CN108697777A

CN108697777A - 对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的t细胞输注疗法的预处理药物

Info

Publication number: CN108697777A
Application number: CN201780010486.9A
Authority: CN
Inventors: 珠玖洋; 原田直纯; 村冈大辅; 秋吉成; 秋吉一成
Original assignee: Oji Paper Co Ltd; Kyoto University NUC
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2018-10-23
Also published as: US20230201263A1; AU2017216653B2; JPWO2017138557A1; EP3415159A1; CA3014027A1; EP3415159B1; AU2017216653A1; US20190111078A1; JP2021113215A; JP6898539B2; EP3415159A4; KR20180105232A; WO2017138557A1

Abstract

本发明提供对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的治疗相关的技术。该技术是在对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法中，通过用于在投予对抗原特异性的T细胞之前投予的医药组合物来实现的，该医药组合物含有：在疏水化多糖纳米凝胶搭载有包含源自上述抗原的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和CD4阳性辅助T细胞识别表位的长链肽抗原或蛋白质抗原的抗原搭载纳米凝胶。

Description

对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法的预处理药物

技术领域

本发明涉及提高对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法的效果的预处理药物。

背景技术

T细胞在肿瘤免疫应答中发挥重要的作用。T细胞介由在细胞表面表达的T细胞受体(TCR)，识别作为抗原提呈细胞(树突状细胞、巨噬细胞等)的细胞表面上的与主要组织相容性基因复合体(MHC)的复合体提呈的来自抗原蛋白的表位肽。将该反应称作抗原刺激。在抗原刺激的同时，通过存在于T细胞表面的膜蛋白CD28和抗原提呈细胞上的膜蛋白质CD80或CD86结合，而建立共刺激信号。通过抗原刺激的TCR信号和共刺激信号同时输入，由此T细胞被适当活化。

相对于此，为了不使T细胞的作用过度，具有被称为免疫检查点的控制机构。膜蛋白质CTLA-4在活化T细胞中表达，与抗原提呈细胞的CD80或CD86结合。其结果，妨碍CD28与CD80、或CD28与CD86之间的结合且阻碍共刺激信号的成立，并且在T细胞内输入抑制信号。在抑制性T细胞表达的CTLA-4通过与抗原提呈细胞上的CD80或CD86结合，具有抑制抗原提呈细胞的活性的作用。通过这样的作用，CTLA-4可以挥发作为抑制T细胞的作用的免疫检查点分子的功能。

在T细胞的活性化时表达增强的膜蛋白质PD-1是免疫检查点分子的一种。作为与PD-1结合的配体，已知有PD-L1。PD-L1在大量肿瘤细胞和被活化的免疫细胞中表达。PD-L1一旦与T细胞上的PD-1结合，通过PD-1信号，抗原刺激时的TCR信号被抑制。其结果，T细胞的细胞因子产生和细胞杀伤活性降低。PD-1信号具有抑制T细胞的增殖和生存的作用。

CTLA-4、PD-1和PD-L1这样的免疫检查点分子减弱了肿瘤特异性的T细胞的作用。其结果，成为肿瘤逃避免疫的主要原因之一。通过抑制CTLA-4、PD-1或PD-L1的作用，能够恢复肿瘤特异的T细胞的作用，强化免疫对肿瘤的攻击。在各种人类癌症中，评价了抑制剂对于免疫检查点分子的有用性。CTLA-4抑制抗体和PD-1抑制抗体在难治性的黑色素瘤、肺癌和肾细胞癌的患者中，显示肿瘤缩小、生存期间延长等优异的治疗效果。但是，在任意一种癌症中，治疗效果也仅限于约2～3成。众多癌症患者对免疫检查点抑制剂具有抵抗性。对于对免疫检查点抑制剂有抵抗性的癌症患者有效的治疗法的开发成为癌症医疗中重要的课题。

使用体外试验系，发现了对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤有效的治疗法的候补。在将小鼠黑色素瘤细胞株B16F10、小鼠前列腺癌细胞株TRAMP-C2、或小鼠大肠癌细胞株CT26在野生型小鼠中皮下移植的非临床肿瘤模型中，在以抗CTLA-4抗体单剂没有确认到明确的治疗效果的条件下，溶瘤病毒(新城疫病毒)的肿瘤内给药和抗CTLA-4抗体的并用疗法显示出治疗效果(非专利文献1)。在将小鼠黑色素瘤细胞株B16F10或小鼠大肠癌细胞株CT26皮下移植到野生型小鼠的非临床肿瘤模型中，在以抗PD-1抗体单剂没有确认到明确的治疗效果的条件下，用辐射线和STING激动剂处理的GM-CSF基因导入肿瘤细胞疫苗和抗PD-1抗体的并用疗法显示出治疗效果(非专利文献2)。在将小鼠乳癌细胞株4T1皮下移植到野生型小鼠的非临床肿瘤模型中，在以抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体的并用疗法没有确认到明确的治疗效果的条件下，DNA甲基化抑制剂、HDAC抑制剂、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体的4剂并用疗法显示出治疗效果(非专利文献3)。在将表达人Her2抗原的小鼠肉瘤细胞株24JK皮下移植到人Her2转基因小鼠的非临床肿瘤模型中，在以抗PD-1抗体单剂没有确认到明确的治疗效果的条件下，导入对人Her2的嵌合抗原受体(CAR)基因的T细胞输注和抗PD-1抗体的并用疗法显示出治疗效果(非专利文献4)。

这些报告的特征均在于组合了免疫检查点抑制剂与其它癌治疗药。确认到治疗效果的肿瘤限定于表达免疫检查点抑制剂的靶标分子的类型。

在人类癌症中，免疫检查点抑制剂的抵抗性的机理不断被解明。如果解析对抗PD-1抗体显示敏感性或抵抗性的黑色素瘤患者的肿瘤组织，则可知在抵抗性的患者中，肿瘤内的PD-L1和PD-1的表达显著降低(非专利文献5)。该结果表明肿瘤局部的免疫检查点抑制剂的靶标分子的表达缺少是肿瘤对该抑制剂显示抵抗性的原因。非专利文献1～4所示的治疗方法的特征均在于组合了免疫检查点抑制剂和其它的癌症治疗药。这些治疗方法对表达免疫检查点抑制剂的靶标分子的肿瘤有效。但是，这些治疗方法存在对不表达免疫检查点抑制剂的靶标分子的肿瘤的效果小的可能性。由这些结果可知，需要对不表达免疫检查点抑制剂的靶标分子的肿瘤的新型治疗方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Zamarin,D.,et al.Sci.Transl.Med.2014；6(226):226ra32.

非专利文献2：Fu,J.,et al.Sci.Transl.Med.2015；7(283):283ra52.

非专利文献3：Kim,K.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2014；111(32):11774-9.

非专利文献4：John,L.B.,et al.Clin.Cancer Res.2013；19(20):5636-46.

非专利文献5：Tumeh,P.C.,et al.Nature.2014；515(7528):568-71.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的治疗技术。具体而言，在于提供通过与T细胞输注疗法并用，显示效果非常高的抗肿瘤、肿瘤抑制效果的预处理药物(抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂)。

用于解决课题的方法

本发明的发明人对于肿瘤局部的免疫检查点抑制剂的靶标分子的表达低、对该抑制剂有抵抗性的肿瘤有效的治疗方法进行了研究。发现，作为预处理药物，将合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原和疏水化多糖纳米凝胶组合得到的抗原搭载纳米凝胶与免疫增强剂组合使用，对于对免疫检查点抑制剂显示抵抗性的肿瘤，抗原特异性的T细胞输注显示显著疗效，从而完成了本发明。

本发明的详细内容如下所述。

1)一种医药组合物，其为在对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法中，在投予抗原特异性的T细胞之前投予的医药组合物，该医药组合物含有抗原搭载纳米凝胶，该抗原搭载纳米凝胶是将包含源自上述抗原的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和/或CD4阳性辅助T细胞识别表位的长链肽抗原或蛋白质抗原搭载于疏水化多糖纳米凝胶得到的。

2)一种医药组合物，其为在对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法中，用于在投予上述抗原搭载纳米凝胶后投予的包含上述抗原特异性的T细胞的医药组合物，上述抗原搭载纳米凝胶是将包含源自上述抗原的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和/或CD4阳性辅助T细胞识别表位的长链肽抗原或蛋白质抗原搭载于疏水化多糖纳米凝胶得到的。

在上述发明中，作为长链肽抗原或蛋白质抗原，也能够使用重组蛋白质抗原。此时，制作具有编码具有规定的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸，使用导入了该核酸的细胞(真核细胞或原核细胞)，表达重组蛋白质后，利用公知的方法精制，由此得到重组蛋白质抗原。

3)如1)或2)所述的组合物，其中，还与抗原搭载纳米凝胶一起投予免疫增强剂，或者还在抗原搭载纳米凝胶中包含免疫增强剂。

4)如1)～3)中任一项所述的组合物，其中，上述抗原特异性的T细胞为表达识别上述抗原的T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞。

5)如1)～4)中任一项所述的组合物，其中，上述长链肽抗原由23～120个氨基酸构成。

6)如1)～5)中任一项所述的组合物，其中，在长链肽抗原所含的T细胞识别表位之间，包含选自2～10个酪氨酸、2～10个苏氨酸、2～10个组氨酸、2～10个谷氨酰胺和2～10个天冬酰胺中的序列。

7)如1)～6)中任一项所述的组合物，其中，上述疏水化多糖包含支链淀粉和胆固醇基。

8)如3)～7)中任一项所述的组合物，其中，上述免疫增强剂为选自TLR(Toll样受体)激动剂(CpG寡聚DNA或Poly-IC RNA)、STING激动剂或RLR(RIG-I样受体)激动剂中的至少一种。

这些之中，优选使用TLR激动剂(CpG寡聚DNA或Poly-IC RNA)。

9)如1)～8)中任一项所述的组合物，其中，上述抗原为肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白。

10)如1)～9)中任一项所述的组合物，其中，上述抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂的给药途径通过选自皮下、皮内、肌肉内、肿瘤内和静脉内中的至少一种途径给药。

这些之中，优选使用皮下给药或静脉内给药。

11)如1)～10)中任一项所述的组合物，其中，上述抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂在投予包含上述抗原特异性的T细胞的医药组合物的至少1天前投予。

12)一种纳米凝胶，其为静脉内给药时传递对肿瘤局部的巨噬细胞选择性的物质的递送系统，由包含支链淀粉和胆固醇基的疏水化多糖构成且粒径为80nm以下。

13)一种非人哺乳类肿瘤模型，其用于鉴定对免疫检查点抑制剂具有抵抗性的肿瘤有效的治疗药，上述肿瘤为小鼠纤维肉瘤CMS5a，非人哺乳类为小鼠。

发明的效果

根据本发明，能够提供对于不表达免疫检查点抑制剂的靶标分子且对该抑制剂显示抵抗性的肿瘤的治疗有用的医药品。通过使用本发明的作为递送系统的包含疏水化多糖纳米凝胶和合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原的抗原搭载纳米凝胶以及免疫增强剂作为预处理药物，可以得到增强抗原特异性的T细胞输注的抗癌作用的效果。

附图说明

图1是对皮下移植到BALB/c小鼠且成活的各种小鼠肿瘤，表示PD-L1及PD-1的表达与肿瘤浸润CD8阳性T细胞数的数据。(A)是表示解析移植7天后肿瘤局部的PD-L1分子的表达的结果的显微镜照片图，(B)是表示用流式细胞仪法解析各肿瘤的肿瘤局部的CD3阳性T细胞的PD-1表达的结果的图表，(C)是表示向各肿瘤的肿瘤局部浸润的CD8阳性T细胞的数量的图表。

图2是表示对皮下移植到BALB/c小鼠且成活的各种小鼠肿瘤，研究对免疫检查点抑制剂的敏感性的结果的图表。

图3是表示对皮下移植到BALB/c小鼠的纤维肉瘤CMS5a肿瘤，作为预处理药物使用搭载有长链肽抗原的胆固醇支链淀粉(CHP)纳米凝胶和免疫增强剂的抗原特异性的T细胞输注的治疗效果的图表。(A)是表示对CMS5a肿瘤在皮下投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA后进行抗原特异性的T细胞输注时能够治愈、以及不是使用纳米凝胶而使用不完全弗氏佐剂(IFA)作为递送系统时没有效果的图表，(B)是表示对CMS5a肿瘤在静脉内投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA后进行抗原特异性的T细胞输注时确认到治愈，本发明的抗原搭载纳米凝胶即使在静脉内给药也有同等效果的图表，(C)是表示对CMS5a肿瘤在投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和Poly-IC RNA后进行抗原特异性的T细胞输注时能够治愈，因此免疫增强剂即使是Poly-IC RNA也有同等效果的图表。

图4是表示对皮下移植到BALB/c小鼠的CMS5a肿瘤，作为预处理药物使用长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和免疫增强剂的抗原特异性的T细胞输注的治疗效果的图表。(A)是表示对CMS5a肿瘤在投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA后进行抗原特异性的T细胞输注时能够治愈，但如果省去长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶则没有效果的图表，(B)是表示对CMS5a肿瘤在投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA后进行抗原特异性的T细胞输注时能够治愈，但如果省去CpG寡聚DNA则没有效果的图表，(C)是表示对CMS5a肿瘤在投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA后进行抗原特异性的T细胞输注时能够治愈，但如果省去抗原特异性的T细胞输注则没有效果的图表。

图5是表示对皮下移植了CMS5a肿瘤的BALB/c小鼠，将CHP纳米凝胶静脉内给药时，CHP纳米凝胶在肿瘤局部的免疫细胞中的摄入试验的结果的数据。

图6是表示对皮下移植了CMS5a肿瘤的BALB/c小鼠，投予长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA时，由于来自肿瘤局部的巨噬细胞造成的抗原提呈反应试验的结果的数据。

具体实施方式

预处理药物的形态

本发明的预处理药物的特征在于：由药剂和1种以上的免疫增强剂构成，该药剂是将同时含有来自肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和CD4阳性辅助T细胞识别表位的1种以上的合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原搭载于作为递送系统的疏水化多糖纳米凝胶得到的。

上述合成长链肽抗原优选为由至少包含2个以上T细胞识别表位的23～120个氨基酸构成的多肽。上述合成长链肽抗原优选为由包含至少2个以上T细胞识别表位的23～80个氨基酸构成的多肽。上述合成长链肽抗原优选为由包含至少2个以上T细胞识别表位的23～60个氨基酸构成的多肽。

上述重组蛋白质抗原希望为包含2个以上T细胞识别表位、根据需要包含用于精制的标签序列、由大肠杆菌或昆虫细胞或哺乳类细胞生产的全长或部分长度的抗原蛋白。

上述CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位优选为肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白的氨基酸序列的一部分。上述CD4阳性辅助T细胞识别表位优选为肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白的氨基酸序列的一部分。

上述肿瘤特异性的抗原蛋白优选选自MAGE家族、NY-ESO-1/LAGE、SAGE、XAGE、HER2、PRAME、Ras、5T4、WT1、p53、MUC-1、hTERT、RHAMM、Survivin、EGFRvIII、HPV E6、MART-1、gp100、CEA、IDO、Brachyury、Mesothelin、PSA和PSMA。上述肿瘤间质特异性的抗原蛋白优选选自FAP、VEGFR家族和TEM1。

上述疏水化多糖纳米凝胶的构成多糖类优选为支链淀粉或甘露聚糖。上述疏水化多糖纳米凝胶的疏水基优选为胆固醇。上述疏水化多糖纳米凝胶优选为非离子性的。上述疏水化多糖纳米凝胶的粒径优选为80nm以下。

上述免疫增强剂优选包含可溶性TLR激动剂、可溶性STING激动剂或可溶性RLR激动剂。作为可溶性TLR激动剂，可以例示CpG寡聚DNA或Poly-IC RNA。作为可溶性STING激动剂，可以例示cdGMP等的环状二核苷酸、DMXAA等的呫吨酮(xanthenone)衍生物。作为可溶性RLR激动剂，可以例示5'-三磷酸化双链RNA。

在本发明中，合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原的特征在于包含至少2个以上的肿瘤特异性的抗原蛋白和/或肿瘤间质特异性的抗原蛋白所含的T细胞识别表位。T细胞识别表位优选包含于肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白。作为这样的T细胞识别表位，能够选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-B1、MAGE-B2等的MAGE家族分子、NY-ESO-1/LAGE分子、SAGE、XAGE、HER2、PRAME、Ras、5T4、WT1、p53、MUC-1、hTERT、RHAMM、Survivin、EGFRvIII、HPV E6、MART-1、gp100、CEA、IDO、Brachyury、Mesothelin、PSA、PSMA等的肿瘤特异性的抗原蛋白所含的T细胞识别表位、以及FAP、VEGFR家族、TEM1等的肿瘤间质特异性的抗原蛋白所含的T细胞识别表位。T细胞识别表位中有由CD8阳性细胞毒性T细胞识别的CTL表位和由CD4阳性辅助T细胞识别的Th表位。本发明的合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原优选分别同时含有1个以上的CTL表位和Th表位。包含CTL表位的长链肽抗原和包含Th表位的长链肽抗原能够分别单独使用，或者组合使用。

本发明中使用的疏水化多糖能够用公知的方法制造。只要是疏水化多糖中的多糖、糖残基以糖苷键结合得到的高分子，就能够没有特别限定地使用。作为构成多糖类的糖残基，能够使用例如源自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖等单糖、或二糖或寡糖等糖类的残基。糖残基可以以1,2-、1,3-、1,4-或1,6-糖苷键结合，该结合可以为α型结合或β型结合的任一种。多糖既可以为直链状也可以为支链状的任一种。作为糖残基，优选葡萄糖残基，作为多糖，可以使用天然或合成来源的支链淀粉(pullulan)、葡聚糖、直链淀粉、支链淀粉(amylopectin)或甘露聚糖，优选使用甘露聚糖或支链淀粉(pullulan)等。作为多糖的平均分子量，可以使用50,000～150,000的平均分子量。

作为疏水基，例如优选将单链和双链的烷基或固醇残基以每100个单糖为1～5个(以重量比计5％以下)的比例导入得到的疏水基，更优选以每100个单糖为1～3个(以重量比计3％以下)的比例导入得到的疏水基。疏水基不限于烷基或固醇残基，可以根据所封入的抗原的分子量或等电点选择封入率合适的基团。作为固醇残基，可以列举例如胆固醇、豆甾醇、β－谷甾醇、羊毛甾醇、麦角甾醇残基等。优选能够使用胆固醇残基。作为烷基，优选碳原子数为20以下的烷基，更优选使用碳原子数为10～18的烷基。烷基也能够使用直链或支链的任意种。

作为疏水化多糖，优选例如构成多糖的糖的每100个中的1～5个伯羟基结合有下式(I)所示的基团的多糖。作为烷基或固醇残基，n优选为1～8。

-O-(CH₂)_mCONH(CH₂)_nNH-CO-O-R(I)

(式中，R表示烷基或固醇残基；m表示0或1；n表示任意的正整数。)

作为疏水化多糖，能够使用经由接头结合而成的多糖。

作为疏水化多糖，优选为非离子性的。搭载有合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原的疏水化多糖纳米凝胶颗粒优选在生理的条件下Zeta电位为－2.0mV～+2.0mV。搭载有合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原的疏水化多糖纳米凝胶颗粒的粒径优选为80nm以下。

在本发明中，包含在作为递送系统的疏水化多糖纳米凝胶搭载合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原得到的抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂的预处理药物能够用各种方法给药。优选通过经由适当的非口服途径、例如静脉内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪组织内、乳腺组织内、吸入或肌肉内的途径注射、或者经由以滴鼻药等的形态的粘膜途径的方法给药。

本发明的预处理药物通常作为将抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂混合得到的制剂或制成分别制剂的药盒，制成适于皮下、静脉内、肌肉内的非口服给药的剂型的制剂。诱导目标免疫所需要的抗原搭载纳米凝胶的给药量能够适当确定。例如作为通常的给药量，以合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原计，能够使用0.1mg/次～10mg/次左右的量。给药次数适合为2～20次。关于给药间隔，以预处理药物和抗原特异性的T细胞输注的间隔计，在1日～2周之间选择。

本发明提供含有包含抗原特异性的T细胞的细胞团作为有效成分的治疗药的预处理药物。适于患者的治疗的上述细胞团例如通过利用注射或点滴的静脉、动脉、皮下或腹腔内等的给药方法给药。上述细胞团能够按照制药领域中公知的方法，与公知的适于非口服给药的有机或无机的载体、赋形剂或稳定剂等混合，作为点滴剂或注射剂制备。上述细胞团的含量、给药量、其它各种条件能够按照公知的免疫疗法适当确定。作为医药中的上述细胞团的含量，没有特别限定，优选1×10³～1×10¹¹个/mL，更优选1×10⁴～1×10¹⁰个/mL，更加优选1×10⁵～2×10⁹个/mL。作为含有上述细胞团作为有效成分的治疗药的给药量，没有特别限定，成人每人，优选1×10⁶～1×10¹²个/日，更优选1×10⁷～5×10¹¹个/日，更加优选1×10⁸～2×10¹¹个/日。在上述细胞团的制造方法中，能够包括在上述细胞团中导入外来基因的工序。“外来基因”是指在含有基因导入对象的T细胞的细胞团中人为地导入的基因，还包括与基因导入对象的细胞为同种来源的基因。外来基因的导入方法没有特别限定，能够从公知的基因导入方法中选择使用合适的方法。基因导入能够使用病毒载体实施，或者不使用病毒载体实施。关于这些方法的详细情况已经有很多报道。

作为上述病毒载体，没有特别限定，可以使用基因导入中使用的公知的病毒载体，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体等。在所导入的细胞的染色体DNA中能够稳定导入外来基因的逆转录病毒载体或慢病毒载体是特别适合的。作为上述病毒载体，适合缺损了复制功能使得在感染的细胞中无法自我复制的病毒载体。基因导入时，能够使用RetroNectin(注册商标，Takara Bio制)等的提高了基因导入效率的物质。作为不使用病毒载体的基因导入方法，能够使用使用脂质体、或配体－聚赖氨酸等的载体的方法、磷酸钙法、电穿孔法、或粒子枪法等。此时，可以导入插入到质粒DNA、直链状DNA或RNA中的外来基因。

可以导入的外来基因没有特别限定，能够使用任意的基因(例如除了编码酶、细胞因子类、趋化因子类、或T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)这样的抗原受体类、共刺激分子的受体或配体等的蛋白质的基因以外，还有反义核酸、siRNA、miRNA、编码核酶、适配子的基因)。外来基因例如能够以在适当的启动子的控制下表达的方式插入载体或质粒等中使用。能够在载体内插入增强子序列或终止子序列这样的控制序列。

使用抗原搭载纳米凝胶、免疫增强剂和抗原特异性的T细胞输注的治疗药的适用的对象可以列举对免疫检查点抑制剂具有抵抗性的肿瘤的人。肿瘤的种类没有特别限定，例如，可以列举前列腺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈癌、食管癌、胃癌、结肠·直肠癌、肝癌、胆囊·胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肾脏癌、睾丸癌、骨·软组织肉瘤、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、皮肤癌、脑肿瘤等。

接着，参照附图详细说明本发明的实施例。本发明不受下述实施例任何限制，只要不变更主旨即可，能够进行各种变更来实施。

＜实施例1＞

1.材料和方法

抗小鼠CD16/CD32抗体(克隆93)、PE标记抗小鼠PD-L1抗体(克隆9G2)、APC-Cy7标记抗CD45抗体(克隆30-F11)和PE-Cy7标记抗PD-1抗体(克隆29F.1A12)从BioLegend购入。V450标记抗CD8抗体(克隆53-6.7)从eBioscience购入。胎牛血清(FBS)从BioWest购入。RPMI1640培养基(添加2-巯基乙醇)从细胞科学研究所购入。红细胞溶血溶液(0.15MNH₄Cl/10mM KHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂ pH 7.2)由三重大学制作。小鼠大肠癌CT26细胞株(CRL-2638)从ATCC购入，使用由三重大学传代后的细胞株。小鼠纤维肉瘤CMS7细胞株和小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株由纪念斯隆凯特琳癌症研究所获得，使用由三重大学传代后的细胞株。人NY-ESO-1抗原基因由纪念斯隆凯特琳癌症研究所赠予。在CMS5a细胞株中稳定导入了人NY-ESO-1抗原基因的CMS5a-NY细胞株使用由三重大学制作并传代的细胞株。雌性BALB/c小鼠是从日本SLC购入6～12周龄的小鼠，在三重大学医学部动物中心饲养。动物实验的实验步骤(protocol)得到了三重大学医学部的伦理委员会的批准。

小鼠大肠癌CT26细胞株、BALB/c小鼠纤维肉瘤CMS7细胞株、小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株和CMS5a-NY细胞株在含有10％FBS的RPMI1640培养基中，使用T75培养烧瓶(Corning)培养。培养得到的细胞株使用含有0.5％胰蛋白酶的磷酸缓冲生理盐水(PBS)剥离，悬浮在含有10％FBS的RPMI1640培养基中。将细胞离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，使用RPMI1640培养基清洗2次后，以1×10⁶个/100μL的浓度悬浮在RPMI1640培养基中。将该悬浮液以100μL/个体的用量皮下移植到BALB/c小鼠的后背部(每一组3只)。

将各细胞株皮下移植，在1周后回收肿瘤。肿瘤用以下所示的方法进行免疫组织化学染色。将包埋在O.C.T.复合物(Sakura Finetech)并冻结的肿瘤以3μm厚度薄薄切片，对所得到的肿瘤切片进行2小时风干。对干燥后的肿瘤切片用冰冷的丙酮进行15分钟的固定，用于免疫染色。将肿瘤切片用PBS清洗3次后，在4℃浸渍于封闭液(含有1％牛血清白蛋白(BSA)和5％Blocking One Histo(Nacalai Tesque)的PBS)，进行封闭。以1μg/mL的浓度将抗小鼠CD16/CD32抗体在封闭液中稀释。使用该抗体，在湿润箱内对肿瘤切片以室温进行30分钟的处理，将Fcγ受体封闭。接着，使用在封闭液以1μg/mL的浓度稀释的PE标记抗小鼠PD-L1抗体，在湿润箱内对肿瘤切片在室温进行1小时染色。用含0.02％Tween20的PBS进行3次清洗后，将肿瘤切片浸渍于Prolong Gold antifade reagent with DAPI(LifeTechnologies)，使用荧光显微镜BX53F(奥林巴斯)或共聚焦激光扫描型显微镜LSM780(Carl Zeiss)观察。对所得到的显微镜观察像，使用Photoshop Element(Adobe Systems)进行图像处理。

将各细胞株皮下移植，在1周后将肿瘤浸润免疫细胞用如下方法分离。从小鼠分离肿瘤，使用Gentle MACS(Miltenyi)破碎后，悬浮于RPMI1640培养基。此时，收集相当于1组3只的细胞。在悬浮的细胞中，加入胶原酶D(终浓度2mg/mL、Roche)在37℃反应30分钟后，再使用Gentle MACS破碎。将细胞通过过滤器(22μm孔径、BDBioscience)后，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)，除去上清后，加入2mL的红细胞溶血溶液，对细胞处理1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)。除去上清，将细胞悬浮于RPMI1640培养基。对细胞数计数后，以达到3×10⁷个/mL的细胞浓度的方式悬浮于染色用缓冲液(含0.5％BSA的PBS)。将每1孔50μL的细胞悬浮液转移至96孔V底微孔板(NUNC)。离心分离(2000rpm、1分钟、4℃)除去上清后，在每1孔50μL的染色用缓冲液中悬浮。按照各抗体的制造商的推荐使用浓度，将APC-Cy7标记抗小鼠CD45抗体、V450标记抗小鼠CD8抗体、PE-Cy7标记抗小鼠PD-1抗体添加于细胞，轻轻混合后，在4℃的暗处静置15分钟。用200μL的染色用缓冲液将细胞清洗2次后，悬浮于200μL的染色用缓冲液，转移至圆底聚苯乙烯试管(BDBioscience)。细胞使用流式细胞仪FACS Canto II(BDBioscience)和数据解析软件FlowJo(Tree Star)解析。作为PD-1表达的频度，求出CD45阳性且CD8阳性的细胞团中的表达频度(％)。作为CD8阳性T细胞的频度，求出CD45阳性细胞团中的CD8阳性细胞的频度(％)。

2.结果

人的免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤显示免疫检查点分子的表达缺陷或观察不到CD8阳性T细胞的肿瘤浸润这样的特征(非专利文献5)。为了探索显示与此相同特征的小鼠肿瘤，回收将各种小鼠癌细胞株在BALB/c小鼠中皮下移植后所形成的肿瘤，测定免疫检查点分子PD-L1和PD-1的表达、以及CD阳性T细胞的浸润数。图1(A)表示用免疫染色法解析CT26肿瘤、CMS7肿瘤、CMS5a-NY肿瘤和CMS5a肿瘤的肿瘤局部的PD-L1分子的表达的结果。在CT26肿瘤、CMS7肿瘤和CMS5a-NY肿瘤中，观察到表达PD-L1的大量细胞，而相对于此，在CMS5a肿瘤中，PD-L1表达细胞的数极少。图1(B)表示用流式细胞仪法解析各肿瘤的肿瘤局部的CD3阳性T细胞中的PD-1的表达频度的结果。CMS5a肿瘤与其它肿瘤比较，表达PD-1的CD3阳性T细胞的比例最低。图1(C)表示各肿瘤的肿瘤局部中浸润的CD8阳性T细胞的频度。CMS5a肿瘤与其它肿瘤相比较，肿瘤局部浸润的CD8阳性T细胞的频度明显低。由以上的结果发现，小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株在小鼠皮下移植而形成的肿瘤显示与人的免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤相同的特征。

＜实施例2＞

1.材料和方法

抗小鼠CTLA-4抗体(克隆9D9)使用由MD安德森癌症中心的James P.Allison博士赠予的杂交瘤并由三重大学制作。抗小鼠GITR抗体(克隆DTA-1)使用由大阪大学的坂口志文博士赠予的杂交瘤并由三重大学制作。抗小鼠PD-1抗体(克隆RMP1-14)使用由顺天堂大学的八木田秀雄博士赠予的抗体。胎牛血清(FBS)由BioWest购入。RPMI1640培养基(2-巯基乙醇添加)由细胞科学研究所购入。小鼠大肠癌CT26细胞株(CRL-2638)使用由ATCC购入、由三重大学传代的细胞株。小鼠纤维肉瘤CMS7细胞株和小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株使用由纪念斯隆凯特琳癌症研究所获得、由三重大学传代的细胞株。人NY-ESO-1抗原基因由纪念斯隆凯特琳癌症研究所赠予。在CMS5a细胞株中稳定导入了人NY-ESO-1抗原基因的CMS5a-NY细胞株使用由三重大学制作并传代的细胞株。雌性BALB/c小鼠是由日本SLC购入的6周龄～12周龄的小鼠，由三重大学医学部动物中心饲养。动物实验的实验步骤得到了三重大学医学部的伦理委员会的批准。

使用T75培养烧瓶(Corning)，将CT26细胞株、CMS7细胞株、CMS5a细胞株和CMS5a-NY细胞株在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。将各细胞株使用含0.5％胰蛋白酶的磷酸缓冲生理盐水(PBS)剥离，悬浮于含10％FBS的RPMI1640培养基。将悬浮液离心分离(400×g、5分钟、4℃)后，除去上清。使用RPMI1640培养基清洗2次后，以1×10⁶个/100μL的浓度悬浮于RPMI1640培养基。将该悬浮液以100μL/个体的用量在BALB/c小鼠的后背部中皮下移植(每1组为4只)。在肿瘤移植后第7、9和11日，将在PBS中稀释的抗小鼠PD-1抗体(150μg)、抗小鼠CTLA-4抗体(100μg)和抗小鼠GITR抗体(100μg)作为免疫检查点抑制剂同时在腹腔内投予。肿瘤移植后经时地测定肿瘤的长径和短径，按照计算式(长径×短径×短径×0.5)算出肿瘤体积。统计解析利用使用Microsoft Excel(微软)的非参数检验进行。

2.结果

由实施例1的结果，可以预料小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株皮下移植到BALB/c小鼠形成的肿瘤对免疫检查点抑制剂显示抵抗性。因此，对于将各小鼠癌细胞株皮下移植而形成肿瘤的BALB/c小鼠，尝试了利用作为免疫检查点抑制剂的抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体和抗GITR抗体的并用疗法的治疗实验。将结果表示在图2中。在CT26肿瘤、CMS7肿瘤和CMS5a-NY肿瘤中，明确确认到利用免疫检查点抑制剂并用疗法的肿瘤增殖抑制。相对于此，CMS5a肿瘤对于免疫检查点抑制剂并用疗法完全没有反应，与未治疗组显示同样的增殖。由此可知，CMS5a肿瘤对免疫检查点抑制剂显示强的抵抗性。结合实施例1的结果，可以认为CMS5a肿瘤是人的免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的良好的模型。可知使用CMS5a肿瘤作为评价体系，能够实现对于人的免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤有效的治疗方法的探索。

＜实施例3＞

1.材料和方法

胆固醇支链淀粉(简称CHP、商品名CHP-80T)由株式会社日油获得。不完全弗氏佐剂(简称IFA、型号F5506)由Sigma Aldrich购入。长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶如下制备。将由Bio-Synthesis化学合成的长链肽抗原(MEN肽：SNPARYEFLYYYYYYQYIHSANVLYYYYYYRGPESRLL(序列编号1)或p121肽：NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列编号2))以10mg/mL的浓度溶解于二甲基亚砜(简称DMSO、Nacalai Tesque)。CHP以10mg/mL的浓度溶解于含6M尿素(NacalaiTesque)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)。将1mL(10mg)的长链肽抗原溶液和20mL(200mg)的CHP溶液混合，在暗处以4℃一边轻轻搅拌一边放置一晩。将混合液转移至透析膜(截止分子量：3,500、Thermo Scientific)，作为透析外液对容积比100倍以上的含0.6M尿素的PBS在4℃透析2小时至一晩。进而，作为透析外液使用容积比100倍以上的含0.06M尿素的PBS，在4℃透析2小时至一晩。再次作为透析外液使用容积比100倍以上的PBS，在4℃透析2小时至一晩。回收透析内液，使用孔径0.22μm的滤过灭菌过滤器(PVDF膜制、Millipore)过滤后，使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific)测定280nm的UV吸收。由长链肽抗原的分子吸光系数(1mg/mL＝4.181)求出其最终浓度。

长链肽抗原：IFA混合物如下制备。将长链肽抗原以60μg/125μL的浓度溶解于含25％DMSO的PBS，采集到注射器中。另外在注射器中采集125μL的IFA。将两个注射器用三通旋塞连结后，反复吸排，充分混合后用于给药。胎牛血清(FBS)由BioWest购入。RPMI1640培养基(添加2-巯基乙醇)由细胞科学研究所购入。小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株使用由纪念斯隆凯特琳癌症研究所赠予、由三重大学传代的细胞株。小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株表达突变型ERK2蛋白质。包含突变型ERK2蛋白质的突变部分的肽(QYIHSANVL：序列编号3，下线部表示突变)被BALB/c小鼠的CD8阳性细胞毒性T细胞。识别该肽的T细胞受体(TCR)被分离，制作基因导入有TCR的小鼠(DUC18小鼠)。本实施例中使用的长链肽抗原(MEN肽和p121肽)包含上述突变型ERK2的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位序列(QYIHSANVL：序列编号3)。

雌性BALB/c小鼠是由日本SLC购入的6周龄～12周龄的小鼠。DUC18小鼠使用由华盛顿大学赠予、在三重大学繁殖的小鼠。小鼠由三重大学医学部动物中心饲养。动物实验的实验步骤得到了三重大学医学部的伦理委员会的批准。

使用T75培养烧瓶(Corning)，将小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。将培养后的细胞株使用含0.5％胰蛋白酶的PBS剥离，悬浮于含有10％FBS的RPMI1640培养基中。将悬浮液离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清。然后，使用RPMI1640培养基清洗2次，以1×10⁶个/100μL的浓度悬浮于RPMI1640培养基。以100μL/个体的用量皮下移植到BALB/c小鼠的两侧后背部(每1组4只)。在将抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂作为预处理药物给药的情况下，在肿瘤移植7日后和11日后，与作为免疫增强剂的溶解于PBS的50μg的CpG寡聚DNA1668(Gene design)或50μg的Poly-ICLC RNA(Oncovir)一起，将长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶或长链肽抗原：IFA混合物向小鼠的后背部皮下或尾静脉内给药。在图4(A)所示的实验中，作为长链肽抗原使用p121肽。在其它实验中全部使用MEN肽。使用CD8a+T Cell分离试剂盒(Miltenyi)从突变型ERK2特异的TCR基因导入小鼠(DUC18小鼠)的脾脏将CD8阳性T细胞分离。将分离得到的CD8阳性T细胞在RPMI1640培养基以2×10⁶个/200μL的浓度悬浮。在肿瘤移植8日后和12日后，将分离得到的CD8阳性T细胞作为治疗用的抗原特异性的T细胞从尾静脉内输注。统计解析通过使用Microsoft Excel(微软)的非参数检验进行。

2.结果

使用皮下移植到BALB/c小鼠形成的CMS5a肿瘤作为评价体系，探索对人的免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤有效的治疗方法。其结果发现，如图3(A)所示，在作为预处理药物将长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和免疫增强剂(CpG寡聚DNA)皮下投予后进行抗原特异性的T细胞输注，则CMS5a肿瘤的增殖被显著抑制。该治疗效果在作为递送系统使用IFA的情况下没有被确认到。如图3(B)所示可知，预处理药物的给药途径以静脉内给药代替皮下给药也有效。如图3(C)所示可知，预处理药物所含的免疫增强剂不限于CpG寡聚DNA，Poly-ICRNA也可以。

如图4(A)所示，如果从预处理药物除去长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶，则确认不到治疗效果。如图4(B)所示，如果从预处理药物除去免疫增强剂(CpG寡聚DNA)，则确认不到治疗效果。由以上结果可知，对于抗原特异性的T细胞输注的预处理药物而言，长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和免疫增强剂是必须的。如图4(C)所示，省略抗原特异性的T细胞输注，仅为预处理药物也确认不到治疗效果。

这样可知，通过将本发明的预处理药物与抗原特异性的T细胞输注并用，能够治疗免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤。

＜实施例4＞

1.材料和方法

罗丹明(Rhodamine)标记CHP纳米凝胶使用由京都大学·秋吉一成博士赠予的凝胶。APC-Cy7标记抗小鼠CD45抗体(克隆30-F11)、FITC标记抗小鼠CD8抗体(克隆53-6.7)、PE标记抗小鼠CD11b抗体(克隆M1/70)、Pacific blue标记抗小鼠F4/80抗体(克隆BM8)和PE-Cy7标记抗小鼠CD11c抗体(克隆N418)由BioLegend购入。PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD4抗体(克隆RM4-5)由BDBioscience购入。APC标记抗小鼠B220抗体(克隆RA3-6B2)由eBioscience购入。胎牛血清(FBS)由BioWest购入。RPMI1640培养基(添加2-巯基乙醇)由细胞科学研究所购入。红细胞溶血溶液(0.15M NH₄Cl/10mM KHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂pH 7.2)由三重大学制作。小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株使用由纪念斯隆凯特琳癌症研究所赠予、由三重大学传代的细胞株。雌性BALB/c小鼠是由日本SLC购入的6周龄～12周龄的小鼠，在三重大学医学部动物中心饲养。动物实验的实验步骤得到了三重大学医学部的伦理委员会的批准。

使用T75培养烧瓶(Corning)，将小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。使用含0.5％胰蛋白酶的磷酸缓冲生理盐水(PBS)将该细胞株剥离，悬浮于含10％FBS的RPMI1640培养基中。离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，使用RPMI1640培养基清洗2次。将细胞株以1×10⁶个/100μL的浓度悬浮于RPMI1640培养基，以100μL/个体的用量皮下移植到BALB/c小鼠的后背部(每1组4只)。在肿瘤移植第7日将1mg的罗丹明标记CHP纳米凝胶(10mg/mL PBS)在后背部皮下或尾静脉内给药。在罗丹明标记CHP纳米凝胶给药的第二日，将肿瘤浸润免疫细胞用如下所示的方法分离。从小鼠分离肿瘤，使用Gentle MACS(Miltenyi)破碎后，悬浮于RPMI1640培养基。收集相当于1组4只的细胞。加入胶原酶D(终浓度2mg/ml、Roche)，在37℃反应30分钟后，再使用Gentle MACS破碎。通过过滤器(22μm孔径、BDBioscience)后，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，加入2mL的红细胞溶血溶液，对细胞处理1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)。除去上清，将细胞悬浮于RPMI1640培养基。对细胞数计数后，以达到3×10⁷个/mL的细胞浓度的方式悬浮于染色用缓冲液(含0.5％牛血清白蛋白的PBS)。将每1孔50μL的细胞悬浮液转移至96孔V底微孔板(NUNC)。进行离心分离(2000rpm、1分钟、4℃)并除去上清后，悬浮于每1孔50μL的染色用缓冲液。罗丹明标记CHP纳米凝胶给药18小时后，回收局部淋巴结。在皮下给药的情况下，回收给药部位的局部淋巴结(腹股沟淋巴结)，在静脉内给药的情况下，回收肿瘤的局部淋巴结(腹股沟淋巴结)。

使用载玻片将淋巴结磨碎后，将游离的细胞悬浮于RPMI1640培养基中。此时，收集相当于1组4只的细胞。进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，加入2mL的红细胞溶血溶液，对细胞处理1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)。除去上清，将细胞悬浮于RPMI1640培养基。将细胞悬浮液离心分离(400×g、5分钟、4℃)后，除去上清，使用含2％FBS的PBS，清洗2次后悬浮。对由肿瘤或淋巴结制备的细胞悬浮液，按照各抗体的制造商推荐的使用浓度，添加APC-Cy7标记抗小鼠CD45抗体、FITC标记抗小鼠CD8抗体、PerCP-Cy5.5标记抗小鼠CD4抗体、APC标记抗小鼠B220抗体、PE标记抗小鼠CD11b抗体、Pacific blue标记抗小鼠F4/80抗体、PE-Cy7标记抗小鼠CD11c抗体，进行混合后，在4℃的暗处静置15分钟。用200μL的染色用缓冲液将细胞清洗2次后，在200μL的染色用缓冲液进行重悬，转移至圆底聚苯乙烯试管(BDBioscience)。细胞使用流式细胞仪FACSCanto II(BDBioscience)和数据解析软件FlowJo(Tree Star)解析。

T细胞作为CD45阳性且CD4阳性或者CD45阳性且CD8阳性的细胞团检出，B细胞作为CD45阳性且B220阳性的细胞团检出，巨噬细胞作为CD45阳性且CD11b阳性且CD11c阳性且F4/80阳性的细胞团检出。将各免疫细胞中的罗丹明阳性细胞作为CHP纳米凝胶摄入细胞检出。

2.结果

如图3(B)所示，本发明的预处理药物在皮下给药或静脉内给药的任一种情况下，对免疫检查点抑制剂抵抗性的CMS5a肿瘤都显示同样的治疗效果。为了解明预处理药物的作用机理，测定对皮下移植了CMS5a肿瘤的BALB/c小鼠皮下给药或静脉内给药的罗丹明标记CHP纳米凝胶的淋巴结和肿瘤局部中存在的免疫细胞中的摄入。如图5所示，皮下给药的CHP纳米凝胶被给药部位局部淋巴结的巨噬细胞良好地摄入。另一方面，静脉内给药的CHP纳米凝胶被肿瘤局部的巨噬细胞良好地摄入。没有确认到在其它免疫细胞中的摄入。可以认为淋巴结或肿瘤局部的巨噬细胞摄入由CHP纳米凝胶传递的长链肽抗原，向所输注的抗原特异性的T细胞提呈，由此增强抗原特异性的T细胞的活性。可知在CHP纳米凝胶被静脉内给药的情况下，具有对肿瘤局部的巨噬细胞选择性地物质输送的能力。

＜实施例5＞

1.材料和方法

胎牛血清(FBS)由BioWest购入。RPMI1640培养基(添加2-巯基乙醇)由细胞科学研究所购入。红细胞溶血溶液(0.15M NH ₄Cl/10mMKHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂pH 7.2)由三重大学制作。小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株使用由纪念斯隆凯特琳癌症研究所赠予、且由三重大学传代的细胞株。雌性BALB/c小鼠是由日本SLC购入的6周龄～12周龄的小鼠。突变型ERK2特异性的TCR基因导入小鼠(DUC18小鼠)使用由华盛顿大学赠予、在三重大学繁殖的小鼠。各小鼠在三重大学医学部动物中心饲养。动物实验的实验步骤得到了三重大学医学部的伦理委员会的批准。

使用T75培养烧瓶(Corning)，将小鼠纤维肉瘤CMS5a细胞株在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。将培养得到的细胞使用含0.5％胰蛋白酶的磷酸缓冲生理盐水(PBS)剥离，悬浮于含10％FBS的RPMI1640培养基。进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，使用RPMI1640培养基清洗2次。将细胞以1×10⁶个/100μL的浓度悬浮于RPMI1640培养基，以100μL/个体的用量皮下移植到BALB/c小鼠的后背部(每1组5只)。肿瘤移植7日后，将与实施例3同样制备的长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶(作为MEN肽60μg、溶解于PBS)和CpG寡聚DNA1668(50μg、溶解于PBS、Gene design)混合并尾静脉内给药。18小时后，从给药小鼠的肿瘤、肺、肝脏、脾脏和淋巴结将抗原提呈细胞以如下所示的方法分离。

对于肿瘤使用Miltenyi制的分离试剂盒(Tumor Dissociation Kit(型号130-096-730))、对于肺使用Miltenyi制的分离试剂盒(Lung Dissociation Kit(型号130-095-927))、对于肝脏使用Miltenyi制的分离试剂盒(Liver Dissociation Kit(型号130-105-807)))，按照制造商推荐实验步骤处理后，将游离的细胞悬浮于RPMI1640培养基中。

此时，收集相当于1组5只的细胞。进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，加入2mL的红细胞溶血溶液，对细胞处理1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)。除去上清，将细胞悬浮于RPMI1640培养基。脾脏和腹股沟淋巴结利用载玻片磨碎后，将游离的细胞回收到RPMI1640培养基中。此时，收集相当于1组5只的细胞。进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)后除去上清，加入2mL的红细胞溶血溶液，对细胞处理1分钟。加入18mL的RPMI1640培养基，进行离心分离(400×g、5分钟、4℃)。除去上清，将细胞悬浮于RPMI1640培养基(一次细胞悬浮液)。将从各组织制备的一次细胞悬浮液离心分离(400×g、5分钟、4℃)后，除去上清，使用含2％FBS的PBS清洗2次，悬浮于含2％FBS的PBS制成二次细胞悬浮液。从二次细胞悬浮液使用CD11b微珠(Miltenyi)分离CD11b阳性细胞，制成来自各组织的抗原提呈细胞。另一方面，由DUC18小鼠的脾脏，与实施例3同样分离CD8阳性T细胞。然后，使用荧光色素的CFSE(Thermo Fisher Science)进行标记，作为效应T细胞。将抗原提呈细胞和效应T细胞在96孔V底微孔板(NUNC)中分别以每1孔2.5×10⁵个和2×10⁵个细胞数添加，在含10％FBS的RPMI1640培养基中共培养72小时。如果效应T细胞受到抗原提呈而增殖，则伴随着细胞分裂，来自CFSE的荧光减弱。其变化使用流式细胞仪FACS CantoII(BDBioscience)和数据解析软件FlowJo(Tree Star)测定。在全部效应T细胞内，算出分裂了2次以上的效应T细胞的比例，评价来自各组织的抗原提呈细胞的抗原提呈性能。

2.结果

可知在实施例4中，静脉内给药的CHP纳米凝胶被肿瘤局部的巨噬细胞选择性地摄入。可以认为静脉内给药的长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶被肿瘤局部的巨噬细胞摄入后，提呈给所输注的抗原特异性的T细胞，增强了抗原特异性的T细胞的活性。为了确认由肿瘤局部巨噬细胞进行的抗原提呈反应，进行如下实验。从将包含突变型ERK2的CD8阳性T细胞识别表位的长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA进行了静脉内给药的CMS5a肿瘤皮下移植BALB/c小鼠，回收在肿瘤以及各种组织局部存在的CD11b阳性巨噬细胞。将其作为抗原提呈细胞，与来自导入了突变型ERK2特异性的TCR基因的小鼠的CD8阳性T细胞在试验管内共培养。只要CD11b阳性巨噬细胞提呈所给药的长链肽抗原所含的来自突变型ERK2的CD8阳性T细胞识别表位，则来自导入了突变型ERK2特异性的TCR基因的小鼠的CD8阳性T细胞就活化并增殖。T细胞的增殖通过利用流式细胞仪的CFSE稀释试验测定，作为抗原提呈的指标。

如图6所示，如果将长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA静脉内给药，则确认到由肿瘤局部巨噬细胞进行的长链肽抗原的提呈。来自淋巴结的巨噬细胞虽然弱但确认到长链肽抗原的提呈。在其它组织的巨噬细胞中没有检测到长链肽抗原的提呈。可以认为这些巨噬细胞存在不摄入长链肽抗原搭载CHP纳米凝胶和CpG寡聚DNA，或者即使摄入也缺乏抗原提呈的能力的可能性。由这些结果可知，CHP纳米凝胶在被静脉内给药的情况下，具有肿瘤局部的巨噬细胞选择性地物质输送、特别是输送抗原、使其抗原提呈的能力。

可以认为上述作用机理除了人类以外，在猴、小鼠、大鼠、猪、牛、狗等非人类哺乳动物中也是同样的。可以认为本发明的组合物对人、猴、小鼠、大鼠、猪、牛、狗等具有同等的效果。

根据本实施方式，能够提供对于不表达免疫检查点抑制剂的靶标分子对该抑制剂显示抵抗性的肿瘤在治疗上有用的医药品。通过使用作为其递送系统的包含疏水化多糖纳米凝胶和合成长链肽抗原或重组蛋白质抗原的抗原搭载纳米凝胶和免疫增强剂作为预处理药物，可以得到增强抗原特异性的T细胞输注的抗癌作用的效果。

序列表

<110> 国立大学法人三重大学

国立大学法人京都大学

<120> 对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法的预处理药物

<130> JP2017001MIK

<150> JP2016/022081

<151> 2016-02-08

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> MEN肽

<400> 1

Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gln

1 5 10 15

Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Gly

20 25 30

Pro Glu Ser Arg Leu Leu

35

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> p121肽

<400> 2

Asn Asp His Ile Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Gln

1 5 10 15

Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn

20 25 30

Leu Leu Leu Asn Thr

35

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> CD8+表位

<400> 3

Gln Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu

1 5

Claims

1.一种医药组合物，其特征在于：

其为在对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法中，在投予抗原特异性的T细胞之前投予的医药组合物，

该医药组合物含有抗原搭载纳米凝胶，所述抗原搭载纳米凝胶是将包含源自所述抗原的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和/或CD4阳性辅助T细胞识别表位的长链肽抗原或蛋白质抗原搭载于疏水化多糖纳米凝胶得到的。

2.一种医药组合物，其特征在于：

其为在对免疫检查点抑制剂抵抗性肿瘤的T细胞输注疗法中，用于在投予所述抗原搭载纳米凝胶后投予的包含所述抗原特异性的T细胞的医药组合物，

所述抗原搭载纳米凝胶是将包含源自所述抗原的CD8阳性细胞毒性T细胞识别表位和/或CD4阳性辅助T细胞识别表位的长链肽抗原或蛋白质抗原搭载于疏水化多糖纳米凝胶得到的。

3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其特征在于：

还与抗原搭载纳米凝胶一起投予免疫增强剂，或者还在抗原搭载纳米凝胶中包含免疫增强剂。

4.如权利要求1～权利要求3中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述抗原特异性的T细胞是表达识别所述抗原的T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞。

5.如权利要求1～权利要求4中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述长链肽抗原由23～120个氨基酸构成。

6.如权利要求1～权利要求5中任一项所述的组合物，其特征在于：

在长链肽抗原所含的T细胞识别表位之间，包含选自2～10个酪氨酸、2～10个苏氨酸、2～10个组氨酸、2～10个谷氨酰胺和2～10个天冬酰胺中的序列。

7.如权利要求1～权利要求6中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述疏水化多糖包含支链淀粉和胆固醇基。

8.如权利要求3～权利要求7中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述免疫增强剂为选自TLR(Toll样受体)激动剂(CpG寡聚DNA或Poly-IC RNA)、STING激动剂或RLR(RIG-I样受体)激动剂中的至少一种。

9.如权利要求1～权利要求8中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述抗原为肿瘤特异性的抗原蛋白或肿瘤间质特异性的抗原蛋白。

10.如权利要求1～权利要求9中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述抗原搭载纳米凝胶的给药途径通过选自皮下、皮内、肌肉内、肿瘤内和静脉内中的至少一种途径给药。

11.如权利要求1～权利要求10中任一项所述的组合物，其特征在于：

所述抗原搭载纳米凝胶在投予包含所述抗原特异性的T细胞的医药组合物的至少1天前投予。

12.一种纳米凝胶，其特征在于：

其为静脉内给药时传递肿瘤局部的巨噬细胞选择性物质的递送系统，所述纳米凝胶由包含支链淀粉和胆固醇基的疏水化多糖构成，且所述纳米凝胶的粒径为80nm以下。

13.一种非人哺乳类肿瘤模型，其特征在于：

其用于鉴定对于免疫检查点抑制剂具有抵抗性的肿瘤有效的治疗药，其中，所述肿瘤为小鼠纤维肉瘤CMS5a，非人哺乳类为小鼠。