JP6898539B2

JP6898539B2 - 免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するｔ細胞輸注療法の前処置薬

Info

Publication number: JP6898539B2
Application number: JP2017566975A
Authority: JP
Inventors: 洋珠玖; 直純原田; 大輔村岡; 一成秋吉
Original assignee: Kyoto University; Mie University NUC
Current assignee: Kyoto University; Mie University NUC
Priority date: 2016-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2037-02-08
Also published as: CN108697777A; KR20180105232A; JPWO2017138557A1; EP3415159A1; EP3415159B1; JP2021113215A; EP3415159A4; AU2017216653B2; AU2017216653A1; US20230201263A1; CA3014027A1; US20190111078A1; WO2017138557A1

Description

本発明は、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するT細胞輸注療法の効果を高める前処置薬に関する。

T細胞は、腫瘍免疫応答において重要な役割を担う。T細胞は、細胞表面に発現するT細胞受容体（TCR）を介して、抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージ等）の細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)との複合体として提示される抗原蛋白質由来エピトープペプチドを認識する。この反応を抗原刺激と言う。抗原刺激と同時に、T細胞表面に存在する膜蛋白質CD28と抗原提示細胞上の膜蛋白質CD80又はCD86が結合することによって共刺激シグナルが成立する。抗原刺激によるTCRシグナルと共刺激シグナルが同時に入力されることによって、T細胞が適切に活性化される。

これに対し、T細胞の働きが過剰にならないように、免疫チェックポイントと呼ばれる制御機構が備わっている。膜蛋白質CTLA-4は、活性化T細胞に発現し、抗原提示細胞のCD80又はCD86と結合する。その結果、CD28とCD80、又はCD28とCD86の間の結合を妨害して共刺激シグナルの成立を阻むと共に、T細胞内に抑制シグナルを入力する。制御性T細胞に発現するCTLA-4は、抗原提示細胞上のCD80又はCD86と結合することで、抗原提示細胞の活性を抑制する作用がある。このような働きを通じ、CTLA-4は、T細胞の働きを抑える免疫チェックポイント分子として機能する。
T細胞の活性化時に発現増強する膜蛋白質PD-1は、免疫チェックポイント分子の一種である。PD-1に結合するリガンドとして、PD-L1が知られている。PD-L1は、多くの腫瘍細胞及び活性化した免疫細胞に発現する。PD-L1がT細胞上のPD-1に結合すると、PD-1シグナルによって、抗原刺激時のTCRシグナルが抑制される。その結果、T細胞のサイトカイン産生や細胞殺傷活性が低下する。PD-1シグナルは、T細胞の増殖や生存を抑制する作用がある。

CTLA-4、PD-1及びPD-L1のような免疫チェックポイント分子は、腫瘍特異的T細胞の働きを弱める。その結果、腫瘍が免疫から逃避する主因の一つとなっている。CTLA-4、PD-1又はPD-L1の働きを阻害することにより、腫瘍特異的T細胞の働きを回復し、腫瘍への免疫的攻撃を強化できる。種々のヒトがんにおいて、免疫チェックポイント分子に対する阻害剤の有用性が評価されている。CTLA-4阻害抗体及びPD-1阻害抗体は、難治性のメラノーマ、肺がん及び腎細胞がんの患者において、腫瘍縮小や生存期間延長等の優れた治療効果を示す。しかし、治療効果は、いずれのがん種においても、約2〜3割に留まっている。多くのがん患者は、免疫チェックポイント阻害剤に対して抵抗性である。免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性のがん患者に有効な治療法の開発が、がん医療における重要な課題となっている。

インビトロ試験系を用いて、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に有効な治療法の候補が見出されている。マウスメラノーマ細胞株B16F10、マウス前立腺がん細胞株TRAMP-C2、又はマウス大腸がん細胞株CT26を野生型マウスに皮下移植した非臨床腫瘍モデルにおいて、抗CTLA-4抗体単剤では明確な治療効果が認められない条件下で、腫瘍溶解ウイルス（ニューカッスル病ウイルス）の腫瘍内投与と抗CTLA-4抗体の併用療法は治療効果を示す（非特許文献１）。マウスメラノーマ細胞株B16F10又はマウス大腸がん細胞株CT26を野生型マウスに皮下移植した非臨床腫瘍モデルにおいて、抗PD-1抗体単剤では明確な治療効果が認められない条件下で、放射線とSTINGアゴニストで処理したGM-CSF遺伝子導入腫瘍細胞ワクチンと抗PD-1抗体の併用療法が治療効果を示す（非特許文献２）。マウス乳がん細胞株4T1を野生型マウスに皮下移植した非臨床腫瘍モデルにおいて、抗CTLA-4抗体と抗PD-1抗体の併用療法では明確な治療効果が認められない条件下で、DNAメチル化阻害剤、HDAC阻害剤、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体の4剤併用療法が治療効果を示す（非特許文献３）。ヒトHer2抗原を発現するマウス肉腫細胞株24JKをヒトHer2トランスジェニックマウスに皮下移植した非臨床腫瘍モデルにおいて、抗PD-1抗体単剤では明確な治療効果が認められない条件下で、ヒトHer2に対するキメラ抗原受容体（CAR）遺伝子導入T細胞輸注と抗PD-1抗体の併用療法が治療効果を示す（非特許文献４）。
これらの報告は、全て免疫チェックポイント阻害剤と他のがん治療薬を組み合わせることを特徴としている。治療効果が認められる腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現するものに限定される。

ヒトがんにおいて、免疫チェックポイント阻害剤の抵抗性の機序が解明されて来ている。抗PD-1抗体に感受性又は抵抗性を示すメラノーマ患者の腫瘍組織を解析すると、抵抗性の患者では、腫瘍内のPD-L1及びPD-1の発現が有意に低いことが明らかとなった（非特許文献５）。この結果は、腫瘍局所における免疫チェックポイント阻害剤の標的分子の発現欠如が、腫瘍が同阻害剤に抵抗性を示す原因であることを示す。非特許文献１〜４に示される治療法は、全て免疫チェックポイント阻害剤と他のがん治療薬を組み合わせることを特徴としている。これらの治療法は、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現する腫瘍に対しては有効である。しかし、これらの治療法は、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現しない腫瘍に対しては効果が少ない可能性がある。これらの結果より、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現しない腫瘍に対する新規治療法が必要とされる。

Zamarin, D., et al. Sci. Transl. Med. 2014;6(226):226ra32. Fu, J., et al. Sci. Transl. Med. 2015;7(283):283ra52. Kim, K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014;111(32):11774-9. John, L. B., et al. Clin. Cancer Res. 2013;19(20):5636-46. Tumeh, P. C., et al. Nature. 2014;515(7528):568-71.

本発明の目的は、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対する治療技術を提供することである。具体的には、T細胞輸注療法と併用することにより、非常に効果が高い抗腫瘍・腫瘍抑制効果を示す前処置薬（抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤）を提供することである。

本発明者は、腫瘍局所における免疫チェックポイント阻害剤の標的分子の発現が低く、同阻害剤に抵抗性の腫瘍に対して有効な治療法について検討した。前処置薬として、合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原と疎水化多糖ナノゲルとを組み合わせた抗原搭載ナノゲルと、免疫増強剤とを組み合わせて用いた。抗原特異的T細胞輸注が、免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性を示す腫瘍に対して、著効を示すことを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。

本発明の詳細は、次の通りである。
１）免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するT細胞輸注療法において、抗原に特異的なT細胞を投与する前に投与される医薬組成物であって、前記抗原に由来するCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ及び／又はCD4陽性ヘルパーT細胞認識エピトープを含む長鎖ペプチド抗原又は蛋白質抗原を疎水化多糖ナノゲルに搭載した抗原搭載ナノゲルを含有する医薬組成物。
２）免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するT細胞輸注療法において、前記抗原搭載ナノゲルを投与した後に投与するための前記抗原に特異的なT細胞を含む医薬組成物であって、前記抗原搭載ナノゲルが前記抗原に由来するCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ及び／又はCD4陽性ヘルパーT細胞認識エピトープを含む長鎖ペプチド抗原又は蛋白質抗原を疎水化多糖ナノゲルに搭載した医薬組成物。
上記発明において、長鎖ペプチド抗原又は蛋白質抗原としては、組換え蛋白質抗原を用いることもできる。この場合には、所定のアミノ酸配列を持つ蛋白質をコードする塩基配列を持つ核酸を作製し、これを組み込んだ細胞（真核細胞又は原核細胞）を用いて、組換え蛋白質を発現させた後、公知の方法によって精製することで、組換え蛋白質抗原を得る。

３）更に、免疫増強剤が抗原搭載ナノゲルと共に投与される、又は免疫増強剤が抗原搭載ナノゲルに含まれている１）又は２）記載の組成物。
４）前記抗原に特異的なT細胞が、前記抗原を認識するT細胞受容体又はキメラ抗原受容体を発現するT細胞である１）〜３）のいずれか１項記載の組成物。
５）前記長鎖ペプチド抗原が23〜120個のアミノ酸から成る１）〜４）のいずれか１項記載の組成物。
６）長鎖ペプチド抗原に含まれるT細胞認識エピトープの間に、2〜10個のチロシン、2〜10個のスレオニン、2〜10個のヒスチジン、2〜10個のグルタミン及び2〜10個のアスパラギンから成る群から選択される配列を含む１）〜５）のいずれか１項記載の組成物。
７）前記疎水化多糖がプルラン及びコレステリル基を含む、１）〜６）のいずれか１項記載の組成物。
８）前記免疫増強剤が、TLR（Toll様受容体）アゴニスト（CpGオリゴDNA又はPoly-IC RNA）、STINGアゴニスト又はRLR（RIG-I様受容体）アゴニストから成る群から選択される少なくとも一つである３）〜７）のいずれか１項記載の組成物。
これらのうち、TLRアゴニスト（CpGオリゴDNA又はPoly-IC RNA）を用いることが好ましい。

９）前記抗原が腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質である１）〜８）のいずれか１項記載の組成物。
１０）前記抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤の投与経路が、皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内及び静脈内からなる群から選択される少なくとも一つの経路によって投与される１）〜９）のいずれか１項記載の組成物。
これらのうち、皮下投与又は静脈内投与を用いることが好ましい。
１１）前記抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤が、前記抗原に特異的なT細胞を含む医薬組成物の投与の少なくとも１日前に投与される１）〜１０）のいずれか１項記載の組成物。
１２）静脈内投与されたときに腫瘍局所のマクロファージに選択的に物質を送達するデリバリーシステムであって、プルラン及びコレステリル基を含む疎水化多糖から成る粒子径80nm以下のナノゲル。
１３）免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性を持つ腫瘍に有効な治療薬を特定するための非ヒト哺乳類腫瘍モデルであって、前記腫瘍がマウス繊維肉腫CMS5aであり、非ヒト哺乳類がマウスである非ヒト哺乳類腫瘍モデル。

本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現しておらず同阻害剤に抵抗性を示す腫瘍の治療に有用な医薬品を提供できる。本発明に係るデリバリーシステムである疎水化多糖ナノゲルと合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原を含む抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤を前処置薬として用いることで、抗原特異的T細胞輸注の抗がん作用を増強する効果を得られる。

BALB/cマウスに皮下移植されて生着した種々のマウス腫瘍について、PD-L1及びPD-1の発現と腫瘍浸潤CD8陽性T細胞数とを示すデータである。（Ａ）移植7日後に腫瘍局所のPD-L1分子の発現を解析した結果を示す顕微鏡写真図、（Ｂ）各腫瘍の腫瘍局所におけるCD3陽性T細胞のPD-1発現をフローサイトメトリー法で解析した結果を示すグラフ、（Ｃ）各腫瘍の腫瘍局所へ浸潤したCD8陽性T細胞の数を示すグラフである。 BALB/cマウスに皮下移植されて生着した種々のマウス腫瘍について、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性を調べた結果を示すグラフである。 BALB/cマウスに皮下移植された線維肉腫CMS5a腫瘍に対して、前処置薬として長鎖ペプチド抗原を搭載したコレステリルプルラン（CHP）ナノゲル及び免疫増強剤を用いた抗原特異的T細胞輸注の治療効果を示すグラフである。（Ａ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを皮下投与してから抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒できること、並びにデリバリーシステムとしてナノゲルではなく不完全フロイントアジュバント（IFA）を用いると効かないことを示すグラフ、（Ｂ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを静脈内投与した後に抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒が認められ、本発明の抗原搭載ナノゲルは静脈内投与でも同等の効果があることを示すグラフ、（Ｃ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びPoly-IC RNAを投与した後に抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒できることから、免疫増強剤はPoly-IC RNAでも同等の効果があることを示すグラフである。 BALB/cマウスに皮下移植されたCMS5a腫瘍に対して、前処置薬として長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及び免疫増強剤を用いた抗原特異的T細胞輸注の治療効果を示すグラフである。（Ａ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを投与した後に抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒できるが、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルを省くと効かないことを示すグラフ、（Ｂ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを投与してから抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒できるが、CpGオリゴDNAを省くと効かないことを示すグラフ、（Ｃ）CMS5a腫瘍に対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを投与してから抗原特異的T細胞輸注を行うと治癒できるが、抗原特異的T細胞輸注を省くと効かないことを示すグラフである。 CMS5a腫瘍を皮下移植したBALB/cマウスに対し、CHPナノゲルを静脈内投与したときに、腫瘍局所の免疫細胞へのCHPナノゲルの取り込み試験の結果を示すデータである。 CMS5a腫瘍を皮下移植したBALB/cマウスに対し、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを投与したときに、腫瘍局所由来マクロファージによる抗原提示反応試験の結果を示すデータである。

前処置薬の形態
本発明の前処置薬は、腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質に由来するCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ及びCD4陽性ヘルパーT細胞認識エピトープを同時に含む1種類以上の合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原をデリバリーシステムである疎水化多糖ナノゲルに搭載した薬剤と、1種類以上の免疫増強剤によって構成されることを特徴とする。
前記合成長鎖ペプチド抗原は、T細胞認識エピトープを少なくとも2つ以上含む23〜120個のアミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。前記合成長鎖ペプチド抗原は、T細胞認識エピトープを少なくとも2つ以上含む23〜80個のアミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。前記合成長鎖ペプチド抗原が、T細胞認識エピトープを少なくとも2つ以上含む23〜60個のアミノ酸から成るポリペプチドであることが好ましい。

前記組換え蛋白質抗原は、T細胞認識エピトープを2つ以上含み、必要に応じて精製のためのタグ配列を含み、大腸菌又は昆虫細胞又は哺乳類細胞で生産される全長又は部分長の抗原蛋白質であることが望ましい。
前記CD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。前記CD4陽性ヘルパーT細胞認識エピトープが、腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質のアミノ酸配列の一部であることが好ましい。
前記腫瘍特異的抗原蛋白質が、MAGEファミリー、NY-ESO-1/LAGE、SAGE、XAGE、HER2、PRAME、Ras、5T4、WT1、p53、MUC-1、hTERT、RHAMM、Survivin、EGFRvIII、HPV E6、MART-1、gp100、CEA、IDO、Brachyury、Mesothelin、PSA及びPSMAからなる群から選択されることが好ましい。前記腫瘍間質特異的抗原蛋白質が、FAP、VEGFRファミリー及びTEM1からなる群から選択されることが好ましい。

前記疎水化多糖ナノゲルの構成多糖類が、プルラン又はマンナンであることが好ましい。前記疎水化多糖ナノゲルの疎水基が、コレステロールであることが好ましい。前記疎水化多糖ナノゲルが、非イオン性であることが好ましい。前記疎水化多糖ナノゲルの粒子径が、80nm以下であることが好ましい。
前記免疫増強剤が、可溶性TLRアゴニスト又は可溶性STINGアゴニスト又は可溶性RLRアゴニストを含むことが好ましい。可溶性TLRアゴニストとして、CpGオリゴDNA又はPoly-IC RNAが例示される。可溶性STINGアゴニストとして、cdGMP等の環状ジヌクレオチド、DMXAA等のxanthenone誘導体が例示される。可溶性RLRアゴニストとして、5'-三リン酸化二本鎖RNAが例示される。

本発明において、合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原は、腫瘍特異的抗原蛋白質及び／又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質に含まれるT細胞認識エピトープを少なくとも二つ以上含むことを特徴とする。T細胞認識エピトープは、腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質に含まれるものが好ましい。そのようなものとして、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-B1、MAGE-B2などのMAGEファミリー分子や、NY-ESO-1／LAGE分子、SAGE、XAGE、HER2、PRAME、Ras、5T4、WT1、p53、MUC-1、hTERT、RHAMM、Survivin、EGFRvIII、HPV E6、MART-1、gp100、CEA、IDO、Brachyury、Mesothelin、PSA、PSMAなどの腫瘍特異的抗原蛋白質に含まれるT細胞認識エピトープ、及びFAP、VEGFRファミリー、TEM1などの腫瘍間質特異的抗原蛋白質に含まれるT細胞認識エピトープから選択することができる。T細胞認識エピトープには、CD8陽性細胞傷害性T細胞によって認識されるCTLエピトープと、CD4陽性ヘルパーT細胞によって認識されるThエピトープとがある。本発明の合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原は、CTLエピトープとThエピトープをそれぞれ一つ以上同時に含むことが好ましい。CTLエピトープを含む長鎖ペプチド抗原と、Thエピトープを含む長鎖ペプチド抗原とは、それぞれ単独、または組み合わせて使用することができる。

本発明において使用される疎水化多糖は、既知の方法で製造することができる。疎水化多糖における多糖、糖残基がグリコシド結合した高分子であれば、特に限定されずに使用できる。多糖類を構成する糖残基としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース等の単糖、又は二糖又はオリゴ糖などの糖類に由来する残基を用いることができる。糖残基は、1,2-、1,3-、1,4-又は1,6-グリコシド結合していてもよく、その結合はα型結合又はβ型結合のいずれであってもよい。多糖は、直鎖状でも分枝鎖状のいずれでもよい。糖残基としては、グルコース残基が好ましく、多糖としては、天然又は合成由来のプルラン、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、又はマンナン、好ましくはマンナン又はプルランなどが用いられる。多糖の平均分子量として、50,000〜150,000のものを用いることができる。
疎水基としては、例えば１本鎖及び２本鎖のアルキル基又はステロール残基を、100単糖あたり1〜5個（重量比で5％以下）の割合で導入したものが好ましく、100単糖あたり1〜3個（重量比で3％以下）の割合で導入したものがより好ましい。疎水基は、アルキル基又はステロール残基に限定されず、封入される抗原の分子量や等電点に応じて封入率のよいものを選択できる。ステロール残基としては、例えばコレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール残基などが挙げられる。好ましくは、コレステロール残基を用いることができる。アルキル基としては、炭素数が20以下のものが好ましく、炭素数が10〜18のアルキル基を用いることがより好ましい。アルキル基は、直鎖又は分岐鎖のいずれを用いることもできる。

疎水化多糖としては、例えば、多糖を構成する糖の100個あたりに1〜5個の1級水酸基が次式（Ｉ）：-O-(CH₂)_mCONH(CH₂)_nNH-CO-O-R （Ｉ）（式中、Ｒはアルキル基又はステロール残基を示し；mは0又は1を示し；nは任意の正の整数を示す）で表されるものが結合しているものが好ましい。アルキル基又はステロール残基として、nは1〜8が好ましい。
疎水化多糖としては、リンカーを介して結合したものを用いることができる。
疎水化多糖としては、非イオン性であることが好ましい。合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原を搭載した疎水化多糖ナノゲル粒子が、生理的条件下でゼータ電位が−2.0mV〜＋2.0mVのものが好ましい。合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原を搭載した疎水化多糖ナノゲル粒子の粒子径が80nm以下であることが好ましい。

本発明において、デリバリーシステムである疎水化多糖ナノゲルに合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原を搭載した抗原搭載ナノゲルと免疫増強剤から成る前処置薬は、色々な方法で投与することができる。適当な非経口経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入又は筋肉内の経路を介して注射、又は点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法により投与することが好ましい。
本発明の前処置薬は、通常、抗原搭載ナノゲルと免疫増強剤を混合した製剤又は別個の製剤としたキットとして、皮下、静脈内、筋肉内への非経口投与に適した剤型の製剤とすることができる。目的の免疫を誘導するのに必要な抗原搭載ナノゲルの投与量は、適宜決定できる。例えば、通常の投与量としては、合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原として、0.1mg／回〜10mg／回程度の量を用いることができる。投与回数は、2〜20回が適当である。投与間隔は、前処置薬と抗原特異的T細胞輸注の間隔として、1日〜2週間の間で選択する。

本発明は、抗原特異的T細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する治療薬の前処置薬を提供する。患者の治療に適した前記細胞集団は、例えば注射又は点滴による静脈、動脈、皮下、又は腹腔内等の投与方法によって投与される。前記細胞集団は、製薬分野で公知の方法に従い、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤又は安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製できる。前記細胞集団の含有量、投与量、その他の諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。医薬における前記細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、1×10³〜1×10¹¹個／ｍＬが好ましく、1×10⁴〜1×10¹⁰個／ｍＬが更に好ましく、1×10⁵〜2×10⁹個／ｍＬが更に好ましい。前記細胞集団を有効成分として含有する治療薬の投与量としては、特に限定はないが、成人あたり、1×10⁶〜1×10¹²個／日が好ましく、1×10⁷〜5×10¹¹個／日が更に好ましく、1×10⁸〜2×10¹¹個／日が更に好ましい。前記細胞集団の製造方法において、前記細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含することができる。「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象のT細胞を含有する細胞集団に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象の細胞と同種由来のものも包含される。外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入は、ウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターを用いることなく実施できる。それらの方法の詳細については、多くの既報がある。

前記ウイルスベクターとしては、特に限定はなく、遺伝子導入に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に外来遺伝子を安定に組み込むことができるレトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターが特に好適である。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。遺伝子導入の際に、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることができる。ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、リポソーム、又はリガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などを使用できる。この場合には、プラスミドDNA、直鎖状DNA又はRNAに組み込まれた外来遺伝子が導入される。

導入される外来遺伝子には特に限定はなく、任意の遺伝子（例えば、酵素、サイトカイン類、ケモカイン類、又はT細胞受容体（TCR）やキメラ抗原受容体（CAR）のような抗原レセプター類、共刺激分子の受容体又はリガンド等の蛋白質をコードするものの他、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA、リボザイム、アプタマーをコードするもの）を使用できる。外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミド等に挿入して使用することができる。ベクター内には、エンハンサー配列又はターミネーター配列のような制御配列を組み込むことができる。
抗原搭載ナノゲル、免疫増強剤及び抗原特異的T細胞輸注を用いる治療薬の適用の対象は、免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性の腫瘍を有するヒトが挙げられる。腫瘍の種別は特に限定されないが、例えば前立腺がん、大腸がん、メラノーマ、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がん、肝臓がん、胆のう・胆管がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、睾丸がん、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、子宮頚がん、皮膚がん、脳腫瘍等が挙げられる。

次に、本発明の実施例について、図面を参照しつつ詳細に説明する。本発明は、下記実施例によって制限されることなく、要旨を変更しない限り、様々に変更して実施できる。
＜実施例１＞
１．材料と方法
抗マウスCD16/CD32抗体（クローン93）、PE標識抗マウスPD-L1抗体（クローン9G2）、APC-Cy7標識抗CD45抗体（クローン30-F11）及びPE-Cy7標識抗PD-1抗体（クローン29F.1A12）はバイオレジェンドから購入した。V450標識抗CD8抗体（クローン53-6.7）はeバイオサイエンスから購入した。ウシ胎児血清（FBS）はバイオウェストから購入した。RPMI1640培地（2-メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。赤血球溶血溶液（0.15M NH₄Cl/10mM KHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂ pH 7.2）は三重大学で作製した。マウス大腸がんCT26細胞株（CRL-2638）はATCCから購入し、三重大学で継代したものを用いた。マウス線維肉腫CMS7細胞株及びマウス線維肉腫CMS5a細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より入手し、三重大学で継代したものを用いた。ヒトNY-ESO-1抗原遺伝子はメモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲を受けた。CMS5a細胞株にヒトNY-ESO-1抗原遺伝子を安定導入したCMS5a-NY細胞株は、三重大学で作製され、継代されたものを用いた。雌性BALB/cマウスは6〜12週齢のものを日本SLCから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。

マウス大腸がんCT26細胞株、BALB/cマウス線維肉腫CMS7細胞株、マウス線維肉腫CMS5a細胞株及びCMS5a-NY細胞株は、10%FBS含有RPMI1640培地中で、T75培養フラスコ（コーニング）を用いて培養した。培養した細胞株は、0.5%トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて剥離し、10%FBS含有RPMI1640培地中に懸濁した。細胞を遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除き、RPMI1640培地を用いて2回洗浄した後、1×10⁶個/100μLの濃度でRPMI1640培地に懸濁した。この懸濁液を100μL/個体の用量でBALB/cマウスの後背部に皮下移植した（一群当たり3匹）。
各細胞株を皮下移植し、1週間後に腫瘍を回収した。腫瘍は、次に示す方法で免疫組織化学染色した。O.C.T.コンパウンド（サクラファインテック）に包埋し凍結した腫瘍を3μm厚で薄切し、得られた腫瘍切片について風乾を2時間行った。乾燥した腫瘍切片に対して氷冷したアセトンで15分間の固定を行い、免疫染色に用いた。腫瘍切片をPBSで3回洗浄した後、4℃でブロッキング液（1%ウシ血清アルブミン（BSA）及び5%Blocking One Histo（ナカライテスク）含有PBS）に浸漬し、ブロッキングを行った。1μg/mLの濃度で抗マウスCD16/CD32抗体をブロッキング液に希釈した。この抗体を用いて、湿潤箱内で腫瘍切片に対して室温で30分間の処理を行い、Fcγ受容体をブロックした。次に、ブロッキング液に1μg/mLの濃度で希釈したPE標識抗マウスPD-L1抗体を用いて、湿潤箱内で腫瘍切片に対して室温で１時間の染色を行った。0.02％Tween20含有PBSで3回の洗浄を行った後、腫瘍切片をProlong Gold antifade reagent with DAPI（ライフテクノロジーズ）に浸漬し、蛍光顕微鏡BX53F（オリンパス)又は共焦点レーザ走査型顕微鏡LSM780（カールツァイス）を用いて観察した。得られた顕微鏡観察像について、Photoshop Element（アドビシステムズ）を用いて画像処理を行った。

各細胞株を皮下移植し、1週間後に腫瘍浸潤免疫細胞を次の方法で分離した。マウスから腫瘍を単離し、Gentle MACS（ミルテニー）を使いて破砕した後、RPMI1640培地に懸濁した。このとき1群3匹分の細胞をプールした。懸濁した細胞にコラゲナーゼD（終濃度2mg/mL、ロシュ）を加えて37℃で30分間反応した後、再びGentle MACSを用いて破砕した。細胞を濾過フィルター（22μm孔径、BDバイオサイエンス）に通した後、遠心分離（400×g、5分、4℃）し、上清を除去した後、2mLの赤血球溶血溶液を加えて細胞を1分間処理した。18mLのRPMI1640培地を加え、遠心分離（400×g、5分、4℃）した。上清を除き、細胞をRPMI1640培地に懸濁した。細胞数を計数した後、3×10⁷個/mLの細胞濃度になるように染色用バッファー（0.5%BSA含有PBS）に懸濁した。1ウェル当たり、50μLの細胞懸濁液を96穴V底マイクロプレート（ヌンク）に移した。遠心分離（2000rpm、1分、4℃）して上清を除いた後、1ウェル当たり50μLの染色用バッファーに懸濁した。各抗体のメーカーの推奨使用濃度に従い、APC-Cy7標識抗マウスCD45抗体、V450標識抗マウスCD8抗体、PE-Cy7標識抗マウスPD-1抗体を細胞に添加し、穏やかに混合した後、4℃の暗所にて15分間静置した。200μLの染色用バッファーで細胞を2回洗浄した後、200μLの染色用バッファーに懸濁し、丸底ポリスチレンチューブ（BDバイオサイエンス）へ移した。細胞はフローサイトメーターFACS Canto II（BDバイオサイエンス）及びデータ解析ソフトウェアFlowJo（ツリースター）を用いて解析した。PD-1発現の頻度として、CD45陽性かつCD8陽性の細胞集団における発現頻度（％）を求めた。CD8陽性T細胞の頻度として、CD45陽性細胞集団におけるCD8陽性細胞の頻度（％）を求めた。

２．結果
ヒトの免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍は、免疫チェックポイント分子の発現欠如やCD8陽性T細胞の腫瘍浸潤が見られないという特徴を示す（非特許文献５）。これと同じ特徴を示すマウス腫瘍を検索するため、種々のマウスがん細胞株がBALB/cマウスに皮下移植された後に形成する腫瘍を回収し、免疫チェックポイント分子PD-L1及びPD-1の発現、並びにCD陽性T細胞の浸潤数を測定した。図１(A)には、CT26腫瘍、CMS7腫瘍、CMS5a-NY腫瘍及びCMS5a腫瘍の腫瘍局所におけるPD-L1分子の発現を免疫染色法で解析した結果を示した。CT26腫瘍、CMS7腫瘍及びCMS5a-NY腫瘍では、PD-L1を発現する多数の細胞が観察されるのに対し、CMS5a腫瘍ではPD-L1発現細胞の数が極めて少なかった。図１(B)には、各腫瘍の腫瘍局所におけるCD3陽性T細胞におけるPD-1の発現頻度をフローサイトメトリー法で解析した結果を示した。CMS5a腫瘍は他の腫瘍と比較して、PD-1発現CD3陽性T細胞の割合が最も低かった。図１(C)には、各腫瘍の腫瘍局所へ浸潤したCD8陽性T細胞の頻度を示した。CMS5a腫瘍は他の腫瘍と比較して、腫瘍局所浸潤CD8陽性T細胞の頻度が著しく低かった。以上の結果から、マウス線維肉腫CMS5a細胞株がマウスに皮下移植されて形成する腫瘍は、ヒトの免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍と同じ特徴を示すことを見出した。

＜実施例２＞
１．材料と方法
抗マウスCTLA-4抗体（クローン9D9）は、MDアンダーソンがんセンターのJames P. Allison博士から分譲されたハイブリドーマを用いて三重大学で作製した。抗マウスGITR抗体（クローンDTA-1）は、大阪大学の坂口志文博士から分譲されたハイブリドーマを用いて三重大学で作製した。抗マウスPD-1抗体（クローンRMP1-14）は順天堂大学の八木田秀雄博士より分譲されたものを用いた。ウシ胎児血清（FBS）はバイオウェストから購入した。RPMI1640培地（2-メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。マウス大腸がんCT26細胞株（CRL-2638）はATCCから購入し、三重大学で継代したものを用いた。マウス線維肉腫CMS7細胞株及びマウス線維肉腫CMS5a細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より入手し、三重大学で継代したものを用いた。ヒトNY-ESO-1抗原遺伝子は、メモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲された。CMS5a細胞株にヒトNY-ESO-1抗原遺伝子を安定導入したCMS5a-NY細胞株は、三重大学で作製され継代されたものを用いた。雌性BALB/cマウスは6週齢〜12週齢のものを日本SLCから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。
CT26細胞株、CMS7細胞株、CMS5a細胞株及びCMS5a-NY細胞株を10%FBS含有RPMI1640培地中で、T75培養フラスコ（コーニング）を用いて培養した。各細胞株を0.5%トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて剥離し、10%FBS含有RPMI1640培地に懸濁した。懸濁液を遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除いた。RPMI1640培地を用いて2回洗浄した後、1×10⁶個/100μLの濃度でRPMI1640培地に懸濁した。この懸濁液を100μL/個体の用量で、BALB/cマウスの後背部に皮下移植した（1群当たり4匹）。腫瘍移植後7、9及び11日目に、PBSに希釈した抗マウスPD-1抗体（150μg）、抗マウスCTLA-4抗体（100μg）及び抗マウスGITR抗体（100μg）を免疫チェックポイント阻害剤として同時に腹腔内投与した。腫瘍移植後は経時的に腫瘍の長径と短径を測定し、計算式（長径×短径×短径×0.5）に従って腫瘍体積を算出した。統計解析は、マイクロソフトエクセル（マイクロソフト）を用いたノンパラメトリック検定により行った。

２．結果
実施例１の結果から、マウス線維肉腫CMS5a細胞株がBALB/cマウスに皮下移植されて形成する腫瘍は免疫チェックポイント阻害剤に対し抵抗性を示すことが予想された。そこで、各マウスがん細胞株を皮下移植して腫瘍を形成させたBALB/cマウスに対し、免疫チェックポイント阻害剤である抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体及び抗GITR抗体の併用療法による治療実験を試みた。結果を図２に示した。CT26腫瘍、CMS7腫瘍及びCMS5a-NY腫瘍では、免疫チェックポイント阻害剤併用療法による腫瘍増殖抑制が明確に認められた。これに対し、CMS5a腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤併用療法に全く反応せず、未治療群と同様の増殖を示した。このことから、CMS5a腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に強い抵抗性を示すことが明らかとなった。実施例１の結果と併せ、CMS5a腫瘍はヒトの免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍の良いモデルであると考えた。CMS5a腫瘍を評価系として用いることで、ヒトの免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対して有効な治療法の探索ができることが分かった。

＜実施例３＞
１．材料と方法
コレステリルプルラン（略称CHP、商品名CHP-80T）は（株）日油より入手した。不完全フロイントアジュバント（略称IFA、型番F5506）はシグマアルドリッチより購入した。長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルは以下の通りに調製した。Bio-Synthesisで化学合成された長鎖ペプチド抗原（MENペプチド：SNPARYEFLYYYYYYQYIHSANVLYYYYYYRGPESRLL（配列番号１）又はp121ペプチド：NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT（配列番号２））を10mg/mLの濃度でジメチルスルホキシド（略称DMSO、ナカライテスク）に溶解した。CHPは10mg/mLの濃度で6M尿素（ナカライテスク）含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した。1mL（10mg）の長鎖ペプチド抗原溶液と20mL（200mg）のCHP溶液を混合し、暗所にて4℃で穏やかに撹拌しながら一晩放置した。混合液を透析膜（カット分子量：3,500、サーモサイエンティフィック）に移し、透析外液として容積比100倍以上の0.6M尿素含有PBSに対し4℃で2時間から一晩透析した。更に、透析外液として容積比100倍以上の0.06M尿素含有PBSを用い、4℃で2時間から一晩透析した。再び、透析外液として容積比100倍以上のPBSを用い、4℃で2時間から一晩透析した。透析内液を回収し、孔径0.22μmの濾過滅菌フィルター（PVDF膜製、ミリポア）で濾過後、Nanodrop 2000（サーモサイエンティフィック）を用いて280nmにおけるUV吸収を測定した。長鎖ペプチド抗原の分子吸光係数（1mg/mL=4.181）からその最終濃度を求めた。

長鎖ペプチド抗原：IFA混合物は、次の通りに調製した。長鎖ペプチド抗原を60μg/125μLの濃度で25%DMSO含有PBSに溶解し、シリンジに採取した。別途、125μLのIFAをシリンジに採取した。両方のシリンジを三方活栓で連結した後、吸排を繰り返し、良く混合した後に投与に用いた。ウシ胎児血清（FBS）はバイオウェストから購入した。RPMI1640培地（2-メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。マウス線維肉腫CMS5a細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲され、三重大学で継代したものを用いた。マウス線維肉腫CMS5a細胞株は、変異型ERK2蛋白質を発現している。変異型ERK2蛋白質の変異部分を含むペプチド（QYIHSANVL：配列番号３、下線部は変異を示す）は、BALB/cマウスのCD8陽性細胞傷害性T細胞に認識される。このペプチドを認識するT細胞受容体（TCR）が単離され、TCRを遺伝子導入したマウス（DUC18マウス）が作出されている。本実施例で用いた長鎖ペプチド抗原（MENペプチド及びp121ペプチド）は、前記変異型ERK2のCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ配列（QYIHSANVL：配列番号３）が含まれている。
雌性BALB/cマウスは6週齢〜12週齢のものを日本SLCから購入した。DUC18マウスはワシントン大学より分譲され、三重大学で繁殖させたものを用いた。マウスは三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。

T75培養フラスコ（コーニング）を用い、マウス線維肉腫CMS5a細胞株を10%FBS含有RPMI1640培地中で培養した。培養後の細胞株を0.5%トリプシン含有PBSを用いて剥離し、10%FBS含有RPMI1640培地に懸濁した。懸濁液を遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除いた。その後、RPMI1640培地を用いて2回洗浄し、1×10⁶個/100μLの濃度でRPMI1640培地に懸濁した。100μL/個体の用量でBALB/cマウスの両側後背部に皮下移植した（1群あたり4匹）。抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤を前処置薬として投与する場合は、腫瘍移植7日後及び11日後に、免疫増強剤としてPBSに溶解した50μgのCpGオリゴDNA1668（ジーンデザイン）又は50μgのPoly-ICLC RNA（Oncovir）と共に、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル又は長鎖ペプチド抗原：IFA混合物をマウスの後背部皮下又は尾静脈内へ投与した。図４(A)に示す実験では、長鎖ペプチド抗原としてp121ペプチドを用いた。その他の実験では全て、MENペプチドを用いた。変異型ERK2特異的TCR遺伝子導入マウス（DUC18マウス）の脾臓からCD8陽性T細胞をCD8a+ T Cell アイソレーションキット（ミルテニー）を用いて単離した。単離したCD8陽性T細胞をRPMI1640培地に、2×10⁶個/200μLの濃度で懸濁した。腫瘍移植8日後及び12日後に、単離したCD8陽性T細胞を治療用の抗原特異的T細胞として尾静脈内から輸注した。統計解析は、マイクロソフトエクセル（マイクロソフト）を用いたノンパラメトリック検定により行った。

２．結果
BALB/cマウスに皮下移植して形成したCMS5a腫瘍を評価系として用いて、ヒトの免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対して有効な治療法を探索した。その結果、図３(A)に示すように、前処置薬として長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルと免疫増強剤（CpGオリゴDNA）を皮下投与した後に抗原特異的T細胞輸注を行うと、CMS5a腫瘍の増殖が顕著に抑制されることを見出した。この治療効果は、デリバリーシステムとして、IFAを用いた場合には認められなかった。図３(B)に示すように、前処置薬の投与経路は皮下投与に代えて、静脈内投与でも効果的であることが分かった。図３(C)に示すように、前処置薬に含まれる免疫増強剤はCpGオリゴDNAに限らずPoly-IC RNAでも良いことが分かった。
図４(A)に示すように、前処置薬から長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルを除くと、治療効果は認められなかった。図４(B)に示すように、前処置薬から免疫増強剤（CpGオリゴDNA）を除くと、治療効果は認められなかった。以上の結果より、抗原特異的T細胞輸注の前処置薬には、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルと免疫増強剤が必須であることが分かった。図４(C)に示すように、抗原特異的T細胞輸注を省略し、前処置薬のみとしても治療効果は認められなかった。
このように、本発明の前処置薬を抗原特異的T細胞輸注と併用することで、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍を治療し得ることが明らかとなった。

＜実施例４＞
１．材料と方法
Rhodamine標識CHPナノゲルは、京都大学・秋吉一成博士より分譲されたものを用いた。APC-Cy7標識抗マウスCD45抗体（クローン30-F11）、FITC標識抗マウスCD8抗体（クローン53-6.7）、PE標識抗マウスCD11b抗体（クローンM1/70）、Pacific blue標識抗マウスF4/80抗体（クローンBM8）及びPE-Cy7標識抗マウスCD11c抗体（クローンN418）は、バイオレジェンドより購入した。PerCP-Cy5.5標識抗マウスCD4抗体（クローンRM4-5）はBDバイオサイエンスから購入した。APC標識抗マウスB220抗体（クローンRA3-6B2）はeバイオサイエンスから購入した。ウシ胎児血清（FBS）はバイオウェストから購入した。RPMI1640培地（2-メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。赤血球溶血溶液（0.15M NH₄Cl/10mM KHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂ pH 7.2）は三重大学で作製した。マウス線維肉腫CMS5a細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲され、三重大学で継代したものを用いた。雌性BALB/cマウスは6週齢〜12週齢のものを日本SLCから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。

T75培養フラスコ（コーニング）を用いて、マウス線維肉腫CMS5a細胞株を10%FBS含有RPMI1640培地中で培養した。この細胞株を0.5%トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて剥離し、10%FBS含有RPMI1640培地に懸濁した。遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除き、RPMI1640培地を用いて2回洗浄した。細胞株を1×10⁶個/100μLの濃度でRPMI1640培地に懸濁し、100μL/個体の用量でBALB/cマウスの後背部に皮下移植した（1群当たり4匹）。腫瘍移植7日目に1mgのRhodamine標識CHPナノゲル（10mg/mL PBS）を後背部皮下もしくは尾静脈内に投与した。Rhodamine標識CHPナノゲル投与の翌日に、腫瘍浸潤免疫細胞を次に示す方法で分離した。マウスから腫瘍を単離し、Gentle MACS（ミルテニー）を使いて破砕した後、RPMI1640培地に懸濁した。1群4匹分の細胞をプールした。コラゲナーゼD（終濃度2mg/ml、ロシュ)を加え、37℃で30分間反応した後、再びGentle MACSを用いて破砕した。濾過フィルター（22μm孔径、BDバイオサイエンス）に通した後、遠心分離（400×g、5分、4℃）後に上清を除去し、2mLの赤血球溶血溶液を加えて細胞を1分間処理した。18mLのRPMI1640培地を加え、遠心分離（400×g、5分、4℃）した。上清を除き、細胞をRPMI1640培地に懸濁した。細胞数を計数した後、3×10⁷個/mLの細胞濃度になるように染色用バッファー（0.5%ウシ血清アルブミン含有PBS）に懸濁した。1ウェル当たり50μLの細胞懸濁液を 96穴V底マイクロプレート（ヌンク）に移した。遠心分離（2000rpm、1分、4℃）して上清を除いた後、1ウェル当たり50μLの染色用バッファーに懸濁した。Rhodamine標識CHPナノゲル投与の18時間後に、所属リンパ節を回収した。皮下投与の場合には、投与部位の所属リンパ節（鼠径リンパ節）を、静脈内投与の場合は、腫瘍の所属リンパ節（鼠径リンパ節）を回収した。

スライドガラスを用いてリンパ節を磨砕した後、遊離した細胞をRPMI1640培地中に懸濁した。このとき、1群4匹分の細胞をプールした。遠心分離（400×g、5分、4℃）後に上清を除去し、2mLの赤血球溶血溶液を加えて細胞を1分間処理した。18mLのRPMI1640培地を加え、遠心分離（400×g、5分、4℃）した。上清を除き、細胞をRPMI1640培地に懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除去し、2%FBS含有PBSを用いて2回洗浄した後に懸濁した。腫瘍又はリンパ節から調製した細胞懸濁液に対し、各抗体のメーカーが推奨する使用濃度に従い、APC-Cy7標識抗マウスCD45抗体、FITC標識抗マウスCD8抗体、PerCP-Cy5.5標識抗マウスCD4抗体、APC標識抗マウスB220抗体、PE標識抗マウスCD11b抗体、Pacific blue標識抗マウスF4/80抗体、PE-Cy7標識抗マウスCD11c抗体を添加し、混合した後、4℃の暗所にて15分間静置した。200μLの染色用バッファーで細胞を2回洗浄した後、200μLの染色用バッファーに再懸濁を行い、丸底ポリスチレンチューブ（BDバイオサイエンス）へ移した。細胞はフローサイトメーターFACS Canto II（BDバイオサイエンス）及びデータ解析ソフトウェアFlowJo（ツリースター）を用いて解析した。
T細胞はCD45陽性かつCD4陽性もしくはCD45陽性かつCD8陽性、B細胞はCD45陽性かつB220陽性、マクロファージはCD45陽性かつCD11b陽性かつCD11c陽性かつF4/80陽性の集団として検出した。各免疫細胞におけるRhodamine陽性細胞をCHPナノゲル取り込み細胞として検出した。

２．結果
図３(B)に示したように、本発明の前処置薬は、皮下投与又は静脈内投与のいずれにおいても、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性のCMS5a腫瘍に対して同様の治療効果を示した。前処置薬の作用機序を解明するため、CMS5a腫瘍を皮下移植したBALB/cマウスに皮下投与又は静脈内投与されたRhodamine標識CHPナノゲルのリンパ節及び腫瘍局所に存在する免疫細胞への取り込みを測定した。図５に示すように、皮下投与されたCHPナノゲルは、投与部位所属リンパ節のマクロファージに良く取り込まれた。一方、静脈内投与されたCHPナノゲルは、腫瘍局所のマクロファージに良く取り込まれた。その他の免疫細胞への取り込みは認められなかった。リンパ節又は腫瘍局所のマクロファージが、CHPナノゲルにより送達された長鎖ペプチド抗原を取り込み、輸注された抗原特異的T細胞へ提示することで、抗原特異的T細胞の活性を増強していると考えられた。CHPナノゲルが静脈内投与された場合には、腫瘍局所のマクロファージに選択的に物質輸送する能力があることが明らかとなった。

＜実施例５＞
１．材料と方法
ウシ胎児血清（FBS）はバイオウェストから購入した。RPMI1640培地（2-メルカプトエタノール添加）は細胞科学研究所から購入した。赤血球溶血溶液（0.15M NH₄Cl/10mM KHCO₃/0.1mM EDTA.Na₂ pH 7.2）は三重大学で作製した。マウス線維肉腫CMS5a細胞株はメモリアルスローンケタリングがん研究所より分譲され、三重大学で継代したものを用いた。雌性BALB/cマウスは6週齢〜12週齢のものを日本SLCから購入した。変異型ERK2特異的TCR遺伝子導入マウス（DUC18マウス）はワシントン大学より分譲され、三重大学で繁殖させたものを用いた。各マウスは、三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールは、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。
T75培養フラスコ（コーニング）を用い、マウス線維肉腫CMS5a細胞株を10%FBS含有RPMI1640培地中で培養した。培養した細胞を0.5%トリプシン含有リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて剥離し、10%FBS含有RPMI1640培地に懸濁した。遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除き、RPMI1640培地を用いて2回洗浄した。細胞を1×10⁶個/100μLの濃度でRPMI1640培地に懸濁し、100μL/個体の用量でBALB/cマウスの後背部に皮下移植した（1群当たり5匹）。腫瘍移植7日後に、実施例３と同様にして調製した長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル（MENペプチドとして60μg、PBSに溶解）とCpGオリゴDNA1668（50μg、PBSに溶解、ジーンデザイン）を混合して尾静脈内投与した。18時間後に、投与マウスの腫瘍、肺、肝臓、脾臓及びリンパ節から抗原提示細胞を次に示す方法で分離した。
腫瘍はミルテニー製の分離キット（Tumor Dissociation Kit（型番130-096-730））を、肺はミルテニー製の分離キット（Lung Dissociation Kit（型番130-095-927））を、肝臓はミルテニー製の分離キット（Liver Dissociation Kit（型番130-105-807）））を、それぞれ用いて、メーカー推奨プロトコルに従って処理した後、遊離した細胞をRPMI1640培地中に懸濁した。

このとき、1群5匹分の細胞をプールした。遠心分離（400×g、5分、4℃）後に上清を除去し、2mLの赤血球溶血溶液を加えて細胞を1分間処理した。18mLのRPMI1640培地を加え、遠心分離（400×g、5分、4℃）した。上清を除き、細胞をRPMI1640培地に懸濁した。脾臓及び鼠径リンパ節はスライドガラスを用いて磨砕した後、遊離した細胞をRPMI1640培地中に回収した。このとき、1群5匹分の細胞をプールした。遠心分離（400×g、5分、4℃）後に上清を除去し、2mLの赤血球溶血溶液を加えて細胞を1分間処理した。18mLのRPMI1640培地を加え、遠心分離（400×g、5分、4℃）した。上清を除き、細胞をRPMI1640培地に懸濁した（一次細胞懸濁液）。各組織から調製した一次細胞懸濁液を遠心分離（400×g、5分、4℃）した後に上清を除去し、2%FBS含有PBSを用いて2回洗浄し、2%FBS含有PBSに懸濁して二次細胞懸濁液とした。二次細胞懸濁液から、CD11bマイクロビーズ（ミルテニー）を用いてCD11b陽性細胞を単離し、各組織由来の抗原提示細胞とした。一方、DUC18マウスの脾臓より、実施例３と同様にして、CD8陽性T細胞を単離した。その後、蛍光色素のCFSE（サーモフィッシャーサイエンス）を用いて標識してレスポンダーT細胞とした。抗原提示細胞及びレスポンダーT細胞を96穴V底マイクロプレート（ヌンク）に1ウェルあたり、それぞれ2.5×10⁵個及び2×10⁵個の細胞数で添加し、10%FBS含有RPMI1640培地中で72時間にわたり共培養した。レスポンダーT細胞が抗原提示を受けて増殖すると、細胞分裂に伴いCFSE由来の蛍光が減弱する。その変化をフローサイトメーターFACS Canto II（BDバイオサイエンス）及びデータ解析ソフトウェアFlowJo（ツリースター）を用いて測定した。全レスポンダーT細胞の内で、2回以上分裂したレスポンダーT細胞の割合を算出し、各組織由来の抗原提示細胞の抗原提示能を評価した。

２．結果
実施例４において、静脈内投与されたCHPナノゲルは腫瘍局所のマクロファージに選択的に取り込まれることが明らかとなった。静脈内投与された長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲルは腫瘍局所のマクロファージに取り込まれた後に、輸注された抗原特異的T細胞に提示され、抗原特異的T細胞の活性を増強していると考えられた。腫瘍局所マクロファージによる抗原提示反応を確認するために、次の実験を行った。変異型ERK2のCD8陽性T細胞認識エピトープを含む長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを静脈内投与したCMS5a腫瘍皮下移植BALB/cマウスから、腫瘍並びに種々の組織に局在するCD11b陽性マクロファージを回収した。これを抗原提示細胞として、変異型ERK2特異的TCR遺伝子導入マウス由来CD8陽性T細胞と試験管内で共培養した。投与された長鎖ペプチド抗原に含まれる変異型ERK2由来CD8陽性T細胞認識エピトープをCD11b陽性マクロファージが提示していれば、変異型ERK2特異的TCR遺伝子導入マウス由来CD8陽性T細胞は活性化して増殖する。T細胞の増殖は、フローサイトメトリーを用いたCFSE希釈試験により測定し、抗原提示の指標とした。
図６に示すように、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを静脈内投与すると、腫瘍局所マクロファージによる長鎖ペプチド抗原の提示が確認された。リンパ節由来のマクロファージは、弱いながらも長鎖ペプチド抗原の提示が認められた。その他の組織のマクロファージでは長鎖ペプチド抗原の提示が検出されなかった。これらのマクロファージは、長鎖ペプチド抗原搭載CHPナノゲル及びCpGオリゴDNAを取り込んでいないか、取り込んでいても抗原提示する能力を欠いている可能性があると考えられた。これらの結果から、CHPナノゲルは、静脈内投与された場合には、腫瘍局所のマクロファージに選択的に物質輸送、特に抗原を輸送し、抗原提示させる能力があることが明らかとなった。

上記作用機序は、ヒト以外に、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物においても同様であると考えられた。本発明による組成物は、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等に対して同等の効果があると考えられた。
本実施形態によれば、免疫チェックポイント阻害剤の標的分子を発現しておらず同阻害剤に抵抗性を示す腫瘍について、治療に有用な医薬品を提供できた。このデリバリーシステムである疎水化多糖ナノゲルと合成長鎖ペプチド抗原又は組換え蛋白質抗原を含む抗原搭載ナノゲル及び免疫増強剤を前処置薬として用いることで、抗原特異的T細胞輸注の抗がん作用を増強する効果を得られた。

Claims

免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するT細胞輸注療法において、抗原に特異的なT細胞の投与する前に投与される医薬組成物であって、前記抗原に由来するCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ及びCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ、又はCD8陽性細胞傷害性T細胞認識エピトープ及びCD4陽性ヘルパーT細胞認識エピトープを含む長鎖ペプチド抗原又は蛋白質抗原を疎水化多糖ナノゲルに搭載した抗原搭載ナノゲルと、免疫増強剤とを含有する医薬組成物であって、
前記疎水化多糖がプルラン及びコレステリル基を含み、前記免疫増強剤が、TLR（Toll様受容体）アゴニスト（CpGオリゴDNA又はPoly-IC RNA）、STINGアゴニスト又はRLR(RIG-I様受容体)アゴニストからなる群から選択される少なくとも一つである医薬組成物。
免疫チェックポイント阻害剤抵抗性腫瘍に対するT細胞輸注療法において、請求項１に記載の医薬組成物と、当該医薬組成物を投与した後に投与するための前記抗原に特異的なT細胞とを含む医薬組成物。
前記抗原に特異的なT細胞が、前記抗原を認識するT細胞受容体又はキメラ抗原受容体を発現するT細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
前記長鎖ペプチド抗原が23〜120個のアミノ酸から成る請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
長鎖ペプチド抗原に含まれるT細胞認識エピトープの間に、2〜10個のチロシン、2〜10個のスレオニン、2〜10個のヒスチジン、2〜10個のグルタミン及び2〜10個のアスパラギンから成る群から選択される配列を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
前記抗原が腫瘍特異的抗原蛋白質又は腫瘍間質特異的抗原蛋白質である請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
前記抗原搭載ナノゲルの投与経路が、皮下、皮内、筋肉内、腫瘍内及び静脈内からなる群から選択される少なくとも一つの経路によって投与される請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
前記抗原搭載ナノゲルが、前記抗原に特異的なT細胞を含む医薬組成物の投与の少なくとも１日前に投与される請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。