CN108473956B - 增强外源性施用t细胞的体内持久性和功效的方法、基因修饰的t细胞和方法以及使用方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种增强T细胞的体外和体内寿命的方法。提供一种增强T细胞寿命的方法。所述方法包括工程改造T细胞以表达外源性核糖核酸(RNA)，其中所述RNA包括编码端粒酶逆转录酶(TERT)的核酸。提供经基因工程改造以瞬时表达包括TERT的编码序列的外源性RNA的T细胞(TERT T细胞)。与不由外源性引入的核苷酸表达TERT的T细胞相比时，TERT T细胞具有以下特征中的一种或多种：增强的体外和体内增殖，减少的衰老细胞数量，和增强的体内抗癌活性。修饰的TERT T细胞可以用于过继性细胞转移以治疗有需要的受试者。
Description
发明领域
本发明大体上属于过继性细胞疗法领域，并且涉及用于增强外源性施用的T细胞的体内持久性和功效的方法。
发明背景
近来，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞免疫疗法作为有希望的治疗肿瘤的方法出现(Cheadle，Methods Mol Biol，907：645-666(2012)；Restifo，Nat Rev Immunol，12：269-281(2012))，并且这种治疗策略已经显示出超出传统T细胞免疫疗法的显著优点。CAR在T淋巴细胞中的表达赋予识别特异性肿瘤抗原的能力(Jensen等人，Curr Opin Immunol，33：9-15(2015))。此外，CAR以不依赖于HLA(人类白细胞抗原)的方式将T细胞特异性重定向，从而消除了考虑HLA限制的需要并且克服了一些肿瘤逃逸机制(Ramos等人，Expert Opin BiolTher，11：855-873(2011))。重要的是，几个最近的临床试验已经显示出靶向CD(分化簇)19抗原的CAR-T细胞有效地诱导了患有急性或慢性成淋巴细胞性白血病的患者的完全缓解[Grupp等人，New Engl J Med，368：1509-1518(2013)；Maude等人，New Engl JMed，371：1507-1517(2014)；Porter等人，New Engl J Med，365：725-733(2011)]，这表明CAR-T细胞免疫疗法在消除癌细胞中的潜力。
目前的CAR-T细胞免疫疗法的一个主要问题是T淋巴细胞具有有限的复制寿命[Brentjens等人，Blood，118：4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood，119：2709-2720(2012)]，其可能影响CAR-T细胞免疫疗法的长期抗肿瘤效力。与大多数体细胞人类细胞类似，T淋巴细胞具有有限的复制寿命，称为复制性衰老[Effros等人Immunol Today，18：450-454(1997)；Zhou等人，J Immunol.，175：7046-7052(2005)]。先前的研究已经显示出过继性T细胞转移的治疗功效与T细胞在体内增殖和存活的能力相关[Milone等人，Mol Ther，17：1453-1464(2009)；Robbins等人，J Immunol.，173：7125-7130(2004)]。具有最小分化(未衰老的)和未耗竭的T细胞具有最高的抗肿瘤活性，这是因为T细胞中的复制性衰老导致增殖能力的缺失和伴有后续物理删除的功能障碍[Shen等人，J Immunother.，30：123-129(2007)；Rubtsova等人，Acta Naturae，4：44-61(2012)]。在涉及调节T细胞寿命的各种因素中，端粒是与T细胞衰老直接相关的主要因素[Migliaccio等人，The Journal ofImmunology，165：4978-4984(2000)；Rufer等人，Blood，98：597-603(2001)]。在包括T细胞的大多数人类细胞类型中，随着每次细胞分裂，端粒丢失了非编码重复DNA的一部分，并且这种端粒DNA的缩短是在多轮细胞分裂后导致细胞衰老的主要机制[Rufer等人，Blood，98：597-603(2001)]。先前的研究试图通过主要使用TERT的组成型过表达的端粒酶逆转录酶(TERT)过表达来增强T细胞寿命[Rufer等人，Blood，98：597-603(2001)；Bennaceur等人，Atherosclerosis，236：312-320(2014)；Verra等人，Cancer Res.，64：2153-2161(2004)]。然而，TERT转基因的基因组整合和组成型表达导致染色体不稳定性[Zhou等人，JImmunol.，175：7046-7052(2005)；Bennaceur，Atherosclerosis，236：312-320(2014)；Verra等人，Cancer Res.，64：2153-2161(2004)；Barsov等人，Immunotherapy，3：407-421(2011)]，这在临床应用中引起安全性问题。
需要一种扩大用于过继性细胞疗法的T细胞寿命的方法，其对于临床应用是安全的方法。
本发明的一个目的是提供用于使用的具有增加的体外寿命的T细胞。
本发明的另一个目的是提供一种增加T细胞的体外寿命和倍增时间的方法。
本发明的又一个目的是提供治疗癌症患者的方法。
发明概述
提供一种增强可用于过继性细胞转移(ACT)的T细胞的寿命的方法。提供一种增强T细胞寿命的方法。所述方法包括工程改造T细胞以表达外源性核糖核酸(RNA)，其中所述RNA包含编码TERT的核酸。外源性RNA包括帽、5’和3”非翻译区、TERT的编码序列和多聚A尾。在优选的实施方案中，外源性RNA包括修饰的核苷酸(包括假尿苷和5-甲基胞苷)，在本文中是TERT修饰的mRNA(mmRNA)。
提供经基因工程改造以瞬时表达包括TERT的编码序列的外源性RNA的T细胞(TERTT细胞)。在优选的实施方案中，T细胞是TERT，在本文中是TERT CAR-T细胞。与不表达TERT修饰的mRNA(mmRNA)的T细胞相比时，TERT T细胞具有以下特征中的一种或多种：增强的体外和体内增殖，减少的衰老细胞数量，和增强的体内抗癌活性。
本发明还提供了治疗癌症患者的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的瞬时表达TERT的T细胞。
附图简述
图1A是pRRL-EF1A-19CAR3的示意图。该载体用EF1α启动子修饰，并且抗-CD19 CAR包含FMC63-ScFv、人CD28的胞外、跨膜和胞内结构域的部分、41-BB的活化结构域和CD3ζ的胞质信号传导结构域。图1B和图1C显示了CD19 CAR慢病毒载体的转染效率在感染后72小时使用流式细胞术证实。用生物素标记的多克隆山羊抗小鼠-F(ab’)2抗体对T细胞进行染色以检测抗-CD19CAR，并且用生物素标记的正常多克隆山羊IgG抗体作为同种型(isotype)对照对另一份T细胞样品进行染色。图1D显示了说明转染后72小时在修饰的T细胞中的CD19CAR表达的蛋白质印迹(Western blot)。蛋白质印迹结果来自用抗-CD3-zata mAb探测的整体T细胞裂解物。未修饰的T细胞系和CD19 CAR修饰的T细胞克隆显示出与野生型CD3-ζ链一致的21-kDa条带。图1E体外培养2周后的CD19CAR T细胞的表面分子标记物。图1F和图1G显示了使用ELISA检测在与CD19+肿瘤细胞共培养后由CD19CAR-T细胞分泌的细胞因子。在不含rhIL-2的新鲜培养基中以1∶1、10∶1和25∶1的E∶T比将CD19 CAR T细胞与CD19+Raji肿瘤细胞或CD19-K562肿瘤细胞共培养4小时，并且随后收集这些培养物的上清，离心并通过ELISA检测。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±SD。*P＜0.05，***P＜0.001。图1H和1I CD19CAR-T细胞显示出CD19+肿瘤细胞的特异性肿瘤杀伤能力。Raji细胞是CD19+人伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤细胞，并且K562细胞是CD19-人淋巴瘤细胞。以1∶1、10∶1和25∶1的E∶T比将靶细胞与CD19 CAR-特异性CD8+T细胞温育，并且在共培养4小时后，使用流式细胞术CTL测定对CD19CAR-T细胞的细胞毒性进行检测。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±SD。*P＜0.05，***P＜0.001。
图2A显示了在NPG/Vst小鼠中Fluc+Raji细胞的生物发光信号的纵向监测。y-轴表示光子通量(p/s/cm2/sr)。图2B显示了用不同T细胞处理后接种有Raji肿瘤细胞的NPG/Vst小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线。使用对数秩检验比较所示CAR+T细胞组的存活曲线。与GFP-T组相比，CAR-T组显示出显著增加的中值存活率(对数秩检验，P＜0.01)。图2C和图2D显示了CAR修饰的T细胞在体内的持久性和增殖。使用qPCR和流式细胞术(FCM)检测每周T细胞注射后的接种Raji的NPG/Vst小鼠的血液中的CAR-T细胞。每周从每只小鼠的眼眶静脉丛中抽取总计100μl的静脉血，并且使用FACS溶解液将50μl的静脉血裂解。使用CD19 CAR特异性单克隆抗体和流式细胞术检测CD19 CAR T细胞。将另一份50μl的静脉血用于使用qPCR检测每微克基因组DNA的CAR拷贝数。
图3A是修饰的mRNA的示意图，所述mRNA包含TERT的全长功能形式或TERT的CI形式的编码序列，其两侧为HBB UTR和151nt多聚A尾，使用修饰的核苷酸假尿苷和5-甲基胞苷合成。图3B显示了在转染后24小时使用流式细胞术测量的用编码GFP的修饰的mRNA处理的T细胞的转染效率超过93.61％，并且在48小时后62.6％的细胞为GFP阳性，而在72小时后仅剩10％。图3C和3D显示了使用RT-PCR和RT-qPCR测量的hTERT mRNA的水平。用相同浓度的外源性TERT mRNA或CI TERT mRNA处理CAR-T细胞导致相似量的mRNA的内化。图3E显示了在修饰的TERT mRNA递送后端粒长度得以延长。每24小时用2.0μg的TERT mRNA或CI TERT mRNA处理T细胞三次。在7-10天收集细胞用于端粒长度测量，并且将重复物用于生长曲线测量，并且在一些情况下，在稍后的时间点进行另外的处理。*P＜0.05，***P＜0.001。
图4A显示了从PD 13开始以24小时间隔连续三次用TERT mRN、CI TERT mRNA转染的CD19 CAR T细胞的生长曲线，并且与未处理的CAR T细胞相比，用一式三份地培养的每个群体重复两次。*P＜0.05，***P＜0.001。图4B显示了使用流式细胞术进行的细胞周期分析(TERT mRNA组、CI TERT mRNA组、GFP-T组或CAR-T组)。图4C显示了每个T细胞系的总S期的百分比。总S期的百分比表示T细胞的增殖。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±s.d.。*P＜0.05，***P＜0.001。图4D显示了在以24小时的间隔连续三次进行修饰的TERTmRNA转染后，表达衰老标记物的T细胞的定量。在显微镜图像中，β-gal阳性T细胞显示为灰绿色。在β-gal染色之前，使用离心收集T细胞，用PBS洗涤并重悬。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±s.d.。*P＜0.05，***P＜0.001
图5A-5C显示了在以不同E/T比(1∶1、10∶1、25∶1)与CD19+肿瘤细胞共培养后通过ELISA检测的向CD19 CAR修饰的T细胞递送TERT mRNA的细胞因子释放，并且检测四种类型的细胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α)。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±s.d.。*P＜0.05，***P＜0.001。图5D显示了通过流式细胞术向CDl9CAR-修饰的T细胞递送TERT mRNA的CD19特异性CTL。Raji细胞是CD19+人伯基特淋巴瘤细胞，并且K562细胞是CD19-人淋巴瘤细胞。图5E-5F显示了共培养4小时后测定的细胞溶解活性。数据表示为来自3次独立实验的结果的平均值±s.d.。*P＜0.05，***P＜0.001。
图6A是体内研究的图解，显示了弥散性人B细胞恶性肿瘤异种NPG/Vst小鼠模型中的转导的T细胞的抗肿瘤活性(GFP-T：n＝6，CAR-T：n＝6，CI-CAR-T：n＝6，TERT-CAR-T：n＝6)。图6B是生物发光信号(以p/s/cm2/sr表示的相对Fluc活性)总结，其作为肿瘤细胞输注后肿瘤生长的量度。y-轴表示光子通量(p/s/cm2/sr)。图6C显示了接受TERT mRNA递送CART细胞处理、CI TERT mRNA(CI)递送CAR T细胞处理、未处理的CAR-T细胞处理或GFP-T细胞处理的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。使用对数秩检验比较所示TERT mRNA递送CAR+T细胞组的生存曲线，其与CAR-T组相比显示出显著着增加的中值存活率(对数秩检验，P＜0.01)。图6D和图6E显示了CAR-T细胞在体内的持久性和增殖。使用qPCR和流式细胞术，每周在T细胞注射后对接种Raji的NPG/Vst小鼠的血液中的CAR-T细胞进行检测。
图7A-7B显示了对总体TERT-CD19-CAR-T(未处理的T细胞：n＝8，TERT-CD19-CAR-T：n＝8)进行的核型分析的结果。图7C显示了在TERT mRNA递送后7和14天，通过RT-qPCR相对于GAPDH检测癌基因C-MYC、BMI1和H-RAS的表达。未处理的T细胞(UN)作为对照进行检测。图7D显示了皮下注射到裸鼠中的TERT-CD19-CAR-T细胞的结果，并且皮下注射人伯基特淋巴瘤Raji细胞作为阳性对照。移植Raji细胞后形成的实体瘤，并且这些小鼠保持存活不超过30天，并且TERT-CD19-CAR-T细胞组中的小鼠全部处于良好状态。
发明详述
I.定义
术语“过继性细胞疗法”和“过继性细胞转移”是指将与患者癌症反应的T细胞转移回患者。所述T细胞优选从患者获得并且使用所公开的方法进行基因工程改造以针对癌症具有反应性。
术语“癌症”是指展现出不受控制的生长、侵入邻近组织并经常转移至身体其它部位的细胞。癌症可以是肉瘤、淋巴瘤、白血病、癌瘤(carcinoma)、胚细胞瘤或生殖细胞瘤。癌症可以是重要器官(诸如胰腺、肝、肺和肠)的上皮癌(癌瘤)。
如本文所使用的“编码序列”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括能够指导向其施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中的表达的启动子和聚腺苷酸化信号/尾。
如本文所使用的“5’帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)”是指在转录开始后不久已被添加到真核生物信使RNA的“前部”或5’端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。
“开放阅读框”或“ORF”在本文中用来指含有能够潜在地编码多肽或蛋白质的碱基序列的一系列核苷酸。开放阅读框位于起始密码子序列(起始密码子或起始密码子)和终止密码子序列(终止密码子)之间。
“聚腺苷酸化”在本文中用来指聚腺苷酰部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。
“T7启动子位点”在本文中用来指T7RNA聚合酶、最初分离自T7噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶(由Davanloo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：2035-39(1984)描述)以高特异性与其结合的核苷酸序列，如Chamberlin等人，Nature，228：227-231(1970)所描述的。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”可互换地使用以指代作为施用或处理目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类或兽医患者。
术语“药学上可接受的”是指这样的那些化合物、材料、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适合用于接触人类和动物的组织，且没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
“T细胞”在本文中用来指由胸腺(由此得到T细胞中的“T”)产生或加工的一类淋巴细胞。
术语“治疗有效的”是指对改善疾病或病症的一种或多种原因或症状(例如癌症生长或转移)是足够量的组合物(例如工程改造的T细胞)的量。这种改善仅需要减少或改变，而不一定是消除。
术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症的一种或多种症状的患者的医学管理。该术语包括特异性针对改善疾病、病理状况或病症的积极治疗，以及作为针对去除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗的病因治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即经设计用来缓解一种或多种症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即涉及最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症发展的治疗；以及支持性治疗，即用于补充针对改善相关疾病、病理状况或病症的另一种特定疗法的治疗。
“瞬时”在本文中用来指外源性导入细胞的核酸的表达和/或持久性达几小时、几天或几周的时间段，其中表达/持久性的时间段小于基因如若整合到基因组中的表达的时间段。
II.组合物
提供包括经基因工程改造以瞬时表达包括TERT的编码序列的外源性RNA的T细胞(TERT T细胞)的组合物。优选的组合物包括TERT CAR-T细胞。CAR T细胞识别肿瘤抗原，并且包括具有帽、5’和3非翻译区、TERT的编码序列和多聚A尾的外源性RNA(图3A)。
更优选地，T细胞不包括由整合到宿主基因组中的转基因表达的TERT。原则上，与DNA转染不同，引入mRNA能够对细胞的遗传结构不造成永久影响。与不由外源性引入的核苷酸表达TERT的T细胞相比时，TERT T细胞具有以下特征中的一种或多种：增强的体外和体内增殖速率，减少的衰老细胞数量，增加的端粒长度，和增强的体内抗癌活性。增强的增殖速率可以通过以下测量：确定在相同条件下培养相同时间段的TERT T细胞和不表达外源性引入的TERT mmRNA的T细胞的群体倍增数(PD)、S期中的细胞数量或细胞百分比。增强的体内抗癌活性可以通过在体内施用相同量的TERT T细胞和不表达外源性引入的TERT的T细胞之后在相同时间长度下杀死癌细胞的能力和/或缩小肿瘤或增加存活的能力来测量。
例如，如实施例中所示，在体外培养后确定的体外培养后，TERT T细胞的PD比使用不表达外源性引入的TERT mmRNA的T细胞所观察到的水平增加50-75％；至少由于PD增加而导致的细胞数量的百分比增加为800至1000；在整个体外培养过期间，S期的T细胞水平不断增加约0.5％至约20％。体内递送的TERT T细胞显示出增加的抗癌活性，如测定在施用至癌症动物模型后存活率的增加。肿瘤动物模型是本领域中已知的。Donnou等人，Adv.Hematol等人，Volume 2012，文章ID 701704，13页(2012)。示例性的动物模型是植入有CD19+Raji细胞的小鼠模型。如上所述，TERT T细胞显示出增加的抗癌活性，以百分比表示在约67％至约70％范围内，如通过对动物模型的存活百分比的增加所测量的)。
A.T细胞
发现T细胞(也称为T淋巴细胞)广泛分布在组织和肿瘤环境中。它们在细胞介导的免疫中发挥核心作用，并且可以介导长效的抗原特异性效应子和免疫记忆应答。T细胞与其它淋巴细胞的区别在于细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。TCR是介导T细胞的抗原特异性活化的多亚基跨膜复合物。通过识别包含由主要组织相容性复合物分子在靶细胞上呈递的蛋白质的短连续氨基酸序列的抗原配体，TCR赋予T细胞上的抗原特异性。T细胞可以是用于T细胞疗法的任何T细胞。这些细胞包括，但不限于，天然杀伤细胞疗法、调节性T细胞、树突细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因修饰的T细胞免疫疗法。T细胞的抗原特异性可以通过基因修饰来操纵，并且重定向到成功靶向由肿瘤表达的抗原。T细胞可以被工程改造以表达修饰的TCR(所谓的TCR疗法)或者具有增强的抗原特异性的蛋白-融合-衍生的嵌合抗原受体(CAR)。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
TILS是罕见的肿瘤抗原特异性T细胞的群体，并且尤其可以在肿瘤部位分离出来，并且这些TIL被称为肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。TIL可以从切除的肿瘤组织中分离出来，培养，活化并离体扩增，并且在对于再输注，其在临床上(特别是黑素瘤的治疗上)显示出有前景的功效。综述于Sharpe等人，Dis.Model.Mech.，8(4)：337-350(2015)。
基因修饰的TCR疗法
基因修饰的TCR疗法基于通过表达特异性TCRα和β链(其介导抗原识别过程)来改变T细胞特异性。鉴定肿瘤特异性TCRα和β链，将其分离并克隆到转导载体中，并且T细胞的转导产生了肿瘤抗原特异性T细胞。为了产生成功的肿瘤特异性TCR，需要鉴定合适的靶序列。这可能从罕见的肿瘤反应性T细胞中分离出来，或者在这种作法是不可能的情况下，可以采用替代技术来产生高活性的抗肿瘤T细胞抗原。一种方法是用人类肿瘤蛋白质免疫表达人类白细胞抗原系统的转基因小鼠，以产生表达针对人类抗原的TCR的T细胞。备选的方法是同种异体TCR基因转移，其中肿瘤特异性T细胞从经历肿瘤缓解的患者中分离出来，并且反应性TCR序列转移到来自另一患者(该患者也患有该疾病但是未响应)的T细胞中。最后，可以采用体外技术来改变TCR的序列，通过增加弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原的相互作用强度(亲和力)来增强它们的肿瘤杀伤活性[Sharpe等人，Dis.Model.Mech.，8(4)：337-350(2015)]。
CAR T细胞
CAR将抗体样识别与T细胞活化功能结合起来。它们由通常来源于抗体的抗原结合区、将CAR锚定到T细胞的跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(所述信号传导结构域诱导转导的T细胞中的持久性、运输和效应功能)组成。用于限定CAR的抗原靶向基序的序列通常来源于单克隆抗体，但是也可以使用配体和其它受体。表达CAR的T细胞(CAR T细胞)识别各种类型的抗原，不仅包括蛋白质，而且还包括通常在肿瘤的细胞表面上表达的碳水化合物和糖脂结构。与TCR识别不同，抗原不需要通过MHC进行加工和呈递，并且因此可以在表达相同肿瘤的所有患者中使用相同的基于CAR的方法，不管HLA类型如何。[Sharpe等人，Dis.Model.Mech.，8(4)：337-350(2015)]。
肿瘤抗原
T细胞上的嵌合T细胞受体识别肿瘤抗原。取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可以被工程改造以包括对所需抗原靶标具有特异性的适当的抗原结合部分。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则可以使用本领域已知的方法将CD19的抗体用作抗原结合部分以并入CAR中。
肿瘤抗原是由引起免疫应答(特别是T细胞介导的免疫应答)的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗的特定类型的癌症。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并且包括例如胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、MUC-16ecto(Koneru等人，J.Transl.Med.，13：102(2015)、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、肾细胞癌相关抗原RAGE-1、碳酸酐酶同工酶IX(MN/CA IX)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、NY-ESO-1(其为癌症-睾丸抗原(也称为癌症生殖细胞抗原))、LAGE-la Rapoport等人，Nature Med，21：914-921(2015)、p53、prostein、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、人内源性逆转录病毒-K(HERV-K)包膜(env)蛋白、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、黑素瘤相关抗原(MAGE)、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白(ephrin)B2和CD22。在一个实施方案中，肿瘤抗原包含一个或多个与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可以充当免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，诸如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的PAP和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子组，例如癌基因HER-2/Neu ErbB-2。另一组靶抗原是肿瘤-胚胎性抗原，诸如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了对于个体肿瘤独特的真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原。B细胞分化抗原(诸如CD I 9、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。CAR转导的T细胞用于黑素瘤疗法的一些靶标包括在50-80％的转移性黑素瘤中过表达的神经节苷脂GD2、GD3以及在＞90的黑素瘤中特异性表达的蛋白聚糖MCSP-1(HMW-MAA)(Erfurt等人，Int J Cancer，124(10)：2341-6(2009)。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，诸如MART-1/MelanA(MART-1)、gl OO(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2，和肿瘤特异性多谱系抗，诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过表达的胚胎抗原，诸如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位造成的独特肿瘤抗原；诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如艾巴(Epstein Barr)病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。
在一些优选的实施方案中，CAR的抗原结合部分靶向包括但不限于以下的抗原：CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素(Mesothelin)、CD33/1L3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR和MAGE A3 TCR。
对肿瘤抗原具有特异性的CAR T细胞是本领域中已知的，例如Koneru等人，JTransl Med.13：102(2015)。
B.修饰的TERT mRNA
修饰合成的mRNA中的最新进展大大降低了由mRNA递送触发的细胞先天性免疫应答[Zangi等人，Nat Biotechnol.，31：898-907(2013)]，从而促进了mRNA递送在异位基因表达中的应用。在一些实施方案中，TERT编码序列是野生型人TERT ORF(开放阅读框)，其用于产生用于mRNA合成的DNA模板(NCBI人TERT转录变体1(索引序列NM_198253.2))。然而，TERTORF可以从pBABE-neo-hTERT质粒(Addgene，1774)获得。
5’帽
5’帽也为RNA分子提供了稳定性。在优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5’帽。
5’帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于经由核糖体识别和免受核糖核酸酶影响是至关重要的。帽添加与转录相关联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。转录开始后不久，正在合成的mRNA的5’端结合与RNA聚合酶缔合的帽合成复合物。该酶促复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。
5’帽可以是例如m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G或G(5’)ppp(5’)A帽类似物，其全部是可商购的。5’帽也可以是抗反向帽类似物(ARCA)(Stepinski等人，RNA，7：1468-95(2001))或任何其它合适的类似物。使用本领域已知的和本文中描述的技术提供5’帽(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.，29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA，7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.，330：958-966(2005))。
5’和3’非翻译区
也可以使用非翻译区(UTR)，其是具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5’和3’UTR。5’和3’UTR可以是目的基因的天然存在的内源性5’和3’UTR。备选地，对于目的基因不是内源性的UTR序列可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加。对于目的基因不是内源性的UTR序列的使用可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以选择或设计3’UTR以基于本领域公知的UTR的性质来增加转录的RNA的稳定性。
在优选的实施方案中，5’和3’区是人β球蛋白基因(HBB)的5’UTR和3’UTR。然而，可以使用任何管家基因的5’和3’UTR。示例性的基因包括但不限于肌动蛋白(ACTB)、3-甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、微管蛋白基因、糖酵解酶基因和核糖体蛋白基因，由以下NCBI(国家生物技术信息中心)参考号表示，其包括另外的实例：NM_001101；NM_000034；NM_002046；NM_000291；NM_005566；NM_002954；NM_000981；NM_000975；NM_007363；NM_004309；NM_000994；NM_022551；和NM_007355。
UTR序列可以单独使用和/或与本领域技术人员已知的另一种或其它序列修饰组合使用。
多聚A(聚腺苷酸)尾
外源性mRNA包括多聚A尾。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3’端是聚腺苷酸化的。3’多聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用将腺嘌呤核苷酸的长序列(通常数百个)添加到前-mRNA中。在高等真核生物中，多聚(A)尾被添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。多聚(A)尾和与之结合的蛋白质有助于保护mRNA免受核酸外切酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但是另外也可以稍后在细胞质中发生。转录终止后，mRNA链通过与RNA聚合酶缔合的内切核酸酶复合物的作用被切割。切割位点通常以在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA为特征。在mRNA已经被切割后，将腺苷残基添加到切割位点处的游离3’端。
在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，多聚A为25至500个，例如25至400个、50至400个、50至300个，优选50至250个、60至250个。多聚(A)序列可以化学或酶促修饰以调节mRNA功能性，例如定位、稳定性或翻译效率。
将瞬时表达TERT的CAR T细胞提供于药学上可接受的载体中用于递送至患者或受试者，或者它们可以使用支架递送。例如，细胞可以悬浮在生理盐水中用于输注。基于支架的T细胞递送描述于例如Stephan等人，Nature Biotechnol.，33：97-101(2015)中。
III.制备和使用方法
选择的T细胞可以使用本领域已知的方法从合适的供体中分离出来[Watkins等人，J.Vis.Exp.(64)，e3952，doi：10.3791/3952(2012)；Sharpe等人，Dis.Model.Mech.，8(4)：337-350(2015)]。在优选实施方案中，供体是人类受试者。在其它实施方案中，供体可以是非人动物，例如家畜、农场动物或非人灵长类动物或动物园动物。具体的实例包括但不限于猫、狗、马、羊、牛、猴、驴和黑猩猩。
制造合成的RNA并将其引入选择的细胞的方法是本领域中已知的。合成的mRNA已经用于表达异位基因[Josephson等人，Drug Discov Today，19：388-399(2014)；Bernal等人，J Cardiovasc Transl Res.，6：956-968(2013)]。与使用DNA载体的组成型过表达相反，编码修饰的mRNA的基因不整合到基因组中，导致细胞中异位基因的瞬时表达[Bernal等人，J Cardiovasc Transl Res.，6：956-968(2013)]。此外，与必须转染到细胞核中以进行异位基因表达的DNA载体不同，mRNA仅需要转染到细胞质中以实现蛋白质表达。因此，该方法能够应用于广泛细胞类型(包括通常难以转染的细胞类型)中的异位基因表达。因此，该方法已被用于在多种细胞类型中表达不同的基因[Nat Biotechnol.，31：898-907(2013)；Hansson等人，Biol Chem，290：5661-5672(2015)；Warren等人，Cell Stem Cell，7：618-630(2010)；Ramunas等人，Faseb J.，29：1930-1939(2015)；Barrett等人，Hum Gene Ther，22：1575-1586(2011)]。
A.RNA递送至细胞
可以使用不同的方法将本文公开的外源性RNA引入靶细胞中，例如包括但不限于以下的可商购的方法：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，德国))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，MA)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，CO)、Multiporator(Eppendorf，Hamburg德国)、阳离子脂质体介导的使用脂转染的转染、聚合物包封、肽介导的转染、或基因枪粒子递送系统如“基因枪(gene gun)”(参见例如Nishikawa等人Hum Gene Ther.，12(8)：861-70(2001)。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的其它物理方法包括磷酸钙沉淀、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域中公知的。参见例如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)。
转导的T细胞使用标准培养方法进行扩增以提供用于治疗用途的足够量。
该方法的一个实施方案包括扩增转导的T细胞。汇集转导的T细胞并使其快速扩增。快速扩增使抗原特异性T细胞的数量在约6至10周的时间内增加至少约300倍(例如，300、400、500、600、700、800、900倍或更大倍数)。扩增可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来完成。例如，在饲养淋巴细胞以及白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)(优选IL-2)的存在下，可以使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激物可以包括约30ng/ml的小鼠单克隆抗-CD3抗体OKT3(可购自
Raritan，N.J.)。备选地，可以通过在T细胞生长因子(诸如300IU/ml的IL-2或IL-15，优选IL-2)的存在下用一种或多种癌症抗原(包括其抗原性部分(诸如表位)，或细胞)在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞，所述癌症抗原可以任选地由载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1：26-35(27L)或gp100：209-217(210M)。体外诱导的T细胞通过用脉冲在表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原进行再刺激来快速扩增。备选地，例如，T细胞可以用经照射的自体淋巴细胞或用经照射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞以及IL-2进行再刺激。
进行分离并在相关实施方案中如本文所公开的将外源性RNA递送至细胞后，可以使用本领域已知的方法在培养中扩增T细胞。例如在WO2012079000中公开了几种方法。
B.应用
所公开的含有T细胞的组合物可以用于通过过继性T细胞治疗来治疗受试者中的癌症。在本文公开的方法中使用的T细胞可以是自体的(来源于相同的个体，并且因此与宿主在遗传上相同)或异源的(来源于不同的个体，并且因此与宿主在遗传上不同)。T细胞可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。优选地，T细胞作为动脉内或静脉内输注施用，其优选持续约30至约60分钟。T细胞的腹膜内注射描述于例如Koneru等人，J TranslMed.13：102(2015)中。施用途径的其它实例包括腹膜内、鞘内和淋巴内。可以施用任何合适剂量的T细胞。有效量的细胞可以在104至1011个细胞的范围内。优选地，施用约1.0×1010个T细胞至约13.7×1010个T细胞，平均施用约5.0×1010个T细胞，特别是当癌症是黑素瘤时。备选地，施用约1.2×1010至约4.3×1010个T细胞。
在再输注之前，接受者的淋巴细胞耗竭优选消除调节性T细胞以及与转移的细胞竞争的正常内源性淋巴细胞以获得稳态的细胞因子。可以使用一种或多种药物进行部分淋巴耗竭，所述药物诸如但不限于环磷酰胺(clyclophosphamide)和fludaramine。包括向患者递送治疗有效量的细胞的再输注被输注到患者中。
可以被治疗的癌症包括未血管化的或尚未实质上血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可以包含非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或者可以包含实体瘤。用所公开的T细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌瘤和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病以及原粒细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)，慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病(Hodgkin’s disease)，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)(惰性和高度形式)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征(myeiodysplastic syndrome)、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤由形成它们的细胞类型而命名(诸如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤(诸如肉瘤和癌瘤)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如胶质瘤(诸如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤(pineaioma)、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)和脑转移)。
实施例
材料和方法
培养基
在包含以下的T细胞培养基中培养T细胞：X-VIVOTM 15培养基(Lonza，Basel，CH)，补充有5％胎牛血清(FBS)(Gibco，LAX，CA，USA)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1.25μg/mL两性霉素B、2mM L-谷氨酰胺(Gibco，CA，USA)和100U/mL hIL-2(PerproTech，RockyHill，USA)。以3珠/细胞使用CD3-和CD28-特异性磁珠(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)将T细胞活化。在包含以下的R10培养基中培养Raji和K562细胞：RoswellPark Memorial Institute(RPMI)1640(Hyclone，Logan，Utah，USA)，补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Gibco，CA，USA)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco，CA，USA)。在包含以下的D10培养基中培养293T细胞：Dulbecco改进的Eagle培养基(Hyclone，UT，USA)，补充有10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺。细胞毒性培养基含有补充有5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的无酚红RPMI。
抗-CD19 CAR慢病毒载体设计和产生
设计第三代抗-CD19 CAR重组慢病毒载体并将其称为pRRL-EF1A-19CAR3。它包括以下组分(从5’到3’)：VSVG慢病毒骨架、FMC63scFv、CD8分子的铰链和跨膜区、CD28和4-1BB的胞质部分、和CD3-ζ分子的胞质组分。该载体是使用多步策略桥接编码CD8、CD28、4-1BB和CD3-ζ组分的片段来构建的。载体骨架(pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE)是Didier Trono(Addgene plasmid，NO.12252，MA，USA)的赠品。该载体用插入BstXI和XbaI位点之间的EF1A启动子进行修饰。编码抗-CD19 CAR(FMC63)的FMC63-28Z从GenBank(NO.HM852952)获得。FMC63 ScFv的序列在OriGene Technologies(北京，中国)合成。抗-CD19 CAR包括ScFv、人CD28的跨膜和胞内结构域、41-BB的活化结构域和CD3ζ的胞质信号传导结构域。这些结构域使用超延伸PCR(over-extension PCR)连接并且经由XbaI位点克隆到骨架载体中。通过与EGFP荧光的相关性使用P2A双顺反子表达可以容易地检测CAR表达。新的慢病毒载体被命名为pRRL-EF1A-19CAR3。将编码GFP蛋白的质粒与CD28基因的一部分和CD3ζ分子的胞质部分的基因克隆到慢病毒载体中，以形成GFP-28Z质粒作为阴性对照。
CD19 CAR慢病毒制备
为了制备永久的慢病毒颗粒，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)，用pMD2.G质粒、psPAX质粒和载体质粒转染293T包装细胞。将转染的细胞在不含抗生素的D10培养基中在37℃温育6-8小时。随后将用于转染的培养基替换为新鲜的D10培养基，并且将细胞温育另外24-48小时。在转染期间和转染后，将293T细胞在10-cm培养皿中培养。收集含有慢病毒颗粒的上清，并将其通过45-μm过滤器过滤以除去细胞碎片。通过在4℃以20,000×g超速离心90分钟来浓缩上清。将病毒沉淀在4℃在PBS中重悬过夜。将新上清在干冰上快速冷冻并储存于-80℃。在10mg/ml凝聚胺(Sigma，St.Louis，MO，USA)的存在下以10-20的感染复数(MOI)感染活性人T细胞后对病毒滴度进行测量。
离体共同刺激和T细胞的大量增殖
通过Ficoll-Paque-Plus(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上的密度梯度离心分离人外周血单核细胞(PBMC)，并且使用浓度为3珠/细胞的CD3/28珠在含有100U/mLIL-2的5％FBS-X-VIVOTM 15培养基中在37℃和5％CO2下将其活化1-2天。共刺激1-2天后，PBMC中的T细胞被特异性活化。随后，将T细胞添加到用RetroNectin(Takara，Tokyo，Japan)预处理的培养瓶中，并且以10-20的MOI加载慢病毒抗-CD19 CAR载体。将细胞转染并且在10mg/mL聚凝胺的存在下在X-VIVO TM 15培养基中在37℃和5％CO2下培养24小时。将转染的T细胞在37℃和5％CO2下在新鲜培养基中培养并且在培养后14天收获。
流式细胞术
基因修饰的T细胞和肿瘤细胞系的细胞表面表型使用流式细胞术进行确定。与CD19 CAR或GFP慢病毒颗粒共培养72小时后收获总计105-106个T细胞，将其用补充有200μl的染色缓冲液的PBS洗涤，并且随后用异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的、藻红蛋白(PE)缀合的或TRITC缀合的对T细胞受体α/β(TCRαβ)、CD3、CD4、CD8具有特异性的mAb(BD Biosciences，San Jose，CA)进行处理。肿瘤细胞在用CD19特异性mAb(BD Biosciences，San Jose，CA)染色后被确定。使用生物素-SP-AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗-小鼠IgG(Jackson，Lancaster，PA，USA)和SAV-APC抗体BD Biosciences，San Jose，CA)来检测CD19-CAR。在冰上孵育30-60分钟后，将细胞洗涤两次并重悬于PBS中，随后在FACSCalibur流式细胞仪(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA)上进行分析。CellQuest软件(BDImmunocytometry Systems)被用于计算直方图的给定区域内的细胞百分比和平均荧光强度(MFI)。为了测量细胞周期时相，收集细胞，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，并且用70％冰冷的乙醇固定过夜。在分析之前，在核糖核酸酶(100μg/ml)的存在下将细胞用碘化丙啶(PI，50μg/ml)(Sigma，MO，USA)染色。不超过30分钟后，收获细胞并通过流式细胞术分析以检测细胞周期时相。
细胞因子产生
在5U/ml的rhIL-2的存在下，将含有106个基因修饰的CD8+T细胞的重复孔与用8000cGy照射的106个刺激细胞在2mL的培养基中共同温育72小时。收获无细胞上清，并且使用酶联免疫吸附测定(ELISA；R&D Systems，Minneapolis，MN)测定细胞因子含量，并且从标准曲线外推浓度。
蛋白质印迹
在用PBS将细胞洗涤一次后收获蛋白质，随后在RIPA缓冲液中将其裂解。将蛋白质在NuPAGE Novex Tris-乙酸盐凝胶上进行电泳，然后在35V下转移至PVDF膜达2小时，随后与抗-α微管蛋白(1∶1000)(Sigma，MO，USA)杂交和抗-CD3-ζ抗体(1∶1000或1∶500)(Abcam，Cambridge，UK)杂交，并且在4℃温育过夜。使用红外线(680nm和800nm)抗体(LI-COR)和奥德赛(Odyssey)成像仪(LI-COR)进行二次检测。使用ImageJ程序量化每个带的总强度。
流式细胞术CTL测定
作为靶细胞，将CD19+人淋巴瘤细胞系(Raji细胞)以1×106个细胞/ml悬浮于PBS+0.1％BSA中。将荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)以2.5μM的浓度添加到该细胞悬液中。将细胞在37℃温育10分钟。在温育后，在添加与细胞悬液相同体积的FBS后终止标记反应，并且将细胞在室温温育2分钟。将细胞洗涤并悬浮于细胞毒性培养基中。将效应T细胞洗涤并以5×106个细胞/mL悬浮于细胞毒性培养基中。在所有实验中，将用抗-CD19 CAR转导的效应T细胞的细胞毒性与阴性对照效应T细胞的细胞毒性进行比较。将CD19 CAR转导的效应T细胞和阴性对照效应T细胞一式两份地在96孔培养板中培养，T细胞∶靶细胞比率为25∶1、10∶1和1∶1。每个培养体系还含有CD19阴性K562细胞作为对照。在每个测试中使用总计104个CD19阳性靶细胞和104个CD19阴性对照细胞。将培养系统在37℃温育4小时。温育后立即加入50μg/ml PI(碘化丙啶)，并且流式细胞术使用BD FacsCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)进行。分析在CFSE阳性细胞上是门控的，并且确定每个T细胞和靶细胞培养物中活的靶细胞和活的CD19阴性对照细胞的百分比。对于每个T细胞和靶细胞培养物，CD19阳性靶细胞的校正的存活百分比通过以下确定：将每个T细胞和靶细胞培养物中活的CD19阴性细胞的百分数除以在仅含有CD19阳性靶细胞和CD19阴性对照细胞而不具有任何效应T细胞的管中CD19阳性靶细胞百分比：CD19阴性对照细胞百分比的比率。这种修正考虑了起始细胞数量和自发靶细胞死亡的变化。将细胞毒性计算为100％(CD19阳性靶细胞的校正的存活百分比)。对于所有的E：T比，一式两份地确定细胞毒性，并且将结果取平均值。将靶细胞的杀伤百分比确定为：比率＝CFSE+PI+靶细胞的百分比/CFSE+靶细胞的百分比×100％。
肿瘤的体内生物发光
将从VITALSTART获得的严重联合免疫缺陷NPG/Vst小鼠用作小鼠异种移植模型。NPG/Vst小鼠是NOD-Prkdcscid Il2rgnull家族的成员，并且已经在国际上公认为最高免疫缺陷小鼠模型和最合适的细胞移植工具。在6至12周龄时，将具有严重免疫缺陷NPG/Vst的雌性小鼠用表达萤火虫萤光素酶融合蛋白(Luc)的5×104个Raji人CD19+伯基特淋巴瘤细胞进行腹膜内接种。四天后，通过腹膜内注射向小鼠施用一剂CD19 CAR-T细胞或GFP转导的T细胞。仅使用在T细胞注射前具有相同肿瘤负荷(1.5±0.5×105个光子/秒)的小鼠。本研究排除肿瘤负荷较小或较大的小鼠。将保留在本研究中的荷瘤小鼠随机分为不同的治疗组(每组至少3只小鼠)。不使用盲法。T细胞剂量基于通过预注射CTL分析而测量的CAR+细胞的百分比。通过体内生物发光成像(IVIS 100成像系统)每周两次监测肿瘤负荷。LivingImage软件4.3.1版被用来获取和量化生物发光成像数据集。在每周IVIS生物发光成像之前，将小鼠用悬浮于200μl PBS中的150mg/kg D-荧光素(Xenogen，Jena，德国)通过腹膜内注射进行输注。十分钟后，在2％异氟烷麻醉下将小鼠成像。图像采集是在中等框并水平下在15或25cm的视野中进行的，曝光时间为0.5至3分钟。所有动物均获得背侧和腹侧视图两者。通过IVIS成像确定肿瘤体积。动物实验方案经北京大学生物医学研究伦理委员会批准，并且严格遵守美国生理学会的“研究和训练中护理和使用脊椎动物的指导原则”。
实时PCR和定量实时PCR
使用TRIzolTM试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)提取总mRNA。逆转录使用用于RT-PCR的Superscript III第一链合成超混合物(Invitrogen LifeTechnologies)进行，并且将RNA(0.1μg)反转录成cDNA。PCR用Taq聚合酶(Invitrogen LifeTechnologies)进行30次循环(变性：95℃，30秒；退火：58℃，30秒；延伸：72℃，30秒)。随后将PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行尺寸分级，用溴化乙锭染色并在紫外光下观察。使用各自的基于探针的TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)进行特定基因的定量PCR。使用ABI PRISM 7500序列检测系统(Applied Biosystems)一式两份地进行反应。使用DDCt方法以GAPDH作为内源性对照计算相对表达。治疗后，每周从小鼠眼眶静脉丛抽取50μl的静脉血到0.5ml K2EDTA抗凝离心管中(Beijing Emilion Science&Technology Co.，北京，中国)。使用QIAamp DNA Blood Midi试剂盒(Qiagen，Hilden，DIN)将基因组DNA直接从全血中分离出来，使用分光光度计定量，并储存于-80℃。使用100ng的基因组DNA、ABITaqman技术和经过验证的测定来批量进行基因组DNA样品的qPCR分析，以检测整合的CD19CAR转基因序列。确定通过/未通过参数范围，包括标准曲线斜率和r2值、参考样品的准确定量(1000个拷贝/质粒掺杂(spike))和不存在获得自健康小鼠的DNA样品的潜在扩增，并且将其用于限定预先确定的测定性能的可接受范围。如先前报道的[Kalos等人，ScienceTranslational Medicine，3：73r-95r(2011)]，设计CD19 CAR转基因的引物/探针。为了确定拷贝数/单位DNA，产生包含掺入100ng未转导的对照基因组DNA中的106至5个拷贝的慢病毒质粒的8点标准曲线。每个数据点(样品、标准曲线、参考样品)一式三份地进行评价，并且报告平均值。扩增反应产生了校正因子(CF)(检测到的ng/ng输入)。根据下式计算转基因拷贝数/微克DNA：从CD19标准曲线计算的拷贝数/输入DNA(ng)×CF×1000ng。与使用CAR特异性检测试剂通过流式细胞术的转基因阳性相比，该测定的准确性被确定为根据下式通过Q-PCR定量输注细胞产物的标记的能力：平均标记＝检测到的拷贝数/输入DNA× 6.3pg DNA/雄性体细胞×CF。
mRNA模板制备和合成
用于产生用于mRNA合成的DNA模板的人TERT开放阅读框(ORF)与NCBI人TERT转录变体1参考序列NM_198253.2相同，其通过pBABE-neo-hTERT质粒(Addgene质粒1774)的ORF中的G516D修饰产生。残基516位于TERT的N末端延伸的QFP基序(与TERT的多聚化和RNA结合相关的基序)中，对于TERT与TERC RNA的相互作用而言是必需的。通过D712A修饰在TERT序列中产生催化失活的TERT(CI TERT)突变。
为了产生修饰的TERT mRNA(催化活性的和催化失活的)，使用起始质粒。将CI-TERT ORF插入到含有T7启动子、人β球蛋白基因(HBB)的5’UTR、MCS、HBB的3’UTR和151bp多聚A序列的起始质粒的MCS(多克隆位点)中，并且通过在pBABE-neo-hTERT质粒(Addgene质粒1774)的ORF中进行D712A修饰来产生突变体。根据多聚A序列，使用II类限制酶实现线性化。
将所得中间体质粒进行测序，将其线性化并使用来自MEGAscript T7试剂盒(Ambion，Austin，Texas)的RNA聚合酶以及规范和非规范核苷酸的定制核苷酸混合物(TriLink BioTechnologies)进行转录，在所述混合物中，每40μl IVT反应的最终核苷酸浓度是：对于腺苷-5’-三磷酸(ATP)、5-甲基胞苷-5’-三磷酸(m5C)和假尿苷-5’-三磷酸(Ψ)中的每一个均为7.5mM，对于鸟苷-5’-三磷酸(GTP)为1.5mM，并且对于帽类似物(ARCA(抗反向帽类似物)，NEB)为6mM，ATP∶m5C∶Ψ∶GTP∶ARCA的摩尔比为1∶1∶1∶0.2∶0.8。为了进一步降低与携带5’-3P部分相关的mRNA的潜在免疫原性，用磷酸酶(南极磷酸酶，NEB)处理IVT产物。使用变性琼脂糖凝胶电泳验证mRNA产物的大小和完整性。
细胞电穿孔
在R10培养基中培养人Raji CD19+伯基特淋巴瘤细胞，并且随后通过离心和再悬浮收集细胞。采用Amaxa Nucleofector II技术(Lonza，Basel，CH)，使用T-021程序对总计2μg的pGL4.51质粒(luc2/CMV/Neo)(Promega E1320，Madison，MI，USA)/2×106个细胞进行电转染。在800μM G418(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的存在下在R10培养基中培养约2周后，Raji细胞显示出萤火虫荧光素酶融合蛋白的稳定表达。在5％FBS-X-VIVOTM 15培养基中培养CAR-修饰的T细胞。为了在活化的CAR修饰的T细胞中瞬时表达，将细胞悬浮于100μl人T细胞Nucleofector试剂盒(Lonza，Basel，CH)中的1μg修饰的mmRNA中，并且随后应用于装备有Nucleofector技术的T-023程序。
通过细胞计数进行群体倍增时间测/量
为了获得寿命曲线和群体倍增时间，将细胞培养物连续传代直至其体外增殖能力结束，并且确定群体倍增水平。群体倍增时间(t)＝T/3.32(lgN2-lgN1)(T：生长对数期的持续时间，N1和N2：生长对数期开始和结束时的细胞数量[Beniumovich等人，Biull EkspBiol Med.，62：120-123(1966)]。
端粒酶活性测量
在转染后开始24小时后，收集细胞并在CHAPS缓冲液中裂解。使用改进版本的TRAPeze试剂盒(EMD Millipore，Billerica，MA，USA)进行端粒重复扩增方案(TRAP)测定，其中在人工端粒底物延伸后添加引物和聚合酶。PCR程序为94℃30s/59℃30s/72℃45s的30个循环，并且产物在0.5×TBE中的15％聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后用SYBR Gold核酸凝胶染料(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)染色。使用TRAPeze RT试剂盒(EMD Millipore)进行端粒酶活性的时程。
使用TRF进行端粒长度测量
使用TIANamp基因组DNA试剂盒(TIANGEN，北京，中国)分离基因组DNA，并且在琼脂糖凝胶上运行以确认其完整性，显示为紧密的冠形条带。使用TeloTAGGG端粒长度测定(Roche，Basel，CH)进行TRF，并且将所得化学发光Southern印迹在Tanon-5200(BEIJINGYUANPINGHAO BIOTECH)上进行成像。使用ImageJ量化图像以确定平均端粒长度。
衰老检测
使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)进行β-半乳糖苷酶染色。
核型分析
在TERT mRNA递送后14天使用采用胰蛋白酶和吉姆萨(Giemsa)(GTG)的常规吉姆萨染色和G显带来分析CD19-CAR-T细胞的核型。简言之，在秋水仙胺(100ng/ml)处理6小时后收集细胞，并且在高渗溶液(0.075M KCl)中在37℃连续温育20分钟，然后在甲醇/乙酸(3∶1)中在室温固定20分钟。将细胞溶液逐滴添加到载玻片上。胰蛋白酶-吉姆萨显带通过Genetix GSL-120自动成像系统进行。并且至少10个中期细胞通过CytoVision 4.5.1版Build 5软件进行分析.
产生具有体内抗肿瘤活性的第三代共刺激性CD19 CAR修饰的T细胞
设计第三代共刺激性CD19 CAR，其具有CD3ζ、CD28和4-1BB活化结构域的组合(图1A)。为了实现CD19 CAR在人T细胞中的高表达，将EF1α启动子用于驱动CD19 CAR的表达。在转导到人T细胞后，强烈检测到CD19 CAR的表达。CD19CAR-T细胞显示约70kDa的第二条带，与引入的嵌合CD3-ζ链一致。(图SB-D，并且数据未显示)。使用IL-2在体外进一步扩增CD19CAR转导的T细胞。在体外扩增2周后，起始细胞数量为约107个，并且整个T细胞增加到超过109个细胞(＞100倍扩增)，并且29.7％的扩增的T细胞是CD19 CAR阳性细胞(图1E)。相比于与CD19-K562细胞共培养的细胞，当以不同E∶T比(1∶1、10∶1、25∶1)与CD19+人Raji伯基特淋巴瘤肿瘤细胞共培养时，扩增的CD19 CAR-T细胞特异性地分泌显著更高水平的免疫细胞因子(图1F-G)。此外，CD19 CAR-T细胞有效地杀伤CD19+Raji细胞，但是不杀伤CD19-K562细胞(图1H-I)。
为了研究CD19 CAR-修饰的T细胞在体内的抗肿瘤活性，建立异种肿瘤模型。将免疫缺陷NPG/Vst小鼠接种表达萤火虫荧光萤光素酶融合蛋白的CD19+Raji细胞。随后，将用CD19 CAR或GFP慢病毒载体转导的人T细胞接种到小鼠模型中。过继性免疫疗法后，使用生物发光(IVIS)成像系统每周对小鼠模型中的肿瘤生长进行评价(图2A)。与GFP转导的T细胞相比，CD19 CAR-T细胞有效地抑制小鼠中的肿瘤生长(图2A)。此外，尽管对照组中的所有小鼠在40天之前即死亡，但是CD19 CAR-T组中大多数小鼠存活超过70天(图2B)，这表明CD19CAR-T细胞免疫疗法可以增加具有CD19+肿瘤细胞的小鼠的存活率。然而，CD19 CAR-T组中的小鼠的存活率在70天以后逐渐下降(图2B)。为了确定这种效果是否反映了体内CD19CAR-T细胞的减少，对这些小鼠中CAR T细胞的数量进行进一步检查。实际上，尽管在开始的60天期间保持了高水平的CAR-T细胞，但是该数量在60天以后逐渐下降(图2C)。当评价这些小鼠中CD19 CAR-T细胞中的CD19 CAR的拷贝数时获得了类似的结果(图2D)。总之，这些结果表明，虽然第三代共刺激性CD19 CAR修饰的T细胞在体内有效地消除了CD19+肿瘤细胞，但是有限的寿命显著地限制了CAR-T细胞的治疗效果。
修饰的TERT mRNA的合成和递送在CAR-T细胞中瞬时增加端粒酶活性并且延长端粒长度
为了延长CD19 CAR修饰的T细胞的寿命，使端粒酶的主要组分TERT在CD19 CAR-T细胞中过表达。为了避免由组成型TERT过表达导致的潜在基因组不稳定性，设计了修饰的TERT mRNA(TERT mmRNA)，其不能整合到转导的细胞的基因组中并且在细胞分裂期间逐渐降解(图3A)。还构建了对照mRNA载体，其编码催化失活(CI)形式的TERT。通过电穿孔将TERT和CI TERT mmRNA转染到T细胞中。为了评价转染效率，还将GFP mmRNA电穿孔作为对照组(数据未显示)，并且电穿孔后24小时达到高转染效率(93.1±2.0％)。另外，电穿孔后存活约85-90％的T细胞(数据未显示)。接下来，证实转导的人T细胞中存在高水平的TERT mmRNA(图3B-图3D)。
为了检查TERT mmRNA转染是否导致功能性TERT蛋白的产生，对TERT mmRNA转导的T细胞中的端粒酶活性进行评价。在常规T细胞或用TERT mmRNA转导的CD19 CAR-T细胞中检测到端粒酶活性，但是在用GFP或CI-TERT mmRNA转导的T细胞中未检测到端粒酶活性(数据未显示)。此外，在TERT mmRNA转导的CAR-T细胞中端粒长度显著增加(数据未显示，以及图3E)，但是在CI-TERT mmRNA转导的CAR-T细胞中并非如此。这些结果表明TERT mRNA的瞬时表达有效地增强了CAR-T细胞中的端粒酶活性和端粒长度。
TERT mmRNA递送在CD19 CAR-T细胞中显著增强增殖并抑制细胞衰老
为了确定TERT mmRNA递送是否促进CD19 CAR-T细胞的增殖，在体外扩增期间的不同时间点计算CAR-T细胞的数量。未处理的和CI TERT mmRNA转导的CAR-T细胞在约20-25次群体倍增(PD)(大约6周)后逐渐停止增殖，而连续三次用TERT mmRNA转导的细胞继续增殖另外15个PD(4周)(图4A)。mmRNA递送后的起始细胞数量为约1×106个，并且增加至3.0±0.22×108个(300倍扩增)。相比之下，未处理的CAR-T细胞或CI TERT mmRNA转导的细胞的整体细胞数量为约3.7±0.75×107(37倍扩增)。进一步检测扩增期间不同时间点的S期T细胞的百分比(图4B)，作为增殖率的指标。与总细胞数量增加一致，用TERT mmRNA转导的CD19CAR-T细胞在S期维持相对高百分比的细胞(约20％)，但是对照细胞在S期的百分比在扩增期间逐渐降低(图4C)。在使用β-半乳糖苷酶(β-gal)染色检测衰老细胞的情况下，对体外扩增后不同处理下的T细胞的衰老程度进行检查。尽管在体外培养40天后对照组中的β-gal阳性细胞的百分比显著增加，但是用TERT mmRNA转导的β-gal阳性CAR-T细胞的百分比仅略微增加(染色数据未显示，以及图4D)。总之，这些数据显示了TERT mmRNA递送在CD19CAR-T细胞中显著增强增殖并抑制细胞衰老。
TERT mmRNA递送不改变CAR-T细胞的表型和功能特征
接下来，检查TERT mmRNA递送对CD19 CAR-T细胞表型的影响。在原始CAR-T和TERT-CAR-T细胞之间的主要T细胞表面标志物的表达中未观察到明显的差异(数据未显示)。此外，用TERT mmRNA转导的CD19CAR-T细胞在体外培养50天后显示正常核型(数据未显示)。进行研究以确定TERT mmRNA递送是否影响CAR-T细胞的功能。将不同处理下的四组T细胞(GFP-T、CAR-T、CI-CAR-T和TERT-CAR-T)以不同的E∶T(效应细胞∶靶细胞)比率单独地与CD19+Raji细胞共培养。用TERT mmRNA转导的CD19 CAR-T细胞显示出与对照组(CAR-T和CI-CAR-T)相当的细胞因子分泌水平(图4A-D)。此外，CD19+肿瘤杀伤功效在TERT-CAR-T、CD19CAR-T和CI-CAR-T细胞中不存在差异(图5E和5F)。因此，TERT mmRNA递送不改变所研究的CAR-T细胞的表型和功能特征。
过继性转移后TERT-CD19 CAR-T细胞的体内增殖和持久性的改善以及抗肿瘤功效的增强
为了评价TERT-CD19CAR-T细胞在体内的抗肿瘤功效，将TERT-CAR-T细胞与CD19+Raji细胞共同注射到小鼠模型中(图6A)。在注射不同处理下的T细胞后，通过生物发光(IVIS)成像每周监测Raji肿瘤进展(图5B-C)。TERT-CAR-T细胞的初始体内抗肿瘤功效与CI-CAR-T或未处理的CAR-T细胞相似(图6B)。然而，未处理的CAR-T组中的小鼠在55天后开始死亡。与此相反，TERT-CAR-T组中的小鼠仍然存活。治疗130天后，来自对照组的大部分小鼠死亡(超过80％)，但是约80％的来自TERT-CAR-T组的小鼠仍然存活(图6C)。与此观察一致，在治疗130天后，来自TERT-CAR-T组的小鼠中的CAR-T细胞的总细胞数量高于来自对照组(CAR-T和CI-CAR-T)的小鼠中的数量(图6D)。当评价这些小鼠中CD19CAR-T细胞中的CD19CAR的拷贝数时获得了类似的结果(图6E)。总之，这些数据表明用TERT mmRNA转导的CD19CAR-T细胞具有改善的体内持久性和增殖，从而增强了CAR-T细胞在体内的长期抗肿瘤效力。
过继性转移的TERT-CAR-T细胞在体内是遗传稳定的
最后，确定TERT mmRNA瞬时递送到CAR-T细胞对遗传稳定性的影响。在转染后14天培养后，TERT-CAR-T细胞仍保持正常核型(图7A-7B)。与此结果一致，这些TERT-CAR-T细胞中的关键致癌基因C-MYC、BMIl和H-RAS的表达在mmRNA转染后的不同时间点没有显示出显著变化(图7C)。此外，仅移植有TERT-CAR-T细胞的小鼠在注射90天后100％存活并且没有肿瘤形成(图7D)，这支持过继性转移的TERT-CAR-T细胞在体内是遗传稳定的结论。
讨论
本研究公开了通过瞬时递送编码TERT的修饰的mmRNA来增强CAR-T细胞寿命的方法。在长期体外培养后，与未处理的对照相比，用TERT mmRNA转导的CAR-T细胞显示出增加的端粒酶活性、延长的端粒、增强的增殖和延迟的细胞衰老。更重要的是，当注射到人B细胞恶性肿瘤的小鼠异种移植肿瘤模型中时，这些修饰的CD19 CAR-T细胞不仅展现出增强的体内持久性和增殖，而且显示出改善的长期体内抗肿瘤功效。CAR-T细胞的体外扩增需要产生足够的细胞数量以在体内杀死肿瘤细胞。然而，CAR-T细胞的体外培养的延长可能导致衰老，从而减少这些细胞在体内的长期持久性。实际上，具有T细胞增殖所需的整合活化结构域的第三代CAR-T细胞在小鼠模型中注射后超过60天即显示出细胞数量减少(图2C-D)，并且用CAR-T细胞处理的小鼠的长期存活率也显著降低(图2B)。与此相反，用TERT mmRNA瞬时转导的CAR-T细胞显示出增强的体内长期持久性(图6D-E)，并且用TERT-CAR-T细胞处理的小鼠的存活率在注射后140天保持高水平(图6B)。TERT-CAR-T细胞注射后小鼠存活率的增强也表明CAR-T细胞的长期抗肿瘤功效可以通过TERT mmRNA的瞬时递送而增强。此外，这种瞬时递送还显著增强了体外培养期间CAR-T细胞的增殖(数据未显示)。因此，本研究的结果提供了一种简单且稳健的方法来产生大量的具有长期抗肿瘤功效的CAR-T细胞。使用TERTmRNA递送来延长CAR-T细胞中的端粒长度的一个突出优点是该方法避免了潜在的安全问题，这是CAR-T细胞免疫疗法的临床应用中的主要问题。先前的研究试图通过主要涉及TERT的组成型过表达的TERT过表达来增强T细胞寿命[Rufer等人，Blood，98：597-603(2001)；Bennaceur等人，Atherosclerosis，236：312-320(2014)；Verra等人，Cancer Res.，64：2153-2161(2004)]。然而，TERT转基因的基因组整合和组成型表达导致染色体不稳定性[Zhou等人，J Immunol.，175：7046-7052(2005)；Bennaceur，Atherosclerosis，236：312-320(2014)；Verra等人，Cancer Res.，64：2153-2161(2004)；Barsov等人，Immunotherapy，3：407-421(2011)]，这在临床应用中引起安全性问题。与先前的研究不同，使用修饰的mRNA，其不整合到接受者细胞的基因组中，因而避免了潜在的基因组不稳定性[Zangi等人，Nat Biotechnol.，31：898-907(2013)；Hansson，J Biol Chem.，290：5661-5672(2015)；Warren等人，Cell Stem Cell，2010；7：618-630(2010)；Ramunas等人，Faseb J.29：1930-1939(2015；Barrett等人，Hum Gene Ther.，22：1575-1586(2011)。实际上，在本研究中，使用该方法修饰的CAR-T细胞显示正常的核型、表型和T细胞功能，并且细胞增殖仍然依赖于细胞因子或抗原刺激(图5A-F和7A-C)。此外，这些数据还表明在体外培养期间将TERT mRNA瞬时递送到CAR-T细胞中足以延长端粒长度(图3E)，这显著增强了这些细胞的体内抗肿瘤功效(图6A-6E)。因此，mRNA递送的优越特征显示该方法在CAR-T细胞的临床应用中的潜在用途。
总之，这些数据表明编码TERT的修饰的mRNA的瞬时递送增强了体外和体内两者的持久性和增殖，并且改善了CAR-T细胞的体内抗肿瘤功效。这种新方法提供了一种有效且安全的方法来改善CAR-T细胞的治疗潜力。尽管第二代或第三代CAR-T细胞用于治疗B细胞恶性肿瘤的临床应用近年来已经取得了显著进展[Brentjens等人，Science TranslationalMedicine，5：138r-177r(2013)；Davila等人，Sci Transl Med.，6：224r-225r(2014)；Imai等人，Leukemia，18：676-684(2004)；Kowolik等人，Cancer Res.，66：10995-11004(2006)]，但是将当前CAR-T细胞免疫疗法应用到治疗其它类型的癌症(特别是实体瘤)的进展仍然有限，这主要反映出CAR-T细胞在体内的持久性和增殖不足[Ahmed等人，J Clin Oncol.，33：1688-1696(2015)；Chen等人，Medical Science Monitor，20：953-959(2014)；Kakarla等人，CancerJ.，20：151-155(2014)]。因此，本发明开发的方法在未来的研究中具有治疗其它类型的癌症(特别是实体瘤)的巨大潜力。
尽管在前面的说明书中已经与本发明的某些实施方案相关地对本发明进行了描述，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说明显的是，本发明容易得到另外的实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文描述的某些细节可以显著地改变。
Claims (17)
1.一种包含外源引入的修饰的TERT mRNA的CD19 CAR-T细胞，其中所述CD19 CAR-T细胞不包括由整合到宿主基因组中的转基因表达的TERT，其中所述修饰的TERT mRNA包含5’帽、人β球蛋白基因(HBB)的5’非翻译区、端粒酶逆转录酶(TERT)的编码序列、人β球蛋白基因(HBB)的3’非翻译区和聚腺苷酸尾，其中所述外源引入的修饰的TERT mRNA包含选自由假尿苷和5-甲基胞苷组成的组的修饰的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的T细胞，其中5’帽选自由以下组成的组：m7G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、抗反向帽(ARCA)(3′-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)和G(5’)ppp(5’)A帽。
3.根据权利要求1所述的T细胞，其中多聚A尾的长度为25至500个核苷酸。
4.根据权利要求2所述的T细胞，其中所述细胞具有选自增强的体内抗癌活性的组的至少一种特性，所述增强的体内抗癌活性可以通过在体内施用相同量的TERT T细胞和不表达外源性引入的TERT的T细胞之后在相同时间长度下杀死癌细胞的能力和/或缩小肿瘤或增加存活的能力来测量。
5.根据权利要求1所述的T细胞，其中所述T细胞在50天的体外培养后具有正常核型。
6.一种药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体中的根据权利要求1-5中任一项所述的细胞。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中T细胞的抗肿瘤有效量是104至1011个细胞/kg需要该细胞的人类的体重。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是生理盐水。
9.权利要求1-5中任一项所述的细胞在制备用于治疗有需要的受试对象的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述细胞以适合通过选自由以下组成的组的方法施用的形式存在于所述药物中：动脉内施用、静脉内输注、腹膜内、鞘内和淋巴内。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有癌瘤。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有选自由以下组成的组的癌症：胚细胞瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、髓样癌、肾细胞癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤和精原细胞瘤。
13.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有乳头状腺癌。
14.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有选自由以下组成的组的癌症：肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、支气管癌、胆管癌、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS癌症。
15.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有选自由以下组成的组的癌症：霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、滑膜瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
16.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试对象患有选自由以下组成的组的癌症：毛细胞白血病和间皮瘤。
17.根据权利要求9-16中任一项所述的用途，其中所述受试对象选自由以下组成的组：人类、猫、狗、马、羊、牛、猴、驴和黑猩猩。
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