%의 아미노산 식별(identity)을 포함하고, 항원성 펩타이드를 수반하고, 항원제시 세포에 의해 포착될 수 있으며 항원성품자에 대해서 면역응답을 꺼낼 수 있는 착체를 형성할 수 있는 α2M의 변종(variant)을 통칭한다. 본 발명의 α2M 분자는 상업적으로 구입되거나 자연스러운 소스로부터 정제되거나 (Kurecki et al., 1979, Anal. Biochem. 99: 415-420), 화학적으로 합성되거나, 유전자 재조합을 통해 생성될 수도 있다.
본 발명의 α2M 폴리펩타이드의 조제를 위해서 사용될 수 있는 α2M 배열의 비극한의 실시예는 이하와 같다: Genbank Accession Nos. M11313, P01023, AAA51551;Kan et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. 82:2282-2286. α2M코드를 코드화하고 있는 퇴화동물배열이 또한 사용될 수 있다.
일단 HSP를 코드화하고 있는 뉴클레오티드 배열 또는 선택된 α2M이 식별되면, 뉴클레오티드 배열 또는 그들의 조각은 얻어지고, 형질발현을 위한 발현 벡터로 클론화된다. 상기 발현 벡터는 HSP 또는 α2M의 생식을 위한 주세포에 도입될 수 있다. 재조합형의 HSP나 α2M을 위한 방법에 대해서 상세히 설명하기로 한다.
DNA는 조직, 세포, 일반적인 분자생물학 기술 (Methods in Enzymology, 1987, volume 154, Academic Press; Sambrook etal. 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; andCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds.), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York 등 참조)을 이용하는 클론화된 DNA (예를 들면, DNA "library")로부터 직접 DNA 증폭 또는 분자 클로닝에 의해 얻어낼 수 있다. 게놈 DNA로부터 파생된 클론은 코딩 영역과 더불어 regulatory 및 인트론 DNA를 포함할 수 있다; cDNA로부터 파생된 클론은 exon 배열만을 포함한다. 소스가 무엇이든지간에, HSP나 α2M gene은 그 gene의 생식을 위한 적절한 벡터로 클론되어야만 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 관련이 있거나 상동적인 HSP나 α2M의 주지의 배열로부터 설계된 프라이머를 이용하는 PCR법(polymerase chain reaction)에 의하여 DNA는 게놈이나 cDNA로부터 확대될 수 있다. PCR은 선택 이전에 DNA 클론이나 게놈 또는 cDNA library 내의 원하는 배열을 확대하는 데 사용된다. PCR은 thermal cycler 와 Taq polymerase (GeneAmp@)를 사용하여 수행할 수 있다. PCR은 gene 또는 중요한 gene 단편을 얻기 위해 일반적으로 사용된다. 예를 들면, 원하는 길이의 HSP나 α2M을 코드화하고 있는 뉴클레오티드 배열은, 열린 독출 fram을 코드화하고 있는 뉴클레오티드 배열의 측면에 위치하는 PCR 프라이머를 이용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 이런 종류의 부위를 이용할 수 있는 경우, HSP나 α2M gene 배열은 한정 엔드누크레아제(s)를 가지는 적당한 부위에서 찢어질 수 있다. 그리고, HSP 또는 α2M gene를 코드화하고 있는 DNA의 단편을 릴리스한다. 편리한 제한 사이트를 이용할 수 없는 경우에는, 그것들이 부위특이적 돌연변이 및/또는 공지기술의 DNA 증폭방법에 따라 적당한 분류학적 위치에 만들어질 수있다 (Shankarappa etal., 1992, PCR Method Appl. 1: 277-278 참조). HSP나 α2M을 코드화하는 DNA 단편은 분리되어 적당한 발현벡터에 결합된다. 그리고, 적당한 해독 범위가 유지되는 것을 확실히 하는 주의가 필요하다.
다른 실시예에 있어서, 게놈 DNA로부터 HSP 또는 α2M 유전자(gene)에 대한 DNA 분절(fragment)은 게놈 라이브러리의 형성을 초래한다(generated to). HSPs 또는 α2M에 연관된 몇몇 배열 인코딩(sequences encoding)은 유용할 뿐만 아니라, 정제(purifed) 및 라벨화(labeled) 할 수 있기 때문에, 게놈 DNA 라이브러리 내의 복제된(cloned) DNA 분절은 라벨된 프로우브(labeled probe)(Benton and Davis, 1977), Science 196:180, Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961)에 핵산 교배(nucleic acid hybridization)에 의해 가려질 수 있다(screened). 프로우브에 대해 실질적으로 상동성(homology)을 수반하는 이들 DNA 분절(fragment)은 교배될 것이다. 또한, 효소 소화작용(s) 제한과 공지의 제한 맵에 따른 이들의 분절 사이즈를 비교함으로써 적절한 분절(fragment)을 식별할 수 있다.
게놈 DNA의 HSP 또는 α2M를 분리하는 다른 방식은 주지의 배열(sequence) 또는 cDNA의 합성(synthesizing)으로부터 HSP 또는 α2M을 인코딩하는 mRNA까지의 유전자 배열 자체를 화학적으로 합성하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, HSP 또는 α2M 유전자의 cDNA 복제에 대한 RNA는 상기 HSP 또는 α2M을 발현하는(express) 세포로부터 분리될 수 있다. cDNA 라이브러리는 게놈 DNA 라이브러리를 스크린하기 위해 개시된 상기 방식과 같은 방법에 의해 스크린되거나(screened), 공지 기술의 방법에 의해 유도될 수 있다. 만일, HSP 또는 α2M에 대한 항체를 이용할 수 있는 경우에는, 상기 HSP 또는 α2M는 HSP 또는 α2M-합성 복제에 대해 라벨된 항체와 결합(binding)함으로써 식별될 수 있을 것이다.
HSP 또는 α2M의 뉴클레오티드 배열 인코딩의 복제를 위한 다른 특정의 실시예는 이하 실시예(examples)로서 나타내지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 특정 실시예에 있어서, HSP 또는 α2M을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열은 식별될 수 있으며, 선행기술(이종(cross-species ) 교배에 채용되는 방법을 포함)로서 잘 알려진 엄격(stringency)한 변수(various) 조건하에서 HSP 또는 α2M을 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 프로우브에서 교배하여 얻을 수 있다.
공지 기술로서 알려진 돌연변이 생성의 어떠한 기술도, 발현된(expressed) 펩타이드 배열에서 아미노산 치환(s)을 만들기 위해, 또는 한층 조작을 더 용이하게 하기 위해 제한 사이트를 생성/삭제하기 위하여, DNA의 배열의 개별 뉴클레오티드를 수정하는데 이용할 수가 있다. 이러한 기술들은 화학적 돌연변이, 시험관내 부위 특이적 돌연변이(Hutchinson et al., 1978, J.Biol. Chem. 253:6551), 올리고뉴클레오디드 특이적 돌연변이(Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463;Hill et al., 1987, Methods Enzymol. 155:558-568), PCR-based 오버랩 확장(Ho et al.,, 1989, Gene 77:51-59), PCR-based 메가프리미어(megamrimer) 돌연변이(Sarkar et al., 1990, Biotechniques 8:404-407 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 수정(Modifications)은 이중 꼬임(double stranded) dideoxynucleotide DNA 배열에 의해 확정될 수 있다.
특정 실시예에 있어서, nonsecreted 된 HSP의 분비성 형태를 인코딩하는 핵산은 본 발명의 방법을 실시하는데 이용된다. 이러한 핵산은 소포체 보관 유지 시그널(ER retention signal)(KDEL)에 대한 코딩 배열을 삭제함으로써 만들 수 있다. 임의적으로, KDEL 코딩 배열은 인식 및 HSP의 정제(purification)가 용이하도록 예컨대, 마우스의 IgGl의 Fc부분을 분자 태그로 교체할 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 분자 태그는 자연스럽게 숨겨진 HSP 또는 α2M에 추가될 수 있다. 특허 협력조약 공표 no. WO99/42121은 gp96의 소포체 보관 유지 시그널의 결여가 감염된 종양 세포들로부터 gp96-Ig 펩타이드 복합체의 분비와, Protein A.을 이용한 아피니티(affinity) 크로마토그라피에 의한 정재와, ELISA 및 FACS에 의해 검출이 용이한 마우스의 IgGl의 KDEL-deleted gp96의 통합을 초래한다(result in)는 것을 증명한다.
4.3.5.1의 발현 시스템(EXPRESSION SYSTEMS)
HSP 또는 α2M 분자를 인코딩하는 뉴플레오티드 배열은 재조합형 세포의 발현과 전파(propagation)을 위한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 형질 발현 구조물은 적당한 호스트 세포 내의 HSP 또는 α2M 분자의 발현을 허락하는 하나 또는 그 이상의 제어 영역과 실시가능하게 연계되는 HSP 또는 α2M를 인코딩하는 뉴클레오티드 배열을 언급한다.퓰챨〈 構 연계된발현된 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드 및 제어 영역이 결합되고, 전사(transcription), 최종적으로 HSP 또는 α2M 배열의 해석을 허용하는 방식으로 위치된 연계를 의미한다(refer to). 다양한 발현 벡터는 특히 한정되는 것을 아니지만 예를 들면, 플라즈미드, 코스미즈(cosmids), 파지(phage), 파지미드(phagemids) 또는 수정된 바이러스들을 포함하는 HSP 또는 α2M의 발현에 사용될 수 있다. 실시예는 람다 도함수와 같은 bacteriophage 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 도함수 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene)를 포함한다.
일반적으로, 이러한 발현 벡터는 적절한 호스트 세포 내 벡터의 전파를 위한 복제의 함수 기원과, HSP 또는 α2M 유전자 배열의 삽입을 위한 제한 효소(restriction endonuclease) 사이트와, 하나 또는 그 이상의 선택 마커를 포함한다.
포유동물 호스트 셀 내의 HSP 또는 α2M의 발현에 있어서, 예를 들어 SV40의 초기 후기 촉진 인자(promoters), cytomegalovirus(CMV) immediate 초기 촉진 인자 및 라우스 육종 바이러스 단말 반복(RSV-LTR) 촉진 인자가 다양한 제어 지역으로서 이용될 수 있다.
포유동물 세포에 유용할 수 있는 유동성 촉진 인자는 특히 한정되지 않지만 예를 들어, 메타로치오네인 II 유전자, 마우스 유방 종양 바이러스 그르코코르치코이드(glucocorticoid) 응답 말단 반복(MMTV-LTR), -인터페론 유전자 및 HSP70 유전자((Williams et al., 1989, Cancer Res. 49: 2735-42; Taylor et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 165- 75)을 포함한다. HSP 또는 α2M의 형질 발현의 효율은 발현 벡터 안에 적절한 전사 강화 요소(enhancer elements) 예를 들어, SV40 바이러스 내에서 발견되는 강화 요소, Hepatitis B 바이러스, 사이트메가로위르스(cytomegalovirus), 면역 글로블린 유전자, metallothionein,p-엑틴(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544; Gorman, 1990, Curr. Op. IN BIOTECHNOL. 1: 36-47 참조)를 포함시킴으로써 강화시킬수 있다.
또한, 상기 발현 벡터는 한 타입 이상의 호스트 세포 내에서 벡터의 복제 및 유지, 또는 호스트 염색체(chromosome) 내 벡터의 통합을 허용하는 배열을 포함할 수 있다. 이런 종류의 배열은 복제 기점(replication origins), 자기 복제 배열(ARS), 센트로메아(centromerer) DNA 및 테로메아(telomere) DNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 적어도 2 종류의 호스트 세포에 대해 유지 또는 복제될 수 있는 셔틀(shuttle) 벡터를 사용하는 것도 편리하다.
또한, 발현 벡터는 HSP 또는 α2M를 인코딩하는 DNA를 포함하는 호스트 세포를 식별 또는 분리하기 위해 선택적으로 또는 screenable으로 마커 유전자를 포함할 수 있다. 장기적으로, 포유동물 세포의 안정 형질 발현(stable expression)을 위해 HSP 또는 α2M의 고 수율 생산(high yield production)이 바람직하다. 다양한 선택계(selection systems)가 포유동물 세포에 사용될 수 있는데, 특히 한정되는 것은 아니지만 예를 들어, Herpes simplex 바이러스 thymidine kinase(Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine- guanine phosphoribosyltransferase(Szybalski and Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 48: 2026) 및 adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) 유전자가 각각 tk, hgprf 또는 aprt 세포에 고용될 수 있는 것을 포함한다. 또한, 대사길항 대항물질(antimetabolite resistance)이 메토트렉사트(methotrexate)(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 3567;O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 1527)에 대항성을 부여하는(confer) dihydrofolate 환원효소; mycophenolic acid(Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 2072)에 대항성을 부여하는 gpt; aminoglycoside G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J.Mol.Biol.150:1)에 대항성을 부여하는 네오마이신 인산전달효소(neomycin phosphotransferase (neo)); 및 하이그로마이신(hygromycin)(Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)에 대항성을 부여하는 하이그로마이신
인산전달효소(hygromycin phosphotransferase (hyg))에 대한 선택의 베이스로서 이용될수 있다. 다른 선택가능한 마커로는 특히 한정되지 않지만, 예를 들어 히스티디놀(histidinol) 및 ZeocinTM 이 사용가능하다.
실시가능한 제어 영역을 수반하는 HSP 또는 α2M 코딩 배열을 포함하는 형질 발현 구조물은 추가 클로닝(예, 미국 특허 번호 5,580, 859 참조) 없이 본 발명의 HSP 또는 α2M 복합체의 생산 및 발현에 대한 적절한 호스트 세포에 직접적으로 도입될 수 있다. 또한, 이 형질 발현 구조물은 예컨대, 상동적 재조합을 거쳐, 호스트 세포의 게놈에 코딩 배열의 통합이 용이하도록 하는 DNA 배열을 포함할 수 있다. 본 실시예에서는, 호스트 세포 내에서 HSP 또는 α2M 분자를 전파(propagate) 또는 발현하기 위하여 적정의 호스트 세포에 적합한 복제 기점(replication origin)을 포함하는 발현 백터를 반드시 사용할 필요는 없다.
복제된 HSP 또는 α2M 코딩 배열을 포함하고 있는 형질 발현 구조물은 공지된 다양한 선행기술 특히 한정하지 않지만, 예를 들 calcium phosphate mediatedtransfection (Wigler et al., 1977, Cell 11 : 223-232), liposome-mediated transfection (Schaefer-Ridder et al., 1982, Science 215: 166-168), electroporation (Wolff et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3344) 및 microinjection (Cappechi, 1980, Cell 22: 479-488)를 포함하는 기술을 이용하여 포유동물 호스트 세포에 도입될 수 있다.
본 발명에 기재된 복제(cloning) 및 발현은 잘 알려진 공지 기술을 이용하여 주지 DNA 배열로부터 조합되거나 합성될 수 있다. 상기 제어 영역 및 강화 요소는 자연적이거나 합성된 다양한 기점(origin)이 될 수 있다. 또한, 소정 벡터들과 호스트 세포는 상업적으로 얻을 수 있다. 유용한 벡터의 non-limiting 실시예가 본 명세서에 인용된 Current Protocols in Molecular Biology, 1988, ed. Ausubel et al., Greene Publish.Assoc. & Wiley Interscience의 부록 5와, Clontech Laboratories, Stratagene INC., 및 Invitrogen, Inc. 와 같은 상업적 공급자의 카탈로그에 기재되어 있다.
대안으로, 복수의 viral-based의 발현 시스템이 HSPs 또는 α2M의 재조합 발현을 위한 포유동물 세포에 의해 이용될 수가 있다. DNA 바이러스 척추를 사용하는 벡터들은 원숭이 바이러스 40(SV40)(Hamer et al., 1979, Cell 17 : 725), adenovirus (Van Doren et al., 1984, Mol. Cell Biol. 4: 1653), adeno-associated virus (McLaughlin et al., 1988, J. Virol. 62: 1963) 및 유두종 바이러스(bovine papillomas virus) (Zinn et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4897)로부터 유래되어 왔다. 발현 벡터로서 아데노바이러스(adenovirus)가 사용되는 경우에는, 도너 DNA 배열이 예를 들어, 후기 촉진 인자 및 3분절 리더 배열(tripartite leader sequence)로서 아데노바이러스 복사/해석 제어 지역에 묶일 수도 있다. 따라서, 이 키메라 유전자(chimeric gene)은 생체외 또는 생체내( in vitro or in vivo) 재결합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수도 있다. 바이러스 게놈(예, E1 또는 E3 지역)의 비본질 영역(non-essential region)으로의 삽입은 실현가능(viable)하며, 감염된 호스트(예. Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 : 3655-3659 참조) 내의 이종 생산물(hetrologous products를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 초래한다(result in).
유두종 바이러스(Bovine papillomavirus)(BPV)는 사람을 포함하는 보다 고등의(higher) 척추동물들과, 이의 에피솜(episome)으로서의 DNA 복제를 감염시킬 수 있다. 복수의 셔틀 벡터는 포유동물 세포 내에서 안정되고, 멀티카피(20-300카피/세포) 세포질 인자(extrachromosomal elements)로서 존재하는 재조함 유전자 발현을 위해 개발되어 왔다. 일반적으로, 이러한 벡터들은 BPV DNA(전체 게놈 또는 69%의 트란스포밍 분절(transforming fragment))의 세그먼트, 넓은 기생 범위(a broad host range)를 수반하는 촉진 인자, 폴리아데닐화 인자(polyadenylation signal), 선택가능한 마커 및 벡터가 대장균(E. coli) 에 전파되도록 하는 "무독성(poisonless)" 플라즈미드 배열을 포함한다. 박테리아 내의 건설(construction) 및 증폭(amplification)에 따르면, 형질 발현 유전자 건설은 예를 들어, 인산 칼슘 공동 침강 반응(calcium phosphate coprecipitation) 또는 electroporation 기술에 의해 배양 포유 세포를 감염시킨다. 형질전환표현형(transformed phenotype)이 분명하지 않은 이들 호스트 세포에 대해서, 형질전환주(transformants)의 선택은 히스티디놀(histidinol) 및G418 저항물질과 같이 지배적으로(dominant) 선택가능한 마커를 사용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, pBCMGSNeo와 pBCMGHis와 같은 BPV 벡터들은 HSP 또는 α2M 형질 발현을 위한 세포 타입의 다양한 범위에 감염될수 있는 HSP 또는 α2M(Karasuyama et al., Eur. J. Immunol. 18 : 97-104; Ohe et al., Human Gene Therapy 6: 325-33) 발현에 이용될 수 있다.
대안으로, 우두 7.5K 촉진 인자가 사용될수 있다(예. , Mackett et all., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864 ; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 4927-4931). 사람의 호스트 세포가 사용된 경우에는, Epstein-Barr virus (EBV) 기원(origin) (OriP) 및 EBV 핵 항원 1 (nuclear antigen 1)(EBNA-1] ; a trans-acting replication factor)에 근거하는 벡터들이 사용될 수 있다. 이러한 벡터들은 예를 들어, EBO-pCD (Spickofsky et al., 1990, DNA Prot. Eng. Tech. 2: 14- 18), pDR2 및 DR2 (available from Clontech Laboratories)인 인간 호스트 세포의 넓은 영역에 사용될 수 있다.
또한, 재조합형 HSP 또는 α2M 형질 발현은 레트로바이러스에 거점을 두는(retrovirus-based) 발현계에 의해 얻을 수 있다. 전달감염(transfection)과는 대조적으로, 레트로바이러스들은 효과적으로 감역 시키거나, 예를 들어 일차 조혈성 세포(primary hematopoietic cells)를 포함하는 세포타입의 넓은 범위에 걸치는유전자를 전달할 수 있다. Moloney 마우스 백혈병 바이러스와 같은 레트로바이러스에 있어서, 대부분의 바이러스 유전자 배열은 없어진 바이러스성 기능이 in trans 에 의해 공급되는 동안, 제거되거나 HSP 또는 α2M 코딩 배열과 교체될 수 있다. 또한, 레트로바이러스성 벡터에 의한 감염의 호스트 영역(host range)도 벡터 팩키징(vector packaging)를 위한 막(envelope)의 선택에 의해 조작될 수 있다.
예를 들어, 리트로바이러스성 벡터는 5 말단 반복(long term repeat)(LTR), 3'LTR, 패키징 시그널, 세균성 복제 개시점(bacterial origin of replication) 및 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. ND-관련 항원성 펩타이드 DNA는 5 LTR 촉진 인자로부터의 전사(transcription)가 복제된 DNA를 전사(transcribe)하도록 5'LTR 및 3'LTR 사이의 위치에 삽입된다. 이 5'LTR는 촉진 인자로 이루어지는데, LTR 촉진 인자, R 지역(region), U5 지역 및 프리미어 결합 사이트(primer binding site)를 차례로 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 LTR 요소의 뉴클레오티드 배열은 공지기술이다. 이종유래 촉진 인자와 멀티플 드러그(drug) 선택 마커는 감염세포(McLauchlin et al., 1990, Prog. Nucleic Acid Res. and Molec. Biol. 38: 91-135; Morgenstern et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18: 3587-3596; Choulika et al., 1996, J. Virol 70: 1792-1798; Boesen et al., 1994, Biotheray 6: 291-302; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114)의 선택을 용이하도록 발현 벡터가 포함될 수 있다.
재조합형의 세포는 온도, 인큐베이션 시간, 광학 밀도(density) 및 배양지조성의 표준 상태로 배양될 수 있다. 대안으로, 세포는 HSP가 내생적으로(endogenously) 발현되는 세포의 영양적 및 생리적 필요 조건을 모방하고 있는 조건하에서 배양될 수 있다.
수정된 배양 조건 및 배양지는 HSP-펩타이드 복합체의 생산을 강화하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 재조합형 세포는 유발성(inducible) HSP 형질 발현을 촉진하는 조건하에서 자랄 수 있다.
본 발명의 -2-마크로글로블린 및 HSP 폴리펩타이드는 이들이 발현되는 세포로부터 정제 및 회복이 용이하도록 융합 단백질(fusion proteins)로 발현될 수 있다. 예를 들어, HSP 또는 α2M 폴리펩타이드는 배양지에 분비를 위한 소포체 막(membrane)을 가로질러(across) 전위(translocation)를 이끌기 위해서 시그널 배열 리더 펩타이드(signal sequence leader peptide)를 포함할 수 있다. 나아가, HSP 또는 α2M 폴리펩타이드는 예를 들어 카르복실 단말(carboxyl terminal)의 항원성 펩타이드와의 결합을 가지지 않는 HSP 또는 α2M의 어느 일단이 용해(fused) 되어 있는 예컨대, 친화성 라벨(affinity lebel)을 포함할 수 있다. 이 친화성 라벨은 친화성 파트너 분자와 결합함으로써 단백질의 정화(purification)를 용이하게 하는데 이용될 수 있다.
이러한 융합 단백질의 생산을 위한 다양한 방법들이 공지 기술로서 잘 알려져 있다. 이들을 생산하기 위한 조작은 유전자 또는 단백질 레벨에서 형성되며, 바람직하게는 유전자 레벨에서 이루어진다. 예를 들어, HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 복제된(cloned) 코딩 지역은 이미 알려진 다양한 재조합형 DNA 방법(Sambrooket al, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., in Chapter 8 of Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York)을 이용하여 수정될 수 있다. 치환, 결여(deletions), 삽입(insertions) 또는 이들의 결합들이 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 최종 뉴클레오티드 배열에 도달하도록 결합하거나 소개하는 것은 이하의 논의에서 분명해질 것이다.
다양한 실시예에 있어서, 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들면, HSP 또는 α2M 폴리펩타이드를 암화화하는 재조합 유전자는 융합단백질로 표지된 폴리펩타이드로 발현되는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드와 같이, 적절한 리딩 프레임 내의 HSP 또는 α2M 유전자 절편을 소정의 친화성 표시의 서열을 보유하고 있는 소정의 벡터 내로 도입하여 제조될 수 있다. 특정한 바인딩 파트너들에 의해 인식될 수 있는 친화성 표시는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 친화도를 정선하기 위해 사용된다.
더 바람직한 실시예에 있어서, 상기 친화성 표시는 HSP 또는 α2M의 카르복실기 말단으로 HSP 또는 α2M의 아미노기 말단에서 융합된다. 상기 카르복실기 말단 내에서 만들어지는 융합 위치의 정학한 위치는 중요한 것은 아니다. 그 최적의 위치는 반복적인 실험을 통해 결정될 수 있다.
상기 기술분야에서 알려진 다양한 친화도 표시는, 면역 글로블린 상수 영역, 폴리히스티딘 서열(페티, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, inCurrent Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience), 글루타티온 S-전이효소(GST)[스미스, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4: 220-229) 이-콜라이 말토스 결합 단백질(구안 등., 1987, Gene 67: 21- 30), 및 다양한 셀룰로스 결합 도메인[미합중국특허 Nos. 5,496, 934; 5,202, 247; 5,137, 819; 톰 등, 1994, Protein Eng. 7: 117-123] 등등이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 친화도 표시는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드에 대한 형광 성질에 따라, 예컨대 녹색 형광을 발하는 단백질과 그 유사한 부분들로 구분될 수 있다. 다른 가능한 친화도 표시는 모노클로날 항체를 이용할 수 있는 짧은 아미노산 서열로서, 이들은 플래그 항원결정인자(FLAG epitope), 아미노산 408-439의 위치에 있는 엠와이시(myc) 항원결정인자, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 항원결정인자와 같이 잘 알려진 예에 한정되지 않는다. 다른 친화도 표시는 특정한 바인딩 파트너에 의해 인식되며, 따라서, 고체 지지체 상부에 고정화시킬 수 있는 바인딩 파트너에 선호되는 결합을 통하여 분리를 촉진시킨다. 일부의 친화도 표시는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드가 다중 결합체(multimers)를 형성케 할 수 있는 능력과 같은 새로운 구조적 특징을 가져오게 할 수 있다. 결합된 펩타이드로 이루어진 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 2분자체는 항원이 존재하는 과정에서 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 2분자체와 이에 대한 결합 파트너 간에 강렬한 상호 작용을 증가시킬 수 있다. 이러한 친화도 표시는 통상 동종 중합체로서 정상적으로 존재하는 단백질로부터 유도된다. CD8(슈 등, 1988, J. Exp. Med. 168: 1993-2005), 또는 CD28 (이 등, 1990, J. Immunol.145: 344-352)의 세포외 도메인 또는 이황화결합을 상호 연결시키는 자리를 포함하는 면역 글로블린 분자의 부분들과 같은 친화도 표시는 다중결합체를 형성시킬 수 있다. DNA 클로닝, DNA 증폭 및 합성 방법 등에 국한되지 않는 기술 분야의 당업자에게는 전술한 친화도 표시에 관한 코딩 영역을 얻기 위해 많은 방법들이 사용될 수 있다. 친화도 표시의 일부와 이들을 검출하고 분리할 수 있는 시약들이 상용화될 수 있다.
친화도 표시로서 바람직한 것은 면역글로블린 분자의 불변 영역이다. 통상, 면역글로블린 중쇄(heavy chain)의 일정한 영역 내에서 적어도 하나의 기능적으로 동작하는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 또한, 융합은 일정한 도메인을 갖는 Fc 영역의 카르복실기 말단을 이용하여 형성되거나, 중쇄(heavy chain) 또는 경쇄(light chain)의 CH1의 아미노기 말단에 인접한 영역을 이용하여서 형성된다. 적합한 면역 글로블린에 근거한 친화도 표시는 IgG-1, -2, -3, 또는 -4의 유형들과 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있으며, 이중 IgG1이 가장 바람직하다. 바람직하게는, 인간 면역글로블린은 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드이 인간을 위해 생체내 사용을 위해 계획될 때 사용된다. 면역글로블린의 경쇄 또는 중쇄의 일정 영역에서의 DNA 암호의 많은 부분은 이미 알려져 있거나 CDNA 라이브러리로부터 용이하게 입수할 수 있다. 이에 대해서는 다음의 논문들을 참조하면 확인할 수 있다(아담스 등, Biochemistry, 1980, 19: 2711-2719; 고흐 등, 1980, Biochemistry, 19: 2702-2710; 돌비 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 6027-6031; 라이스 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 7862-7865; 팔크너 등, 1982,Nature, 298: 286-288 ; 및 모리슨 등, 1984, Ann. Rev. Immunol, 2: 239- 256). 많은 면역학 시약들과 표시 시스템은 면역글로블린의 검출에 유용하기 때문에, 면역학 기술 분야에서 알려진 다양한 기술, 예컨대 엘리자(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역침강(immunoprecipitation), 팩스(luorescence activated cell sorting, FACS) 등과 같은 기술을 이용하여 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드-Ig 융합 단백질은 용이하게 검출하고 정량화할 수 있다. 친화도 표시가, 용이하게 입수 가능한 항체를 갖고 있는 항원결정인자인 경우에는, 친화도 표시를 보유하고 있는 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드를 검출, 정량 및 분리하기 위하여 전술한 기술을 사용할 수 있는 시약이 사용될 수 있다. HSP 또는 α2M 폴리펩타이드에 대한 특정한 항체를 개발할 필요가 없는 경우가 많이 있다.
특히 바람직한 실시예는, 인간 면역글로블린 G-1(IgG-1, 참조 : 브라운 등, 1996,] J. Immunol. 156: 442-49)의 CH2 및 CH3 도메인들인 힌지(hinge)에 대한 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드의 융합이다. 이들 힌지 영역은, 통상 Ig 분자 내의 다른 시스테인과 이황화 결합으로 참여되는 세 개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다. 상기 시스테인들의 어느 것도 태그로서 기능하기 위한 펩타이드를 요구하지는 않기 때문에, 하나 이상의 시스테인 잔기들은, 예컨대 세린과 같은 다른 아미노산 잔기에 의해 임의로 대체될 수 있다.
종래에 알려져 있는 다양하게 해독된 서열들은 박테리아 및 포유류 세포(폰 하이지네, 1985,, J, Mol, Biol. 184-99-105)로부터 HSP 또는 α2M 폴리펩타이드를 효율적으로 분비시키기 위해 사용될 수 있다. 리더 펩타이드들은 의도된 호스트 세포에 기초하여 선별되며, 여기에는 많은 박테리아, 이스트, 바이러스, 동물 및 포유류의 서열이 포함될 수 있다. 예를 들어, 포진 바이러스 당단백질 D 리더 펩타이드(herpes virus glycoprotein D leader peptide)는 다양한 포유류 세포의에 사용하기에 적합하다. 포유류 세포에 사용되기에 바람직한 리더 펩타이드는 쥐의 면역글로블린 카파(kappa) 사슬(버나드 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5812-5816)의 V-J2-C 영역으로부터 얻을 수 있다. HSP 또는 α2M 폴리펩타이드를 박테리아 세포 내 발현을 표적화하기 위한 바람직한 리더 서열은,E.coli단백질 OmPa(호봄 등, 1995, Dev. Biol. Stand. 84 : 255-262), Pho A(오카 등, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci 82: 7212-16), OmpF(존슨 등, 1996, Protein Expression 7: 104-113), LamB and OmpF(호프만 & 라이트, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5107-5111), β-락탐(라도나가 등, 1984, J. Biol. Chem. 259: 2149-54), 엔테로톡신(enterotoxins) (모리오카-후지모토 등, 1991, J. Biol. Chem. 266: 1728-32) 및 황색포도알균(Staphylococcus aureus) 단백질 A(아브람센 등, 1986, Nucleic Acids Res. 14: 7487- 7500) 및 바실러스 고초균 엔도글루카네이즈(로 등, Appl. Environ. Microbiol. 54 : 2287-2292)의 이들 뿐만 아니라 인공 및 합성 신호 순서(머신티레 등, 1990, Mol. Gen. Genet. 221: 466-74; 카이저 등, 1987, Science, 235: 312-317)의 리더 서열을 포함하며, 이들에 국한하지 않는다.
본 발명의 실시를 위해 적합한, 요구되는 선호도 표시 또는 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 라이브러리를 통해서 얻거나, 합성에 의해 생성하거나, 상업적인 공급자들로부터 용이하게 입수할 수 있으며, 이들은 본 발명의 실시를 위해적합하다. 이러한 방법은 종래에 잘 알려져 있다.
4.4. 단백질과 펩타이드를 HSP 및 α2M으로의 합성
이하, 항원성 세포, 이들의 세포성 절편 또는 바이러스성 부분들로부터 준비된 단백질 및/또는 펩타이드의 모집단를 이용하여 HSP 및 α2M으로의 합성하는 실험적인 방법을 설명하기로 한다. 단백질 및/또는 펩타이드의 모집단은 항목 4.2.1에서 설명된 바와 같은 항원성 세포들로부터 분비한다. 어떤 실시예에서는, 상기 펩타이드는 항원성 세포, 이들의 세포성 절편 또는 바이러스성 부분들의 단백질 준비 작용의 결과이다. 상기 합성반응은 하나의 HSP와 항원성 세포 또는 바이러스성 부분으로 이루어진 하나의 단백질 또는 펩타이드 간의 공유 결합을 형성하게 할 수 있다. 상기 합성 반응은 하나의 α2M과 항원성 세포, 이들의 세포성 절편 또는 바이러스성 부분들의 하나의 단백질 또는 펩타이드 간의 공유 결합을 형성하게 할 수 있다. 상기 합성 반응은 하나의 HSP와 하나의 펩타이드 또는 하나의 α2M 및 하나의 단백질 및/또는 하나의 펩타이드 간에 비공유연합관계를 형성하게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 바람직한 단백질/펩타이드에 대한 HSP70의 비공유 결합 복합제를 제조하기 위해, 정제된 gp96 또는 HSP90 5-10마이크로그램이 동일 몰양 또는 초과량의 단백질/펩타이드와 함께 20mM의 나트륨 인산염, pH 7.5, 0.5M NaCl, 3mM MgCl2를 함유하는 완충제와 같이 적절한 완충제 내에서 섭씨 60-65도에서 5-20분 동안 배양된다. 이러한 배양 혼합물은 상온으로 냉각되고 필요하면 임의의 미결합 펩타이드를 제거하기 위해 센트리콘(Centricon) 10 조립체(Millipore)를 통해 한번 이상 원심분리된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 바람직한 단백질/펩타이드에 대한 HSP70의 비공유 결합 복합제를 제조하기 위해, 정제된 gp96 또는 HSP90 5-10마이크로그램이 동일 몰양 또는 초과량의 단백질/펩타이드와 함께 20mM의 나트륨 인산염, pH 7.5, 0.5M NaCl, 3mM MgCl2를 함유하는 완충제와 같이 적절한 완충제 내에서 섭씨 60-65도에서 5-20분 동안 배양된다. 이러한 배양 혼합물은 상온으로 냉각되고 필요하면 임의의 미결합 펩타이드를 제거하기 위해 센트리콘(Centricon) 10 조립체(Millipore)를 통해 한번 이상 원심분리된다.
항원 단백질 및/또는 항원 펩타이드와의 복합에 이어, 면역원성 HSP 복합제 또는 α2M 복합제가 예를 들어, 이하에서 설명하는 혼합 림프구 타겟 세포 분석(MLTC)를 사용하여 선택적으로 분석될 수 있다. 일단 HSP-펩타이드 복합제 및/또는 HSP-단백질 복합제가 분리되고 희석되면, 이들은 선택적으로 후술하는 바람직한 투여 프로토콜과 부형제를 사용하여 동물 모델로 특성화될 수 있다.
HSPs와 단백질/펩타이드의 비공유결합 복합제를 제조하는 대안으로서, 단백질/펩타이드 군이 HSPs에 공유결합적으로 부착될 수 있다.
일 실시예에서, HSPs는 화학적 크로스링크에의해 조제된 단백질 내의 단백질 및/또는 펩타이드에 공유결합적으로 결합된다. 화학적 크로스링크 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려진 것이다. 예를 들면, 바람직한 실시예에서, 글루타랄데하이드(glutaraldehyde) 크로스링크가 사용될 수 있다. 글루타랄데하이드 크로스링크는 펩타이드와 HSP의 공유결합 복합제를 형성하기 위해 사용되어 왔다.(Barrios et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22; 1365-1372 참조). 바람직하게,1-2 mg의 HSP-펩타이드 복합제는 0.002% 글루타랄데하이드(glutaraldehyde)와 2시간 동안 크로스링크된다. 글루타랄데하이드는 인산염 완충염(phosphate buffered saline)(PBS)에 대해 하룻밤 투석에 의해 제거된다.(Lussow et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21: 2297-2302참조) 대안으로서, HSP 및 단백질/펩타이드 군은 당해 분야에서 알려진 조건 하에서 자외선(UV) 크로스링크로 크로스링크될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 단백질/펩타이드 군 및/또는 펩타이드 조제 내의 펩타이드는 단백질/펩타이드를 α2M와 50:1의 비율로 섭씨 50도에서 10분동안 배양하고, 25도에서 30분동안 배양함으로써 α2M에 비공유결합적으로 결합될 수 있다. 자유(결합되지 않은)펩타이드는 사이즈 추출 필터에 의해 제거될 수 있다. 바람직하게, 복합제는 단위 몰당 각각의 HSP 또는 α2M이 단백질/펩타이드(펩타이드 초기량 약 0.1%)와 동일량 결합된 것을 확인하기 위해 섬광 카운터로 측정된다.
상세하게는, 여기에 참조문헌으로 전체로서 통합되는 Binder, 2001, J. Immunol. 166(8):1968-72를 참조하라. 이 반응에서 α2M과 단백질 및 펩타이드의 공유 복합체 형성 경향을 줄이기 위해, 합성 전에 단백질분해효소의 활성을 억제하거나 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 단백질분해효소 억제제를 사용함으로써 예컨대, 전술한 4.2.1.에 기재된 방법에 의해 달성될 수 있다. 또한 바람직하게는 α2M을 공유결합 활성화시킬 수 있는 단백질 제조에서 나타나는 친핵성 조성물을 중화시키는 반응에 2-메캅토에탄올과 같은 감소제를 추가한다.
합성하기에 앞서, 상기 HSP는 관심있는 HSP와 비공유적으로 관계할 수 있는 임의의 펩타이드를 제거하기 위한 목적으로, ATP로 전처리하거나 산성조건에 노출되도록 전처리할 수 있다. ATP에 의한 전처리 과정이 진행되는 경우, 레비 등이 제출한 논문(1991, CELL 67 : 265-274)에서 기술하고 있는 어피라네이즈(apyranase)를 첨가하여 준비과정에서 과다 사용된 ATP를 제거한다. 산성 조건에 의한 전처리 과정이 진행되는 경우, pH 조절제의 첨가를 통해 중성적인 pH로 버퍼가 재조정되도록 한다. 생체 외에서 HSP 또는 α2M에 대한 펩타이드(평균 7 내지 20 아미노산 길이) 집단의 비공유성 합성에 관한 바람직하고 효과적인 방법은 다음에 기술되는 바와 같다.
펩타이드 집단(1μg)과 전처리된 HSP(9μg)은 대략 HSP 1몰당 5개의 펩타이드(또는 단백질)를 생성하기 위해 혼합된다. 이어서, 상기 혼합물은 예컨대 20mM의 인산나트륨, pH 7.2, 350mM NaCl2 및 1mM 페닐 메틸 설포닐 플로라이드(PMSF)를 포함하는 것과 같은 적절한 바인딩 버퍼 내에서 4℃ 내지 45℃에서 15분 내지 3시간 동안 배양된다. 상기 준비는 임의의 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 센트리콘 10 어셈블리(미소동공)를 통하여 원심력을 부여한다. 상기 HSP와 단백질/펩타이드 간의 비공유관계는 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 또는 질량분광기(MS)에 의해 분석될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 실시예에 있어서, 단백질/펩타이드에 대한 정제된 HSP의 비공유적인 복합체를 생성하기 위해, 5 내지 10 마이크로그램의 정제된 HSP70이, pH7.5, 0.5M NaCl, 3mM MgCl2 및 1mM ADP, 100 마이크로리터 부피인 20mM 인산나트륨 버퍼 내에서 동등한 몰량의 단백질/펩타이드와 함께 배양된다. 임의의 결합되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 필요하다면, 상기 배양된 혼합물에 센트리콘10 어셈블리(미소동공)을 이용하여 한 번 이상 원심력을 부여한다.
또 다른 실시예에 있어서, 단백질 준비에 있어서 항원 단백질 및/또는 항원 펩타이드의 집단은 펩타이드를 α2M으로 복합체화 하기 위하여 PCT 공개 공보 WO 94/14976 및 WO 99/50303에서 설명되고, 인용에 의하여 본 명세서에 완전히 합체되는 방법들에 의해 공유적으로 α2M으로 복합체화 될 수 있다. 예를 들어, 항원 단백질 및/또는 항원 펩타이드들은 구핵 원자의 활성화 반전(reversal of the nucleophilic activation) 동안, 열(GRON and Pizzo, 1998, Biochemistry., 37: 6009-6014; 인용에 의해 본 명세서에 완전히 합체됨)을 채용함으로써 암모니아 또는 메틸아민(또는 에틸아민과 같은 다른 작은 아민 구핵원자(nucleophils))에 의해 α2M으로 통합될 수 있다. α2M에 의한 우연한 펩타이드의 트래핑(trapping)을 허용하는 그러한 상태들은 본 발명의 α2M 복합체를 준비하기 위해 채택될 수 있다. 또한, 항원 단백질/펩타이드들 집단의 α2M에의 공유 연결은 두 가지 기능을 가진 상호 연결 매개체(bifunctional crosslinking agent)를 사용함으로써 수행될 수 있다.
그러한 상호 연결 매개체 및 그들의 사용 방법들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 바람직하게, 상호 연결 매개체는 복합체가 형성된 후 비활성화 및/또는 제거된다.
또 다른 실시예에 있어서, 단백질/펩타이드 집단은 상술한 바와 같이 비공유(non-covalent) 또는 공유 방법에 의한 동일한 반응에 있어서 HSP 및 α2M의 혼합물로 복합체화 될 수 있다.
분리된 공유 및/또는 비-공유 복합체화 반응으로부터의 HSP 및 항원 단백질 및/또는 펩타이드의 복합체는 환자에게 투여되기 전에 조성물을 형성하기 위해 선택적으로 결합된다. 또한, 분리된 공유 및/또는 비-공유 복합체화 반응으로부터의 α2M 및 항원 단백질 및/또는 펩타이드의 복합체들은 환자에게 투여되기 전에 조성물을 형성하기 위해 선택적으로 결합될 수 있다.
4.5. 암과 전염병의 예방 및 치료(PREVENTION AND TREATMENT OF CANCER AND INFECTIOUS DISEASES)
본 발명에 따르면, 소화된 세포질 및/또는 항원 세포의 막-추출 단백질 또는 바이러스 입자(viral particle)로부터 추출된 항원 펩타이드들과 HSP 및/또는 α2M의 복합체들을 구비하는 본 발명의 조성물은, 암 또는 전염병을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 일 실시예에 있어서, "처리(treatment)" 또는 "처치(treating)"는 암 또는 전염병 또는 그것의 적어도 하나의 인식할 수 있는 증상의 개선(amelioration)을 의미한다. 또 다른 실시예에 있어서, "처리(treatment)" 또는 "처치(treating)"는 환자에 의해 반드시 인식될 필요는 없지만 암 또는 전염병과 관련된 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선(amelioration)을 의미한다. 또 다른 실시예에 있어서, "처리(Treatment)" 또는 "처치(treating)"는 신체적으로, 예를 들어, 인식할 수 있는 증상의 안정화, 생리학적으로 신체적 파라미터의 안정화 중 어느 하나 또는 모두의 암 또는 전염병의 진행의 예방을 의미한다.
세포질(cytosolic)과 세포막 유래 단백질(membrane-derived protein)의 복합체를 포함하는 본 발명의 의약 조성물 및 치료 요법은, 시토카인(cytokine) IFN- ,IFN- , IL-2, IL-4, IL-6, TNF, 또는 다른 시토카인 정동 면역세포(cytokine affecting immune cell), 그리고 열충격 단백질 및 항원 분자의 복합체를 비한정적으로 포함하는 추가의 면역 반응 증진제나 생물학적 반응 조절제와 결부시켜 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명 또는 바람직한 실시예의 조성물은 항원보강제(adjuvant)와 함께 또는 항원보강제 없이 투여될 수 있다.
4.5.1. 대상 감염성 질병(Target Infectious Diseases)
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 감염성 질병은, 바이러스, 박테리아, 균류 원충(fungi protozoa) 및 기생충을 비한정적으로 포함하는 감염원에 의해 유발된다. 본 발명은 세포내 병원체에 의해 유발되는 감염병의 치료 또는 예방에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 바이러스성 질병은, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스(adenovirus), 단순 헤르페스-I(HSV-I), 단순 헤르페스-Ⅱ(HSV-Ⅱ), 우역(rinderpest), 리노바이러스(rhinovirus), 에코바이러스(echovirus), 로타바이러스(rotavirus), 호흡기세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(papova virus), 거대세포 바이러스(cytomegalovirus), 에키노바이러스(echinovirus), 아르보바이러스(arbovirus), 훈타바이러스(huntavirus), 코크사키 바이러스(coxsackie virus), 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 폴리오 바이러스(polio virus), 후천성 면역결핍 바이러스-I(HIV-I), 및 후천성 면역결핍 바이러스-Ⅱ(HIV-Ⅱ)에 의해 유발되는 것들을 포함하나 여기에 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 박테리아성 질병은, 그 라이프 사이클에 세포내 단계를 가지는 박테리아, 미코박테리아(mycobacteria), 리케차(rickettsia), 미코플라즈마(mycoplasma), 나이세리아(neisseria) 및 레지오넬라(legionella)를 비한정적으로 포함하는 박테리아에 의해 유발된다.
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 원충성(protozoal) 질병은, 리슈만편모충(leishmania), 코크지디오아(kokzidioa), 및 파동편모충(trypanosoma)를 비한정적으로 포함하는 원충에 의해 유발된다.
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 기생충성 질병은, 클라미디아(chlamydia) 및 리케차를 비한정적으로 포함하는 기생충에 의해 유발된다.
4.5.2. 대상 암(Target Cancers)
본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 유형의 암은, 예컨대, 섬유육종, 점액육종(myxosarcoma), 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 대장암종, 췌암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평표피암, 기저세포암, 샘암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두암종, 유두선암, 낭포선암, 골수암, 기관지암종, 신장세포암종, 간암, 담관암, 융모막암, 생식세포종, 배아암종, 윌름즈 종양, 자궁목암, 고환종양, 폐암종양, 소세포폐암종, 방광암종, 상피암종, 신경교종, 성장세포종, 골수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 속귀신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병 예컨대, 급성 림프구 백혈병 및 급성 골수 백혈병(골수모구 백혈병, 전골수구 백혈병, 골수단핵구 백혈병, 단핵구 백혈병, 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수 (과립) 백혈병 및 만성 림프구 백혈병); 및 진성 적혈구 증가증, 림프종(호지킨병(Hodgkin's disease) 및 비호지킨병(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종, 발덴슈트룀 매크로글로블린혈증(Waldenstr?'s macroglobulinemia) 및 중쇄병을 포함하나 인간의 육종과 암종에 한정되지는 않는다.
어떤 실시예에서 암은 전이성이 있다. 다른 실시예에서 암 환자는 HSP 및/또는 α2M-펩타이드 복합체의 투여 또는 α2M-민감 APC의 투여에 앞선 항암치료 때문에 면역이 억제되어 있다.
본 발명에 의해 제공되는 면역요법이 암 환자들에게 바람직한 이유는 많다. 첫째, 암 환자들의 면역이 억제되어 있을 때 마취를 수반한 수술 및 뒤이은 화학요법은 면역억제를 악화시킬 수도 있다. 수술전 기간에 적절한 면역요법이 취해진다면 이 면역억제는 방지되거나 반전될 수 있다. 이것은 감염성 합병증을 억제하고 상처 치유를 가속화할 수 있다. 둘째, 종양의 크기는 수술에 의해 최소화되고, 이러한 상황에서 면역요법은 가장 효과적이다. 세 번째 이유는 수술에 의해 종양 세포가 혈액순환되고 효과적인 면역요법이 이때 적용되다면 이러한 세포들을 제거할 수 있다는 가능성에서 찾아진다.
본 발명의 예방 및 치료 방법은 수술전, 수술시 또는 수술후 암환자의 면역력 증진을 유도하고, 암의 억제 목적과 총체적인 암의 경감과 근절이라는 임상 목적과 함께 암세포에 대한 종양에 한정된 면역을 유도한다. 본 발명의 방법은 또한 예컨대 가족의 이력이나 환경적 위험 요소와 같은 특정 유형의 암에 대한 위험이 높은 개인들에 사용될 수 있다.
4.5.3. 자가 구현(Autologous Embodiment)
HSP 및 α2M의 특정 면역원성은 HSP나 α2M 자체에서 유래하는 것이 아니라, 그에 연결된 항원 펩타이드로부터 유래한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 암 백신으로 사용하기 위한 본 발명의 조성물 안의 복합체는 자가의 조성물이고, 따라서 암 면역요법의 가장 다루기 힘든 장애물 두 가지를 무력화시킨다. 첫째는 실험동물의 암과 같이 인간의 암은 항원적으로 구별될 수 있다는 가능성이다. 이 장애물을 제거하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, HSP 및/또는 α2M는 항원 단백질 및 펩타이드에 합성되고, 이 복합체는 그 단백질 또는 펩타이드가 유래한 동일한 환자 안에 있는 암을 치료하는데 사용된다. 둘째로, 암 면역요법의 가장 최근의 연구는 암 세포 라인의 CTL-인식된 에피토프(epitope)를 결정하는 데에 초점을 두고 있다. 이 연구는 세포 라인과 암에 대한 CTL의 유용성을 요한다. 이러한 시약은 압도적인 비율의 인간 암에 대해 유용하지 않다. 자가 항원 펩타이드에 따른 본 발명의 일 실시예에서, 암 면역요법은 세포 라인 또는 CTL의 유용성에 의존하지도 않고 암 세포의 항원 에피토프의 정의를 요하지 않는다. 이러한 이점은 암에 대한 면역원에 이끌리는 자가 항원 펩타이드에 연결된 HSP 및/또는 α2M의 복합체를 가능하게 한다.
다른 실시예에서, 치료 또는 예방 복합체 안의 항원 펩타이드는 이 복합체가투여된 환자와 동종의 환자로부터 동일한 유형의 암의 암성 조직으로부터 마련될 수 있다.
4.6. 타가 면역요법(Adoptive Immunotherapy)
타가 면역요법은 암 또는 감염성 질병을 치료하기 위한 요법을 말한다. 이 요법에서는 면역 세포가 숙주에 투여되는데, 이는 이 세포가 직간접적으로 종양 세포 및/또는 항원 요소에 대한 특정한 면역, 종양의 경감, 또는 감염성 질병의 치료를 매개할 목적으로 행해진다(1999년 11월 16일 등록되고 여기서 참조문헌으로 통합되는 미국 특허 제5,985,270호 참조).
일 실시예에서, 타가 면역요법에 사용되는 항원 제공 세포(APC)는, 여기서 상술한 방법에 따라 준비된 항원 단백질 및 펩타이드에 합성된 HSP 및/또는 α2M로 민감하게 된다. 복합체는 감염성 질병을 유발하는 인자의 항원 결정인자로 발현하는 바이러스성 입자 또는 항원 세포 안에 존재하는 적어도 100의 다른 단백질 또는 적어도 50%의 다른 단백질로부터 유래하는 항원 단백질에 α-2-매크로글로블린 또는 열충격(heat shock) 단백질을 합성함으로써 제조될 수 있다. 복합체는 또한, (a) 상기 유형의 암 세포로부터 유래하는 단백질 제제를 단백질 분해효소로 분해하거나, ATP, 구아니디움 하이드로클로라이드(guanidium hydrochloride), 및/또는 산과 접촉시켜, 일군의 항원 펩타이드를 생성하고, (b) 상기 일군의 항원 펩타이드를 열충격 단백질 또는 α-2-매크로글로블린에 합성함으로써 제조될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 준비된 인비트로 합성된 HSP 및/또는 α2M과 항원 펩타이드의 투여 요법은, 이 분야에서 알려진 방법(예컨대, 미국특허 제5,985,270호 참조)에 의해 준비된 HSP- 및/또는 α2M-항원 펩타이드 복합체에 의해 민감화된 APC를 사용하는 타가 면역요법과 결합될 수 있다. 민감해진 APC는 단독으로, 인비트로 합성된 단백질/펩타이드와 HSP 및/또는 α2M와 결합하여, 또는 합성된 단백질/펩타이드와 HSP 및/또는 α2M의 투여전 또는 후에 투여될 수 있다. 특히, 암의 치료 및 억제를 위한 민감해진 APC의 사용은, 항원 단백질/펩타이드에 합성된 열충격 단백질 및/또는 α-2-매크로글로블린을 포함하는 상술한 방법에 의해 제조된 복합체를 소정 양(상기 치료 또는 억제에 효과적인 양) 환자에게 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 유사하게, 감염성 질병을 치료하거나 억제하는데에, 민감해진 APC를 사용하는 경우도, 항원 단백질/펩타이드에 합성된 열충격 단백질 및/또는 α-2-매크로글로블린을 포함하는 상술한 방법에 의해 제조된 복합체를 소정 양(상기 치료 또는 억제에 효과적인 양) 환자에게 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
나아가서, 인비트로 합성된 항원 단백질/펩타이드와 HSP 및/또는 α2M의 투여 방식은 다양할 수 있는데, 예컨대, 진피내 투여가 바람직하나 피하내 투여, 정맥내 투여, 또는 근육내 투여 등을 비한정적으로 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명에 따라 제조된 복합체로 민감해진 항원 제공 세포의 투여에 의한 타가 면역요법은, 이 분야에 알려진 방법(예컨대, 미국특허 제5,750,119호, 제5,837,251호, 제5,961,979호, 제5,935,576호, PCT 공개공보 WO94/14976 또는 WO99/50303 참조)에 의해 준비된 HSP- 및/또는 α2M-항원 분자(예컨대, 펩타이드로, 상기 항원 분자는 바라는 항원성을 보인다) 복합체에 의한 투여요법과 결합될 수 있다.
4.6.1. 항원 제공 세포의 획득(Obtaining Antigen-Presenting Cells)
대식세포, 가지세포 및 B-세포를 비한정적으로 포함하는 항원 제공 세포는, 바람직하게, Inaba et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1693-1702에 기재된 바와 같이, 인간의 말초 혈액 또는 골수의 줄기 및 전구 세포로부터 인비트로 제조에 의해 얻을 수 있다. 가지세포는 비한정적인 예로서, 참조문헌으로 전체가 여기에 통합되는 Sallusto et al., 1994, J Exp Med 179:1109-1118 및 Caux et al., 1992, Nature 360, 258-261에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직한 태양으로는, 인간의 혈액으로부터 얻어진 인간의 가지세포가 사용된다.
APC는 이 분야에 알려진 다양한 방법에 의해 얻을 수 있다. 일 태양으로서, 인간의 혈액세포에서 얻어진 인간의 대식세포가 사용된다. 비한정적인 예로서, 대식세포는 다음과 같이 얻어진다.
피콜-하이파크 그레디언트 원심분리(Ficoll-Hypaque gradient centrifugation)에 의해 환자(바람직하게는 치료할 환자)의 말초 혈액으로부터 단핵세포가 분리되고, 환자 자신의 혈청 또는 다른 AB+ 인간 혈청이 입혀진 조직 배양 접시에 뿌려진다. 이 세포들은 37 에서 1 시간동안 배양되고, 유착되지 않은 세포들은 피펫으로 제거된다. 접시에 남은 유착된 세포들에 인산 완충된 식염수내 1 mM의 찬(4 ) EDTA를 가하고 실온에서 15분간 접시를 방치한다. 세포들을 수거하여 RPMI 완충액으로 세척하고 RPMI 완충액에 현탁한다. 증가된 수의 대식세포는 대식세포 집락자극인자(M-CSF)와 함께 37 에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
4.6.2. HSP-펩타이드 또는 α2M-펩타이드 합성된 항원 제공 세포 및 대식세포의 민감화(Sensitization of Macrophages and Antigen Presenting Cells with HSP-Peptide or α2M-Peptide Complexes)
항원 펩타이드에 결합된 HSP 또는 α2M으로, 바람직하게 세포들을 복합체와 함께 인비트로 배양함으로써, APC는 민감화된다. HSP-복합체 또는 α2M-복합체와 함께 37 에서 15분 내지 24시간 배양함으로써 APC는 HSP 또는 α2M과 항원 분자의 복합체와 함께 민감해진다. 비한정적 예로서, 보통의 1 ml의 RPMI 배지 안에서 ml당 10 ㎎의 gp96-펩타이드 복합체 또는 ml당 10 ㎍의 HSP90-펩타이드 복합체와 함께 37 15분 내지 24시간 배양함으로써 4?07개의 가지세포가 배양될 수 있다. 상기 세포들을 세 번 세척하고 환자에의 주입을 위해 적당한 농도(예컨대, 1?07/ml)로 생리 배지, 바람직하게는 무균 배지에 재현탁한다. 민감해진 가지세포가 주입되는 환자는 상기 가지세포가 원래 분리되었던 그 환자인 것이 바람직하다(자가 구현).
부가적으로, 민감해진 APC의, 예를 들어 상기 항원-제한적인, 클래스 I-제한된 세포독성 T-림프구(CTL)를 자극하는 능력은, CTL로하여금 종양 괴사 인자를 방출하도록 자극하는 능력 및 그러한 CTL의 표적으로서 작용하는 능력에 의해 모니터링할 수 있다.
4.6.3. 민감해진 APC의 재주입(Reinfusion of Sensitized APC)
민감해진 APC는 그 환자에게 통상적인 임상 처리에 의해 체내에, 바람직하게는 진피내에, 재주입될 수 있다. 이러한 활성화된 세포들이 재주입, 바람직하게는 자가요법의 환자에게 전신투여된다. 환자들은 일반적으로 그 환자의 상태에 따라 약 106 내지 약 1012 개의 가지세포들을 받는다. 어떤 요법에서는, 환자들은 부가적으로 적절한 투여량의, 시토카인 IFN- , IFN- , IL-2, IL-4, IL-6, TNF, 또는 다른 시토카인 성장인자를 비한정적으로 포함하는 생물학적 반응 조절제를 추가적으로 받는다.
4.7. 약품의 준비 및 투여 방법(Pharmaceutical Preparation and Methods of Administration)
본 발명의 방법에 의해 준비된 HSP 및/또는 α2M에 결합된 항원 펩타이드 복합체는 세포증식 이상 또는 감염성 질병을 치료하거나 개선하기 위하여 치료에 유효한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료에 유효한 양이란 이러한 이상 증상을 개선하기에 충분한 복합체의 양을 말한다.
４.７.１　효과적인 용량
HSP 및/또는 α2M을 가지는 항원펩티트 1군의 복합체를 면역성에 효과적인 양만큼 가지는 본 발명의 조성물은 암이나 전염성 질병의 치료가 필요한 환자에게, 암이나 전염성 질병에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로 투여된다. 그러한 복합체(complexes)의 독성과 치료 효능은 세포 배양 또는 동물 실험에 있어서 표준 조제 절차에 따라 결정될 수 있는데, 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 대한 치사량)과 ED50 (집단의 50%에 대한 효과적인 치료량)를 결정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 복용량 비율은 치료 지수(therapeutic index)가 되고, 이것은 LD50/ED50의 비율로 표시될 수 있다. 보다 큰 치료 지수를 가지는 복합체가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 복합체가 사용될 수 있지만, 이 경우에는 감염되지 않은 세포에 대한 손상을 최소화하고 그로 인한 부작용을 줄이기 위해 상기복합체가 감염된 조직부를 타겟으로 하도록 약물 전달 체계가 신중하게 디자인되어야 한다.
일 실시예에서, 세포 배양 분석이나 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인체에 대한 투여량을 설정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게 복합체의 투여량은 독성이 소량이거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 혈중(circulating) 농도 범위 내에서 이루어진다. 투여량은 적용된 투여형태와 투약 경로에 따라 이 같은 범위 내에서 변동될 수 있다. 본 발명에 사용된 임의의 복합체에서, 치료에 효과적인 투여량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 결정되는 것과 같이 IC50(즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 실험 복합제의 농도)를 포함하는 혈중 혈장(circulating plasma) 농도 범위를 달성하는 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 인체 투여량을 정확하게 결정하는데 유용될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 혈장내의 수치가 측정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, hsp70- 및/또는 gp96-항원 분자 복합체가 투여되는데 이것은 환자에 대해 약 10마이크로그램에서 약 600마이크로그램의 범위 내이다. 본 발명에 의해 제공되는 hsp-90 항원 복합체의 환자에 대한 투여량은 50 내지 5,000마이크로그램의 범위이고, 바람직한 투여량은 100마이크로그램이다. 바람직하게, 언급된 투약은 4-6주 동안 매주 한번씩 되며, 투약 모드나 부위는 바람직하게 투약시마다 바뀌어진다. 따라서, 한정되지 않는 실시예를 들자면, 첫 번째 주사는 왼쪽 팔의 피하층에 주어지고, 두 번째는 오른 팔에, 세 번째는 왼쪽 복부, 네 번째는오른쪽 복부, 다섯 번째는 왼쪽 허벅다리, 여섯 번째는 오른쪽 허벅다리 등이 된다. 한번 이상의 주사 간격 이후에 동일한 부위에 반복될 수 있다. 분리 주사 또한 이루어질 수 있다. 예를 들면, 투여량의 절반이 일부위에 주사되고, 나머지 반은 다른 부위에 주사될 수 있다. 대안으로서, 투여 모드는 순차적으로 바뀌어지는데, 예를 들어, 주간 단위로 진피층에, 근육내에, 정맥내에 또는 복막내에 주사될 수 있다. 4-6주 후에, 바람직하게 한 달에 걸쳐 2주 간격으로 추가 주사가 이루어진다. 이후에는 월단위로 주사될 수 있다. 사후의 주사 주기는 환자의 치료 진전과 면역치료에 대한 반응성을 고려하여 변경될 수 있다.
또 다른 실시예에서, hsp70- 및/또는 gp96-항원 펩타이드 복합체가 투여되는데 이것은 환자에 대해 약 0.1마이크로그램에서 약 60마이크로그램의 범위 내이다. 또 다른 특정 실시예에서, hsp70- 및/또는 gp96-항원 분자 복합체의 효과적인 치료량은 10마이크로그램 미만, 즉 0.1 내지 9마이크로그램 범위이고, 바람직한 인체 투여량은 25g 쥐에 사용된 투여량과 실질적으로 동일한, 즉 0.5 내지 2.0마이크로그램이다. 본 발명에 의해 제공되는 hsp-90 항원 분자 복합체의 환자에 대한 바람직한 투여량은 5 내지 500마이크로그램의 범위이다. 구체적인 실시예에서, 치료적으로 효과적인 hsp90-항원 분자 복합체의 양은 50마이크로그램 미만, 즉 5 내지 49마이크로그램이고, 바람직한 투여량은 5 내지 40마이크로그램이다. 이들은 바람직하에 진피층 또는 점막내에 투여된다. 실시예에서, 바람직하게 진피층에 매 이틀마다 총 5회의 주사가 이루어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 언급된 투약은 4-6주 동안 매주 한번씩 되며, 투약 모드나 부위는 바람직하게 투약시마다 바뀌어진다.바람직한 실시예에서, 진피층의 투약이 이루어지고, 투약 부위가 순차적으로 변경된다.
따라서, 본 발명은 환자의 암 또는 전염성 질병을 방지하고 처치하는 방법을 제공하는 것으로서, 숙주 개별의 면역적격성을 고무하고 발암전 및/또는 발암 세포 또는 감염 세포에 대한 특정 면역성을 유도하는 복합체를 투여하는 것을 포함한다.
4.7.2 처방조제 및 용도
본 발명에 따른 사용을 위해 제약 복합체는 생리적으로 허용되는 하나 이상의 운반체 또는 첨가제를 사용하여 종래의 방식으로 조제될 수 있다. 따라서 복합체와 그들의 생리적으로 허용가능한 염 및 용매화합물은 흡입 또는 통기법(입이나 코를 통해) 또는 경구투여, 구강투여, 비경구투여 또는 직장 투여에 의한 투약을 위해 조제될 수 있다.
경구투여의 경우, 치료 복합체는 예를 들어, 결합체예, 프레지라티니스드 메이즈 녹말(pregelatinised maize starch), 폴리비닐파이로리돈(polyvinylpyrolidone), 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose); 필러예, 락토스(lactose), 미정질 셀룰로스 또는 칼슘수소인산염(calcium hydrogen phosphate); 윤활제(예, 마그네슘 스테아르산염, 활석 또는 실리카); 붕괴제(예, 감자 녹말 또는 나트륨 녹말 글리콜); 또는 습윤제예, 나트륨 로릴 황산염(sodium lauryl sulphate)와 같이 생리적으로 허용가능한 첨가제에 의한 종래의 방법을 사용하여 타블렛 또는 캡슐 형태가 될 수 있다. 상기 타블렛은 당해 기술분야에 있어서 잘 알려진 방법에 의해 코팅된다. 경구투여를 위한 액체 약제는 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액 형태를 취할 수 있으며, 또는 물 또는 종전의 매개체에 용해될 수 있도록 건조 제재 형태가 될 수도 있다. 그러한 액체 약제는 부유제(예, 소르비톨 시럽(sorbitol syrup), 셀룰로스 유도체 또는 수소화식용지방(hydrogenated edible fats); 유화제(예, 레시틴(lecithin), 아카시아); 비수성 운반체((예, 아몬드유, 유화에스테르(oily esters), 에틸알코올, 또는 분리된 식물성기름(fractionated vegetable oils); 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조네이트(propyl-p-hydroxybenzoates), 또는 소르빈산) 등과 같은 생리적으로 허용가능한 첨가제를 사용하여 종래의 방법에 의해 조제될 수 있다. 약제는 또한 완충염, 향신료, 착색료 및 감미료 등을 적절히 함유할 수 있다.
경구투여 약제는 활성 복합제의 적절한 배출을 위해 조제될 수 있다.
구강투여를 위해 복합제는 종래의 방법에 따라 조제되어 타블렛 또는 정제 형태가 될 수 있다.
흡입투여를 위해, 본 발명에 따른 복합제는, 예를 들어 디클로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디크롤로테트라플루오로메탄(dichlorotetrafluoroethane), 카본다이옥사이드(carbon dioxide) 또는 다른 적절한 가스와 같은 분무 가스를 사용하여 종래 방식에 따라 적절한 압축된 분무기 용기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 투약될 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 공급하는 밸브를 구비함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기 사용을 위해 예를들어, 복합제와 락토스 또는 녹말과 같은 적절한 분말 베이스의 혼합 분말을 함유하는 젤라틴과 같은 캡슐 또는 카트리지가 조제될 수 있다.
복합제는 예를 들어, 큰 덩어리의 주사 또는 연속적인 주사과 같은 주사에 의한 비경구투여를 위해 조제될 수 있다. 주사을 위한 조제는 예를 들어, 보존제가 첨가된 앰플 형태 또는 다중 투약 용기 형태로 마련될 수 있다. 복합체는 그러한 것을 유성 또는 수성 운반체 내에 부유액, 용액 또는 이멀젼 형태로 취할 수 있으며, 부유제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 조제제를 함유할 수 있다. 대안으로서, 활성 성분은 이전의 무균수(sterile pyrogen-free water)와 같은 적절한 운반체와 결합되는 파우더 형태로 될 수 있다.
상기 복합제는, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약 베이스제를 함유하여 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여를 위해 조제될 수 있다.
전술한 바와 같은 조제 외에, 복합제는 또한 저장 제재 상태로 조제될 수 있다. 그러한 장기 작용 제재는 (예를 들어, 피하층 또는 근육내에) 이식되거나, 또는 근육 주사에 의해 투여될 수 있다. 이러한 예로서, 복합제는 적절한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 내의 이멀젼 상태로)과 또는 이온교환수지, 또는 용해염과 같은 용해 유도체와 함께 조제될 수 있다.
원하는 경우, 상기 복합제는 활성제를 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 가지는 팩 또는 디스펜서 기구에 마련될 수 있다. 예를 들어, 상기 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서기구는 투약 설명서를 구비할 수 있다.
4.7.3. 키트
본 발명은 또한 본 발명의 방법 및/또는 치료 요법을 달성하기 위한 키트를 제공한다. 일 실시예에서, 그러한 키트는, 하나 이상의 용기 내에 있으며, 제2 용기에서 제공되는 HSPs 및/또는 α2M와의 결합을 위한 항원 단백질 및 펩타이드를 포함하는 단백질 조제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 그러한 키트는, 하나 이상의 용기 내에, 제2 용기에서 제공하는 HSPs 및/또는 α2M와의 결합을 위한 항원 펩타이드를 포함하는 소화 펩타이드를 포함한다. 대안으로서, 단백질 및/또는 펩타이드는 유사한 투약을 위해 특정 환자로부터 분리된 HSPs 및/또는 α2M에 대한 복합을 위해 하나 이상의 용기로 공급될 수 있다. 선택적으로, 제2 용기에는 단백질 및 펩타이드에 대한 복합을 위해 정제된 HSP가 더 구비될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 그러한 키트는 바람직하게, 하나 이상의 용기 내에, 정제된 HSPs 및/또는 α2M에 치료적으로 허용가능한 형태로 복합되는 치료적으로 또는 질병예방적으로 효과적인 양만큼의 단백질/펩타이드를 포함한다. 상기 키트는 선택적으로 제2 용기 내에, 바람직하게 정제된 민감성 APCs를 더 포함한다.
본 발명의 키트의 용기 내에 있는 HSPs 또는 α2M 복합제는 예를 들어, 무균 염류, 포도당 용액, 또는 완충 용액 또는 그 외 다른 치료학적으로 허용가능한 중성 용액과 결합되는 치료적으로 허용가능한 용액 형태로 될 수 있다. 대안으로서, 상기 HSPs 및α2M 복합제는 냉동 건조되거나 탈수 건조될 수 있다. 이 경우, 상기 키트는 용기 내에 선택적으로 치료학적으로 허용가능한 용액(예, 염류, 포도당 용액 등) 바람직하게 무균 용액을 더 포함하여, HSPs 및α2M, 또는 α2M 및 HSP 함유 복합제와 혼합하여 주사 목적의 용액을 만들 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 키트는 HSPs 및 α2M 복합제 투여를 위해 바람직하게 무균 상태로 포장된 바늘 또는 주사기와 포장된 알코올 패드를 더 포함한다. 선택적으로 임상의 또는 환자가 α2M 및 HSP-펩타이드 복합체의 투여를 하기 위한 설명서는 포함된다.
4.8 HSP 및α2M 복합제의 면역원성 결정
선택적으로, 본 발명의 HSP-단백질 복합제, HSP-펩타이드 복합제, a2M-단백질 복합제 및 α2M-펩타이드 복합제는 당해 분야에서 알려진 방법에 의해 면역원성이 분석될 수 있다. 한정되지 않는 예로서, 다음의 절차들이 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, ELISPOT 분석이 사용된다.(아래 4.9.4 참조).
4.8.1. MLTC 분석
간단히, 종래의 방식을 사용하여 쥐에게 HSP 및/또는 α2M 복합제를 주입한다. 네가티브 대조로서, 다른 쥐에게 예를 들어, 정상 조직으로부터 채취된 단백질 및/또는 펩타이드에 복합된 HSP를 주입한다. 종양 세포 또는 전염성 질병의 병원체에 감염된 세포와 같은 특정 항원을 가진 것으로 알려진 세포가 분석을 위한 포지티브 대조가 된다. 쥐는 7-10간격으로 두 번 주입된다. 면역성 부여 10일 후에, 비장이 제거되고 림프구가 떼내어진다. 떼내어진 림프구는 시험관 내에서 관심 항원을 나타내는 죽은 세포를 첨가함으로써 순차적으로 재자극된다.
예를 들어, 8X106 개의 면역 비장 세포가 10%의 새끼 송아지 혈청을 함유하는 3ml의 RPMI 매개체에서 관심 항원을 함유하는 4X104 개의 마이토마이신 C 처리된 또는 γ 조사된(5-10,000 rads) 세포(경우에 따라 세포는 적절한 유전자로 트랜스펙션될 수 있다)로 자극될 수 있다. 어떤 경우에는 33%의 2차 혼합 림프구 배양 상청액이 배약 매체 내에 T 세포 성장 요소로서 포함될 수 있다.(Glasebrook, et al., 1980, J EXP. Med.151:876 참조) 면역성 부여후 1차 T세포 세포독성 반응 실험을 위해, 비장 세포가 자극없이 배양될 수 있다. 또한 몇몇 실험에서, 면역화된 쥐의 비장 세포는 세포독성 T세포 반응의 특이성을 결정하기 위해 항원 특성 세포로 재자극될 수 있다.
6일 후에, 배양 세포는 4시간51Cr-릴리이스 분석(Palladino, et al., 1987, Cancer Res. 47:5074-5079 and Blachere, at al., 1993, J. Immunotherapy 14:352-356 참조)을 위해 테스트된다. 이 분석에서, 혼합 림프구 배양이, 다른 효과기(effector):타겟(E:T) 비율(통상 1:1 내지 40:1)을 주기 위해 타겟 세포 현탁액에 첨가된다. 상기 타겟 세포는, 20mCi51Cr/ml를 함유하는 배양 매개체 내에서 1x106 타겟 세포를 37℃에서 한시간 동안 배양함으로써 프리-라벨링된다. 상기 세포들은 세차례 세척하고 라벨링한다. 각각의 분석 포인트(E:T 비율)는 세벌로 되어, 자발적인 51Cr 방출(분석에 림프구의 첨가 없음) 및 100% 방출(세제로 세척된 세포)을 측정하기 위해 적절한 제어로 수행된다. 상기 세포 혼합물을 4시간동안 배양 후, 세포는 200g을 5시간 동안 원심분리하여 입자화된다. 상청액에 대한 51Cr 방출량이 감마 카운터에 의해 측정된다. 세포독성치의 비율은 테스트 샘플의 cpm 빼기 자발적 방출 cpm이 총 세정 방출 cpm 빼기 자발적 방출로 나눈 것으로 측정된다.
MHC 클래스 I 캐스캐이드를 막기 위해, K-44 하이브리도마 세포(안티-MHC class I 하이브리도마)로부터 유도된 농축된 하이브리도마 상청액이 테스트 샘플에 첨가되어 최종 농도는 12.5%가 된다.
4.8.2. CD4+ T-세포 증식 분석
비장, 신선한 혈액 또는 CSF로부터 T세포를 얻어 FICOLL_PAQUE PLUS[(Pharmacia, Upsalla, Sweden)를 사용하여 실질적으로 크루제 및 세발드(Kruse and Sebald, 1992, EMBO J.11:3237-3244)에서와 같이 원심하여 정제한다. 말초 혈액 단핵 세포는 항원 분자를 나타내는 세포 용해질과 함께 7-10일 동안 배양된다. 세포에 있는 항원은, 용해질 내에 항원이 존재하도록 처리하기 위해 선택적으로 분석에 앞서 24 내지 48시간 배양시 추가될 수 있다. 그 다음 세포는 원심분리에 의해 채취되고 RPMI1640 매체(GibcoBRL, Gaithersburg, Md.) 내에서 세척된다. 5X104 활성 T 세포/웰이 10%의 태아 보빈 혈청, 10mM HEPES, pH 7.5, 2mM L-글루타민, 100 유니트/ml 페니실린 G, 및 100μg/ml 스트렙토마이신 황산염을 함유하는 RPMI 1640 매체 내에서 96 웰 플레이트에서 37℃, 72시간 동안 두고, 1μCi3H-시미딘(thymidine)(DuPont NEN, Boston, Mass.)/웰로 6시간 동안 펄스된 다음, 수거되어, TOPCOUNT 섬광 카운터(Packard Instrument Co. , Meriden, CONN.)에 의해 방사능 측정된다.
4.8.3. 항체 반응 분석
본 발명의 실시예에서, HSP- 또는 α2M- 복합제의 면역원성은 복합제에 대한백신주사의 응답으로 얻어진다. 일 실시예에서, 마이크로타이터 플레이트(96-well Immune Plate II, Nunc)가 정제된 0.75μg/ml용액의 50μl/well, 4℃, 16시간 동안 그리고 20℃, 1시간동안 PBS에 백신으로 사용된 단백질/펩타이드 비-HSP- 또는 αa2M-복합제 형태로 코팅된다. 웰은 비워지고 웰 당 200μlPBS-T-BSA0.05%(v/v) TWEEN 20 및 1%(w/v) 보빈 혈청 알부민을 함유하는 PBS) 20℃에서 1시간 동안 차단되고, PBS-T로 세차례 세척한다. 50μl/well 혈장 또는 예방접종된 동물(실험쥐 또는 환자)로부터 채취된 CSF가 20℃에서 1시간동안 가해지고, 그 다음 PBS-T로 세차례 세척한다. 그 다음, PBS-T-BSA 및 (전술한 바와 같이 세차례의 PBS-T 세척후) 50μl의 오페닐렌디아민(o-phenylene diamine)(OPD)-H202 기저용액으로 1:1,500으로 희석된 호세라디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase)(Amersham)와 적절히 결합된 50μl/well의 쉽 안티-마우스 또는 안티-휴먼 면역글로불린과 함께, 20℃에서 1시간동안 배양후 항-펩타이드 항체 활성도가 칼로리미터단위로 측정된다. 5분후 150μl의 2MH2SO4와 정지되고, 콘트론(Kontron) SLT-210 광도계(SLT Lab-instr. Zurich, Switzerland)를 사용하여 492nm에서(기준 620nm) 흡광도를 결정한다.
4.8.4. 사이토카인(cytokine) 탐지 실험
본 발명의 HSP- 또4.8.4. 사이토카인(cytokine) 탐지 실험
본 발명의 HSP- 또는 α2M-복합체에 대한 CD4+ T 세포 증식 반응은 특수한 사이토카인 레벨의 탐지 및 계량화에 의해 측정될 수도 있다. 일 실시예에 있어서, 예를 들어, 본 발명의 복합체의 면역원성을 위하여 세포내 사이토카인은 IFN-γ 탐지 실험을 이용하여 측정될 수도 있다. 이러한 방법의 한 예에 있어서, HSP-펩타이드 또는 α2M 펩타이드 복합체를 이용하여 치료되는 환자로부터의 말초혈 단핵 세포들은 주어진 종양의 펩타이드 항원들 또는 전염병 에이전트의 펩타이드 항원과 함께 자극받는다. 그 후에 세포들은 예를 들어, FITC-결합 안티-CD8 및 PerCP-라벨드 안디 CD4 항원들과 같이, 유식세포측정기(flow cytometry)에 의해 탈지될 수 있는 T 세포-특이 라벨(specific labeled) 항체에 착색된다. 세정 작업 후, 세포들은 고정되고, 투과될 수 있도록 되며, 인간의 IFN-γ(PE-안티-IFN-γ)와 반응성이 있는 염료-라벨(dye-labeled) 항원들과 반응한다. 샘플들은 표준 기법들을 이용하는 유식세포측정기에 의해 분석된다.
대안적으로, 필터 면역측정(immunoassay), 효소 연결 이뮤노스팟(immunospot) 실험(ELISPOT) 실험이 T 세포를 둘러싸고 있는 특정 사이토카인을 탐지하기 위해 사용될 수도 있다. 일 실시예에 있어서, 예를 들어, 니트로셀룰로스-백(backed) 마이크로타이터(microtiter) 플레이트는 정화된 제1기(primay) 사이토카인-특이 항원, 예를 들어, 안티-IFN-γ으로 코팅되며, 상기 플레이트는 다른 단백질들의 일반적인 결합으로 기인된 배경(background)를 회피하도록 봉쇄된다. 사이토카인-분비 세포를 함유하는 단핵 혈액 세포들의 샘플은 HSP-펩타이드 및/또는 α2M 펩타이드 복합체로 치료된 환자로부터 획득되는 바, 이 샘플은 마이크로타이터 플레이트의 벽 위에 희석된다. 예를 들어, 바이오틴(biotin)- 라벨과 같은 라벨, 제2기의 안티-사이토카인 항체가 첨가된다. 항체 사이토카인 복합체는 그 후 예를 들어, 효소-결합 스트렙타비딘(streptavidin)-사이토카인에 의해 탐지되고-분비 세포들은 시각적, 현미경적, 전자적 탐지법에 의해 "스폿(spot)"으로 나타날 것이다.
4.8.4. 테트라메르(tetramer) 실험
또 다른 실시예에 있어서, "테트라메르(tetramer) 착색(staining)" 실험(Altman 등, 1996, Science 274:94-96)은 T-세포 특이 항원을 확인하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 일 실시예에 있어서, 종양-특이 항원(tumor-specific antigen)과 같이 특이 펩타이드 항원(antigen)을 함유하는 MHC 분자는 용해성 펩타이드 세트라메르들 만들기 위해 다중복합화(multimerized), 예를 들어, 스트렙타비딘(streptavidin)에 복합체화됨에 의해 라벨된다(labeled). MHC-펩타이드 항원 복합체는 그 후 HSP- 또는 α2M-복합체로 치료된 환자로부터 획득된 T 세포 집단과 혼합된다. 그후, 바이오틴(biotin)은 관심있는 항원 즉, 종양-특이 항원을 나타내는 T 세포들을 착색하는데 사용된다.
4.9. 암 예방 및 면역 요법 동안의 모니터링 효과
종양(neoplastic) 질병의 전개 및 진행에 있어서 HSP- 또는 α2M-복합체를 이용한 면역 요법의 효과는 당업자에게 알려진 그 어떤 방법에 의해 모니터될 수 있는 바, 그 방법은 다음과 같은 측정들을 포함하지만 그에 한정되지는 않는다. a) 세포 면역의 평가로서 지연된 과민증; b) in vitro 세포융합 T-림프구(lymphocyte)의 활동; c) 예를 들어, 태아성암항원(carcinoembryonic)(CEA) 항원과 같은 종양 특이 항원의 레벨; d) 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캠과 같은 기법을 이용한 종양 조직의 변화; 및 e) 위험이 높은 상태의 개인들의 특별한 암을 위한 리스크의 추정 바이오마커(biomarker)의 베렐 변화, 및 f) 소노그램(sonogram)을 이용한 종양 조직의 변화.
다음의 소구분들(subsections)은 선택적이고, 전형적인 절차들을 설명한다.
4.9.1. 지연 과민증 피부 시험
지연 과민증 피부 시험은 총체적 면역적격성(immunocompetence) 및 항원에 대한 세포 면역에 대단한 가치가 있다. 보통의 피부 항원들의 종합 테스트(battery)에 반응 무능력(Inability)은 아네르기(anergy) (Sato, T., 등, 1995, Clin. Immunol. PATHOL. 74: 35-43)로 불려진다.
피부 시험의 적절한 기법은 항원들이 4℃에서 살균 저장되어야 하고, 빛으로부터 보호되어야 하고, 사용 전 짧게 재구성되어야 할 필요가 있다. 25- 또는 27-게이지 필요(gauge need)는 항원의 피하(subcutaneous) 투여보다는 피내(intradermal) 투여(administration)를 보증한다. 항원의 피내 투여 후 24시간 및 48시간이 지나면, 홍진(erythema) 및 경화(induration) 모두의 가장 큰 치수들은 자(ruler)를 이용하여 측정된다. 그어떤 주어진 항원 또는 항원 그룹에 대한 하이포액티브티(Hypoactivity)는 항원의 보다 높은 집중(concentration)을 가진 테스팅 또는, 확실하지 않은 환경에서, 중간 시험(intermediate test)을 가진 반복 시험에 의해 확인된다.
4.9.2. In vitro 사이토립틱(CYTOLYTIC) T-림프구(LYMPHOCYTES)의 활동(activity)
T 림프구로부터 유래되고 Ficoll-Hypaque 원심분리법(centrifugation gradient technique)에 의해 분리된 8×06 말초혈(peripheral blood)은 4×04 마이토마이신 C(MITOMYCIN C)으로 재자극되어, 10%의 송아지 태아 혈청(fetal calf serum)을 함유하는 3ml RPMI 매개체(medium)에서 종양 세포들을 치료한다. 몇몇 실험들에 있어서, 33%의 두 번째 혼합된 림프구 배양상청액(culture supernatant) 또는 IL-2는 T 세포 생장 인자들의 소스로서 배양 매개물에 포함된다.
면역 조치 후 사이토립틱 T-림프구의 제1차 반응을 측정하기 위하여, T 세포들은 종양 세포 자극제(stimulator)없이 배양된다. 다른 실험들에 있어서, T 세포들은 항원적으로 독특한(distinct) 세포들에 의해 재자극된다.
6일 후, 배양액들은 4 시간 51CR-방출(RELEASE) 시험에서 세포 파괴(cytotoxicity)를 위해 테스트된다. 표적들(targets)의 자발적인(SPONTANEOUS) 51CR-방출은 20% 보다 적은 레벨에 도달해야만 한다. 앤티-MHC class I 블로킹(blocking) 활동을 위하여, W6/32 하이브리도마(hybridoma)의 10배로 농축된 상청액이 12.5%의 최종 농축에서의 테스트에 첨가되어야 한다(Heike M. 등., J. Immunotherapy 15:165-174).
4.9.3. 종양 특이 항원(TUMOR SPECIFIC ANTIGENS)의 레벨(level)
모든 종양들에서 독특한 종양 항원을 발견하는 것이 가능할지도 모르지만, 많은 종양들은 정상 세포들로부터 그들을 구별할 수 있는 항원을 표시한다. 단일 세포에서 유래하는 세포로 만들어 진(monoclonal) 항체 반응자(reagents)는 항원의 분리 및 생화학적 특성을 허용해 왔고, 변형되지 않은 세포들로부터 변형된 것의 구별 및 변형된 세포들의 세포 혈통(lineage)의 정의를 위해 진단적으로 매우 소중하였다. 가장 특징적인(best-characterized) 인간 종양-관련 항원들은종양태아성(oncofetal) 항원이다. 이러한 항원들은 배자발생(embryogenesis) 동안 표현되지만, 정상적인 성인 조직에서는 없거나 탐지하기 매우 어렵다. 원형 항원(prototype antigen)은 태아성암항원(carcinoembryonic antigen (CEA)), 태아 창자(fetal gut)의 인간 결장 암 세포(colon cancer cells)에서 발견되는 당단백질(glycoprotein)이지만, 정상의 성인 결장 세포는 아니다. CEA가 콜론(colon) 암종(carcinoma) 세포로부터 발생되고, 혈청(serum)에서 발견되기 때문에, 이러한 항원의 혈청에의 존재는 콜론 암 환자를 스크린하는데 사용될 수 있다고 생각되어 왔다. 그러나, 췌장 및 흉부 암(pancreatic and breast cancer)과 같이 다른 종양들을 가진 환자들 역시 CEA의 상승된 혈청 레벨을 가진다. 따라서, 치료를 받고 있는 암 환자에 있어서, CEA 레벨의 등락을 모니터링하는 것은 종양의 경과 및 치료에 대한 반응을 예견하는데 유용하다고 증명되었다.
인간의 종양들, 예를 들어, 태아 간장(fetal liver) 및 난황 주머니(yolk sac) 세포에 의해 정상적으로 분비된 알파태아단백질(alpha-fetoprotein), 알파-글로불린(alpha-globulin)의 진단 및 모니터링에 유용하였던 몇몇 다른 종양태아성 항원(oncofetal antigens)은 간장 및 배종(germinal) 세포 종양 환자들의 혈정에서 발견되고 질병 현상의 문제로서 사용될 수 있다.
4.9.4. CT 사진(COMPUTED TOMOGRAPHIC (CT) SCAN)
CT는 암의 정확한 단계를 위한 선택 방법으로 남아 있다. CT는 전이(METASTASES)의 발견을 위한 다른 어떤 이미징 기법보다 더 민감하고 특징적이다는 사실이 증명되었다.
4.9.5. 추정적(putative) 마이오마커(biomarker)의 측정
특이한 암의 리스크를 위한 추정적 바이오마커의 레벨은 세포질(cytosolic) 및 막(membrane)-추출(derived) 단백질을 구비하는 조성물의 효과를 모니터하도록 측정된다. 예를 들어, 개체들에 있어서, 전립선(prostate) 암을 위한 강화된 리스크에서, 혈청 전립선-특이 항원(PSA)은 Brawer, M. K., 등, 1992, J. Urol. 147:841-845, 및 Catalona, W. J., 등, 1993, JAMA 270:948-958에 의해 설명된 절차에 의해 측정되고; 혹은 직장결장 암(colorectal cancer)을 위한 개체들의 리스크는 상기 4.5.3에서 설명된 바와 같이 측정된다; 그리고, 흉부 암 을 위한 개체들의 강화된 리스크에서 에스트라디올(estradiol)의16-α-하이드록시레이션(hydroxylation)은 Schneider, J. 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. ISA 79:3047-3051에 의해 측정된다. 위에서 인용된 참고문헌들은 본 명세서에 완전히 합체된다.
4.9.6. 소노그램(SONOGRAM)
소노그램은 암의 정확한 단계를 위한 대안적 선택 방법으로 남는다.
5. 보기(EXAMPLE)
다음 실험은 (a) 세포 파편(fraction)으로부터 추출된 항원 펩타이드들과, (b) HSP 또는 알파-2-매크로글로불린(macroglobulin)(α2M) 중 어느 하나와의 복합체들은 암 세포 성장으로부터 동물을 예방학적으로(prophylactically) 보호하는데 유효함을 증명한다.
5.1. 물질과 방법(MATERIALS AND METHOD)
5.1.1 단백질 정화(purification)
α2M의 정화를 위하여, 쥐로부터 추출된 혈청은 0.04M Tris pH 7.6, 0.15M NaCl을 이용하여 1:1로 희석되었고, 65ml Sephacryl S 300R (SIGMA) 칼럼(column)에 적용되어 동일한 버퍼(buffer)와 평행 및 엘루트(eluted) 되었다. α2M-파지티브(positive) 파편들(fractions)은 도트-블롯(dot-blot)에 의해 결정되어, 파편 내부의 버퍼는 PD-10 칼럼의 사용에 의해 0.01M 인산 나트륨(sodium phosphate) 버퍼 pH 7.5로 변화되었다. 단백질-함유 파편들은 Concanavalin A sepharose 칼럼에 적용되었다. 결합된(bound) 단백질은 0.2M 메틸맨노스(methylmannose) 피라노시드(pyranoside)와 엘루트(elut)되어 DEAE 칼럼에 적용되어 0.05M 아세트산 나트륨(sodium acetate) 버퍼와 평형을 이루었다. α2M은 SDS-PAGE에 의해 분석된 바와 같이 순수한 형태에서 엘루트되었고(eluted) 0.13M 아세트산 나트륨과 임뮤노블로팅(immunoblotting)되었다.
몇몇 실험들에서, α2M은 시그마(SIGMA)로부터 구입되었다.
Gp96은 4.3.3섹션에서 설명된 방법에 의해 획득된다.
5.1.2 종양 거부 실험(Tumor rejection assays)
모든 예방접종들이 100㎕ 체적의 PBS에서 피내적(intradermally) 수행되었다. 2개의 예방접종이 일 주일 동안 분리되어 시행되었다. α2M의 7마이크로그램 또는 GP96의 1㎍이 복합체 또는 홀로(alone) 중 어느 하나로서 주사액당 사용되었다. 살아 있는 종양 세포들(100,000)은 배양 매개체가 없도록 세척되어, PBS에서 리서스펜드 되었고(resuspended) 최후 예방접종 후 일 주일동안 피내 주사되었다.종양들은 2개의 디멘전(dimension)에서 측정되었다. 평균의 반은 종양의 양을 계산하기 위해 종양의 반경(radius)으로 사용되었다. P 값들은 변화의 단일-분류 분석(ANOVA)을 이용하여 결정되었다.
5.1.3 복합체 생성(Generation of complexes)
세포 용해질(lysate)은 초원심분리법(ultracentrifugation)의 결과로서 발생되는 다운스(dounce) 균질화(homogenization)에 의한 살아 있는 Meth A 세포들로부터 획득되었다. 100,000g의 상청액(supernatant)은 10kDa 컷오프 리미트(cut off limit)를 가진 CENTRICON 막 필터(membrane filter)(Millipore)에서의 원심분리에 의해 발생되는 0.1%의 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid)(TFA) 및 3mM ATP를 이용하여 10시간 동안 치료되었다. 10kDa(이하, "MethA 10"이라 함) 보다 적은 펩타이드들은 C18 역 위상 칼럼(reverse phase column)에의 결합과, 펩타이드들의 메탄올과의 엘루팅(eluting), 펩타이드들을 진공 상태로 건조, 및 복합화(complexing)에 적합한 버퍼에서 펩타이드들의 재구성에 의해 더 분리된다. Gp96, α2M, 또는 알부민(albumin)(컨트롤로서 사용됨)은 50몰 이상의 MethaA10이 존재하는 상황에서 50℃로 가열된다. 결과적인 복합체들을 수용하는 반응들은 30분 동안 상온(room temperature)에서 놓여진 후, 얼음 위에 놓여졌다. 자유롭고, 복잡하지 않은 펩타이드는 CENTRICON 50 (Millipore)을 이용하여 제거되었다. 그러므로, 제조된 복합체들은 예방접종을 위해 사용되었다.
5.2. 결과(RESULTS)
이 실험에 있어서, Meth A 종양 모델은 gp96-펩타이드 복합체, 및 α2M-펩타이드 복합체에 의해 도출되는 안티-종양 면역성을 입증하는데 사용되었다. 이 종양의 항원 MHC I 에피토프(epitopes)는 알려지지 않았다. Meth A 세포 용해질(lysates)은 ATP와 트리플루오로 아세트 산(trifluoroacetic acid)(TFA)으로 처치되었고 10 kD (Meth A10) 보다 적은 펩타이드들의 파편(fraction)은 수거되어 상술한 바와 같이 α2M 또는 gp96으로 복합체화 되었다. BALB/c 쥐들은 α2M 또는 gp96으로 면역되어, 복합체화 되지 않거나 복합체화 되었다. 또한, BALB/c 쥐들은 네거티브 컨트롤(negative control)로서 알부민(albumin)-MethA10 또는 PBS를 이용하여 면역되었다. 예방접종은 일 주일에 2번씩 분리하여 시행되었다. 모든 쥐들은 최종 예방접종 후 일 주일 동안 100,000개의 살아 있는 Meth A 세포에 피내적으로(intradermally) 챌린지 받았다(callenged). 종양 성장은 챌린지 후 5일부터 20일까지 매일 모니터 되었다.
[표 1]
[표 1]의 데이터는 α2M-MethA10(p＜0.05) 또는 gp96-MethA10(p＜0.05) 복합체로 면역된 쥐들에 있어서 의미있는 종양 보호를 나타내지만, α2M 단독, gp96 단독, 알부민-MethA10 또는 PBS로 면역된 쥐들은 아니다.
5.3. 검토(DISCUSSION)
본 명세서에서 설명된 종양에 대한 면역에 관한 실험은 암의 면역 요법에 대한 새로운 접근을 논증하는 바, 자가(self) 및 항원 펩타이드들을 포함하는, 종양으로부터의 전체적인 세포 펩타이드 에레이(array)는 HSP 또는 α2M으로 복합체화 된다. 그러한 복합체들은 본 명세서에서 보여진 바와 같이 명확하게 반응하는 호스트(host)의 면역 시스템을 효과적으로 자극하였다. 데이터는 예방법(prophylaxis)에 있어서 이러한 접근법의 유용성은 병원 감염(pathogenic infections)의 치료 및예방 뿐만 아니라 미리-존재하는 질병의 치료에 확장될 수 있다는 것을 나타낸다.
각각의 개별 출판물 또는 특허 또는 특허출원이 명백하게 개별적으로 모든 목적들을 위해 인용에 의해 완전하게 합체되는 것과 마찬가지로, 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌들은 인용에 의해 동일한 정도로 모든 목적을 위해 완전히 합체된다.
본 발명의 많은 변형과 변화들은 당업자에 의해 명백해 질 수 있는 바와 같이, 그것의 정신과 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 예시적인 방법으로만 제공되고, 본 발명은 첨부된 청구범위와 함께 그러한 청구항들이 부여한 균등물의 완전한 범위에만 한정되어야 한다.

Claims (67)

  1. 항원 세포 또는 바이러스 입자에서 온 일 군의 항원 단백질을 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질 과 항원 단백질의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 그 항원 세포의 세포 분획에 각각 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함한다.
  2. 일 군의 항원 펩타이드를 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 항원 펩타이드의 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.
  3. 일 군의 항원 펩타이드를 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 항원 펩타이드의 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하는 것을 특징으로 한다.
  4. 단백질 조제물에 있는 단백질들이 상기 열 충격 단백질들과 복합체를 형성할 조건하에서 상기 단백질 조제물을 인 비트로에서 하나 이상의 다른 열 충격 단백질에 접촉하는 것을 특징으로 하는 열 충격 단백질과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 그 항원세포의 세포 분획의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
  5. (a) 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 하나 이상의 다른 열 충격 단백질과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 열 충격 단백질과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
  6. 항원 세포 또는 바이러스 입자로부터 온 일군의 항원 단백질을 인 비트로에서 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 알파-2-마크로글로불린과 항원 단백질의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 그 항원 세포의 세포 분획에 각각 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함한다.
  7. 일 군의 항원 펩타이드를 인 비트로에서 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 알파-2-마크로글로불린과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 항원 펩타이드의 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.
  8. 일 군의 항원 펩타이드를 인 비트로에서 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 알파-2-마크로글로불린과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 항원 펩타이드의 상기 군은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하는 것을 특징으로 한다.
  9. 단백질 조제물에 있는 단백질들이 상기 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성할 조건하에서 단백질 조제물을 인 비트로에서 알파-2-마크로글로불린과 접촉하는 것을 알파-2-마크로글로불린과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
    여기서 상기 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포 또는 바이러스 입자 또는 그 항원세포의 세포 분획의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
  10. (a) 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포, 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 알파-2-마크로글로불린과 항원 펩타이드의 복합체를 제조하는 방법.
  11. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질은 원형질 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제2항, 제3항,제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 조제물은 원형질 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질은 막에서 유래한 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제2항, 제3항,제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 조제물은 막에서 유래한 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  15. 제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질은 분리된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  16. 제2항, 제3항,제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 조제물은 분리된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 군 또는 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 암 세포 또는 그것의 세포 분획의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 군 또는 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 전염병을 일으키는 병원체의 항원성을 보이는 세포의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 군 또는 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 전염원의 항원을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되어 상기 항원을 발현하는 세포의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 군 또는 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 분자로 형질전환되어 상기 종양 특이적 항원 또는 종양 관련 항원을 발현하는 세포의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 군 또는 단백질 조제물은 적어도 50%의 다른 단백질 또는 인간 세포의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  22. 제 2항 또는 제7항에 있어서, 상기 프로테이즈 처리 단계는 상기 군의 항원펩타이드가 7 아미노산 잔기에서 20 아미노산 잔기의 크기 범위를 갖는 항원 펩타이드인 조건 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제 2항 또는 제7항에 있어서, 상기 프로테이즈는 트립신, 스타필로코코스 펩티데이즈 I, 카이모트립신, 펩신, 카뎁신 G, 써모라이신, 에라스테이즈 및 파파인으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  24. 제 2항 또는 제7항에 있어서, 상기 프로테이즈의 혼합물은 상기 프로테이즈 처리단계에 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  25. 제3항 또는 제8항에 있어서, 상기 단백질 조제물을 ATP에 노출시키는 것은 0.1% 트리후로로아세틱 산 하에서 초음파 처리(sonication)가 따르는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  26. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 분리된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  27. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 HSP 60, HSP 70,HSP 90, gp96, 칼레티쿠린(calreticulin)), grp78, 단백질 다이설파이드 아이조머레이즈(PDI), HSP 110, 및 grp 170으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로하는 제조 방법.
  28. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 열 충격 단백질은 HSP 60, HSP 70,HSP 90, gp96, 칼레티쿠린(calreticulin)), grp78, 단백질 다이설파이드 아이조머레이즈(PDI), HSP 110, 및 grp 170으로 구성된 군으로부터 선택된 다른 열 충격 단백질의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  29. 제6항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 알파-2-마크로글로불린은 분리된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  30. 제5항 또는 제10항에 있어서, 상기 (a)단계는 분리된 반응에서 다른 프로테이즈로 반복하고 그 다른 프로테이즈 처리 결과로부터 온 항원 펩타이들은 (b) 단계 전에 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  31. 제 4항에 있어서, 상기 접촉은 상기 단백질 조제물과 열 충격 단백질을 크로스 링킹제를 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  32. 제 9항에 있어서, 상기 접촉은 상기 단백질 조제물과 알파-2-마크로글로불린을 크로스 링킹제를 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  33. 제5항 또는 제10항에 있어서, (b) 단계 전에 상기 군의 항원 펩타이드를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  34. 제2항 또는 제7항에 있어서, 상기 군의 항원 펩타이드로부터 상기 프로테이즈를 불활성화 또는 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  35. 제1항에 있어서, 열 충격 단백질과 상기 군의 항원 단백질의 복합체를 분리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  36. 제2항 또는 제3항에 있어서, 열 충격 단백질과 상기 군의 항원 펩타이드의 복합체를 분리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  37. 제6항에 있어서, 알파-2-마크로글로불린과 상기 군의 항원 단백질의 복합체를 분리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  38. 제7항 또는 제8항에 있어서, 알파-2-마크로글로불린과 상기 군의 항원 펩타이드의 복합체를 분리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  39. 항원 단백질들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 면역원(immunogen) 양의 복합체를 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 대한 대상 내의 면역 반응을 유도하는 방법.
    상기 복합체는 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린을 적어도 50%의 다른 단백질 또는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 공통의 적어도 한 항원 결정을 발현하는 제2 항원 세포에 존재하는 또는 그것의 세포 분획 또는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질에서 온 항원 단백질을 복합시켜서 제조한다.
  40. 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 면역원(immunogen) 양의 복합체를 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 대한 대상 내의 면역 반응을 유도하는 방법.
    상기 복합체는 적어도 50%의 다른 단백질 또는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 공통의 적어도 한 항원 결정을 발현하는 제2 항원 세포에 존재하는 또는 그것의 세포 분획 또는 제2 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하여 일군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계 및 (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  41. 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 면역원(immunogen) 양의 복합체를 포함하는 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 대한 대상 내의 면역 반응을 유도하는 방법.
    상기 복합체는 (a) 적어도 50%의 다른 단백질 또는 제1 항원 세포 또는 바이러스 입자에 공통의 적어도 한 항원 결정을 발현하는 제2 항원 세포에 존재하는 또는 그것의 세포 분획 또는 제2 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하는 단계; (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  42. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 단백질들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린을 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암 세포내에 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질에서 온 항원 단백질을 복합시켜서 제조한다.
  43. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암 세포 내 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 이상의 프로테이즈로 처리하여 일군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계 및 (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  44. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 (a) 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암 세포 내에 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계; (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  45. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 단백질들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 전염병 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린을 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원 세포, 그것의 세포 분획 또는 전염병을 일으키는 병원체의 항원 결정을 발현하는 바이러스 입자의 적어도 50종의 다른 단백질과 복합화시켜서 제조한다.
  46. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 전염병 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포 또는 그것의 세포 분획에 존재하는 또는 전염병을 일으키는 병원체의 항원 결정을 발현하는 바이러스의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 또는 복수개의 프로테이즈로 처리하는 단계 및 (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  47. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체를 포함하는 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 전염병 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 (a) 적어도 50%의 다른 단백질 또는 항원세포 또는 그것의 세포 분획에 존재하는 또는 전염병을 일으키는 병원체의 항원 결정을 발현하는 바이러스의 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계; (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  48. 제39항, 제40항, 또는 제41항에 있어서, 상기 제1 항원 세포 및 상기 제2 항원 세포는 동일 한 것을 특징으로 하는 유도 방법.
  49. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 항원 세포는 전염병을 일으키는 병원체에 의해 전염된 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방 방법.
  50. 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 항원 세포는 상기 병원체의 항원성을 나타내는 상기 병원체의 변이체(variant)에 의해 전염된 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방 방법.
  51. 제42항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 조성물은 아쥬반트(adjuvant)를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방 방법.
  52. 제42항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 투여는 주 간격으로(weekly interval) 반복되는 것을 특징으로 치료 또는 예방 방법.
  53. 제42항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 투여는 상기 대상의 동일 자리에 반복되는 것을 특징으로 치료 또는 예방 방법.
  54. 제42항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 투여는 피내(intradermally) 투여하는 것을 특징으로 치료 또는 예방 방법.
  55. 제42항, 제43항, 제44항, 제45항, 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 투여는 피하내(subcutaneously) 투여하는 것을 특징으로 치료 또는 예방 방법.
  56. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 단백질들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체로 민감화(sensitize)된항원 제공(presenting) 세포의 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린을 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암 세포내에 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질에서 온 항원 단백질과 복합시켜서 제조한다.
  57. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체로 민감화(sensitize)된 항원 제공(presenting) 세포의 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암세포에 존재한는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 하나 또는 복수개의 프로테이즈로 분리하여 처리하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계 및 (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  58. 치료용 또는 예방용으로 유효한 양의 항원 펩타이드들과 복합체화된 열 충격 단백질 및/또는 알파-2-마크로글로불린을 포함하는 복합체로 민감화(sensitize)된 항원 제공(presenting) 세포의 조성물을 그러한 치료 또는 예방이 필요한 대상에 투여하는 단계를 포함하는 일 종의 암 치료 또는 예방 방법.
    상기 복합체는 적어도 50%의 다른 단백질 또는 상기 타입의 암 세포 내에 존재하는 적어도 50종의 다른 단백질을 포함하는 단백질 조제물을 ATP, 구아니디움 하이드로크로라이드, 및/또는 산 조건에 노출하여 일 군의 항원 펩타이드를 제조하는 단계; (b) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 일 군의 항원 펩타이드를 열 충격 단백질 또는 알파-2-마크로글로불린과 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
  59. 제 1항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질들과 상기 열 충격 단백질의 상기 복합체화는 공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  60. 제 1항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질들과 상기 열 충격 단백질의 상기 복합체화는 비공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  61. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 일 군의 항원 펩타이드들과 상기 열 충격 단백질의 상기 복합체화는 공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  62. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 일 군의 항원 펩타이드들과 상기 열 충격 단백질의 상기 복합체화는 비공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  63. 제 6항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질들과 알파-2-마크로글로불린의 상기 복합체화는 공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  64. 제 6항에 있어서, 상기 일 군의 항원 단백질들과 알파-2-마크로글로불린의 상기 복합체화는 비공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  65. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 일 군의 항원 펩타이드들과 알파-2-마크로글로불린의 상기 복합체화는 공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  66. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 일 군의 항원 펩타이드들과 알파-2-마크로글로불린의 상기 복합체화는 비공유 결합을 통하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  67. 제3항 또는 제8항에 있어서, 복합체화 단계 전에 상기 일 군의 항원 펩타이드의 회수를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211971A1 (en) * 2001-09-17 2003-11-13 Srivastava Pramod K. Compositions and methods for prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with compositions comprising unfractionated cellular proteins
JP4976848B2 (ja) * 2003-02-20 2012-07-18 ユニバーシティー オブ コネティカット ヘルス センター アルファ（２）マクログロブリン−抗原分子複合体を用いる癌および感染性疾患の治療のための方法および組成物
KR20050109498A (ko) * 2003-02-20 2005-11-21 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터 암 또는 전염병 치료에서 열 충격 단백질 또는알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물을 사용하는 방법
WO2005028496A2 (en) * 2003-09-12 2005-03-31 Antigenics, Inc. Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection
WO2005120558A2 (en) * 2004-05-25 2005-12-22 University Of Connecticut Health Center Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease
US8754094B2 (en) * 2007-08-15 2014-06-17 The Research Foundation Of State University Of New York Methods for heat shock protein dependent cancer treatment
BR122019024895B8 (pt) 2008-06-26 2021-07-27 Orphazyme As uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular de hsp70
CN103338784A (zh) 2010-11-30 2013-10-02 奥菲泽米有限公司 用于增加Hsp70细胞内活性的方法
US10265388B2 (en) 2012-02-21 2019-04-23 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation
CN103372209B (zh) * 2012-04-24 2014-09-17 中国科学院微生物研究所 gp96蛋白的抗体在制备癌细胞抑制剂中的应用
PL3193840T3 (pl) 2014-09-15 2021-12-06 Orphazyme A/S Preparat arimoklomolu
RU2714157C2 (ru) * 2015-02-06 2020-02-12 Хит Байолоджикс, Инк. Вектор, коэкспрессирующий молекулы для вакцинации и костимулирующие молекулы
EP3294324A1 (en) 2015-05-13 2018-03-21 Agenus Inc. Vaccines for treatment and prevention of cancer
US10898476B2 (en) 2016-04-13 2021-01-26 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
CN109069496A (zh) 2016-04-29 2018-12-21 奥菲泽米有限公司 用于治疗葡糖脑苷脂酶相关疾病的arimoclomol
RU2640017C1 (ru) * 2016-10-31 2017-12-25 Алла Анатольевна Ляшенко Способ получения биологического материала для создания аутологичных противоопухолевых вакцин
EP3784688A2 (en) 2018-04-26 2021-03-03 Agenus Inc. Heat shock protein-binding peptide compositions and methods of use thereof
NZ800483A (en) 2020-11-19 2024-03-22 Zevra Denmark As Processes for preparing arimoclomol citrate and intermediates thereof

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US192230A (en) * 1877-06-19 Improvement in ironing-tables
US211971A (en) * 1879-02-04 Improvement in centrifugal drying-machines
US2004A (en) * 1841-03-12 Improvement in the manner of constructing and propelling steam-vessels
US28207A (en) * 1860-05-08 Alfred b
US172682A (en) * 1876-01-25 Improvement in tool-carrier attachments to screw-machines
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
WO1989012455A1 (en) 1988-06-15 1989-12-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Stress proteins and uses therefor
WO1990002564A1 (en) 1988-09-12 1990-03-22 Codon Vaccine diagnostic employing proteins homologous to heat shock proteins of trypanosoma cruzi
US5232833A (en) 1988-09-14 1993-08-03 Stressgen Biotechnologies Corporation Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
GB9007194D0 (en) 1990-03-30 1990-05-30 Wellcome Found Live vaccines
US5348945A (en) 1990-04-06 1994-09-20 Wake Forest University Method of treatment with hsp70
US5188964A (en) 1990-04-12 1993-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and kit for the prognostication of breast cancer patient via heat shock/stress protein determination
GB9016315D0 (en) 1990-07-25 1990-09-12 Burnie James P Medicaments
GB9024320D0 (en) 1990-11-08 1990-12-19 Univ London Treatment of uveitis
CA2095855C (en) 1990-11-08 2003-04-29 Graham A.W. Rook Mycobacterium as adjuvant for antigens
GB2251186A (en) 1990-12-04 1992-07-01 Randall Neal Gatz Polypeptide for use in treatment of autoimmune disease
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
GB9200949D0 (en) 1992-01-17 1992-03-11 Medical Res Council Diagnostic peptides
US6689363B1 (en) * 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
WO1993018150A1 (en) 1992-03-02 1993-09-16 Biocine S.P.A. Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
FR2688227A1 (fr) 1992-03-04 1993-09-10 Inst Nat Sante Rech Med Proteines formant des complexes avec des chaperones et leurs ligands, leurs fragments, leur obtention et leurs applications biologiques.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
EP0630404A1 (en) 1992-03-09 1994-12-28 Istituto Nazionale Per Lo Studio E La Cura Dei Tumori Fondazione Giovanni Pascale Protein compound capable of inhibiting tumoral growth
AU4024593A (en) 1992-04-14 1993-11-18 Abbott Laboratories Method of detecting tumors containing complexes of P53 and HSP70
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
US5736146A (en) 1992-07-30 1998-04-07 Yeda Research And Development Co. Ltd. Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them
GB2270076A (en) 1992-08-18 1994-03-02 Univ Manchester Human HSP 90 Epitopes
GB9223816D0 (en) 1992-11-13 1993-01-06 Medical Res Council Heat shock proteins and the treatment of tumours
AU5873994A (en) 1992-12-18 1994-07-19 Duke University Immune response modulator complex, and uses thereof
US5496934A (en) * 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
DE69429723T2 (de) 1993-06-04 2002-09-26 Whitehead Biomedical Inst Stressproteine und ihre verwendung
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
US5750119A (en) 1994-01-13 1998-05-12 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer
US5961979A (en) 1994-03-16 1999-10-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens
US5869058A (en) 1994-05-25 1999-02-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Peptides used as carriers in immunogenic constructs suitable for development of synthetic vaccines
JP2000508884A (ja) 1995-08-18 2000-07-18 スローンケタリング インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 癌および感染症の治療方法ならびにそれに有用な組成物
AU727673B2 (en) * 1995-09-13 2000-12-21 Fordham University Therapeutic and prophylactic methods using heat shock proteins
US5985270A (en) 1995-09-13 1999-11-16 Fordham University Adoptive immunotherapy using macrophages sensitized with heat shock protein-epitope complexes
US5935576A (en) 1995-09-13 1999-08-10 Fordham University Compositions and methods for the treatment and prevention of neoplastic diseases using heat shock proteins complexed with exogenous antigens
US5837251A (en) * 1995-09-13 1998-11-17 Fordham University Compositions and methods using complexes of heat shock proteins and antigenic molecules for the treatment and prevention of neoplastic diseases
US5891653A (en) 1995-12-29 1999-04-06 Attfield; Derrick Cecil Method of suppressing graft rejection by means of stress proteins
WO1997026910A2 (de) 1996-01-27 1997-07-31 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Tumorimpfstoff für die immuntherapie von malignen tumoren
DE19602985A1 (de) 1996-01-27 1997-07-31 Max Delbrueck Centrum Tumorzellimpfstoff für die Immuntheraphie von malignen Tumoren
CA2251781A1 (en) * 1996-03-20 1997-09-25 Charles Nicolette A method for identifying cytotoxic t-cell epitopes
WO1998012208A1 (en) 1996-09-20 1998-03-26 The University Of New Mexico Heat shock protein complexes
US5747332A (en) * 1996-09-20 1998-05-05 University Of New Mexico Methods for purifying and synthesizing heat shock protein complexes
US6017540A (en) * 1997-02-07 2000-01-25 Fordham University Prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with heat shock/stress protein-peptide complexes
US5830464A (en) 1997-02-07 1998-11-03 Fordham University Compositions and methods for the treatment and growth inhibition of cancer using heat shock/stress protein-peptide complexes in combination with adoptive immunotherapy
US5947646A (en) * 1997-02-25 1999-09-07 Guardian Fiberglass, Inc. System for blowing loose-fill insulation
US6709672B2 (en) 1997-03-05 2004-03-23 Biotech Tools S.A. Pharmaceutical or food composition for treating pathologies associated with graft rejection or an allergic or autoimmune reaction
BE1011033A6 (fr) 1997-03-05 1999-04-06 Univ Bruxelles Composition pharmaceutique et/ou alimentaire pour le traitement de pathologies liees a un rejet de greffe, une reaction allergique ou auto-immune ou du cancer.
EP0988379B1 (en) 1997-04-15 2007-04-11 The Wellcome Trust Limited as Trustee to the Wellcome Trust Ldl-receptor
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
US6403092B1 (en) 1998-04-01 2002-06-11 Duke University Immune response modulator alpha-2 macroglobulin complex
US6797480B1 (en) 1998-10-05 2004-09-28 University Of Connecticut Health Center Purification of heat shock/stress protein cell surface receptors and their use as immunotherapeutic agents
US6730302B1 (en) 1998-11-24 2004-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Intracellular targeted delivery of compounds by 70 kD heat shock protein
WO2000054801A1 (en) 1999-03-17 2000-09-21 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ldl-like receptor ligands for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
US7179462B2 (en) 2000-06-02 2007-02-20 University Of Connecticut Health Center α (2) macroglobulin receptor as a heat shock protein receptor and uses thereof
AU6669401A (en) 2000-06-02 2001-12-11 Univ Connecticut Health Ct Complexes of alpha (2) macroglobulin and antigenic molecules for immunotherapy
WO2002011669A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Antigenics, Llc Compositions comprising heat shock proteins or alpha(2)macroglobulin, antigenic molecules and saponins, and methods of use thereof
WO2002015930A1 (en) 2000-08-25 2002-02-28 Duke University Adjuvant
AU2001292674A1 (en) 2000-09-15 2002-04-29 University Of Connecticut Health Center Improved formulations using heat shock/stress protein-peptide complexes
EP1322317A4 (en) 2000-09-15 2004-12-01 Univ Connecticut Health Ct COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PRIMARY NEOPLASTIC DISEASES, METASTATIC NEOPLASTIC DISEASES, AND INFECTIOUS DISEASES USING COMPOSITIONS COMPRISING NON-FRACTIONAL CELLULAR PROTEINS
US20020172682A1 (en) 2000-10-20 2002-11-21 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to increase immune response
US7132109B1 (en) * 2000-10-20 2006-11-07 University Of Connecticut Health Center Using heat shock proteins to increase immune response
US20030211971A1 (en) 2001-09-17 2003-11-13 Srivastava Pramod K. Compositions and methods for prevention and treatment of primary and metastatic neoplastic diseases and infectious diseases with compositions comprising unfractionated cellular proteins
IL164799A0 (en) 2002-04-25 2005-12-18 Univ Connecticut Using heat shock proteins to improve the therapeutic benefit of a non-vaccine treatment modality
KR20050007375A (ko) 2002-05-02 2005-01-17 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터 항체 치료의 효능을 개선하기 위한 열 충격 단백질의 사용
KR20050109498A (ko) 2003-02-20 2005-11-21 유니버시티 오브 코네티컷 헬스 센터 암 또는 전염병 치료에서 열 충격 단백질 또는알파-2-마크로글로불린을 포함하는 조성물을 사용하는 방법

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Publication number Publication date
CN1635896A (zh) 2005-07-06
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RU2004108129A (ru) 2005-04-20
US7666581B2 (en) 2010-02-23
WO2003015712A2 (en) 2003-02-27

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