KR20180105232A - 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 t세포 수주요법의 전처치약 - Google Patents
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Abstract
(과제)면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 치료에 관한 기술을 제공하는 것이다.
(해결수단)면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 항원에 특이적인 T세포의 투여전에 투여하기 위한 의약조성물로서, 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 항원 탑재 나노겔을 함유하는 의약조성물에 의해 달성된다.
(해결수단)면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 항원에 특이적인 T세포의 투여전에 투여하기 위한 의약조성물로서, 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 항원 탑재 나노겔을 함유하는 의약조성물에 의해 달성된다.
Description
본 발명은, 면역체크포인트 저해제 저항성 종양(immune checkpoint inhibitor 抵抗性 腫瘍)에 대한 T세포 수주요법(T cell 輸注療法)의 효과를 높이는 전처치약(前處置藥)에 관한 것이다.
T세포는, 종양면역응답에 있어서 중요한 역할을 담당한다. T세포는, 세포 표면에 발현되는 T세포 수용체(TCR)를 통하여, 항원제시세포(수상세포(樹狀細胞), 대식세포(macrophage) 등)에 있어서 세포 표면상의 주요조직 적합유전자 복합체(MHC)와의 복합체로서 제시되는 항원단백질 유래 에피토프 펩티드(epitope peptide)를 인식한다. 이 반응을 항원자극이라고 한다. 항원자극과 동시에, T세포 표면에 존재하는 막단백질 CD28과 항원제시세포상의 막단백질 CD80 또는 CD86이 결합함으로써, 공자극 시그널(共刺戟 signal)이 성립한다. 항원자극에 의한 TCR 시그널과 공자극 시그널이 동시에 입력됨으로써, T세포가 적절하게 활성화된다.
이에 대하여 T세포의 작용이 과잉이 되지 않도록, 면역체크포인트라고 불리는 제어기구가 갖춰지고 있다. 막단백질 CTLA-4는 활성화 T세포에 발현되어, 항원제시세포의 CD80 또는 CD86과 결합한다. 그 결과, CD28과 CD80, 또는 CD28과 CD86 사이의 결합을 방해해서 공자극 시그널의 성립을 저지함과 아울러 T세포내에 억제 시그널을 입력한다. 제어성 T세포에 발현되는 CTLA-4는 항원제시세포상의 CD80 또는 CD86과 결합함으로써, 항원제시세포의 활성을 억제하는 작용이 있다. 이러한 작용을 통하여, CTLA-4는 T세포의 작용을 억제하는 면역체크포인트 분자로서 기능한다.
T세포의 활성화시에 발현증강하는 막단백질 PD-1은, 면역체크포인트 분자의 일종(一種)이다. PD-1에 결합하는 리간드로서, PD-L1이 알려져 있다. PD-L1은 많은 종양세포 및 활성화한 면역세포에 발현된다. PD-L1이 T세포상의 PD-1에 결합하면, PD-1 시그널에 의하여 항원자극시의 TCR 시그널이 억제된다. 그 결과, T세포의 사이토카인 생산이나 세포살상 활성이 저하한다. PD-1 시그널은 T세포의 증식이나 생존을 억제하는 작용이 있다.
CTLA-4, PD-1 및 PD-L1과 같은 면역체크포인트 분자는, 종양특이적 T세포의 작용을 약하게 한다. 그 결과, 종양이 면역으로부터 도피하는 주요인의 하나가 되고 있다. CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1의 작용을 저해함으로써 종양특이적 T세포의 작용을 회복하고, 종양에 대한 면역적 공격을 강화할 수 있다. 다양한 인간암에 있어서, 면역체크포인트 분자에 대한 저해제의 유용성이 평가되어 있다. CTLA-4 저해 항체 및 PD-1 저해 항체는, 난치성의 멜라노마(melanoma), 폐암 및 신장세포암의 환자에 있어서, 종양축소나 생존기간연장 등의 우수한 치료효과를 나타낸다. 그러나 치료효과는, 어느 암종(癌種)에 있어서도 약 2∼3할에 그치고 있다. 많은 암환자는 면역체크포인트 저해제에 대하여 저항성이다. 면역체크포인트 저해제에 저항성인 암환자에게 유효한 치료법의 개발이 암의료에 있어서의 중요한 과제가 되고 있다.
인 비트로 시험계(in vitro 試驗系)를 사용하여 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 유효한 치료법의 후보를 찾아내고 있다. 마우스 멜라노마세포주 B16F10, 마우스 전립선암세포주 TRAMP-C2 또는 마우스 대장암세포주 CT26을 야생형 마우스에 피하이식(皮下移植)한 비임상(非臨床) 종양모델에 있어서, 항(抗)CTLA-4 항체 단제(單劑)에 의하여서는 명확한 치료효과를 인정받지 못한 조건하에서, 종양 용해 바이러스(뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus))의 종양내 투여와 항CTLA-4 항체의 병용요법은 치료효과를 나타낸다(비특허문헌1). 마우스 멜라노마세포주 B16F10 또는 마우스 대장암세포주 CT26을 야생형 마우스에 피하이식한 비임상 종양모델에 있어서, 항PD-1 항체 단제에 의하여서는 명확한 치료효과를 인정받지 못한 조건하에서, 방사선과 STING 아고니스트로 처리한 GM-CSF유전자도입 종양세포 백신과 항PD-1 항체의 병용요법이 치료효과를 나타낸다(비특허문헌2). 마우스 유방암세포주 4T1을 야생형 마우스에 피하이식한 비임상 종양모델에 있어서, 항CTLA-4 항체와 항PD-1 항체의 병용요법에서는 명확한 치료효과를 인정받지 못한 조건하에서, DNA 메틸화 저해제, HDAC 저해제, 항CTLA-4 항체, 항PD-1 항체의 4제(劑) 병용요법이 치료효과를 나타낸다(비특허문헌3). 인간 Her2 항원을 발현하는 마우스 육종세포주 24JK를 인간 Her2 트랜스제닉 마우스에 피하이식한 비임상 종양모델에 있어서, 항PD-1 항체 단제에 의하여서는 명확한 치료효과를 인정받지 못한 조건하에서, 인간 Her2에 대한 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자도입 T세포 수주(輸注)와 항PD-1 항체의 병용요법이 치료효과를 나타낸다(비특허문헌4).
이들 보고는 모두 면역체크포인트 저해제와 다른 암치료약을 조합시키는 것을 특징으로 하고 있다. 치료효과가 인정되는 종양은, 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하는 것에 한정된다.
인간암에 있어서, 면역체크포인트 저해제의 저항성의 기서(機序)가 해명되어 오고 있다. 항PD-1 항체에 감수성 또는 저항성을 나타내는 멜라노마 환자의 종양조직을 해석하면, 저항성인 환자에게서는 종양내의 PD-L1 및 PD-1의 발현이 유의하게 낮은 것이 밝혀졌다(비특허문헌5). 이 결과는, 종양 국소(局所)에 있어서의 면역체크포인트 저해제의 표적분자의 발현결여가 종양이 동(同)저해제에 저항성을 나타내는 원인인 것을 나타낸다. 비특허문헌1∼4에 나타내지는 치료법은 모두 면역체크포인트 저해제와 다른 암치료약을 조합시키는 것을 특징으로 하고 있다. 이들 치료법은, 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하는 종양에 대하여는 유효하다. 그러나 이들의 치료법은, 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하지 않는 종양에 대하여는 효과가 적을 가능성이 있다. 이들의 결과로부터 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하지 않는 종양에 대한 신규치료법이 필요하다.
Zamarin, D., et al. Sci. Transl. Med. 2014;6(226):226ra32.
Fu, J., et al. Sci. Transl. Med. 2015;7(283):283ra52.
Kim, K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014;111(32):11774-9.
John, L. B., et al. Clin. Cancer Res. 2013;19(20):5636-46.
Tumeh, P. C., et al. Nature. 2014;515(7528):568-71.
본 발명의 목적은, 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 치료기술을 제공하는 것이다. 구체적으로는, T세포 수주요법과 병용함으로써 매우 효과가 높은 항종양·종양억제효과를 나타내는 전처치약(항원 탑재 나노겔 및 면역증강제)을 제공하는 것이다.
본 발명자는, 종양 국소에 있어서의 면역체크포인트 저해제의 표적분자의 발현이 낮고, 동(同)저해제에 저항성인 종양에 대하여 유효한 치료법에 대해서 검토했다. 전처치약(前處置藥)으로서, 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원과 소수화 다당나노겔과를 조합시킨 항원 탑재 나노겔과, 면역증강제를 조합시켜서 사용했다. 항원특이적 T세포 수주가, 면역체크포인트 저해제에 저항성을 나타내는 종양에 대하여 현저하게 잘 듣는 것을 찾아내어, 기본적으로는 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 상세는, 다음과 같다.
1)면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 항원에 특이적인 T세포를 투여하기 전에 투여되는 의약조성물로서, 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및/또는 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 항원 탑재 나노겔을 함유하는 의약조성물.
2)면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 상기 항원 탑재 나노겔을 투여한 후에 투여하기 위한 상기 항원에 특이적인 T세포를 포함하는 의약조성물로서, 상기 항원 탑재 나노겔이 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및/또는 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 의약조성물.
상기 발명에 있어서, 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원으로서는, 재조합 단백질항원을 사용할 수도 있다. 이 경우에는, 소정의 아미노산 배열을 가지는 단백질을 코드하는 염기배열을 가지는 핵산을 제작하고, 이것을 조립한 세포(진핵세포 또는 원핵세포)를 사용하여 재조합 단백질을 발현시킨 후에, 공지의 방법에 따라 정제함으로써 재조합 단백질항원을 얻는다.
3)또한 면역증강제가 항원 탑재 나노겔과 함께 투여되거나 또는 면역증강제가 항원 탑재 나노겔에 포함되어 있는 1) 또는 2)기재의 조성물.
4)상기 항원에 특이적인 T세포가, 상기 항원을 인식하는 T세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T세포인 1)∼3)의 어느 1항의 조성물.
5)상기 장쇄 펩티드항원이 23∼120개의 아미노산으로 이루어지는 1)∼4)의 어느 1항의 조성물.
6)장쇄 펩티드항원에 포함되는 T세포 인식 에피토프의 사이에, 2∼10개의 티로신, 2∼10개의 트레오닌, 2∼10개의 히스티딘, 2∼10개의 글루타민 및 2∼10개의 아스파라긴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 배열을 포함하는 1)∼5)의 어느 1항의 조성물.
7)상기 소수화 다당이 풀루란 및 콜레스테릴기를 포함하는 1)∼6)의 어느 1항의 조성물.
8)상기 면역증강제가, TLR(Toll 유사 수용체) 아고니스트(CpG 올리고 DNA 또는 Poly-IC RNA), STING 아고니스트 또는 RLR(RIG-I 유사 수용체) 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 3)∼7)의 어느 1항의 조성물.
이들 중에서, TLR 아고니스트(CpG 올리고 DNA 또는 Poly-IC RNA)를 사용하는 것이 바람직하다.
9)상기 항원이 종양특이적 항원단백질 또는 종양간 질특이적 항원단백질인 1)∼8)의 어느 1항의 조성물.
10)상기 항원 탑재 나노겔 및 면역증강제의 투여경로가, 피하, 피내, 근육내, 종양내 및 정맥내로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경로에 의해 투여되는 1)∼9)의 어느 1항의 조성물.
이들 중에서, 피하투여 또는 정맥내 투여를 사용하는 것이 바람직하다.
11)상기 항원 탑재 나노겔 및 면역증강제가, 상기 항원에 특이적인 T세포를 포함하는 의약조성물의 투여의 적어도 1일전에 투여되는 1)∼10)의 어느 1항의 조성물.
12)정맥내 투여되었을 때에 종양 국소의 대식세포(macrophage)에 선택적으로 물질을 송달하는 딜리버리 시스템이며, 풀루란 및 콜레스테릴기를 포함하는 소수화 다당으로 이루어지는 입자지름 80nm 이하의 나노겔.
13)면역체크포인트 저해제에 저항성을 가지는 종양에 유효한 치료약을 특정하기 위한 비인간 포유류 종양 모델로서, 상기 종양이 마우스 섬유육종 CMS5a이며, 비인간 포유류가 마우스인 비인간 포유류 종양모델.
본 발명에 의하면, 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하고 있지 않고 동(同)저해제에 저항성을 나타내는 종양의 치료에 유용한 의약품을 제공할 수 있다. 본 발명에 관한 딜리버리 시스템(delivery system)인, 소수화 다당나노겔과 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원을 포함하는 항원 탑재 나노겔 및 면역증강제를 전처치약으로서 사용함으로써, 항원특이적 T세포 수주의 항암작용을 증강시키는 효과를 얻을 수 있다.
[도1]BALB/c 마우스에 피하이식되어서 생착(生着)한 다양한 마우스 종양에 대해서, PD-L1 및 PD-1의 발현과, 종양 침윤 CD8 양성 T세포수를 나타내는 데이터이다. (A)이식 7일후에 종양 국소의 PD-L1분자의 발현을 해석한 결과를 나타내는 현미경 사진도, (B)각 종양의 종양 국소에 있어서의 CD3 양성 T세포의 PD-1 발현을 플로우사이토메트리법(flow cytometry)으로 해석한 결과를 나타내는 그래프, (C)각 종양의 종양 국소에 침윤(浸潤)한 CD8 양성 T세포의 수를 나타내는 그래프이다.
[도2]BALB/c 마우스에 피하이식되어서 생착한 다양한 마우스 종양에 대해서, 면역체크포인트 저해제에 대한 감수성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도3]BALB/c 마우스에 피하이식된 섬유육종 CMS5a종양에 대하여, 전처치약으로서 장쇄 펩티드항원을 탑재한 콜레스테릴풀루란(CHP) 나노겔 및 면역증강제를 사용한 항원특이적 T세포 수주의 치료효과를 나타내는 그래프이다. (A)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 피하투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있는 것, 및 딜리버리 시스템으로서 나노겔이 아니라 불완전 프로이드어주번트(Freund’s adjuvant)(IFA)를 사용하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (B)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 정맥내 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유가 확인되어, 본 발명의 항원 탑재 나노겔은 정맥내 투여로도 동등한 효과가 있는 것을 나타내는 그래프, (C)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 Poly-IC RNA를 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있기 때문에, 면역증강제는 Poly-IC RNA여도 동등한 효과가 있는 것을 나타내는 그래프이다.
[도4]BALB/c 마우스에 피하이식된 CMS5a종양에 대하여, 전처치약으로서 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 면역증강제를 사용한 항원특이적 T세포 수주의 치료효과를 나타내는 그래프이다. (A)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔을 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (B)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, CpG 올리고 DNA를 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (C)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, 항원특이적 T세포 수주를 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프이다.
[도5]CMS5a종양을 피하이식한 BALB/c 마우스에 대하여, CHP 나노겔을 정맥내 투여했을 때에, 종양 국소에 있어서 면역세포에 대한 CHP 나노겔의 혼입시험의 결과를 나타내는 데이터이다.
[도6]CMS5a종양을 피하이식한 BALB/c 마우스에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여했을 때에, 종양 국소 유래 대식세포에 의한 항원제시반응시험의 결과를 나타내는 데이터이다.
[도2]BALB/c 마우스에 피하이식되어서 생착한 다양한 마우스 종양에 대해서, 면역체크포인트 저해제에 대한 감수성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
[도3]BALB/c 마우스에 피하이식된 섬유육종 CMS5a종양에 대하여, 전처치약으로서 장쇄 펩티드항원을 탑재한 콜레스테릴풀루란(CHP) 나노겔 및 면역증강제를 사용한 항원특이적 T세포 수주의 치료효과를 나타내는 그래프이다. (A)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 피하투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있는 것, 및 딜리버리 시스템으로서 나노겔이 아니라 불완전 프로이드어주번트(Freund’s adjuvant)(IFA)를 사용하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (B)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 정맥내 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유가 확인되어, 본 발명의 항원 탑재 나노겔은 정맥내 투여로도 동등한 효과가 있는 것을 나타내는 그래프, (C)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 Poly-IC RNA를 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있기 때문에, 면역증강제는 Poly-IC RNA여도 동등한 효과가 있는 것을 나타내는 그래프이다.
[도4]BALB/c 마우스에 피하이식된 CMS5a종양에 대하여, 전처치약으로서 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 면역증강제를 사용한 항원특이적 T세포 수주의 치료효과를 나타내는 그래프이다. (A)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔을 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (B)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, CpG 올리고 DNA를 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프, (C)CMS5a종양에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여하고나서 항원특이적 T세포 수주를 하면 치유할 수 있지만, 항원특이적 T세포 수주를 생략하면 효과가 없는 것을 나타내는 그래프이다.
[도5]CMS5a종양을 피하이식한 BALB/c 마우스에 대하여, CHP 나노겔을 정맥내 투여했을 때에, 종양 국소에 있어서 면역세포에 대한 CHP 나노겔의 혼입시험의 결과를 나타내는 데이터이다.
[도6]CMS5a종양을 피하이식한 BALB/c 마우스에 대하여, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 투여했을 때에, 종양 국소 유래 대식세포에 의한 항원제시반응시험의 결과를 나타내는 데이터이다.
전처치약의 형태
본 발명의 전처치약은, 종양특이적 항원단백질 또는 종양간(腫瘍間) 질특이적(質特異的) 항원단백질에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 동시에 포함하는 1종류 이상의 합성 장쇄 펩티드항원(合成 長鎖 peptide抗原) 또는 재조합 단백질항원을 딜리버리 시스템인 소수화 다당나노겔(疏水化 多糖 nanogel)에 탑재한 약제(藥劑)와, 1종류 이상의 면역증강제(免疫增强劑)로 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 합성 장쇄 펩티드항원은, T세포 인식 에피토프를 적어도 2개 이상 포함하는 23∼120개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 상기 합성 장쇄 펩티드항원은, T세포 인식 에피토프를 적어도 2개 이상 포함하는 23∼80개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 상기 합성 장쇄 펩티드항원이, T세포 인식 에피토프를 적어도 2개 이상 포함하는 23∼60개의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 것이 바람직하다.
상기 재조합 단백질항원은, T세포 인식 에피토프를 2개 이상 포함하고, 필요에 따라 정제(精製)를 위한 태그 배열(tag sequence)을 포함하고, 대장균 또는 곤충세포 또는 포유류세포에서 생산되는 전장(全長) 또는 부분장(部分長)의 항원단백질인 것이 바람직하다.
상기 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프가, 종양특이적 항원단백질 또는 종양간 질특이적 항원단백질의 아미노산 배열의 일부인 것이 바람직하다. 상기 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프가, 종양특이적 항원단백질 또는 종양간 질특이적 항원단백질의 아미노산 배열의 일부인 것이 바람직하다.
상기 종양특이적 항원단백질이, MAGE 패밀리, NY-ESO-1/LAGE, SAGE, XAGE, HER2, PRAME, Ras, 5T4, WT1, p53, MUC-1, hTERT, RHAMM, Survivin, EGFRvIII, HPV E6, MART-1, gp100, CEA, IDO, Brachyury, Mesothelin, PSA 및 PSMA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 종양간 질특이적 항원단백질이, FAP, VEGFR 패밀리 및 TEM1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 소수화 다당나노겔의 구성 다당류가 풀루란(pullulan) 또는 만난(mannan)인 것이 바람직하다. 상기 소수화 다당나노겔의 소수기(疏水基)가 콜레스테롤인 것이 바람직하다. 상기 소수화 다당나노겔이 비이온성인 것이 바람직하다. 상기 소수화 다당나노겔의 입자지름이 80nm 이하인 것이 바람직하다.
상기 면역증강제가, 가용성 TLR 아고니스트 또는 가용성 STING 아고니스트 또는 가용성 RLR 아고니스트를 포함하는 것이 바람직하다. 가용성 TLR 아고니스트로서, CpG 올리고 DNA 또는 Poly-IC RNA가 예시된다. 가용성 STING 아고니스트로서, cdGMP 등의 환상 디뉴틀레오티드(環狀 dinucleotide), DMXAA 등의 xanthenone 유도체가 예시된다. 가용성 RLR 아고니스트로서, 5'- 3인산화 2개 사슬 RNA가 예시된다.
본 발명에 있어서 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원은, 종양특이적 항원단백질 및/또는 종양간 질특이적 항원단백질에 포함되는 T세포 인식 에피토프를 적어도 2개 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. T세포 인식 에피토프는 종양특이적 항원단백질 또는 종양간 질특이적 항원단백질에 포함되는 것이 바람직하다. 그러한 것으로서, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2 등의 MAGE 패밀리 분자나, NY-ESO-1/LAGE 분자, SAGE, XAGE, HER2, PRAME, Ras, 5T4, WT1, p53, MUC-1, hTERT, RHAMM, Survivin, EGFRvIII, HPV E6, MART-1, gp100, CEA, IDO, Brachyury, Mesothelin, PSA, PSMA 등의 종양특이적 항원단백질에 포함되는 T세포 인식 에피토프 및 FAP, VEGFR 패밀리, TEM1 등의 종양간 질특이적 항원단백질에 포함되는 T세포 인식 에피토프로부터 선택할 수 있다. T세포 인식 에피토프에는, CD8 양성세포 상해성 T세포에 의해 인식되는 CTL 에피토프와, CD4 양성 헬퍼T세포에 의해 인식되는 Th 에피토프가 있다. 본 발명의 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원은, CTL 에피토프와 Th 에피토프를 각각 1개 이상 동시에 포함하는 것이 바람직하다. CTL 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원과, Th 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원은, 각각 단독으로 또는 조합시켜서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 소수화 다당은, 이미 알고 있는 방법으로 제조할 수 있다. 소수화 다당에 있어서의 다당, 당잔기(糖殘基)가 글리코시드 결합한 고분자이면 특별하게 한정되지 않고 사용할 수 있다. 다당류를 구성하는 당잔기로서는, 예를 들면 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 푸코오스 등의 단당(單糖) 또는 2당 또는 올리고당 등의 당류에서 유래하는 잔기를 사용할 수 있다. 당잔기는, 1,2-, 1,3-, 1,4- 또는 1,6-글리코시드 결합하고 있어도 좋고, 그 결합은 α형결합 또는 β형결합의 어느 것이더라도 좋다. 다당은 직쇄상(直鎖狀)이어도 좋고 분기쇄상(분지쇄상(分岐鎖狀))의 어느 것이라도 좋다. 당잔기로서는 글루코오스 잔기가 바람직하고, 다당으로서는 천연 또는 합성 유래의 풀루란, 덱스트란, 아밀로오스, 아밀로펙틴 또는 만난, 바람직하게는 만난 또는 풀루란 등이 사용된다. 다당의 평균분자량으로서 50,000∼150,000의 것을 사용할 수 있다.
소수기로서는, 예를 들면 1개 사슬(chain) 및 2개 사슬의 알킬기 또는 스테롤 잔기를, 100단당(單糖)당(當) 1∼5개(중량비로 5％ 이하)의 비율로 도입한 것이 바람직하고, 100단당당 1∼3개(중량비로 3％ 이하)의 비율로 도입한 것이 더 바람직하다. 소수기는, 알킬기 또는 스테롤 잔기에 한정되지 않고, 봉입(封入)되는 항원의 분자량이나 등전점(等電點)에 따라 봉입률이 좋은 것을 선택할 수 있다. 스테롤 잔기로서는, 예를 들면 콜레스테롤, 스티그마스테롤, β-시토스테롤, 라노스테롤, 에르고스테롤 잔기 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 콜레스테롤 잔기를 사용할 수 있다. 알킬기로서는, 탄소수가 20이하인 것이 바람직하고, 탄소수가 10∼18인 알킬기를 사용하는 것이 더 바람직하다. 알킬기는 직쇄(直鎖:normal chain) 또는 분기쇄의 어느 것이나 사용할 수 있다.
소수화 다당으로서는, 예를 들면 다당을 구성하는 당의 100개당 1∼5개의 1급 수산기가, 다음식(I) : -O-(CH2)mCONH(CH2)nNH-CO-O-R （Ｉ) (식중에서, R은 알킬기 또는 스테롤 잔기를 나타내고; m은 0 또는 1을 나타내고; n은 임의의 양의 정수를 나타낸다)로 나타내지는 것이, 결합하고 있는 것이 바람직하다. 알킬기 또는 스테롤 잔기로서, n은 1∼8이 바람직하다.
소수화 다당으로서는, 링커(linker)를 통하여 결합한 것을 사용할 수 있다.
소수화 다당으로서는, 비이온성인 것이 바람직하다. 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원을 탑재한 소수화 다당나노겔 입자가, 생리적 조건하에서 제타전위(zeta potential)가 -2.0mV ∼ +2.0mV인 것이 바람직하다. 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원을 탑재한 소수화 다당나노겔 입자의 입자지름이 80nm 이하인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 딜리버리 시스템인 소수화 다당나노겔에 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원을 탑재한 항원 탑재 나노겔과 면역증강제로 이루어지는 전처치약은, 여러가지 방법으로 투여할 수 있다. 적절한 비경구 경로, 예를 들면 정맥내, 복강내, 피하, 피내, 지방조직내, 유선조직내, 흡입 또는 근육내의 경로를 통하여, 주사 또는 점비약(點鼻藥) 등의 형태로 점막경로를 통하는 방법에 의해 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 전처치약은, 보통 항원 탑재 나노겔과 면역증강제를 혼합한 제제 또는 별개의 제제로 한 키트로서, 피하, 정맥내, 근육내로의 비경구투여에 적절한 제형의 제제로 할 수 있다. 원하는 면역을 유도하는데에 필요한 항원 탑재 나노겔의 투여량은 적절하게 결정할 수 있다. 예를 들면 통상의 투여량으로서는, 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원으로서 0.1mg/회 ∼ 10mg/회 정도의 양을 사용할 수 있다. 투여횟수는 2∼20회가 적당하다. 투여간격은, 전처치약과 항원특이적 T세포 수주의 간격으로서, 1일 ∼ 2주간의 사이에서 선택한다.
본 발명은, 항원특이적 T세포를 포함하는 세포집단을 유효성분으로서 함유하는 치료약의 전처치약을 제공한다. 환자의 치료에 적절한 상기 세포집단은, 예를 들면 주사 또는 점적(點滴)에 의한 정맥, 동맥, 피하 또는 복강내 등의 투여방법에 의해 투여된다. 상기 세포집단은, 제약분야에서 공지의 방법에 따라 공지의 비경구투여에 적절한 유기 또는 무기의 담체(擔體), 부형제(賦形劑) 또는 안정제 등과 혼합하여, 점적제(點滴劑) 또는 주사제로서 조제할 수 있다. 상기 세포집단의 함유량, 투여량, 그 이외의 여러가지 조건은 공지의 면역요법에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 의약에 있어서의 상기 세포집단의 함유량으로서는, 특별하게 한정은 없지만, 1×103∼1×1011개/ｍＬ가 바람직하고, 1×104∼1×1010개/ｍＬ가 더 바람직하고, 1×105∼2×109개/ｍＬ가 더 바람직하다. 상기 세포집단을 유효성분으로서 함유하는 치료약의 투여량으로서는, 특별하게 한정은 없지만, 성인당 1×106∼1×1012개/일이 바람직하고, 1×107∼5×1011개/일이 더 바람직하고, 1×108∼2×1011개/일이 더 바람직하다. 상기 세포집단의 제조방법에 있어서, 상기 세포집단에 외래유전자를 도입하는 공정을 포함할 수 있다. 「외래유전자」란, 유전자도입 대상의 T세포를 함유하는 세포집단에 인위적으로 도입되는 유전자를 의미하고, 유전자도입 대상의 세포와 동종(同種) 유래의 것도 포함된다. 외래유전자의 도입수단에는 특별하게 한정은 없고, 공지의 유전자도입방법에 의해 적절한 것을 선택해서 사용할 수 있다. 유전자도입은, 바이러스 벡터를 사용하거나 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 실시할 수 있다. 그 방법의 상세에 대해서는 많은 기보(旣報)가 있다.
상기 바이러스 벡터로서는, 특별하게 한정은 없고, 유전자도입에 사용되는 공지의 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 시미안바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터 등이 사용된다. 도입하는 세포의 염색체 ＤＮＡ내에 외래유전자를 안정하게 편입시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터가 특히 적합하다. 상기 바이러스 벡터로서는, 감염시킨 세포내에서 자기복제(自己複製)할 수 없도록 복제능(複製能)을 결손시킨 것이 적합하다. 유전자도입시에, 레토로넥틴(RetroNectin)(등록상표, 다카라바이오(Takara Bio Inc.) 제품) 등의, 유전자도입 효율을 향상시키는 물질을 사용할 수 있다. 바이러스 벡터를 사용하지 않는 유전자도입 방법으로서, 리포솜 또는 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용하는 방법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법(electroporation) 또는 파티클건법(particle gun method) 등을 사용할 수 있다. 이 경우에는, 플라스미드 DNA, 직쇄상 DNA 또는 RNA에 편입된 외래유전자가 도입된다.
도입되는 외래유전자로는 특별하게 한정은 없고, 임의의 유전자(예를 들면 효소, 사이토카인류, 케모카인류, 또는 T세포 수용체(TCR)나 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 항원 리셉터류, 공자극 분자의 수용체 또는 리간드 등의 단백질을 코드하는 것 외에, 안티센스 핵산, siRNA, miRNA, 리보자임, 압타머를 코드하는 것)를 사용할 수 있다. 외래유전자는, 예를 들면 적절한 프로모터의 제어하에 발현되어지도록 벡터 또는 플라스미드 등에 삽입해서 사용할 수 있다. 벡터내에는, 인헨서 배열 또는 터미네이터 배열과 같은 제어배열을 편입시킬 수 있다.
항원 탑재 나노겔, 면역증강제 및 항원특이적 T세포 수주를 사용하는 치료약의 적용의 대상은, 면역체크포인트 저해제에 저항성인 종양을 구비하는 인간을 들 수 있다. 종양의 종별(種別)은 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 전립선암, 대장암, 멜라노마, 두경부암, 식도암, 위암, 결장·직장암, 간장암, 담낭·담관암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 신장암, 고환암, 골·연부육종, 악성림프종, 백혈병, 자궁경암, 피부암, 뇌종양 등을 들 수 있다.
다음에 본 발명의 실시예에 대해서 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 제한되지 않고, 요지를 변경하지 않는 한 다양하게 변경해서 실시할 수 있다.
<실시예1>
1.재료와 방법
항마우스 CD16/CD32 항체(클론(clone)93), PE표지 항마우스 PD-L1 항체(클론9G2), APC-Cy7표지 항CD45 항체(클론30-F11) 및 PE-Cy7표지 항PD-1 항체(클론29F.1A12)는 바이오레전드(BioLegend)로부터 구입했다. V450표지 항CD8 항체(클론53-6.7)는 e바이오사이언스(eBioscience)로부터 구입했다. 소 태아 혈청(FBS)은 바이오웨스트(BioWest)로부터 구입했다. RPMI1640 배지(2-메르캅토에탄올 첨가)는 세포과학연구소(Cell Science & Technology Institute, Inc. (CSTI))로부터 구입했다. 적혈구용혈용액(0.15M NH4Cl/10mM KHCO3/0.1mM EDTA.Na2 pH7.2)은 미에대학(Mie University)에서 제작했다. 마우스 대장암 CT26세포주(CRL-2638)는 ATCC로부터 구입하고, 미에대학에서 계대(繼代)한 것을 사용했다. 마우스 섬유육종 CMS7세포주 및 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)로부터 입수하고, 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 인간NY-ESO-1 항원유전자는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 분양을 받았다. CMS5a세포주에 인간NY-ESO-1 항원유전자를 안정하게 도입한 CMS5a-NY세포주는, 미에대학에서 제작되어 계대된 것을 사용했다. 암컷(자성(雌性)) BALB/c 마우스는 6∼12주령(週齡)의 것을 일본SLC(Japan SLC,Inc.)로부터 구입하고, 미에대학 의학부 동물센터에서 사육했다. 동물실험의 프로토콜은 미에대학 의학부의 윤리위원회의 승인을 얻었다.
마우스 대장암 CT26세포주, BALB/c 마우스 섬유육종 CMS7세포주, 마우스 섬유육종 CMS5a세포주 및 CMS5a-NY세포주는, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 T75 배양플라스크(코닝(Corning Incorporated))를 사용해서 배양했다. 배양한 세포주는 0.5% 트립신 함유 인산 완충 생리식염수(PBS)를 사용해서 박리하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에 현탁했다. 세포를 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청(上淸)을 제거하고, RPMI1640 배지를 사용해서 2회 세정한 후, 1×106개/100μL의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁했다. 이 현탁액을 100μL/개체의 용량으로 BALB/c 마우스의 후배부(後背部)에 피하이식했다(１군당 3마리).
각 세포주를 피하이식하고, 1주후에 종양을 회수했다. 종양은 다음에 나타내는 방법으로 면역조직화학염색했다. O.C.T.콤파운드(사쿠라파인텍(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.))로 포매(包埋;embedding)하여 동결(凍結)한 종양을 3㎛ 두께로 얇게 자르고, 얻어진 종양절편에 대해서 풍건(風乾)을 2시간 하였다. 건조시킨 종양절편에 대하여 빙냉(氷冷)한 아세톤으로 15분간 고정을 하여, 면역염색에 사용했다. 종양절편을 PBS로 3회 세정한 후에, 4℃에서 블록킹액(1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 5% Blocking One Histo(나카라이테스크(Nacalai Tesque)) 함유 PBS)에 침지시켜서 블록킹을 하였다. 1㎍/mL의 농도로 항마우스 CD16/CD32 항체를 블록킹액으로 희석했다. 이 항체를 사용하여 습윤상자내에서 종양절편에 대하여 실온에서 30분간의 처리를 하여, Fcγ수용체를 블록킹했다. 다음에 블록킹액에 1㎍/mL의 농도로 희석한 PE표지 항마우스 PD-L1 항체를 사용하여, 습윤상자내에서 종양절편에 대하여 실온에서 1시간 염색을 하였다. 0.02％ Tween20 함유 PBS로 3회 세정을 한 후에, 종양절편을 Prolong Gold antifade reagent with DAPI(라이프테크놀로지즈)에 침지시키고, 형광현미경 BX53F(올림푸스(Olympus Corporation)) 또는 공초점 레이저 주사형 현미경 LSM780(칼짜이즈(Carl Zeiss))을 사용해서 관찰했다. 얻어진 현미경 관찰상에 대해서, Photoshop Element(아도비시스템즈(Adobe Systems Co., Ltd.))를 사용해서 화상처리를 했다.
각 세포주를 피하이식하고, 1주후에 종양 침윤 면역세포를 다음의 방법으로 분리했다. 마우스로부터 종양을 단리(單離)하고, Gentle MACS(밀테니(Miltenyi Biotec K.K.))를 사용해 파쇄한 후에, RPMI1640 배지에 현탁했다. 이때에 1군 3마리분(分)의 세포를 모았다(풀(pool)했다). 현탁한 세포에 콜라게나아제D(종농도 2mg/mL, 로슈(Roche))를 가하여 37℃로 30분간 반응시킨 후에, 다시 Gentle MACS를 사용해서 파쇄했다. 세포를 여과 필터(22㎛ 구멍지름, BD바이오사이언스(BD Biosciences))에 통과시킨 후에, 원심분리(400×g, 5분, 4℃)하고 상청을 제거한 후, 2mL의 적혈구용혈용액을 가하여 세포를 1분간 처리했다. 18mL의 RPMI1640 배지를 가하고, 원심분리(400×g, 5분, 4℃)했다. 상청을 제거하고, 세포를 RPMI1640 배지에 현탁했다. 세포수를 계수(計數)한 후에 3×107개/mL의 세포농도가 되도록 염색용 버퍼(0.5% BSA 함유 PBS)에 현탁했다. 1웰당 50μL의 세포현탁액을 96홀(hole) V바닥 마이크로 플레이트(눈크(Nunc))에 옮겼다. 원심분리(2000rpm, 1분, 4℃)해서 상청을 제거한 후, 1웰당 50μL의 염색용 버퍼에 현탁했다. 각 항체의 메이커(maker)의 권장사용농도에 따라, APC-Cy7표지 항마우스 CD45 항체, V450표지 항마우스 CD8 항체, PE-Cy7표지 항마우스 PD-1 항체를 세포에 첨가하고 부드럽게 혼합한 후, 4℃의 어두운 곳(暗所)에서 15분간 정치(靜置)했다. 200μL의 염색용 버퍼로 세포를 2회 세정한 후, 200μL의 염색용 버퍼에 현탁하여 둥근바닥 폴리스티렌 튜브(BD바이오사이언스)로 옮겼다. 세포는 플로우사이토미터(Flow Cytometer) FACS Canto II(BD바이오사이언스) 및 데이터해석 소프트웨어 FlowJo(트리스타(Tree Star, Inc.))를 사용해서 해석했다. PD-1 발현의 빈도로서, CD45 양성 그리고 CD8 양성의 세포집단에 있어서의 발현빈도(％)를 구했다. CD8 양성 T세포의 빈도로서, CD45 양성세포집단에 있어서의 CD8 양성세포의 빈도(％)를 구했다.
2.결과
인간의 면역체크포인트 저해제 저항성 종양은, 면역체크포인트 분자의 발현결여나 CD8 양성 T세포의 종양 침윤이 보이지 않는다고 하는 특징을 나타낸다(비특허문헌5). 이것과 같은 특징을 나타내는 마우스 종양을 검색하기 위해서, 다양한 마우스 암세포주가 BALB/c 마우스에 피하이식된 후에 형성하는 종양을 회수하고, 면역체크포인트 분자 PD-L1 및 PD-1의 발현, 및 CD양성 T세포의 침윤수(浸潤數)를 측정했다. 도1(A)에는, CT26종양, CMS7종양, CMS5a-NY종양 및 CMS5a종양의 종양 국소에 있어서의 PD-L1분자의 발현을 면역염색법으로 해석한 결과를 나타냈다. CT26종양, CMS7종양 및 CMS5a-NY종양에서는 PD-L1을 발현하는 다수의 세포가 관찰되는 것에 대해, CMS5a종양에서는 PD-L1 발현세포의 수가 극히 적었다. 도1(B)에는, 각 종양의 종양 국소에 있어서 CD3 양성 T세포에 있어서의 PD-1의 발현빈도를 플로우사이토메트리법(flow cytometry)으로 해석한 결과를 나타냈다. CMS5a종양은 다른 종양과 비교하여 PD-1 발현 CD3 양성 T세포의 비율이 가장 낮았다. 도1(C)에는, 각 종양의 종양 국소에 침윤한 CD8 양성 T세포의 빈도를 나타냈다. CMS5a종양은 다른 종양과 비교하여 종양 국소침윤CD8 양성 T세포의 빈도가 현저하게 낮았다. 이상의 결과로부터, 마우스 섬유육종 CMS5a세포주가 마우스에 피하이식되어서 형성하는 종양은 인간의 면역체크포인트 저해제 저항성 종양과 같은 특징을 나타내는 것을 찾아냈다.
<실시예2>
1.재료와 방법
항마우스 CTLA-4 항체(클론9D9)는, MD앤더슨 암센터(MD Anderson Cancer Center)의 James P.Allison 박사로부터 분양된 하이브리도마를 사용해서 미에대학에서 제작했다. 항마우스 GITR 항체(클론DTA-1)는, 오사카대학의 사카구치 시몬(SAKAGUCHI Shimon) 박사로부터 분양된 하이브리도마를 사용해서 미에대학에서 제작했다. 항마우스 PD-1 항체(클론RMP1-14)는, 순천당대학의 야기타 히데오(YAGITA Hideo) 박사로부터 분양된 것을 사용했다. 소 태아 혈청(FBS)은 바이오웨스트로부터 구입했다. RPMI1640 배지(2-메르캅토에탄올 첨가)는 세포과학연구소로부터 구입했다. 마우스 대장암 CT26세포주(CRL-2638)는 ATCC로부터 구입하여 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 마우스 섬유육종 CMS7세포주 및 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는, 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 입수하고 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 인간NY-ESO-1 항원유전자는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 분양받았다. CMS5a세포주에 인간NY-ESO-1 항원유전자를 안정하게 도입한 CMS5a-NY세포주는, 미에대학에서 제작되어 계대된 것을 사용했다. 암컷 BALB/c 마우스는 6주령∼12주령의 것을 일본SLC로부터 구입하고, 미에대학 의학부 동물센터에서 사육했다. 동물실험의 프로토콜은 미에대학 의학부의 윤리위원회의 승인을 얻었다.
CT26세포주, CMS7세포주, CMS5a세포주 및 CMS5a-NY세포주를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 T75 배양플라스크(코닝)를 사용해서 배양했다. 각 세포주를 0.5% 트립신 함유 인산 완충 생리식염수(PBS)를 사용해서 박리하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 현탁했다. 현탁액을 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거했다. RPMI1640 배지를 사용해서 2회 세정한 후, 1×106개/100μL의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁했다. 이 현탁액을 100μL/개체의 용량으로 BALB/c 마우스의 후배부에 피하이식했다(1군당 4마리). 종양이식후 7, 9 및 11일째에, PBS로 희석한 항마우스 PD-1 항체(150㎍), 항마우스 CTLA-4 항체(100㎍) 및 항마우스 GITR 항체(100㎍)를 면역체크포인트 저해제로서, 동시에 복강내 투여했다. 종양이식후에는 경시적(經時的)으로 종양의 장경(長徑(긴 지름))과 단경(短徑)을 측정하고, 계산식(장경×단경×단경×0.5)에 따라 종양부피를 산출했다. 통계해석은 마이크로소프트 엑셀(마이크로소프트(Microsoft Corporation))을 사용한 논파라메트릭(non-parametric) 검정에 의하여 이루어졌다.
2.결과
실시예1의 결과로부터, 마우스 섬유육종 CMS5a세포주가 BALB/c 마우스에 피하이식되어서 형성하는 종양은 면역체크포인트 저해제에 대하여 저항성을 나타내는 것이 예상되었다. 그래서 각 마우스 암세포주를 피하이식해서 종양을 형성시킨 BALB/c 마우스에 대하여, 면역체크포인트 저해제인 항PD-1 항체, 항CTLA-4 항체 및 항GITR 항체의 병용요법에 의한 치료실험을 시도했다. 결과를 도2에 나타냈다. CT26종양, CMS7종양 및 CMS5a-NY종양에서는, 면역체크포인트 저해제 병용요법에 의한 종양증식 억제가 명확하게 확인되었다. 이에 대하여 CMS5a종양은, 면역체크포인트 저해제 병용요법에 전혀 반응하지 않고, 미치료군(未治療群)과 동일한 증식을 나타냈다. 이것으로부터, CMS5a종양은 면역체크포인트 저해제에 강한 저항성을 나타내는 것이 분명해졌다. 실시예1의 결과와 더불어, CMS5a종양은 인간의 면역체크포인트 저해제 저항성 종양의 좋은 모델이라고 생각되었다. CMS5a종양을 평가계(評價系)로서 사용함으로써 인간의 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대하여 유효한 치료법을 탐색할 수 있는 것을 알았다.
<실시예3>
1.재료와 방법
콜레스테릴풀루란(약칭 CHP, 상품명 CHP-80T)은 (주)닛치유(日油)로부터 입수했다. 불완전 프로이드어주번트(약칭 IFA, 형번(型番;형식번호) F5506)는 시그마알드리치(Sigma-Aldrich Co. LLC)로부터 구입했다. 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔은 이하와 같이 조제했다. Bio-Synthesis로 화학합성된 장쇄 펩티드항원(MEN 펩티드 : SNPARYEFLYYYYYYQYIHSANVLYYYYYYRGPESRLL(배열번호1) 또는 p121 펩티드 : NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(배열번호2))을 10mg/mL의 농도로 디메틸술폭시드(약칭 DMSO, 나카라이테스크)에 용해했다. CHP는 10mg/mL의 농도로 6M 요소(나카라이테스크) 함유 인산 완충 생리식염수(PBS)에 용해했다. 1mL(10mg)의 장쇄 펩티드항원 용액과 20mL(200mg)의 CHP용액을 혼합하고, 어두운 곳, 4℃에서 부드럽게 교반하면서 하룻밤 방치했다. 혼합액을 투석막(컷 분자량 : 3,500, 써모사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))으로 옮기고, 투석외액으로서 용적비 100배 이상의 0.6M 요소 함유 PBS에 대하여 4℃에서 2시간에서 하룻밤 투석했다. 또한 투석외액으로서 용적비 100배 이상의 0.06M 요소 함유 PBS를 사용하여, 4℃에서 2시간에서 하룻밤 투석했다. 다시, 투석외액으로서 용적비 100배 이상의 PBS를 사용하여, 4℃에서 2시간에서 하룻밤 투석했다. 투석내액을 회수하여, 구멍지름 0.22㎛의 여과멸균필터(PVDF막(膜)제(製), 밀리포어(Millipore))로 여과한 후에, Nanodrop 2000(써모사이언티픽)을 사용해서 280nm에 있어서의 UV흡수를 측정했다. 장쇄 펩티드항원의 분자흡광계수(1mg/mL=4.181)로부터 그 최종농도를 구했다.
장쇄 펩티드항원 : IFA혼합물은, 다음과 같이 조제했다. 장쇄 펩티드항원을 60㎍/125μL의 농도로 25% DMSO 함유 PBS에 용해하여 시린지로 채취했다. 별도로, 125μL의 IFA를 시린지로 채취했다. 양방의 시린지를 삼방활전(三方活栓)으로 연결한 후, 흡배(吸排)를 반복하여 잘 혼합한 후에 투여에 사용했다. 소 태아 혈청(FBS)은 바이오웨스트로부터 구입했다. RPMI1640 배지(2-메르캅토에탄올 첨가)는 세포과학연구소로부터 구입했다. 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 분양받아 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는, 변이(mutation)형 ERK2단백질을 발현하고 있다. 변이형 ERK2단백질의 변이부분을 포함하는 펩티드(QYIHSANVL : 배열번호3, 밑줄부는 변이를 나타낸다)는, BALB/c 마우스의 CD8 양성세포 상해성 T세포로 인식된다. 이 펩티드를 인식하는 T세포 수용체(TCR)가 단리(單離)되어, TCR을 유전자도입한 마우스(DUC18 마우스)가 새롭게 만들어지고 있다. 본 실시예에서 사용한 장쇄 펩티드항원(MEN 펩티드 및 p121 펩티드)은, 상기 변이형 ERK2의 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 배열(QYIHSANVL : 배열번호3)이 포함되어 있다.
암컷 BALB/c 마우스는 6주령∼12주령의 것을 일본SLC로부터 구입했다. DUC18 마우스는 워싱턴대학(University of Washington)으로부터 분양받아 미에대학에서 번식시킨 것을 사용했다. 마우스는 미에대학 의학부 동물센터에서 사육했다. 동물실험의 프로토콜은 미에대학 의학부의 윤리위원회의 승인을 얻었다.
T75 배양플라스크(코닝)를 사용하여, 마우스 섬유육종 CMS5a세포주를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 배양했다. 배양후의 세포주를 0.5% 트립신 함유 PBS를 사용해서 박리하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 현탁했다. 현탁액을 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거했다. 그 후에 RPMI1640 배지를 사용해서 2회 세정하고, 1×106개/100μL의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁했다. 100μL/개체의 용량으로 BALB/c 마우스의 양측 후배부에 피하이식했다(1군당 4마리). 항원 탑재 나노겔 및 면역증강제를 전처치약으로서 투여하는 경우에는, 종양이식 7일후 및 11일후에, 면역증강제로서 PBS에 용해한 50㎍의 CpG 올리고 DNA1668(진디자인(GeneDesign, Inc.)) 또는 50㎍의 Poly-ICLC RNA(Oncovir)와 함께, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 또는 장쇄 펩티드항원 : IFA혼합물을, 마우스의 후배부 피하 또는 미정맥(尾靜脈)내에 투여했다. 도4(A)에 나타내는 실험에서는, 장쇄 펩티드항원으로서 p121 펩티드를 사용했다. 그 밖의 실험에서는 모두 MEN 펩티드를 사용했다. 변이형 ERK2 특이적 TCR 유전자도입 마우스(DUC18 마우스)의 비장(脾臟)으로부터, CD8 양성 T세포를 CD8a+ T Cell 아이솔레이션 키트(밀테니)를 사용해서 단리했다. 단리한 CD8 양성 T세포를 RPMI1640 배지에 2×106개/200μL의 농도로 현탁했다. 종양이식 8일후 및 12일후에, 단리한 CD8 양성 T세포를 치료용의 항원특이적 T세포로서 미정맥내에서부터 수주하였다. 통계해석은, 마이크로소프트 엑셀(마이크로소프트)을 사용한 논파라메트릭 검정에 의하여 이루어졌다.
2.결과
BALB/c 마우스에 피하이식해서 형성한 CMS5a종양을 평가계로서 사용하여, 인간의 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대하여 유효한 치료법을 탐색했다. 그 결과, 도3(A)에 나타나 있는 바와 같이, 전처치약으로서 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔과 면역증강제(CpG 올리고 DNA)를 피하투여한 후에 항원특이적 T세포 수주를 하면, CMS5a종양의 증식이 현저하게 억제되는 것을 찾아냈다. 이 치료효과는, 딜리버리 시스템으로서 IFA를 사용한 경우에는 없었다. 도3(B)에 나타나 있는 바와 같이, 전처치약의 투여경로는, 피하투여를 대신하여 정맥내 투여하여도 효과적인 것을 알았다. 도3(C)에 나타나 있는 바와 같이, 전처치약에 포함되는 면역증강제는 CpG 올리고 DNA에 한하지 않고 Poly-IC RNA이어도 좋은 것을 알았다.
도4(A)에 나타나 있는 바와 같이, 전처치약으로부터 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔을 제거하면, 치료효과는 확인할 수 없었다. 도4(B)에 나타나 있는 바와 같이, 전처치약으로부터 면역증강제(CpG 올리고 DNA)를 제거하면, 치료효과는 확인할 수 없었다. 이상의 결과로부터, 항원특이적 T세포 수주의 전처치약에는 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔과 면역증강제가 필수적인 것을 알았다. 도4(C)에 나타나 있는 바와 같이, 항원특이적 T세포 수주를 생략하고 전처치약만으로 하여도 치료효과는 확인할 수 없었다.
이와 같이 본 발명의 전처치약을 항원특이적 T세포 수주와 병용함으로써 면역체크포인트 저해제 저항성 종양을 치료할 수 있는 것이 분명해졌다.
<실시예4>
1.재료와 방법
Rhodamine표지 CHP 나노겔은, 교토대학·아키요시 카즈나리(Akiyoshi Kazunari) 박사로부터 분양받은 것을 사용했다. APC-Cy7표지 항마우스 CD45 항체(클론30-F11), FITC표지 항마우스 CD8 항체(클론53-6.7), PE표지 항마우스 CD11b 항체(클론M1/70), Pacific blue표지 항마우스 F4/80 항체(클론BM8) 및 PE-Cy7표지 항마우스 CD11c 항체(클론N418)는, 바이오레전드로부터 구입했다. PerCP-Cy5.5표지 항마우스 CD4 항체(클론RM4-5)는 BD바이오사이언스로부터 구입했다. APC표지 항마우스 B220 항체(클론RA3-6B2)는 e바이오사이언스로부터 구입했다. 소 태아 혈청(FBS)은 바이오웨스트로부터 구입했다. RPMI1640 배지(2-메르캅토에탄올 첨가)는 세포과학연구소로부터 구입했다. 적혈구용혈용액(0.15M NH4Cl/10mM KHCO3/0.1mM EDTA.Na2 pH7.2)은 미에대학에서 제작했다. 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 분양받아 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 암컷 BALB/c 마우스는 6주령∼12주령의 것을 일본SLC로부터 구입하여, 미에대학 의학부 동물센터에서 사육했다. 동물실험의 프로토콜은 미에대학 의학부의 윤리위원회의 승인을 얻었다.
T75 배양플라스크(코닝)를 사용하여 마우스 섬유육종 CMS5a세포주를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 배양했다. 이 세포주를 0.5% 트립신 함유 인산 완충 생리식염수(PBS)를 사용해서 박리하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 현탁했다. 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, RPMI1640 배지를 사용해서 2회 세정했다. 세포주를 1×106개/100μL의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁하고, 100μL/개체의 용량으로 BALB/c 마우스의 후배부에 피하이식했다(1군당 4마리). 종양이식 7일째에 1mg의 Rhodamine표지 CHP 나노겔(10mg/mL PBS)을 후배부 피하 혹은 미정맥내에 투여했다. Rhodamine표지 CHP 나노겔 투여의 다음날에 종양 침윤 면역세포를 다음에 나타내는 방법으로 분리했다. 마우스로부터 종양을 단리하고, Gentle MACS(밀테니)를 사용해 파쇄한 후, RPMI1640 배지에 현탁했다. 1군 4마리분의 세포를 모았다. 콜라게나아제D(종농도2mg/ml, 로슈)를 가하고 37℃로 30분간 반응시킨 후에, 다시 Gentle MACS를 사용해서 파쇄했다. 여과필터(22㎛ 구멍지름, BD바이오사이언스)에 통과시킨 후, 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, 2mL의 적혈구용혈용액을 가하여 세포를 1분간 처리했다. 18mL의 RPMI1640 배지를 가하고 원심분리(400×g, 5분, 4℃)했다. 상청을 제거하고 세포를 RPMI1640 배지에 현탁했다. 세포수를 계수한 후에 3×107개/mL의 세포농도가 되도록 염색용 버퍼(0.5% 소 혈청 알부민 함유 PBS)에 현탁했다. 1웰당 50μL의 세포현탁액을 96홀 V바닥 마이크로 플레이트(눈크)로 옮겼다. 원심분리(2000rpm, 1분, 4℃)해서 상청을 제거한 후, 1웰당 50μL의 염색용 버퍼에 현탁했다. Rhodamine표지 CHP 나노겔을 투여하고 18시간 후에 소속 림프절을 회수했다. 피하투여의 경우에는 투여부위의 소속 림프절(서경림프절(鼠徑 lymph node))을, 정맥내 투여의 경우에는 종양의 소속 림프절(서경림프절)을 회수했다.
슬라이드 글라스를 사용해서 림프절을 마쇄(磨碎)한 후에, 유리(遊離)된 세포를 RPMI1640 배지중에 현탁했다. 이때에 1군 4마리분의 세포를 모았다. 원심분리(400×g, 5분, 4℃)후에 상청을 제거하고, 2mL의 적혈구용혈용액을 가하여 세포를 1분간 처리했다. 18mL의 RPMI1640 배지를 가하고 원심분리(400×g, 5분, 4℃)했다. 상청을 제거하고 세포를 RPMI1640 배지에 현탁했다. 세포현탁액을 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, 2% FBS 함유 PBS를 사용해서 2회 세정한 후에 현탁했다. 종양 또는 림프절로부터 조제한 세포현탁액에 대하여, 각 항체의 메이커가 권장하는 사용농도에 따라, APC-Cy7표지 항마우스 CD45 항체, FITC표지 항마우스 CD8 항체, PerCP-Cy5.5표지 항마우스 CD4 항체, APC표지 항마우스 B220 항체, PE표지 항마우스 CD11b 항체, Pacific blue표지 항마우스 F4/80 항체, PE-Cy7표지 항마우스 CD11c 항체를 첨가하고, 혼합한 후에, 4℃의 어두운 곳에서 15분간 정치했다. 200μL의 염색용 버퍼로 세포를 2회 세정한 후에, 200μL의 염색용 버퍼에 재현탁을 하고, 둥근바닥 폴리스티렌 튜브(BD바이오사이언스)로 옮겼다. 세포는 플로우사이토미터 FACS Canto II(BD바이오사이언스) 및 데이터해석 소프트웨어 FlowJo(트리스타)를 사용해서 해석했다.
T세포는 CD45 양성 그리고 CD4 양성 혹은 CD45 양성 그리고 CD8 양성, B세포는 CD45 양성 그리고 B220 양성, 대식세포는 CD45 양성 그리고 CD11b 양성 그리고 CD11c 양성 그리고 F4/80 양성의 집단으로서 검출했다. 각 면역세포에 있어서의 Rhodamine 양성세포를 CHP 나노겔 혼입세포로서 검출했다.
2.결과
도3(B)에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 전처치약은, 피하투여 또는 정맥내 투여의 어느 것에 있어서도 면역체크포인트 저해제 저항성의 CMS5a종양에 대하여 동일한 치료효과를 나타냈다. 전처치약의 작용기서를 해명하기 위해서, CMS5a종양을 피하이식한 BALB/c 마우스에 피하투여 또는 정맥내 투여된 Rhodamine표지 CHP 나노겔에 있어서 림프절 및 종양 국소에 존재하는 면역세포에 대한 혼입을 측정했다. 도5에 나타나 있는 바와 같이 피하투여된 CHP 나노겔은, 투여부위 소속 림프절의 대식세포에 잘 혼입되었다. 한편, 정맥내 투여된 CHP 나노겔은 종양 국소의 대식세포에 잘 혼입되었다. 그 밖의 면역세포에 대한 혼입은 확인되지 않았다. 림프절 또는 종양 국소의 대식세포가, CHP 나노겔에 의해 송달된 장쇄 펩티드항원을 받아 들여, 수주된 항원특이적 T세포에 제시함으로써, 항원특이적 T세포의 활성이 증강되고 있다고 생각되었다. CHP 나노겔이 정맥내 투여된 경우에는, 종양 국소의 대식세포에 선택적으로 물질수송하는 능력이 있는 것이 분명해졌다.
<실시예5>
1.재료와 방법
소 태아 혈청(FBS)은 바이오웨스트로부터 구입했다. RPMI1640 배지(2-메르캅토에탄올 첨가)는 세포과학연구소로부터 구입했다. 적혈구용혈용액(0.15M NH4Cl/10mM KHCO3/0.1mM EDTA.Na2 pH7.2)은 미에대학에서 제작했다. 마우스 섬유육종 CMS5a세포주는 메모리얼 슬로언 케터링 암연구소로부터 분양받아 미에대학에서 계대한 것을 사용했다. 암컷 BALB/c 마우스는 6주령∼12주령의 것을 일본SLC로부터 구입했다. 변이형 ERK2 특이적 TCR유전자도입 마우스(DUC18 마우스)는 워싱턴대학으로부터 분양받아 미에대학에서 번식시킨 것을 사용했다. 각 마우스는 미에대학 의학부 동물센터에서 사육했다. 동물실험의 프로토콜은 미에대학 의학부의 윤리위원회의 승인을 얻었다.
T75 배양플라스크(코닝)를 사용하고, 마우스 섬유육종 CMS5a세포주를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 배양했다. 배양한 세포를 0.5% 트립신 함유 인산 완충 생리식염수(PBS)를 사용해서 박리하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 현탁했다. 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, RPMI1640 배지를 사용해서 2회 세정했다. 세포를 1×106개/100μL의 농도로 RPMI1640 배지에 현탁하고, 100μL/개체의 용량으로 BALB/c 마우스의 후배부에 피하이식했다(1군당 5마리). 종양이식 7일후에, 실시예3과 마찬가지로 하여 조제한 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔(MEN 펩티드로서 60㎍, PBS로 용해)과 CpG 올리고 DNA1668(50㎍, PBS에 용해, 진디자인)을 혼합해서 미정맥내에 투여했다. 18 시간후에 투여 마우스의 종양, 폐, 간장, 비장 및 림프절로부터 항원제시세포를 다음에 나타내는 방법으로 분리했다.
종양은 밀테니 제품의 분리 키트(Tumor Dissociation Kit(형번130-096-730))를, 폐는 밀테니 제품의 분리 키트(Lung Dissociation Kit(형번130-095-927))를, 간장은 밀테니 제품의 분리 키트(Liver Dissociation Kit(형번130-105-807)))를 각각 사용하여, 메이커 권장 프로토콜에 따라 처리한 후에, 유리된 세포를 RPMI1640 배지중에 현탁했다.
이때에 1군 5마리분의 세포를 모았다. 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, 2mL의 적혈구용혈용액을 가하여 세포를 1분간 처리했다. 18mL의 RPMI1640 배지를 가하고 원심분리(400×g, 5분, 4℃)했다. 상청을 제거하고 세포를 RPMI1640 배지에 현탁했다. 비장 및 서경림프절은 슬라이드 글라스를 사용해서 마쇄한 후, 유리된 세포를 RPMI1640 배지중으로 회수했다. 이때에 1군 5마리분의 세포를 모았다. 원심분리(400×g, 5분, 4℃)후에 상청을 제거하고, 2mL의 적혈구용혈용액을 가하여 세포를 1분간 처리했다. 18mL의 RPMI1640 배지를 가하고 원심분리(400×g, 5분, 4℃)했다. 상청을 제거하고 세포를 RPMI1640 배지에 현탁했다(1차 세포현탁액). 각 조직으로부터 조제한 1차 세포현탁액을 원심분리(400×g, 5분, 4℃)한 후에 상청을 제거하고, 2% FBS 함유 PBS를 사용해서 2회 세정하고, 2% FBS 함유 PBS에 현탁해서 2차 세포현탁액이라고 했다. 2차 세포현탁액으로부터 CD11b 마이크로비즈(microbeads)(밀테니)를 사용해서 CD11b 양성세포를 단리하여, 각 조직 유래의 항원제시세포로 했다. 한편, DUC18 마우스의 비장으로부터, 실시예3과 마찬가지로 하여 CD8 양성 T세포를 단리했다. 그 후에 형광색소의 CFSE(써모핏셔사이언스)를 사용해서 표지하여 레스폰더 T세포라고 했다. 항원제시세포 및 레스폰더 T세포를 96홀 V바닥 마이크로 플레이트(눈크)에, 1웰당 각각 2.5×105개 및 2×105개의 세포수로 첨가하고, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지중에서 72시간에 걸쳐 공배양(共培養)했다. 레스폰더 T세포가 항원제시를 받아서 증식하면, 세포분열에 따라 CFSE 유래의 형광이 약해진다. 그 변화를 플로우사이토미터 FACS Canto II(BD바이오사이언스) 및 데이터해석 소프트웨어 FlowJo(트리스타)를 사용해서 측정했다. 전(全)레스폰더 T세포중에서 2회 이상 분열한 레스폰더 T세포의 비율을 산출하여, 각 조직 유래의 항원제시세포의 항원제시능을 평가했다.
2.결과
실시예4에 있어서, 정맥내 투여된 CHP 나노겔은 종양 국소의 대식세포에 선택적으로 받아들여지는 것이 분명해졌다. 정맥내 투여된 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔은 종양 국소의 대식세포에 혼입된 후에 수주된 항원특이적 T세포에 제시되어, 항원특이적 T세포의 활성을 증강시키고 있다고 생각되었다. 종양 국소 대식세포에 의한 항원제시반응을 확인하기 위해서, 다음의 실험을 하였다. 변이형 ERK2의 CD8 양성 T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 정맥내 투여한 CMS5a종양 피하이식 ALB/c 마우스로부터, 종양 및 다양한 조직에 국재(局在(일부의 곳에만 존재)하는 CD11b 양성 대식세포를 회수했다. 이것을 항원제시세포로 하여, 변이형 ERK2 특이적 TCR유전자도입 마우스 유래 CD8 양성 T세포와 시험관내에서 공배양했다. 투여된 장쇄 펩티드항원에 포함되는 변이형 ERK2 유래 CD8 양성 T세포 인식 에피토프를 CD11b 양성 대식세포가 제시하고 있으면, 변이형 ERK2 특이적 TCR유전자도입 마우스 유래 CD8 양성 T세포는 활성화해서 증식한다. T세포의 증식은 플로우사이토메트리를 사용한 CFSE 희석시험에 의해 측정하여, 항원제시의 지표로 했다.
도6에 나타나 있는 바와 같이 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 정맥내 투여하면, 종양 국소 대식세포에 의한 장쇄 펩티드항원의 제시가 확인되었다. 림프절 유래의 대식세포는, 약하지만 장쇄 펩티드항원의 제시가 확인되었다. 그 밖의 조직의 대식세포에서는 장쇄 펩티드항원의 제시가 검출되지 않았다. 이들의 대식세포는, 장쇄 펩티드항원 탑재 CHP 나노겔 및 CpG 올리고 DNA를 받아 들이지 않고 있거나, 받아 들이고 있어도 항원제시하는 능력을 결하고 있을 가능성이 있다고 생각되었다. 이들 결과로부터, CHP 나노겔은, 정맥내 투여된 경우에는, 종양 국소의 대식세포에 선택적으로 물질수송, 특히 항원을 수송하고, 항원제시시키는 능력이 있는 것이 분명해졌다.
상기 작용기서는, 인간 이외에 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 개 등의 비인간 포유동물에 있어서도 동일하다고 생각된다. 본 발명에 의한 조성물은, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 돼지, 소, 개 등에 대하여 동등의 효과가 있다고 생각된다.
본 실시형태에 의하면, 면역체크포인트 저해제의 표적분자를 발현하고 있지 않고 동(同)저해제에 저항성을 나타내는 종양에 대해서, 치료에 유용한 의약품을 제공할 수 있었다. 이 딜리버리 시스템인 소수화 다당나노겔과 합성 장쇄 펩티드항원 또는 재조합 단백질항원을 포함하는 항원 탑재 나노겔 및 면역증강제를 전처치약으로서 사용함으로써, 항원특이적 T세포 수주의 항암작용을 증강시키는 효과를 얻을 수 있었다.
SEQUENCE LISTING
<110> MIE UNIVERSITY
KYOTO UNIVERSITY
<120> Pre-treatment drug of T cell infusion therapy against tumors with
the resistance to the immune checkpoint inhibitor
<130> JP2017001MIK
<150> JP2016/022081
<151> 2016-02-08
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> MEN peptide
<400> 1
Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gln
1 5 10 15
Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Arg Gly
20 25 30
Pro Glu Ser Arg Leu Leu
35
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> p121 peptide
<400> 2
Asn Asp His Ile Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Gln
1 5 10 15
Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn
20 25 30
Leu Leu Leu Asn Thr
35
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD8+ epitope
<400> 3
Gln Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu
1 5
Claims (13)
- 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 항원에 특이적인 T세포의 투여하기 전에 투여되는 의약조성물로서, 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및/또는 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 항원 탑재 나노겔을 함유하는 의약조성물.
- 면역체크포인트 저해제 저항성 종양에 대한 T세포 수주요법에 있어서, 상기 항원 탑재 나노겔을 투여한 후에 투여하기 위한 상기 항원에 특이적인 T세포를 포함하는 의약조성물로서, 상기 항원 탑재 나노겔이 상기 항원에서 유래하는 CD8 양성세포 상해성 T세포 인식 에피토프 및/또는 CD4 양성 헬퍼T세포 인식 에피토프를 포함하는 장쇄 펩티드항원 또는 단백질항원을 소수화 다당나노겔에 탑재한 의약조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
또한 면역증강제가 항원 탑재 나노겔과 함께 투여되거나 또는 면역증강제가 항원 탑재 나노겔에 포함되어 있는 의약조성물.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 항원에 특이적인 T세포가, 상기 항원을 인식하는 T세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T세포인 의약조성물.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 장쇄 펩티드항원이 23∼120개의 아미노산으로 이루어지는 의약조성물.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
장쇄 펩티드항원에 포함되는 T세포 인식 에피토프의 사이에, 2∼10개의 티로신(tyrosine), 2∼10개의 트레오닌(threonine), 2∼10개의 히스티딘, 2∼10개의 글루타민 및 2∼10개의 아스파라긴(asparagine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 배열을 포함하는 의약조성물.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 소수화 다당이 풀루란 및 콜레스테릴기를 포함하는 의약조성물.
- 제3항 내지 제7항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 면역증강제가, TLR(Toll 유사 수용체) 아고니스트(CpG 올리고 DNA 또는 Poly-IC RNA), STING 아고니스트 또는 RLR(RIG-I 유사 수용체) 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개인 의약조성물.
- 제1항 내지 제8항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 항원이 종양특이적 항원단백질 또는 종양간 질특이적 항원단백질인 의약조성물.
- 제1항 내지 제9항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 항원 탑재 나노겔의 투여경로가, 피하, 피내, 근육내, 종양내 및 정맥내로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 경로에 의해 투여되는 의약조성물.
- 제1항 내지 제10항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 항원 탑재 나노겔이, 상기 항원에 특이적인 T세포를 포함하는 의약조성물의 투여의 적어도 1일전에 투여되는 의약조성물.
- 정맥내 투여되었을 때에 종양 국소의 대식세포(macrophage)에 선택적으로 물질을 송달하는 딜리버리 시스템으로서, 풀루란 및 콜레스테릴기를 포함하는 소수화 다당으로 이루어지는 입자지름 80nm 이하의 나노겔.
- 면역체크포인트 저해제에 저항성을 가지는 종양에 유효한 치료약을 특정하기 위한 비인간 포유류 종양모델로서, 상기 종양이 마우스 섬유육종 CMS5a이며, 비인간 포유류가 마우스인 비인간 포유류 종양모델.
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