KR102547477B1 - HPK-1을 표적화하는 gRNA 및 HPK-1 유전자의 편집 방법 - Google Patents

HPK-1을 표적화하는 gRNA 및 HPK-1 유전자의 편집 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HPK-1을 표적화하는 gRNA 및 HPK-1 유전자를 편집하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 T 세포 HPK-1 유전자를 녹아웃시키고, T 세포 사멸 활성을 증대시키며, 말초 혈액 단핵 세포의 Th1 사이토카인 수준을 증가시킬 수 있고, 상기 T 세포 HPK-1 유전자의 녹아웃은 또한 T 세포 표면상에서의 PD-1 및 TIM3의 발현을 하향 조절하고 T 세포 고갈을 억제할 수 있다.

Description

HPK-1을 표적화하는 gRNA 및 HPK-1 유전자의 편집 방법
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2017년 9월 20일자 출원된 중국 출원 제 201710853090.2 호(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 우선권을 주장한다.
기술분야
다양한 실시태양에서, 본 발명은 분자 생물학 및 면역학의 기술 분야에 관한 것이며, 보다 특히 암 면역요법에 관한 것이다. 예를 들어, 다양한 실시태양에서, 본 발명은 일반적으로 HPK-1 유전자를 편집하기 위한 조성물 및 방법, 편집된 HPK-1 유전자를 갖는 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포, 상기 세포를 포함하는 약학 조성물, 및 예를 들어 암 치료를 위한 그의 사용 방법에 관한 것이다.
종양은 인간의 건강을 위협하는 주요 질병 중 하나이다. 최근 수년간, 종양에 대한 면역요법은 암 요법에서 점차적으로 연구의 핫스폿이 되고 있다. 종양 면역 세포 요법은 인체로부터 수집된 면역 세포를 시험관내에서 변형시키고, 배양하고 확대시키고, 이어서 환자의 신체로 돌려보내 상기 신체의 자가 면역 기능을 자극하고 증대시켜, 종양 성장을 억제하고 종양 세포를 사멸시키는 효과를 성취하는 것이다.
다수의 암 면역요법 방법 중에서, 비교적 분명한 기전 및 유효 효과를 갖는 것은 키메릭 항원 수용체 T 세포 종양 표적화된 요법(CAR-T 세포 요법) 및 PD-1 억제제 요법이다. CAR-T를 포함한 세포 면역요법은 혈액 종양의 치료에서 현저한 성공을 성취하였지만, 고형 종양을 정복하는데는 장애가 있었다. 주요 원인은 T 세포 고갈, 감소된 활성, 및 불충분한 종양 사멸 능력이다. 따라서, 신규의 T 세포 시험관내 변형 부위 및 변형 방법을 찾고, T 세포 활성 및 사멸 활성을 증대시키며, T 세포 고갈을 억제시키는 것이 상기 연구 및 기술 발전의 연구 방향이다.
조혈 전구세포 키나제 1(hpk1, HPK1, HPK-1 또는 map4k1로서 약기함)은 포유동물 ste20 관련 단백질 키나제의 map4k 패밀리에 속하는 조혈-특이성 세린/쓰레오닌 단백질 키나제이다. HPK-1은 주로 조혈 조직 및 세포에서 발현된다. 다수의 연구가, HPK-1이 mapk(마이토젠-활성화된 단백질 키나제) 신호전달, 항원 수용체 신호전달, 세포자멸 신호전달, 성장인자 신호전달, 및 사이토카인 신호전달 등을 포함한 다수의 신호전달 캐스케이드에 관련됨을 입증하였다. HPK-1의 3개의 활성화 방식, 즉 세린 인산화, 쓰레오닌 인산화 또는 타이로신 인산화가 존재한다. PCR 기술이 1996년에 마우스 조혈 모세포로부터 HPK-1을 클로닝하기 위해 처음 사용된 후에, 연구는 HPK-1이 주로 조혈 조직 및 세포에서 발현됨을 입증하였다. 현재, HPK-1에 대한 연구는 주로 조혈계에 초점을 두고 있다. 최근의 연구는 HPK-1이 암과 관련될 수도 있음을 입증하였다. 사와스디코솔 에스(Sawasdikosol S) 등의 마우스 모델 연구는 T 세포 및 DC 세포의 HPK-1 유전자의 붕괴가 폐암 세포의 성장 억제를 돕는 것을 발견하였으며, HPK-1은 항-종양 면역요법의 새로운 표적이 될 것으로 기대된다. US 2016/0158360은 암의 치료를 위해 PD-1 길항물질과 함께 HPK-1 세린/쓰레오닌 단백질 키나제 활성을 억제하는 HPK-1 길항물질의 용도를 개시한다.
다양한 실시태양에서, 본 개시는 HPK-1 유전자 붕괴와 관련된 세포, 세포 조성물, 핵산, 및 벡터뿐만 아니라, 그의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.
본 개시의 일부 실시태양은 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 함유하는 면역 세포, 및/또는 상기 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제에 관한 것이다. 상기 유전학적 붕괴는 HPK-1 유전자의 불활성화, 감소된 활성 및/또는 감소된 발현을 생성시키는 상기 HPK-1 유전자 중의 결실, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 상기 HPK-1 유전자의 하나 이상의 엑손(예를 들어, 제1 또는 제2 엑손) 중 적어도 일부의 결실을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시태양 중 어느 하나에서, 상기 유전학적 붕괴는 또한 HPK-1 유전자 중의 삽입 및 결실(인델)을 수행하는 비-상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 복구되는 상기 HPK-1 유전자 중의(예를 들어, 제1 또는 제2 엑손 중의) 이중가닥 절단(DSB)의 생성을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 또한 상기 DSB에 이어서 공여체 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 CAR을 암호화하는 서열)을 삽입하는 상동-직접 복구(HDR)에 의해 복구되는, HPK-1 유전자 중의 이중가닥 절단의 생성을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 면역 세포는 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 것, 및 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및/또는 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는 것.
본 명세서에서 유전학적 붕괴를 수행하는데 다양한 작용제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 작용제는 억제성 핵산 분자, 예를 들어 RNA 간섭제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 억제성 핵산 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 미세RNA-적응 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), shRNA, 헤어핀 siRNA, 전구체 미세RNA(전구-miRNA) 또는 미세RNA(miRNA)이거나, 이를 포함하거나, 이를 암호화한다. 일부 실시태양에서, 상기 억제성 핵산 분자는 HPK-1 유전자의 핵산 서열(예를 들어, mRNA)에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제는 면역 세포에서 HPK-1의 발현을 감소시키거나 감소시킬 수 있는 하나 이상의 분자, 또는 상기 하나 이상의 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 분자는 상기 HPK-1 유전자에 특이적으로 결합하거나, HPK-1 유전자를 인식하거나, HPK-1 유전자에 하이브리드화하는 안티센스 분자, siRNA, shRNA, miRNA, 유전자 편집 뉴클레아제, 아연 집게 뉴클레아제 단백질(ZFN), TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 CRISPR-Cas9 조합이거나, 이를 포함하거나, 이를 암호화할 수 있다.
일부 특정한 실시태양에서, 상기 작용제는 (a) HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 gRNA, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; (b) Cas9 단백질, 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (a) 및 (b)의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제는 Cas9 분자 및 상기 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 gRNA의 리보핵단백질 복합체(또는 분자 복합체 또는 단순히 복합체 또는 RNP)를 포함할 수 있다. 다양한 gRNA 및 Cas9 단백질이 적합하며 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 충분히 상보적인 서열과 동일하거나 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드 이하로 상이한 표적화 서열을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적인, 예를 들어 충분히 상보적인 표적화 서열을 가질 수 있다. 상기 gRNA는 키메릭 또는 모듈식일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9이다. 일부 실시태양에서, 상기 Cas9 단백질은 상기 Cas9 분자의 포유동물, 예를 들어 인간 면역 세포의 핵내로의 진입을 촉진할 수 있는 핵 국소화 서열의 삽입(예를 들어, Cas9 분자의 C- 및 N-말단 중 하나 또는 둘 다에 삽입)에 의해 추가로 변형된다. 본 명세서의 실시태양 중 어느 하나에서, gRNA/Cas9의 복합체는, NHEJ 또는 HDR을 통해 HPK-1 유전자의 복구를 허용하는 이중가닥 절단으로 표적 도메인을 절단할 수 있다.
일부 실시태양은 또한 본 명세서의 작용제를 암호화하는 핵산 및 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용하기에 적합한 벡터는 비제한적으로 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 다른 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 벡터를 포함한다. 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포는 또한 본 개시의 하나의 실시태양이다.
일부 실시태양에서, 본 명세서의 면역 세포는 바람직하게는 상기 면역 세포의 표면상에서 발현되는 재조합 수용체, 또는 상기 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 전형적으로, 상기 재조합 수용체는 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 면역 세포는 상기 재조합 수용체가 항원에 결합시 세포독성을 유도하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비할 수 있다. 본 명세서에 기재된 것들을 포함하여 다양한 재조합 수용체가 적합하다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)이다. 비제한적인 유용한 재조합 TCR 및 CAR은 본 명세서에 기재되어 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스(Lewis) Y, Ll-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(CEA), 전립선 특이항원, PSMA, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름 종양(Wilms Tumor) 1(WT-1), 사이클린 Al(CCNA1), BCMA 및 인터류킨 12 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
다양한 면역 세포를 본 개시의 조성물 및 방법에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는 인간 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는 T 세포, 예를 들어 Car-T 세포, NKT 세포, 및 NK 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는 입양 면역요법에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는 암, 예를 들어 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및/또는 수모세포종을 앓고 있는 피실험자의 1차 세포로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 갖는 면역 세포 또는 세포 집단은 또한 상기 유전학적 붕괴를 갖지 않는 대조용 면역 세포에 비해 몇몇 향상된 특징을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전학적 붕괴를 갖는 면역 세포 또는 세포 집단은 증대된 세포독성, 감소된 세포자멸, 개선된 지속성, 및/또는 감소된 탈진을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 개시는, 예를 들어 실시예 4에 기재된 T7E1 분석에 따른 방법 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 의해 측정된, 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 HPK-1 유전학적 녹아웃 효율을 특징으로 하는, 본 명세서의 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어 Car-T 세포)를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 집단은 상기 세포의 약 50%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이 세표 표면상에 재조합 수용체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 키메릭 항원 수용체)를 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포 집단은 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신(Annexin) V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 및/또는 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 높은 것을 추가의 특징으로 한다.
본 개시의 일부 실시태양은 면역 세포의 생성 방법, 예를 들어 T 세포의 변경 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 인간 환자로부터 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 수득하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이); (b) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; (c) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜 HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 본 명세서에 기재된 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 면역 세포 및 작용제는 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는, 예를 들어, 상기 면역 세포에서 NHEJ 또는 HDR을 통해 HPK-1 유전자의 복구를 허용하는, 상기 HPK-1 유전자 중의 이중가닥 절단으로 표적 도메인을 절단할 수 있는 gRNA/Cas9의 복합체 중 어느 하나가 도입될 수 있다. 본 명세서의 방법에 의해 생성된 면역 세포 또는 세포 집단은 본 명세서에 기재된 바와 같은 HPK-1 유전자 녹아웃 효율, 탈진 마커, PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3의 발현, 세포자멸 마커 애넥신 V의 발현, 세포독성 마커 CD107a의 발현과 같은 특징 중 어느 하나를 특징으로 할 수 있다.
본 개시의 일부 실시태양은 면역요법을 위해 면역 세포의 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 본 개시는 면역 세포 집단의 세포독성을 증대시키고/거나, 탈진을 억제하고/거나, 비장 및/또는 종양내 침윤을 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 면역 세포 집단을, HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 인간 환자로부터 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단을 수득하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이); (b) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; (c) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜, 상기 작용제 도입전의 세포 집단에 비해 증대된 세포독성, 감소된 탈진, 및/또는 증대된 비장 및/또는 종양내 침윤을 갖는 HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 본 명세서에 기재된 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 면역 세포 및 작용제는 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포는, 예를 들어, 상기 면역 세포에서 NHEJ 또는 HDR을 통해 HPK-1 유전자의 복구를 허용하는, 상기 HPK-1 유전자 중의 이중가닥 절단으로 표적 도메인을 절단할 수 있는 gRNA/Cas9의 복합체 중 어느 하나가 도입될 수 있다.
본 개시의 일부 실시태양은 HPK-1 유전학적 붕괴를 갖는 면역 세포 또는 본 명세서의 세포 조성물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 일부 실시태양은 질병 또는 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 감염성 질병 또는 상태, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 종양 또는 암이다. 일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성-림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종암, 골암, 뇌암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉육종, 수모세포종, 골육종, 활막육종 및/또는 중피종인 암 또는 종양일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의, HPK-1 유전학적 붕괴를 갖는 면역 세포 또는 본 명세서의 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 치료가 필요한 피실험자로부터 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 수득하는 단계; (b) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; (c) 상기 면역 세포를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 제공하는 단계; 및 (d) 상기 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 상기 피실험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 재조합 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산, 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 (b) 및 (e)의 도입 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다. 적합한 작용제 및 재조합 수용체는 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다.
다양한 다른 장점 및 이득은 하기의 바람직한 실시태양의 상세한 설명을 판독함으로써 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다. 도면은 단지 상기 바람직한 실시태양을 예시하기 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
도 1은 정제된 시험관내 전사된 gRNA의 전형적인 젤 전기영동 상을 도시하며, 좌측에서 우측으로, 레인 1은 블랭크 대조용 NC이고; 레인 2는 정제된 HPK-1 gRNA mRNA이고; 레인 3은 정제된 PD1 gRNA mRNA이다.
도 2는 정제된 발현된 재조합 Cas9 단백질의 전형적인 젤 전기영동 상을 도시하며, 좌측에서 우측으로, 레인 1은 단백질 분자량 마커이고; 레인 2는 농축 후의 재조합 Cas9 단백질(GST 태그를 갖는다)이고; 레인 3은 트롬빈에 의한 GST 태그 절제 후의 Cas9 단백질이고; 레인 4는 농축 전의 재조합 Cas9 단백질(GST 태그를 갖는다)이다.
도 3은 실시예 4에 상세히 기재된 바와 같은 T7E1 효소적 절단에 의해 검출된, 상이한 조건하에서의 전형적인 유전자 녹아웃 효율을 나타내는 아가로스 젤 전기영동으로부터의 상을 나타내며, 좌측에서 우측으로, 레인 1은 4x106 T 세포 + 8 ㎍ Cas9 단백질 + 8 ㎍ HPK-1 gRNA mRNA이고; 레인 2는 4x106 T 세포 + 8 ㎍ Cas9 단백질 + 16 ㎍ HPK-1 gRNA mRNA이고; 레인 3은 4x106 T 세포 + 16 ㎍ Cas9 단백질 + 8 ㎍ HPK-1 gRNA mRNA이고; 레인 4는 4x106 T 세포 + 16 ㎍ Cas9 단백질 + 16 ㎍ HPK-1 gRNA mRNA이고; 레인 5는 4x106 T 세포 + 8 ㎍ Cas9 단백질 + 8 ㎍ PD1 gRNA mRNA이고; 레인 6은 4x106 T 세포 + 8 ㎍ Cas9 단백질 + 16 ㎍ PD1 gRNA mRNA이고; 레인 7은 4x106 T 세포 + 16 ㎍ Cas9 단백질 + 8 ㎍ PD1 gRNA mRNA이고; 레인 8은 4x106 T 세포 + 16 ㎍ Cas9 단백질 + 16 ㎍ PD1 gRNA mRNA이다.
도 4는 전형적인 유전자 녹아웃 효율을 도시하는 웨스턴 블럿 상을 나타낸다. 결과는 CAR19+HPK-1+/- T 세포 중의 HPK-1의 발현 수준이 다른 3개의 그룹보다 현저하게 감소됨을 도시한다. β-액틴이 내부 표준으로서 사용되었다.
도 5는 CD19+ 세포, CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포에 대한 표면 마커 CAR19 및 PD1 수용체를 검출하는 유식 세포측정 결과를 도시한다. 상들은 CAR19+HPK-1+/- T 세포의 표면상의 PD1 수용체가 대조용 CAR19+ T 세포에 비해 현저하게 감소됨을 도시한다. CAR19+HPK-1+/- T 세포의 표면상의 PD1 수용체의 발현 수준은 CAR19+PD1+/- T 세포의 경우에 가깝다.
도 6A 내지 6C는 상이한 세포 조성물인 T 세포, CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포의 T 세포 사멸 활성을 비교하는 막대 그래프를 나타낸다. 도 6A는 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 K562에 대한 사멸 효과를 비교하고; 도 6B는 림프모구성 라지(Raji) 세포주에 대한 사멸 효과를 비교하며; 도 6C는 인간 버킷 림프종 세포주 다우디(Daudi)에 대한 사멸 효과를 비교한다.
도 7A 및 7B는 상이한 세포 조성물인 T 세포(CD19- T 세포), CD19+ T 세포, CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포의 사이토카인 생성물 수준을 비교하는 막대 그래프를 나타낸다. 도 7A는 IFN-γ의 생성 수준을 비교하고; 도 7B는 IL-2의 생성 수준을 비교한다.
도 8은 상이한 처리 그룹: T 세포 처리 그룹, Car-T WT 처리 그룹, Car-T HPK-1 KO 처리 그룹, 및 Car-T PD1 KO 처리 그룹간의 마우스의 종양 부피의 비교를 도시하는 그래프를 나타낸다. (n = 그룹당 6마리 마우스). ***P<0.001, 독립표본 t 검정.
도 9는 T 세포, Car-T WT, Car-T HPK-1 KO, 및 Car-T PD1 KO로 처리된 마우스의 상을 나타낸다. 도 9에서, NSG 마우스에게 라지-ffluc 세포를 접종하고, 7일 후에 상기 마우스를 4-1BB/CD3ζ 신호전달 모듈을 함유하는 CD19-CAR을 발현하는 1x106 T 세포로 또는 단지 EGFRt만을 발현하는 T 세포로 처리하였다(그룹당 4 내지 5마리 마우스). 화살표는 T 세포 이식일을 표시한다. 종양 성장을 생물발광 영상화에 의해 분석하였으며 개별적인 마우스로부터의 결과를 상이한 CAR에 대해 플롯팅한다. T 세포 이식후 7일째(d7)로부터 이식후 28일째(d28)까지의 상들을, 상이한 CART 세포들을 수용한 마우스에 대해 나타내었다.
도 10은 40일의 기간에 걸친 처리-후의 마우스에서 T 세포, Car-T WT, Car-T HPK-1 KO, 및 Car-T PD1 KO 세포의 지속성을 도시하는 그래프를 나타낸다. 혈액내 T 세포의 정량분석을 마우스내 입양 T 세포 이식 후에 수행하였다. n = 그룹당 3마리 마우스. 독립표본 t 검정에 의해 *P<0.05, **P<0.01. 막대 그래프 및 산포도는 평균±s.e.m을 나타낸다.
도 11A 내지 11C는 각각의 그룹의 마우스 종양 조직 중 침윤 세포, T 세포, Car-T WT, Car-T HPK-1 KO, 및 Car-T PD1 KO 세포에 대한 다양한 표면 마커, 애넥신 V/CD107a/PD1/Tim3/Lag-3의 발현 수준의 전형적인 평가를 나타낸다. 도면은 입양 이식후 14일째로부터 CAR-T 세포의 세포자멸, 세포독성 및 탈진 마커 발현을 평가한다. 도 11A는 종양 조직내 침윤 세포상의 애넥신 V/CD107a/PD1/Tim3/Lag-3의 발현 수준을 도시하는 그래프를 나타낸다. 도 11B는 종양 조직내 침윤성 Car-T 세포상의 애넥신 V 및 CD107a의 발현 수준을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 도 11C는 종양 조직 중 침윤성 Car-T 세포상의 PD1, Tim3 및 Lag-3의 발현 수준을 도시하는 막대 그래프를 나타낸다. 독립표본 t 검정에 의한 ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
도 12는 동물 연구의 일반적인 흐름도를 도시한다.
도 13A 내지 13D는 생체외 확대 중 her2 CAR-T 세포 탈진을 도시한다. A. T 세포상의 Her2 Car 발현; B. 0일째 미경험 T 세포에서부터 초기 활성화후 10일까지 및 Her2 CAR이 3일째에 형질도입된 T 세포상의 HPK-1의 발현을 평가하는 웨스턴 블럿; C. 0일째 미경험 T 세포에서부터 초기 활성화후 10일까지 및 Her2 CAR이 3일째에 형질도입된 T 세포상의 HPK-1의 발현을 평가하는 Facs; D. 상이한 Her2 CAR-T 세포에서 HPK-1 발현(적색)의 형광 현미경관찰(PD1 발현 고 및 저)
도 14A 내지 14C는 Cas9 단백질과 함께 sgRNA를 사용하는 HPK-1의 절단 효능을 도시하는 그래프 및 상을 나타낸다. A. T 세포에서 Her2 Car 발현의 FACS 분석(형질도입 후 3일째); B. CRISPR/Cas9-표적화된 HPK-1 또는 PD-1 후의 HPK-1의 발현을 평가하는 웨스턴 블럿; C. CRISPR/Cas9-표적화된 HPK-1 또는 PD-1 후의 PD-1의 발현의 FACS 분석.
도 15A 내지 15C는 HPK-1 유전자 녹아웃을 갖는 Her2 CAR-T 세포의 증대된 생체내 효능을 도시하는 상 및 그래프를 나타낸다. 도 15A에서, NSG 마우스에게 SKOV3-ffluc 세포를 접종하고, 7일 후에 상기 마우스를 4-1BB/CD3ζ 신호전달 모듈을 함유하는 HER2-CAR을 발현하는 1x106 T 세포로 또는 단지 EGFRt만을 발현하는 T 세포로 처리하였다(그룹당 4 내지 5마리 마우스). 화살표는 T 세포 이식일을 표시한다. 종양 성장을 생물발광 영상화에 의해 분석하였으며 개별적인 마우스로부터의 결과를 상이한 CAR에 대해 플롯팅한다. T 세포 이식후 7일째(d7)로부터 이식후 28일째(d28)까지의 상들을, 상이한 CART 세포를 수용한 마우스에 대해 나타내었다. 도 15B는 상기 처리된 마우스(n = 그룹당 6마리 마우스)의 28일에 걸친 종양 성장을 도시하는 그래프를 나타낸다. ***P<0.001, 독립표본 t 검정. 도 15C는 마우스의 생존의 카플란-마이어 분석을 도시한다. SKOV-3-함유 마우스를 1x106 CAR-T 세포로 처리하였다(n = 그룹당 6; 도트 = 한 마리 마우스).
도 16은 HPK-1 녹아웃이 종양 중 CAR-T 세포의 침윤을 증대시킴을 도시하는 상 및 그래프를 나타낸다. HER2-CAR을 발현하는 1x106 T 세포로 처리후 10일째에, 종양 조직을 상기 마우스로부터 절제하고 각각의 조직을 면역조직화학(IHC)에 사용하였다. IHC 분석에서, 항-CD3 항체의 조합을 1차 염색에 사용하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다(청색). IHC 샘플의 현미경검사를 x100 배율로 수행하였다. 종양 중 CAR-T 세포를 정량분석하였으며 도 16의 그래프는 또한 CAR-T 세포 대 종양 비를 도시한다. 독립표본 t 검정에 의한 **P<0.01, *P<0.05.
도 17A 내지 17C는 HPK-1 녹아웃이 비장에서 CAR-T 세포의 침윤을 증대시킴을 도시하는 상 및 그래프를 나타낸다. 종양-침윤성 Her2 Car-t 세포 및 비장 Her2 Car-t 세포를, HER2-CAR을 발현하는 1x106 T 세포로 처리후 25일째에 분석하였다. 독립표본 t 검정에 의한 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 18A 및 18B는 HPK-1 녹아웃이 생체내에서 Her2 CAR-T 세포의 탈진을 개선시킴을 도시한다. 도 18A는 세포독성 마커의 분석을 도시하고 도 18B는 입양 이식후 14일째에 마우스로부터의 CAR-T 세포의 탈진 마커 발현의 분석을 도시한다. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05, NS: 유의수준 아님. 독립표본 t 검정.
도 19A 및 19B는 BCMA CAR-T 세포의 녹아웃 및 감염 효율을 도시한다. 도 19A는 CAR-BCMA 렌티바이러스 형질도입 72h 후의 감염 효율을 도시한다. 도 19B는 HPK-1 유전자가 전기영동 후 효율적으로 녹아웃되었음을 도시하는 웨스턴 블럿의 상이며, 이때 gRNA:Cas9 단백질 비는 약 1:3이다.
도 20은 PD-1의 녹아웃 전(상부) 및 후(기부)의 BMCA CAR-T 세포에서의 PD1의 발현을 도시한다.
도 21A 내지 21D는 HPK-1 편집된 CAR-T 세포가 시험관내에서 증대된 항종양 효능을 나타냄을 도시하는 그래프를 나타낸다. T 세포 및 CAR-BCMA T 세포를 U266(21A), RPMI8226(21B), K562(21C) 및 K562-BCMA(21D)와 공-배양하였으며, 12h 후에, 세포독성을 시험하였다. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
도 22는 HPK-1 편집된 CAR-T 세포가 시험관내에서 증대된 증식 효능을 나타냄을 도시하는 상을 나타낸다. T 세포 및 CAR-BCMA T 세포를 CSFE와 배양하고. 이어서 U266 및 RPMI8226과 공-배양하였으며, 48h 후에, 상기 세포를 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
도 23은 항-BCMA CAR-형질도입된 T 세포가 다발성 골수종 PDX-모델에서 종양 크기를 현저하게 감소시켰음을 도시하는 그래프를 나타낸다. 상기 연구를 위해서, 접종된 종양 크기가 100 ㎣에 도달한 후에 상기 T 세포를 정맥내 주사하고, 이어서 종양 부피를 29일의 과정에 걸쳐 측정하였다.
도 24A 내지 24C는 HPK-1 편집된 CAR-T 세포가 생체내에서 감소된 T 세포 탈진을 나타냄을 도시하는 막대 그래프이다. 상기 그래프는 상기 T 세포의 정맥내 주사후 7일째의 T 세포 탈진 마커의 유식 세포측정 분석에 근거한다.
도 25는 상이한 표적 서열을 갖는 다양한 sgRAN를 사용하는 HPK-1 녹아웃 효율을 도시한다.
도 26은 웨스턴 블럿에 의해 측정된 녹아웃 효율의 전형적인 정량분석을 도시한다.
종양 미세환경에서 종양 세포 및/또는 세포는 종종 PD-1에 대한 리간드(예를 들어, PD-L1 및 PD-L2)를 상향조절하며, 이는 차례로 PD-1을 발현하는 종양-특이성 T 세포상에 PD-1의 결찰을 유도하여 억제 신호를 전달한다. PD-1은 또한 종종 종양 미세환경 중의 T 세포상에서, 예를 들어 종양-침윤성 T 세포상에서 상향조절되며, 이는 항원 수용체 또는 몇몇 다른 활성화 신호를 통한 신호전달에 이어서 발생할 수 있다. 일부의 경우에, 상기와 같은 사건은 T 세포 탈진에 기여할 수 있으며, 이는 차례로 감소된 기능성에 이를 수 있다. T 세포의 탈진은 T 세포 기능의 점진적인 상실 및/또는 상기 세포의 고갈에 이를 수 있다(Yi et al. (2010) Immunology, 129:474-481). T 세포 탈진 및/또는 T 세포 지속성의 결여는 입양 세포요법의 효능 및 치료학적 성과에 장애일 수 있다. 임상 시험은 항원 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포에의 보다 큰 및/또는 보다 긴 노출 정도와 치료 성과간의 상관성을 밝혀내었다. WO 2016/196388 및 WO 2017/193107은 PD-1 유전자를 유전학적으로 붕괴시킴으로써 PD-1 또는 PDL-1 발현을 감소시키는 방법 및 조성물을 기재한다.
본 개시 이전에, 면역요법에서와 같은 면역 세포 기능에 영향을 미치는 HPK-1의 역할은 대체로 공지되지 않았다. 다양한 실시태양에서, 본 발명자는 뜻밖에도 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 HPK-1 유전자의 붕괴, 예를 들어 녹아웃이 그의 세포독성을 증대시키고/시키거나 감소된 탈진과 함께 그의 지속성을 개선시키며, PDCD1 유전자의 붕괴(예를 들어, 녹아웃)와 유사하거나 그보다 양호한 효능을 가짐을 발견하였다. 예를 들어, 본 명세서에 상세히 나타낸 바와 같이, 다양한 Car-T 세포에서 HPK-1 유전자의 녹아웃은 뜻밖에도 탈진 마커, 예를 들어 PD-1, Lag-3 및 Tim3의 발현 수준을 또한 감소시켰다. 더욱이, HPK-1 유전자의 녹아웃은 또한 뜻밖에도 다양한 Car-T 세포 표면상에서 세포독성 마커 CD107a의 증가된 발현 수준을 도출한다. HPK-1 유전자의 녹아웃은 또한 뜻밖에도, 표면 마커 애넥신 V의 감소된 수준에 의해 입증되는 바와 같이, Car-T 세포의 세포자멸을 감소시켰다. 이들 특징은, 예를 들어 암 치료를 위한 입양면역요법에 유용하다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, HPK-1 유전자 녹아웃을 갖는 Car-T 세포는 뜻밖에도 상이한 동물 종양 모델에서 야생형 Car-T 세포를 능가하였으며, PD-1 유전자 녹아웃을 갖는 상응하는 Car-T 세포와 유사하거나 그보다 양호한 효능을 가졌다. 더욱이, 생체내 시험시, HPK-1 유전자 녹아웃을 갖는 Car-T 세포는 야생형 Car-T 세포 및 PD-1 녹아웃 Car-T 세포의 경우에 비해 보다 긴 지속기간과 함께 더 높은 혈장 수준으로 존재한다.
상응하게, 다양한 실시태양에서, 본 발명은 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포를 포함한 신규의 세포 및 세포 조성물, 및 상기 세포 및 세포 조성물의 생성 및 사용 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에서 상기 세포는 HPK-1 폴리펩타이드를 암호화하는 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 갖고/갖거나 상기 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 함유함을 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는, 예를 들어 암 환자로부터 유래된 인간 세포, 예를 들어 인간 T 세포(예를 들어, Car-T 세포) 또는 NK 세포이다. 인간 HPK-1 유전자에 대한 예시적인 서열을 본 명세서에 제공한다(예를 들어, 서열번호 16 및 17을 참조하시오; 또한 NCBI 수탁번호 NM_007181 및 NM_001042600을 참조하시오). 본 명세서의 실시태양 중 어느 하나에서, 상기 유전학적 붕괴는 유전자 녹아웃일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 또한 유전자 녹다운일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴를 갖는 세포는 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및/또는 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는다. 본 명세서의 실시태양 중 어느 하나에서, 본 명세서의 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 유전자이식 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함할 수 있으며, 이들은 상기와 같은 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 생성물을 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체는 조작된 TCR 및 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예를 들어 활성화, 자극 및 보조자극 CAR을 포함한 키메릭 항원 수용체(CAR), 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체는 항원에 특이적으로 결합하며(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이), 상기 면역 세포는 상기 재조합 수용체가 항원에 결합시 세포독성을 유도하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 명세서의 세포 및 조성물을 입양 세포요법, 예를 들어 입양 면역요법에 사용할 수 있다.
HPK-1 유전학적 붕괴
본 개시의 다양한 실시태양은 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 갖고/갖거나 상기 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 함유하는 면역 세포에 관한 것이다. 몇몇 특정한 실시태양에서, HPK-1 유전자 녹아웃이 바람직하며, 일부 실시태양에서, 기능성 HPK-1 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 유전학적 붕괴가 또한 유용할 수 있으며 본 명세서에서 고려된다.
본 명세서에서 유전학적 붕괴는 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어 Car-T 세포)에서 HPK-1의 감소, 결실, 제거, 녹아웃 또는 발현의 붕괴를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 HPK-1의 하나 이상의 엑손(예를 들어, 제1 및/또는 제2 엑손)의 일부의 결실을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴는 상기 유전자의 일부 또는 전부, 예를 들어 하나 이상의 엑손 또는 그의 일부의 녹아웃, 삽입, 미스센스 또는 프레임이동 돌연변이, 예를 들어 이대립인자 프레임이동 돌연변이, 결실, 및/또는 녹-인일 수 있다.
본 명세서에서 유전학적 붕괴는 다양한 작용제에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시태양에서, 면역 세포에서 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴는 억제성 핵산 분자, 예를 들어 RNA 간섭(RNAi) 작용제, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀(shRNA), 미세 RNA(miRNA), 안티센스 RNA, 및/또는 리보자임과 같은 인자에 의해 수행될 수 있으며, 이들 인자는 상기 유전자의 발현을 선택적으로 억제하거나 통제하는데 사용될 수 있다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사된 mRNA의 뉴클레오타이드 서열과의 서열 상동성, 및 상기 뉴클레오타이드 서열과의 서열 상보성을 갖는 이중가닥 RNA 분자를 사용하는 RNAi에 기반한 기술을 포함한다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사된 mRNA의 하나의 영역에 상동성/상보적이거나, 상이한 영역에 상동성/상보적인 다수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 유전자의 서열 또는 그의 일부에 표적화되도록 특이적으로 설계된 서열-특이성 또는 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어 DNA-결합 표적화된 뉴클레아제 및 유전자 편집 뉴클레아제, 예를 들어 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 RNA-안내 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR-관련 뉴클레아제(Cas)를 포함하는 작용제에 의해 수행될 수 있다.
아연 집게, TALE 및 CRISPR 시스템 결합 도메인을, 예를 들어 천연 아연 집게 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해, 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 조작할 수 있다. 조작된 DNA 결합 단백질(아연 집게 또는 TALE)은 비-천연인 단백질이다. 설계에 합리적인 기준은 대체 규칙의 적용 및 존재하는 ZFP 및/또는 TALE 설계의 정보를 저장하는 데이터베이스 및 결합 데이터에서 정보 처리를 위한 컴퓨터 연산을 포함한다. 예를 들어 미국특허 제6,140,081호; 미국특허 제6,453,242호; 및 미국특허 제6,534,261호를 참조하시오; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개공보 제2011/0301073호 및 제US 2014/0120622호를 또한 참조하시오.
본 명세서에서 CRISPR 시스템에 사용하기 위한 gRNA의 설계 방법은, 예를 들어 WO 2017/193107에 기재된 바와 같은, 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 표적화 도메인의 선택, 설계 및 확인 방법을 포함한다. 예시적인 표적화 도메인은 본 명세서에 제공되며 본 명세서에 기재된 gRNA내에 통합될 수 있다.
표적 서열의 선택 및 확인 방법뿐만 아니라 표적-외 분석이, 예를 들어 문헌[Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826]; 문헌[Hsu et al. NAT BIOTECHNOL, 31(9): 827-32]; 문헌[Fu et al., 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574]; 문헌[Heigwer et al., 2014 NAT METHODS l l(2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216]; 문헌[Bae et al., 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181]; 문헌[Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24389662]에 기재되어 있다. 사용자의 표적 서열내 gRNA의 선택을 최적화하기 위한 소프트웨어 도구를 또한 입수할 수 있으며, 이를 본 명세서에서 HPK-1 유전자의 녹아웃 또는 녹다운에 더욱 적합한 gRNA의 선택을 위해 사용할 수 있다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 유전학적 붕괴는 유전자 녹아웃이다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 면역 세포의 HPK-1 유전자 자리를 상기 HPK-1 유전자에 특이적인 RNA-안내 뉴클레아제, 예를 들어 군집되어 규칙적으로 산재된 짧은 회문구조 핵산(CRISPR)-Cas 시스템, 예를 들어 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은)을 사용하여 편집할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 유전자 편집은 표적화된 자리(HPK-1 자리)에서 삽입 또는 결실, 또는 표적화된 자리의 "녹아웃" 및 암호화된 단백질 발현의 제거를 생성시킨다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 일부 실시태양에서, 본 명세서에서 HPK-1 유전자 편집(예를 들어, 녹아웃을 위한)을, 표적화된 이중가닥 절단 또는 단일가닥 절단을 유도하고, 실수유발 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동-직접 복구(HDR)를 포함한 세포 DNA-복구 기전을 자극함으로써 정확한 유전학적 변형으로 수행할 수 있다. 일부 실시태양에서, 유전자 조작된 항원 수용체를 암호화하는 공여 핵산, 예를 들어 공여 플라스미드 또는 핵산을 제공하며, 이를 DSB의 도입에 이어서 유전자 편집 부위에서 HDR에 의해 삽입한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 유전자의 붕괴 및 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 도입을 동시에 수행할 수 있으며, 이에 의해 상기 유전자는 부분적으로 CAR-암호화 핵산의 녹-인 또는 삽입에 의해 붕괴된다. 그러나, 일부 실시태양에서, 공여 핵산이 제공되지 않는다. 일부 실시태양에서, DSB의 도입에 이은 NHEJ-매개된 복구는, 예를 들어 미스센스 돌연변이 및/또는 프레임이동에 의해 유전자 붕괴를 일으킬 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이를 생성시킨다. 본 명세서에 기재된 실시태양 중 어느 하나에서, CRISPR/Cas9 시스템은 이중가닥 절단을 생성시킬 수 있으며, 이는 HPK-1 유전자에서 삽입 및 결실(인델)을 수행하는 비-상동 말단 연결에 의해 복구된다.
일부 실시태양에서, HPK-1 유전자 외에, 면역 세포 중 다른 유전자는 실질적으로 붕괴되지 않는다. 그러나, 일부 실시태양에서, 본 개시는 또한, 예를 들어 면역 세포 중에 PD-1 또는 PDL-1 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 표적화하는 추가적인 작용제를 도입시킴으로써, 상기 면역 세포 중의 하나 이상의 유전자를 추가로 붕괴시킴을 고려한다. PD-1 또는 PDL-1 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 붕괴시키는 몇몇 작용제가, 예를 들어 WO 2016/196388 및 WO 2017/193107에 기재된 바와 같이 공지되어 있다.
본 명세서에서 면역 세포의 HPK-1 유전학적 붕괴 효율은 일반적으로 높을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, HPK-1 유전자의 녹아웃 또는 유전학적 붕괴를 위한 작용제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포 조성물 중 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세포가 유전학적 붕괴를 함유하며; 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및/또는 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는다. 일부 실시태양에서, 본 명세서에서 면역 세포, 세포 조성물 및 방법은 HPK-1 유전자의 녹아웃 또는 유전학적 붕괴를 위한 작용제(예를 들어, gRNA/Cas9)가 도입된 세포 조성물 중 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세포의 HPK-1 유전자에서 또는 그 부근에서(예를 들어, 절단 부위의 상류 또는 하류 100 염기쌍내 또는 약 100 염기쌍 내, 50 염기쌍내 또는 약 50 염기쌍내, 또는 25 염기쌍내 또는 약 25 염기쌍 내, 또는 10 염기쌍내 또는 약 10 염기쌍 내)의 Cas9-매개된 절단 효율(%인델)을 특징으로 할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서에서 면역 세포, 세포 조성물 및 방법은 실시예 4에 기재된 바와 같은 T7E1 분석 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 따른 방법에 의해 측정된, 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율을 특징으로 할 수 있다.
일부 실시태양에서, HPK-1의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 갖는 세포는 몇몇 펩타이드의 발현 수준을 추가의 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴가 없거나, 상기 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 임의의 작용제에 도입되지 않음을 제외하고 실질적으로 동일한 대조용 면역 세포와 비교시, 본 명세서의 면역 세포는 전형적으로, 유식 세포측정에 의해 측정된, 감소된 수준의 PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3; 증대된 수준의 CD107a; 및/또는 감소된 수준의 애넥신 V를 가질 수 있다.
예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 명세서의 세포, 세포 조성물 및 방법은 또한 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단 중의 경우보다 낮은 것; 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신 V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단 중의 경우보다 낮은 것; 및/또는 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단 중의 경우보다 높은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대조용(면역) 세포" 또는 "대조용(면역) 세포 집단"(또한 "상응하는 조성물" 또는 "상응하는 세포 집단", "참조 조성물", 또는 "참조 세포 집단"이라 칭함)에 대한 언급은, T 세포 또는 T 세포 집단과 같은 세포가 면역 세포에서 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제(예를 들어, Cas9/gRNA)와 함께 도입되지 않았음을 제외하고, 동일하거나 실질적으로 동일한 조건하에서 수득되고/거나, 단리되고/거나, 생성되고/거나, 생산되고/거나, 배양된 면역 세포(예를 들어, T 세포, 예를 들어 Car-T 세포)를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제의 도입을 함유하지 않는 경우를 제외하고, 상기와 같은 세포 또는 T 세포는 상기 작용제가 도입된 T 세포 또는 세포와 동일하거나 실질적으로 동일하게 처리되며, 따라서 면역 세포 활성 및/또는 탈진 마커와 관련된 하나 이상의 분자, 예를 들어 PD-1, HPK-1, TIM-3, LAG-3의 상향조절 또는 발현을 포함하여 상기 세포의 활성 또는 성질에 영향을 미칠 수 있는 임의의 하나 이상의 조건은 상기 작용제의 도입 외에 상기 세포들간에 변하지 않거나 실질적으로 변하지 않는다. 예를 들어, 하나 이상의 분자(예를 들어, PD-1, HPK-1, TIM-3 및 LAG-3)의 발현의 감소 및/또는 상향조절의 억제를 평가하기 위해서, 상기 작용제의 도입을 함유하는 T 세포 및 상기 작용제의 도입을 함유하지 않는 T 세포를, T 세포 중 상기 하나 이상의 분자의 발현 및 또는 상향조절을 유도하는 것으로 공지된 동일한 조건하에서 배양한다.
PD-1, HPK-1, TIM-3 및 LAG-3과 같은 분자를 포함한, T 세포 마커의 발현 및/또는 수준을 평가하기 위한 방법 및 기법은 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에서 예시된다. 상기와 같은 마커의 검출을 위한 항체 및 시약은 당해 분야에 주지되어 있으며 쉽게 입수할 수 있다. 상기와 같은 마커의 검출을 위한 분석 및 방법은 비제한적으로 세포내 유식 세포측정을 포함한 유식 세포측정, ELISA, ELISPOT, 세포측정 비드 배열 또는 다른 멀티플렉스 방법, 웨스턴 블럿 및 다른 면역친화성-기반 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, T 세포상에서의 마커의 표면 발현의 평가는 투여 후 피실험자에서 투여된 항원 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포를 검출함을 포함한다. 피실험자에서 항원 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포를 검출하고 표면 마커의 수준을 평가하는 것은 숙련가의 기술 수준 내에 있다. 일부 실시태양에서, 항원 수용체(예를 들어, CAR)-발현 세포, 예를 들어 피실험자의 말초 혈액으로부터 수득된 세포를 유식 세포측정 또는 상기와 같은 세포 특유의 마커의 발현에 대한 다른 면역친화성 기반 방법에 의해 검출할 수 있으며, 이어서 상기와 같은 세포를 또 다른 T 세포 표면 마커 또는 마커들로 공-염색할 수 있다. 일부 실시태양에서, 비-면역원성 선택 에피토프로서 절두된 EGFR(EGFRt)을 함유하는 항원 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 T 세포를 생성시킬 수 있으며, 이어서 상기를 상기와 같은 세포의 검출을 위한 마커로서 사용할 수 있다(예를 들어, 미국특허 제8,802,374호를 참조하시오).
재조합 수용체(들)를 갖는 면역 세포
본 명세서에서 세포는 전형적으로 암과 같은 질병 또는 질환의 치료를 위해 입양에 의해 이식되는 면역 세포(예를 들어, T 세포)(예를 들어, CAR 또는 유전자이식 TCR을 발현하도록 조작된 세포)이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 피실험자로부터의 1차 세포, 예를 들어 피실험자로부터의 1차 면역 세포(예를 들어, T 세포)로부터 유래되고, 본 명세서의 HPK-1의 유전학적 붕괴를 유도할 수 있는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된)의 도입에 의해 생체외에서 변형될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 피실험자로부터 단리되고, 조작되며, 동일한 피실험자에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 상기는 한 명의 피실험자로부터 단리되고, 조작되고, 또 다른 피실험자에게 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "도입"이란 용어는 시험관내 또는 생체내에서 DNA를 세포내로 도입시키는 다양한 방법을 포함하며, 상기와 같은 방법은 형질전환, 형질도입, 형질감염(예를 들어, 전기천공) 및 감염을 포함한다. 벡터가 세포에 DNA 암호화 분자를 도입시키는데 유용하다. 가능한 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 다른 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 벡터를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 면역 세포, 예를 들어 T 세포를, 하나 이상의 유전자 조작된 핵산 또는 그의 생성물, 예를 들어 유전자 조작된 항원 수용체, 예를 들어 조작된 T 세포 수용체(TCR) 및 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예를 들어 키메릭 항원 수용체(CAR), 예를 들어 활성화, 자극, 및 보조자극 CAR, 및 이들의 조합을 도입시킴으로써 조작한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 또한 상기 세포에서 HPK-1 유전자의 감소, 억제 또는 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 도입시킨다.
본 명세서에 예시되는 바와 같이, HPK-1 유전자의 유전자 녹아웃과 같은 유전학적 붕괴는 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 기능적 성질 또는 본 명세서에 기재된 상기와 같은 재조합 수용체의 발현을 방해하지 않는다. 일부 실시태양에서, 재조합 수용체 및 상기 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴, 예를 들어 녹아웃에 의해 조작된 세포를 포함하는 본 명세서의 조성물은, 동일한 조건하에서 평가시, 상기 재조합 수용체로 조작되지만 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴는 포함하지 않는 상응하는 또는 참조 조성물의 조작된 세포에서 발현된 재조합 수용체에 비해 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 기능성 성질 또는 활성을 유지한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 항원에 대한 특이적인 결합을 유지한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 항원 결합시 세포에서 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비를 유도하는 활성화 또는 자극 활성을 유지한다. 일부 실시태양에서, 상기 제공된 조성물의 조작된 세포는 동일한 조건하에서 평가시, 상기 재조합 수용체로 조작되지만 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 포함하지 않거나 상기 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 상기와 같은 조작된 세포를 포함하는 상응하는 또는 참조 조성물에 비해 기능성 성질 또는 활성을 유지한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 상기와 같은 상응하는 또는 참조 조성물에 비해 세포독성, 증식, 생존 또는 사이토카인 분비를 유지한다(또는 상기가 증대된다).
일부 실시태양에서, 상기 조성물 중의 HPK-1 유전자 붕괴된 세포는 동일한 조건하에서 평가시 상응하는 또는 참조 조성물 중의 세포의 표현형에 비해 상기 면역 세포 또는 세포들의 표현형을 유지한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물 중의 세포는 미경험 세포, 효과기 기억세포, 중심 기억세포, 줄기 중심 기억세포, 효과기 기억세포, 및 장수 효과기 기억 세포를 포함한다. 일부 실시태양에서, T 세포, 또는 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하고 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 포함하는 T 세포의 백분율은, 상기 재조합 수용체로 조작되었지만 상기 유전학적 붕괴를 함유하지 않거나 상기 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않는 세포의 상응하는 또는 참조 집단 또는 조성물과 동일하거나 실질적으로 동일한 비-활성화된, 장수 기억 또는 중심 기억 표현형을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본 개시의 조성물은 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 및 CCR7+, 4-1BB+ (CD137+), TIM3+, CD27+, CD62L+, CD127+, CD45RA+, CD45RO-, t-베트로우(betlow), IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rp+, CXCR3+ 또는 LFA-1+ 중에서 선택된 하나 이상의 표현형 마커를 포함하는 T 세포를 포함한다.
상기와 같은 성질, 활성 또는 표현형의 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어 이들을 시험관내 분석에서, 예를 들어 37℃+2℃에서 또는 약 37℃+2℃에서 약 12, 24, 36, 48 또는 60시간 이하 또는 약 12, 24, 36, 48 또는 60시간 이하 동안, 예를 들어 항원 및/또는 하나 이상의 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-15 및/또는 IL-17)의 존재하에 상기 세포의 배양에 의해 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 평가된 활성, 성질 또는 표현형 중 어느 하나를 상기 작용제의 전기천공 또는 다른 도입에 이어서 다양한 날에, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7일 후에 또는 상기 일까지 평가할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 활성, 성질 또는 표현형은, 동일한 조건하에서 평가시 상기 재조합 수용체로 조작되었지만 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 포함하지 않는 세포를 함유하는 상응하는 조성물의 경우에 비해 상기 조성물 중의 세포의 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%에 의해 유지된다.
세포
다양한 세포가 본 개시의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포, 예를 들어 조작된 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되고, 면역계의 세포, 예를 들어 선천 또는 적응 면역의 세포, 예를 들어 골수 세포 또는 림프구를 포함한 림프 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 다른 예시적인 세포는 줄기세포, 예를 들어 다능성 및 만능성 줄기세포, 예를 들어 유도만능 줄기세포(iPSC)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어 피실험자로부터 직접 단리된 세포 및/또는 피실험자로부터 단리되고 동결된 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 부분집합, 예를 들어 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 그의 아집단, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확대, 재순환, 국소화, 및/또는 지속성 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획 중의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 한정되는 것들을 포함한다. 치료되는 피실험자에 관하여, 상기 세포는 동종이계 및/또는 자기유래일 수 있다. 상기 방법 중에는 규격(off-the-shelf) 방법이 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 규격 기술에 관하여, 상기 세포는 만능성 및/또는 다능성, 예를 들어 줄기세포, 예를 들어 유도만능 줄기세포(iPSC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 피실험자로부터 세포를 단리, 제조, 처리, 배양 및/또는 조작하고, 상기를 동결보전 전 또는 후에 동일한 환자에게 다시도입시킴을 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 하위유형 및 아집단 중에는 미경험 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 그의 하위유형, 예를 들어 줄기세포 기억 T(TSCMX 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙한 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, NK T 세포, 점막-관련 불변성 T(MAIT) 세포, 천연 및 적응 조절성 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 실시태양에서, 상기 T 세포 집단 중 하나 이상은 하나 이상의 특정 마커, 예를 들어 표면 마커에 대해 양성이거나(마커"1") 또는 상기 마커를 높은 수준으로 발현하거나(마커high), 또는 하나 이상의 마커에 대해 음성이거나(마커") 또는 상기 마커를 비교적 낮은 수준으로 발현하는(마커low) 세포가 풍부하거나 고갈된다. 일부의 경우에, 상기와 같은 마커는 T 세포의 몇몇 집단(예를 들어, 비-기억 세포)상에서 존재하지 않거나 비교적 낮은 수준으로 발현되지만 T 세포의 몇몇 다른 집단(예를 들어, 기억 세포)상에서는 존재하거나 비교적 높은 수준으로 발현되는 것들이다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포(예를 들어, CD8+　세포 또는 T 세포, 예를 들어 CD3+　세포)는 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, 및/또는 CD62L에 대해 양성이거나 상기를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포가 풍부하고(즉, 상기에 대해 양성적으로 선택되고), 및/또는 CD45RA에 대해 양성이거나 상기를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포가 고갈된다(예를 들어, 음성적으로 선택된다). 일부 실시태양에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Ra(CD 127)에 양성이거나 상기를 높은 표면 수준으로 발현하는 세포가 풍부하거나 고갈된다. 일부의 예에서, CD8+ T 세포는 CD45RO(또는 CD45RA에 대해 음성) 및 CD62L에 대해 양성인 세포가 풍부하다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 CD4+ T 세포 집단 또는 CD8+ T 세포 아집단, 예를 들어 중심 기억(TCM) 세포가 풍부한 아집단일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 세포는 자연살해(NK) 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 단핵구 또는 과립구, 예를 들어 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구, 및/또는 호염기구이다.
재조합 수용체
입양 면역요법을 위해서, 본 명세서의 세포는 전형적으로 재조합 수용체를 함유한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 상기와 같은 핵산의 유전자 조작된 생성물을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 비상동성이고, 즉 세포 또는 상기 세포로부터 수득된 샘플, 예를 들어 또 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 샘플 중에 통상적으로 존재하지 않으며, 예를 들어 조작되는 세포 및/또는 상기와 같은 세포가 유래된 유기체 중에서 통상적으로 발견되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산은 천연이 아니고, 예를 들어 자연에서 발견되지 않으며, 다수의 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산의 키메릭 조합을 포함하는 핵산이 포함된다.
상기 세포는 일반적으로 재조합 수용체, 예를 들어 기능성 비-TCR 항원 수용체를 포함한 항원 수용체, 예를 들어 키메릭 항원 수용체(CAR) 및 다른 항원-결합 수용체, 예를 들어 유전자이식 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 또한 상기 수용체 중에는 다른 키메릭 수용체가 있다.
CAR을 포함한 예시적인 항원 수용체, 및 상기와 같은 수용체를 조작하고 세포에 도입시키는 방법은 예를 들어 국제 특허출원 공보 WO 2000/14257, WO 2013/126726, WO 2012/129514, WO 2014/031687, WO 2013/166321, WO 2013/071154, WO 2013/123061, 미국 특허출원 공보 US 2002/131960, US 2013/287748, US 2013/0149337, 미국특허 제6,451,995호, 미국특허 제7,446,190호, 미국특허 제8,252,592호, 미국특허 제8,339,645호, 미국특허 제8,398,282호, 미국특허 제7,446,179호, 미국특허 제6,410,319호, 미국특허 제7,070,995호, 미국특허 제7,265,209호, 미국특허 제7,354,762호, 미국특허 제7,446,191호, 미국특허 제8,324,353호, 및 미국특허 제8,479,118호, 및 유럽 특허출원 EP2537416에 기재된 것들, 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398]; 문헌[Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]; 문헌[Turtle et al., Curr. Opin. Immunol, 2012 October; 24(5): 633-39]; 문헌[Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항원 수용체는 미국특허 제7,446,190호에 기재된 바와 같은 CAR, 및 국제 특허출원 공보 WO 2014/055668 Al에 기재된 것들을 포함한다. 상기 CAR의 예는 상기 언급한 공보 중 어느 하나, 예를 들어 WO 2014/031687, 미국특허 제8,339,645호, 미국특허 제7,446,179호, US 2013/0149337, 미국특허 제7,446,190호, 미국특허 제8,389,282호, 문헌[Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)]; 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701]; 및 문헌[Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR을 포함한다. 또한 WO 2014/031687, 미국특허 제8,339,645호, 미국특허 제7,446,179호, US 2013/0149337, 미국특허 제7,446,190호, 및 미국특허 제8,389,282호를 참조하시오. 상기 키메릭 수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예를 들어 항체 분자의 일부, 일반적으로 항체, 예를 들어 scFv 항체 단편의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 실시태양에서, 상기 항원은 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 실시태양에서, 상기 항원은 정상 또는 표적화되지 않은 세포 또는 조직에 비해, 질병 또는 질환의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 실시태양에서, 상기 항원은 정상 세포상에서 발현되고/되거나 조작된 세포상에서 발현된다.
일부 실시태양에서 상기 수용체(예를 들어, CAR)에 의해 표적화된 항원은 희귀 타이로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성 암항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, 빌름 종양 1(WT-1), 사이클린, 예를 들어 사이클린 Al(CCNA1), 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체, 예를 들어 CAR은 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성 암항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름 종양 1(WT-1), 사이클린 Al(CCNA1), BCMA 및 인터류킨 12 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 CD19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2 및/또는 메소텔린에 특이적으로 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 병원체-특이성 항원에 결합한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR)는 바이러스 항원(예를 들어, HIV, HCV, HBV 등), 세균 항원 및/또는 기생충 항원에 특이성이다.
일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어 힌지 영역, 예를 들어 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역 중 적어도 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 불변 영역 또는 일부는 인간 IgG, 예를 들어 IgG4 또는 IgG1을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 불변 영역 부분은 항원-인식 성분, 예를 들어 scFv와 막관통 도메인 사이에서 이격자 영역으로서 작용한다. 상기 이격자는 상기 이격자 부재하의 경우에 비해, 항원 결합에 따른 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 이격자, 예를 들어 힌지 영역은 국제 특허출원 공보 WO 2014/031687에 기재된 것을 포함한다. 일부의 예에서, 상기 이격자는 길이가 12 아미노산 또는 약 12 아미노산이거나 길이가 12 아미노산 이하이다. 예시적인 이격자는 적어도 약 10 내지 229 아미노산, 약 10 내지 200 아미노산, 약 10 내지 175 아미노산, 약 10 내지 150 아미노산, 약 10 내지 125 아미노산, 약 10 내지 100 아미노산, 약 10 내지 75 아미노산, 약 10 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40 아미노산, 약 10 내지 30 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산, 또는 약 10 내지 15 아미노산, 및 상기 나열된 범위 중 어느 한 범위의 종점 사이의 임의의 정수를 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 이격자 영역은 약 12 아미노산 이하, 약 119 아미노산 이하, 또는 약 229 아미노산 이하를 갖는다. 예시적인 이격자는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다.
이러한 항원 인식 도메인은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 성분, 예를 들어 항원 수용체 복합체, 예를 들어 TCR 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호전달 성분, 및 CAR의 경우에 임의의 관련된 보조자극 신호, 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호에 연결된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 항원-결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 하나의 실시태양에서, 자연적으로 수용체, 예를 들어 CAR 중의 도메인 중 하나와 관련된 막관통 도메인이 사용된다. 일부의 예에서, 상기 막관통 도메인은, 상기와 같은 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 피하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형된다.
일부 실시태양에서 상기 막관통 도메인은 자연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 상기 공급원이 자연적인 경우, 일부 실시태양에서 상기 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타, 또는 제타 쇄로부터 유래된 것들을 포함한다(즉, 적어도 상기의 막관통 영역을 포함한다). 한편으로, 일부 실시태양에서 상기 막관통 도메인은 합성적이다. 일부 실시태양에서, 상기 합성적 막관통 도메인은 우세하게 소수성 잔기, 예를 들어 류신 및 발린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿이 합성적 막관통 도메인의 양쪽 단부에서 발견될 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 연결은 링커, 이격자, 및/또는 막관통 도메인에 의한다.
상기 세포내 신호전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호(예를 들어, CD3 신호), 보조자극 수용체와 함께 상기와 같은 수용체를 통한 신호(예를 들어, CD3/CD28 신호), 및/또는 보조자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것들이 있다. 일부 실시태양에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 길이가 2 내지 10 아미노산인 링커, 예를 들어 글리신 및 세린을 함유하는 것, 예를 들어 글리신-세린 더블릿이 존재하며 상기 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호전달 도메인간의 연결을 형성한다.
상기 수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 수용체는 TCR 복합체의 세포내 성분, 예를 들어 T 세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 쇄를 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 실시태양에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 다른 CD3 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 수용체, 예를 들어 CAR은 하나 이상의 추가적인 분자의 일부, 예를 들어 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 CAR 또는 다른 키메릭 수용체는 CD3-제타 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메릭 분자를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 CAR 또는 다른 키메릭 수용체의 결찰시, 상기 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포, 예를 들어 상기 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상적인 효과기 기능 또는 반응 중 하나 이상를 활성화한다. 예를 들어, 일부 상황에서, 상기 CAR은 T 세포의 기능, 예를 들어 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예를 들어 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 실시태양에서, 항원 수용체 성분 또는 보조자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이, 예를 들어 상기 부분이 효과기 기능 신호를 전달하는 경우, 완전한 면역자극 쇄 대신에 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 세포내 신호전달 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열, 및 일부 실시태양에서, 자연적인 상황에서 항원 수용체 관여에 이어서 신호전달을 개시시키기 위해 상기와 같은 수용체와 협력하여 작용하는 보조-수용체의 서열을 포함한다.
천연 TCR의 상황에서, 완전한 활성화는 일반적으로 상기 TCR을 통한 신호전달뿐만 아니라 보조자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 보조-자극 신호의 생성 성분이 또한 상기 CAR에 포함된다. 다른 실시태양에서, 상기 CAR은 보조자극 신호를 생성시키는 성분을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 추가적인 CAR이 동일한 세포에서 발현되며 상기 2차 또는 보조자극 신호의 발생 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 실시태양에서 2가지 부류의 세포질 신호전달 서열에 의해 매개되는 것으로 기재된다: TCR을 통한 항원-의존적인 1차 활성화를 개시시키는 서열(1차 세포질 신호전달 서열), 및 항원-독립적인 방식으로 작용하여 2차 또는 보조-자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호전달 서열). 일부 실시태양에서, 상기 CAR은 상기와 같은 신호전달 성분 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 타이로신-계 활성화 동기 또는 ITAM으로서 공지된 신호전달 동기를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 CAR 중 세포질 신호전달 분자는 세포질 신호전달 도메인, 그의 일부, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 실시태양에서, 상기 CAR은 보조자극 수용체, 예를 들어 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS의 신호전달 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 같은 CAR은 활성화 및 보조자극 성분을 모두 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 상기 보조자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 실시태양에서, 상기 CAR은 활성화 또는 자극 CAR, 보조자극 CAR을 포함하며, 이 둘은 모두 동일한 세포상에서 발현된다(WO 2014/055668을 참조하시오). 일부 실시태양에서, 상기 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 보조자극 CAR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 억제성 CAR(iCAR, 문헌[Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215)](2013년 12월)을 참조하시오), 예를 들어 질병 또는 질환과 관련된 및/또는 상기에 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR을 추가로 포함하며, 이에 의해 상기 질병-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는 상기 억제성 CAR의 그의 리간드에의 결합에 의해 감소되거나 억제되어, 예를 들어 표적-외 효과를 감소시킨다.
몇몇 실시태양에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메릭 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 보조자극 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 CAR은 세포질 부분 중에 하나 이상, 예를 들어 2개 이상의 보조자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 CAR 또는 다른 항원 수용체는, 상기 수용체, 예를 들어 세포 표면 수용체의 절두된 버전, 예를 들어 절두된 EGFR(tEGFR)을 발현하는 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있는 마커, 예를 들어 세포 표면 마커를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 마커는 치료학적 기능을 제공하지 않고/않거나, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포의 선택을 위한 유전공학용 마커로서 사용되는 것 이외의 효과는 생성시키지 않는다. 다른 실시태양에서, 상기 마커는 치료학적 분자이거나 달리 일부 목적하는 효과를 발휘하는 분자, 예를 들어 생체내에서 접하게 되는 세포에 대한 리간드, 예를 들어 입양 이식 및 리간드와 조우시 세포의 반응을 증대시키고/시키거나 꺽는 보조자극 또는 면역관문 분자일 수 있다.
CAR을 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CAR로 칭할 수 있다. 일부 실시태양에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-쇄 유도된 신호를 제공하는 것이고; 일부 실시태양에서, 2세대 CAR은 상기와 같은 신호 및 보조자극 신호를 제공하는 것, 예를 들어 CD28 또는 CD137과 같은 보조자극 수용체로부터의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것이며; 일부 실시태양에서, 3세대 CAR은 상이한 보조자극 수용체의 다수의 보조자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체 또는 단편은 scFv를 포함하고 상기 세포내 도메인은 ITAM을 함유한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 쇄의 제타 쇄의 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 상기 세포외 도메인과 상기 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 T 세포 보조자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포 보조자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
"폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는데 호환 가능하게 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 수용체 및 다른 폴리펩타이드, 예를 들어 링커 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 폴리펩타이드의 발현-후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 및 인산화를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드는 상기 단백질이 목적하는 활성을 유지하는 한, 고유 또는 천연 서열에 관한 변형을 함유할 수 있다. 이들 변형은 부위-지향된 돌연변이유발을 통해서처럼 의도적이거나, 단백질을 생성시키는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우발적일 수도 있다.
일부 실시태양에서, 상기 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 천연 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 실시태양에서, 표적 항원(예를 들어, 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론이 식별되고, 환자로부터 단리되고, 세포내로 도입된다. 일부 실시태양에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역계 유전자(예를 들어, 인간 백혈구 항원계, 또는 HLA)에 의해 조작된 유전자이식 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원을 참조하시오(예를 들어, 문헌[Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15: 169-180] 및 문헌[Cohen et al. (2005) Immunol. 175:5799-5808]을 참조하시오). 일부 실시태양에서, 파지 디스플레이가 표적 항원에 대한 TCR을 단리시키는데 사용된다(예를 들어, 문헌[Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14: 1390-1395] 및 문헌[Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354]을 참조하시오).
일부 실시태양에서, 상기 T 세포 클론을 수득한 후에, 상기 TCR 알파 및 베타 쇄를 단리하고 유전자 발현 벡터내로 클로닝시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 TCR 알파 및 베타 유전자를, 2개의 쇄가 모두 동시-발현되도록 피코르나바이러스 2A 리보솜 스킵 펩타이드를 통해 연결시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 TCR의 유전자 이식을 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해, 또는 트랜스포손을 통해 수행한다(예를 들어, 문헌[Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13: 1050-1063]; 문헌[Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18: 1748-1757]; 및 문헌[Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683]을 참조하시오).
CRISPR/Cas9 시스템
다양한 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 본 명세서의 면역 세포에서 유전학적 붕괴, 예를 들어 HPK-1 유전자의 유전자 녹아웃을 유도할 수 있다. 전형적으로, 상기 면역 세포에, 상기 HPK-1 유전자의(예를 들어, 제1 또는 제2 엑손 중의) 표적 도메인 또는 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나, 상기에 결합하거나, 상기를 인식하거나, 상기에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 갖는, Cas9 분자 및 gRNA를 포함하는 작용제를 도입시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 면역 세포에 도입된 작용제는 상기 HPK-1-표적화된 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 gRNA의 리보핵단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나 상기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 도입은 상기 작용제 또는 그의 일부를 상기 면역 세포와 시험관내에서 접촉시킴을 포함하며, 상기 접촉은 상기 세포 및 작용제를 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일까지 또는 그 이상 동안 배양함을 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 상기 Cas9 및 gRNA 또는 암호화 폴리뉴클레오타이드를, 예를 들어 전기천공에 의해 세포내에 직접 도입시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 작용제를 상기 세포와 접촉시키기 전, 상기 접촉 도중 또는 상기 접촉에 후속적으로, 및/또는 전달(예를 들어, 전기천공)을 수행하기 전, 상기 수행 도중 또는 상기 수행에 후속적으로, 상기 세포를 카이토카인, 자극제 및/또는 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 증식을 유도할 수 있는 작용제의 존재하에서 배양할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 배양의 적어도 일부는, CD3에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나 이들을 포함하는 자극제의 존재하에서이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양의 적어도 일부는 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-5 중의 하나의 존재하에서이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양은 상기 전기천공 전 또는 후 8일까지의 시간, 예를 들어 24시간, 36시간 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일까지 또는 그 이상 동안이다. 일부 실시태양에서, 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28) 및/또는 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15) 존재하에서의 배양은 상기 전기천공 전 24시간, 25시간 또는 48시간까지이다.
gRNA
일부 실시태양에서, 상기 세포에 도입되는 작용제는 HPK-1 유전자 자리의 영역을 표적화하는 gRNA, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA 분자는 단분자(단일 RNA 분자를 가짐)일 수 있으며, 때때로 본 명세서에서 "키메릭" gRNA, 또는 모듈식(하나 초과, 및 전형적으로 2개의 별도의 RNA 분자를 포함하는)으로 지칭된다.
일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 5'에서 3'으로, 표적 핵산, 예를 들어 HPK-1 유전자로부터의 서열(예시적인 서열은 서열번호 16 및 17에 제공되며; 또한 NCBI 수탁번호 NM_007181 및 NM_001042600을 참조하시오)에 상보적인 표적화 도메인, 제1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제2 상보적 도메인(상기 제1 상보적 도메인에 상보성이다); 근위 도메인; 및 임의로 꼬리 도메인을 포함하는 키메릭 gRNA이다.
일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 제1 및 제2 가닥을 포함하는 모듈식 gRNA이다. 이러한 경우에, 상기 제1 가닥은 바람직하게는 5'에서 3'으로, 표적화 도메인(상기는 표적 핵산, 예를 들어 HPK-1 유전자로부터의 서열(예시적인 서열은 서열번호 16 및 17에 제공되며; 또한 NCBI 수탁번호 NM_007181 및 NM_001042600을 참조하시오)에 상보적이다) 및 제1 상보적 도메인을 포함한다. 상기 제2 가닥은 일반적으로 5'에서 3'으로, 임의로 5' 연장 도메인; 제2 상보적 도메인;' 근위 도메인; 및 임의로 꼬리 도메인을 포함한다.
상기 gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산(예를 들어, HPK-1 유전자, 예를 들어 제1 또는 제2 엑손)상의 표적 서열에 상보적인, 예를 들어 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적인, 예를 들어 충분히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 표적 서열을 포함하는 표적 핵산의 가닥을 본 명세서에서 상기 표적 핵산의 "상보적 가닥"이라 칭한다. 표적화 도메인의 선택에 관한 안내를, 예를 들어 문헌[Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi:10.1038/nbt.2808)] 및 문헌[Sternberg SH et al, Nature 2014 (doi: 10.1038/naturel3011)]에서 찾을 수 있다.
상기 표적화 도메인은 RNA 분자의 부분이며 따라서 유라실(U) 염기를 포함할 것인 반면, 상기 gRNA 분자를 암호화하는 임의의 DNA는 티민(T) 염기를 포함할 것이다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 하나의 실시태양에서, 표적화 도메인과 표적 서열의 상보성은 상기 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체와 표적 핵산과의 상호작용의 특이성에 기여하는 것으로 여겨진다. 표적화 도메인 및 표적 서열쌍에서, 상기 표적화 도메인 중의 유라실 염기는 상기 표적 서열 중의 아데닌 염기와 짝을 이룰 것으로 생각된다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적화 도메인은 길이가 5 내지 50개 뉴클레오타이드이다. 상기 표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥을 본 명세서에서 상보적 가닥이라 칭한다. 상기 도메인의 뉴클레오타이드 중 일부 또는 전부는 변형을 가질 수 있고, 예를 들어 상기를 분해에 덜 민감성으로 만들어 생체적합성을 개선시키는 변형 등을 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 상기 표적화 도메인의 주쇄를 포스포로티오에이트 또는 다른 변형으로 변형시킬 수 있다. 일부의 경우에, 상기 표적화 도메인의 뉴클레오타이드는 2' 변형, 예를 들어 2-아세틸화, 예를 들어 2' 메틸화, 또는 다른 변형을 포함할 수 있다.
다양한 실시태양에서, 본 명세서의 gRNA의 표적화 도메인은 길이가 16 내지 26개 뉴클레오타이드이다(즉, 상기는 길이가 16개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 17개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 뉴클레오타이드이다).
일부 실시태양에서, 상기 표적 서열(표적 핵산)은 HPK-1 자리 또는 그 부근에서, 예를 들어 서열번호 16 및 17 중 HPK-1 암호화 서열의 임의의 부분이다. 일부 실시태양에서, 상기 표적화 도메인에 상보적인 표적 핵산은 관심 유전자, 본 명세서에서 HPK-1 유전자의 초기 암호화 영역에 위치한다. 상기 초기 암호화 영역의 표적화를 사용하여 관심 유전자, 예를 들어 HPK-1 유전자를 녹아웃시킬 수 있다(즉, 그의 발현을 제거할 수 있다). 일부 실시태양에서, 상기 관심 유전자(예를 들어, HPK-1 유전자)의 초기 암호화 영역은 개시 코돈(예를 들어, ATG) 바로 다음의 서열, 또는 상기 개시 코돈의 500 bp 이내(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 또는 l0 bp 미만)에 있는 서열을 포함한다. 특정 예에서, 상기 표적 핵산은 상기 개시 코돈의 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 l0 bp 이내에 있다. 일부 예에서, 상기 표적 핵산은 상기 HPK-1 유전자의 제1 또는 제2 엑손 중에 위치한다. 일부 예에서, 상기 gRNA의 표적화 도메인은 표적 핵산, 예를 들어 상기 HPK-1 자리 중의 표적 핵산상의 표적 서열에 상보적이고, 예를 들어 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적이고, 예를 들어 충분히 상보적이다.
일부 실시태양에서, HPK-1의 녹아웃 또는 녹다운을 위한 표적 도메인은 서열번호 1 및 11 내지 15 중 어느 하나 중에서 선택된 서열이거나 상기 서열을 포함한다.
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일부 실시태양에서, 상기 gRNA의 표적화 도메인은 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 충분히 상보적인 서열과 동일하거나 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드 이하로 상이하다.
Cas9
일부 실시태양에서, 상기 작용제는 Cas9 분자 또는 상기 Cas9를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제는 Cas9/gRNA 분자 복합체(예를 들어, 본 명세서의 gRNA 중 어느 하나와 본 명세서의 Cas9 중 어느 하나에 의해 형성됨), 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 Cas9 단백질 및 gRNA는 분리될 수 있으며, 이들을 예를 들어 약 10:1 내지 약 1:10(Cas9 대 gRNA, 질량 기준)의 비로 배양하여 gRNA/Cas9 복합체를 형성시킬 수 있고, 이어서 상기를, 예를 들어 전기천공에 의해 면역 세포내로 전달할 수 있다. 전형적으로, 상기 유전자 붕괴에 사용되는 gRNA/Cas9 복합체의 양은 약 1 내지 100 ㎍/1x106 세포일 수 있다.
당해 분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는, 가이드 RNA(gRNA) 분자와 상호작용할 수 있고 상기 gRNA 분자와 협력하여, 표적 도메인 및 PAM 서열(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의 경우에, NGG PAM, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 경우에, NNGRR(예를 들어, NNGRRT 또는 NNGRRV) PAM, 및 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningtidis)의 경우에, NNNNGATT 또는 NNNNGCTT PAM)을 포함하는 부위로 국소화되는 폴리펩타이드이다.
다양한 종의 Cas9 분자를 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 Cas9 분자는 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 또는 네이세리아 메닌지티디스 Cas9이다. 비제한적인 유용한 Cas9 분자는 스트렙토코커스 피오게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 메닌지티디스, 스트렙토코커스 써모필레스(Streptococcus thermophiles), 애시도보 액스 아베나에(Acidovo ax avenae), 액티노바실러스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 액티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 액티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 액티노마이세스 스페시즈(Actinomyces species), 사이클리필루스데니트리피칸스(Cycliphilusdenitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 스미티이(Bacillus smithii), 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 스페시즈(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Bslastopirellula marina), 브라디리조븀 스페시즈(Bradyrhizobium species), 브레비바실러스 라테로스포숙스(Brevibacillus laterospoxus), 캄필로박터 콜리(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 콕시네박테리움 아콜렌스(Coxynebacterium accolens), 콕시네박테리움 디프테리아(Coxynebacterium diphtheria), 콕시네박테리움 마트루코티이(Coxynebacterium matruchotii), 디녹소세오박터 쉬바에(Dinoxoseobacter shibae), 유박테리움 돌리쿰(Eubacterium dolichum), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 하에모필루스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 하에모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라에(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비이(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세아에 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 스페시즈(Methylocystis species), 메틸로시누스 트리코스폭시움(Methylosinus trichospoxium), 모빌룬쿠스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포르미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 스페시즈(Neisseria species), 네이세리아 와즈복스티이(Neisseria wadswoxthii), 니트로소모나스 스페시즈(Nitrosomonas species), 파르비바쿨룸 라바멘티복산스(Parvibaculum lavamentivoxans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기이(Ralstonia syzygii), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 스페시즈(Rhodovulum species), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 스페시즈(Sphingomonas species), 스폭소락토바실러스 비네아에(Spoxolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 루그듀넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 스페시즈(Streptococcus sp.), 서브도리그라눌룸 스페시즈(Subdoligranulum species), 티스트렐라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 스페시즈(Treponema sspecies) 또는 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae)를 포함한 종으로부터 유래되는 것들을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서의 방법에 사용되는 Cas9 분자는 야생형 Cas9 분자이다. 전형적으로, 야생형 Cas9 분자는 표적 핵산 분자의 2개 가닥을 모두 절단한다. 일부 실시태양에서, 변경된 뉴클레아제 절단 성질(또는 다른 성질)을 갖는, 예를 들어 표적 핵산을 절단하는 능력이 없는 변형된 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드, 예를 들어 닉카제를 또한 사용할 수 있다. 포유동물 발현의 경우, 일부 실시태양에서, 세균 Cas9 cDNA를, 예를 들어 인간화된 Cas9 cDNA 내로 코돈 최적화할 수 있다.
예시적인 천연 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재되어 있다. 상기와 같은 Cas9 분자는 클러스터 1 내지 78 세균과의 Cas9 분자를 포함한다. 예시적인 천연 Cas9 분자는 클러스 1 세균과의 Cas9 분자를 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(예를 들어, 균주 SF370, MGAS 10270, MGAS 10750, MGAS2096, MGAS315, MGAS5005, MGAS6180, MGAS9429, NZ131 및 SSI-1), 스트렙토코커스 써모필루스(예를 들어, 균주 LMD-9), 스트렙토코커스 슈도포르시누스(예를 들어, 균주 SPIN 20026), 스트렙토코커스 뮤탄스(예를 들어, 균주 UA159, NN2025), 스트렙토코커스 마카카에(예를 들어, 균주 NCTC11558), 스트렙토코커스 갈로리티쿠스(예를 들어, 균주 UCN34, ATCC BAA-2069), 스트렙토코커스 에퀴네스(예를 들어, 균주 ATCC 9812, MGCS 124), 스트렙토코커스 디스탈락티아에(예를 들어, 균주 GGS 124), 스트렙토코커스 보비스(예를 들어, 균주 ATCC 700338), 스트렙토코커스 안기노수스(예를 들어, 균주 F0211), 스트렙토코커스 아갈락티아에(예를 들어, 균주 NEM316, A909), 리스테리아 모노사이토게네스(예를 들어, 균주 F6854), 리스테리아 인노쿠아(엘 인노쿠아, 예를 들어, 균주 Clipl l262), 엔테로코커스 이탈리쿠스(예를 들어, 균주 DSM 15952), 또는 엔테로코커스 파에시움(예를 들어, 균주 1,231,408)의 Cas9 분자를 포함한다. 또 다른 예시적인 Cas9 분자는 네이세리아 메닌지티디스의 Cas9 분자이다(문헌[Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]).
일부 실시태양에서, 적합한 Cas9 분자를, 상기 Cas9 분자의 인간 면역 세포 핵내로의 진입을 촉진할 수 있는 하나 이상의 인간 서열, 예를 들어 핵 국소화 서열(예를 들어, Cas9 분자의 C- 및 N-말단 중 하나 또는 둘 다에 삽입된)을 통합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 핵 국소화 신호 또는 서열(NLS)은 핵 수송에 의해 세포 핵내로의 수입을 위해 단백질을 "태그하는" 아미노산 서열이다. 전형적으로, 상기 신호는 상기 단백질 표면상에 노출된 양으로 하전된 리신 또는 아르기닌의 하나 이상의 짧은 서열로 이루어진다. 상이한 핵 국소화된 단백질은 동일한 NLS를 공유한다. 상기 Cas9 핵 활성은 전형적으로 상기와 같은 NLS의 도입에 의해 유지되며, 따라서 상기는 NHEJ 또는 HDR 복구를 위한 이중가닥 절단을 생성시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 인간 세포와 같은 포유동물 세포에서의 발현을 촉진하기 위해서, 전형적으로 코돈-최적화된 Cas9 cDNA를 사용할 수 있다. 상기와 같은 "인간화된 Cas9"의 예는, 예를 들어 문헌[Chang, N. et al., Cell Research 23:465-472 (2013)]에 기재된 바와 같이, 상기 문헌 중에 보고된 인간화된, 코돈-최적화된 Cas9 cDNA의 서열 및 단백질 서열을 포함하여 공지되어 있으며 상기 문헌의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다. 다른 NLS도 또한 Cas9의 세포 핵내로의 진입을 촉진하기에 적합할 수 있으며, 예를 들어 미국특허 제8,795,965호에서와 같이 보고되었다.
핵산, 벡터 및 전달
전형적으로, 본 명세서의 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴는 상기 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 면역 세포에 도입시키고/거나(배양이 이어질 수 있다), 배양하고/거나, 확대시키고/거나, 상기 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 함유하는 세포를 선택함으로써 수행될 수 있다.
HPK-1 유전자의 붕괴를 위한 작용제를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 상이한 방법을 통해 면역 세포내로 전달할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 작용제는 상기 HPK-1 유전자에 특이적으로 결합하거나, HPK-1 유전자를 인식하거나, HPK-1 유전자에 하이브리드화하는 안티센스 분자, siRNA, shRNA, miRNA, 유전자 편집 뉴클레아제, 아연 집게 뉴클레아제 단백질(ZFN), TAL-효과기 뉴클레아제(TALEN) 또는 CRISPR-Cas9 조합이거나, 이를 포함하거나, 이를 암호화하는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 상기와 같은 작용제를 일부 실시태양에서, 예를 들어 전기천공, 리포솜 또는 나노입자 등에 의해 면역 세포내로 직접 전달할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 분자를 암호화하는 핵산 분자를 면역 세포내로 전달할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 핵산 분자 또는 그의 복합체를 당해 분야에 주지된 방법에 의해 세포, 예를 들어 T 세포내로 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 방법은 비제한적으로, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스), 리포솜 또는 나노입자 형태의 도입을 포함한다. 일부 실시태양에서, 방법은 미세주사, 전기천공, 유전자총법, 칼슘 포스페이트 형질감염, 세포 압축, 압착을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포에서의 발현에 비추어 벡터, 보다 특히 플라스미드 또는 바이러스에 포함시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터는 주지된 방법에 의해 표적 세포(예를 들어, 본 명세서의 면역 세포 또는 면역 세포내로의 도입을 위해 gRNA를 생성시키기 위한 세포)내에 도입될 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 감마레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 벡터일 수 있다.
본 명세서의 gRNA/Cas9 시스템을 다양한 방법에서, 전형적으로 시험관내 또는 생체외에서 표적 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 DNA를 당해 분야-공지된 방법에 의해, 예를 들어 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터), 비-벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체 사용), 또는 이들의 조합에 의해 세포내로 전달할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 Cas9- 및/또는 gRNA-암호화 DNA를 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달할 수 있다. 상기 벡터는 Cas9 분자 및/또는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터는 조절/통제 요소, 예를 들어 프로모터, 예를 들어 U6 또는 T7 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터)는 본 명세서의 gRNA 분자, 예를 들어 HPK-1 유전자의 표적 도메인(예를 들어, HPK-1 유전자의 하나 이상의 엑손, 예를 들어 제1 또는 제2 엑손, 예를 들어 서열번호 1 및 11 내지 15)과 상보적(예를 들어, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 상보적 또는 충분한 상보적)인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터)는 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 충분히 상보적인 서열과 동일하거나 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드 이하로 상이한 표적화 도메인을 포함하는 gRNA를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터는 서열번호 3 및 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 플라스미드 벡터이다. 일부 실시태양에서, 상기 플라스미드 벡터는 pUC57kan-T7-gRNA이다.
일부 실시태양에서, 상기 벡터 또는 전달 비히클은 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스의 생성을 위한)이다. 일부 실시태양에서, 상기 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 일부 실시태양에서, 상기 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는, 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 우두 바이러스, 폭스바이러스, 및 헤르페스 단순 바이러스를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이러스 벡터는 복제 적격성일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 바이러스 벡터는 복제 결함성일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 gRNA 및 Cas9 단백질을 제조 및 단리하고, 이어서, 예를 들어 전기천공을 통해 표적 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 gRNA를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터를 상기 gRNA의 제조에 사용할 수 있다. 이어서, 상기 gRNA를 본 명세서의 면역 세포내로의 전달을 위해 단리 및/또는 정제할 수 있다. 상기 gRNA를 Cas9 단백질, 예를 들어 gRNA/Cas9 복합체와 함께 면역 세포내로 전달할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA를, 별도의 단백질 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산/벡터로서 세포에 도입될 수 있는 Cas9 단백질과 별도로 면역 세포내로 전달할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 면역 세포에 도입되는 작용제는 HPK-1-표적화된 표적화 도메인을 함유하는 Cas9 및 gRNA의 리보핵단백질(RNP) 복합체(Cas9/gRNA RNP)이거나 상기를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 도입은 상기 작용제 또는 그의 일부를 시험관내에서 상기 면역 세포와 접촉시킴을 포함하며, 상기 접촉은 상기 세포 및 작용제를 24, 36 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일까지 또는 그 이상 동안 배양함을 포함할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 상기 Cas9 및 gRNA 또는 상기 암호화 폴리뉴클레오타이드를, 예를 들어 전기천공에 의해 세포내에 직접 도입시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 작용제를 상기 세포와 접촉시키기 전, 상기 접촉 도중 또는 상기 접촉에 후속적으로, 및/또는 전달(예를 들어, 전기천공)을 수행하기 전, 상기 수행 도중 또는 상기 수행에 후속적으로, 상기 세포를 카이토카인, 자극제 및/또는 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 증식을 유도할 수 있는 작용제의 존재하에서 배양할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 배양의 적어도 일부는, CD3에 특이적인 항체, CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인이거나 이들을 포함하는 자극제의 존재하에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 배양의 적어도 일부는 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-7 및 IL-5 중 하나의 존재하에 있다. 일부 실시태양에서, 상기 배양은 상기 전기천공 전 또는 후 8일까지의 시간 동안, 예를 들어 24시간, 36시간 또는 48시간 또는 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일까지 또는 그 이상 동안이다. 일부 실시태양에서, 자극제(예를 들어, 항-CD3/항-CD28) 및/또는 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15) 존재하에서의 배양은 상기 전기천공 전 24시간, 25시간 또는 48시간까지이다.
상기 gRNA 및 Cas9 단백질과 같은 작용제의 다른 전달 방법은 당해 분야에 공지된 것들을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 명세서의 면역 세포는 재조합 수용체를 추가로 포함하며, 상기 작용제(예를 들어, gRNA/Cas9 복합체)의 도입은 상기 재조합 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산 또는 그의 생성물의 도입과 동시에 또는 상기 도입과 순차적으로 일어날 수 있다.
일부 실시태양에서, 다양한 시점에서, 예를 들어 작용제 도입후 24 내지 72시간째에 유전자(예를 들어, HPK-1)의 녹아웃 정도(한편으로 녹아웃 효율로서 지칭됨)를, 세포에서 유전학적 붕괴를 평가하기 위한 다수의 주지된 분석 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어 본 명세서의 실시예 섹션에 기재된 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 시점에서, 예를 들어 작용제 도입후 24 내지 72시간째에 유전자의 녹다운 정도를, 세포에서의 유전자 발현을 평가하기 위한 다수의 주지된 분석 중 어느 하나, 예를 들어 전사 또는 단백질 발현 또는 세포 표면 발현의 수준을 측정하는 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
T 세포 조성물 및 방법
몇몇 특정한 실시태양은 T 세포, 보다 구체적으로 CAR(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은)을 갖는 T 세포에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 (a) 본 명세서의 gRNA 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, (b) 본 명세서의 Cas9 단백질 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, 또는 (a) 및 (b)의 조합을 함유한다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 본 명세서의 gRNA/Cas9 복합체를 함유한다.
일부 실시태양에서, T 세포 조성물은 T 세포 및 상기 T 세포 중 HPK-1 유전자의 녹아웃을 위한 수단을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 인간 암 환자로부터의 1차 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 환자는 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암, 수모세포종 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 앓고 있다. 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전자의 녹아웃을 위한 수단은 gRNA/Cas9 복합체이며, 여기에서 상기 gRNA는 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 충분히 상보적인 서열과 동일하거나 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드 이하로 상이한 표적화 서열을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전자의 녹아웃을 위한 수단은 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같은 gRNA/Cas9 복합체이다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 재조합 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 추가로 포함한다.
일부 특정한 실시태양에서, 본 개시는 세포의 약 50%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이 세표 표면상에 재조합 수용체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 키메릭 항원 수용체)를 포함하고; 예를 들어, 실시예 4에 기재된 T7E1 분석에 따른 방법 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 의해 측정된 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율을 특징으로 하는, T 세포 집단(예를 들어, Car-T 세포 집단)을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포 집단(예를 들어, Car-T 세포 집단)은 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신 V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 및/또는 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 높은 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 특징들을 갖는 T 세포 집단을 본 개시에 비추어 당해 분야의 숙련가들에 의해 제조할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, "T 세포 집단" 또는 "Car-T 세포 집단"이란 용어 및 본 명세서의 유사한 용어들은 상기 세포 집단이, 바람직하게는 상기와 같은 집단이 각각 대부분(예를 들어, 약 50% 이상) T 세포 또는 Car-T 세포로서 함유되어야 하지만, 임의의 다른 유형의 세포를 함유하지 않음을 의미하지는 않는다. Car-T 세포 외에, 2개의 시판되는 Car-T 요법인 킴리아(Kymriah)(티사젠렉류셀) 또는 예스카르타(Yescarta)(악시카브타젠 실로류셀)이 또한 NK 세포, NK-T 세포, B 세포 등을 함유할 수 있음은 주지되어 있다.
일부 특정한 실시태양에서, 본 개시는 T 세포를 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 T 세포의 변경 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 인간 환자로부터 T 세포를 수득하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은); (b) T 세포에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; 및 (c) 상기 T 세포를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜 HPK-1 유전자 붕괴된 T 세포 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 배양은 사이토카인, 예를 들어 IL-2 또는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 존재하에서 수행될 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (d) 상기 T 세포에 재조합 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산, 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 작용제는 본 명세서에 기재된 것들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 T 세포에 (a) 본 명세서의 gRNA 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, (b) 본 명세서의 Cas9 단백질 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, 또는 (a) 및 (b)의 조합을 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 T 세포에 gRNA/Cas9 복합체를 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서의 방법에 의해 생성된 HPK-1 유전자 붕괴된 T 세포 집단은 본 명세서에 기재된 바와 같은 HPK-1 유전자 녹아웃 효율, 탈진 마커, PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3의 발현, 세포자멸 마커 애넥신 V의 발현, 세포독성 마커 CD107a의 발현과 같은 특징 중 어느 하나를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전자 녹아웃 효율은, 예를 들어 실시예 4에 기재된 T7E1 분석에 따른 방법 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 의해 측정된 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상일 수 있다.
상기 T 세포 또는 T 세포 집단은 피실험자(예를 들어, 암을 갖는, 예를 들어 인간 피실험자)로부터 수득된 세포, 예를 들어 1차 세포, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 분획되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 생성물, 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 수득된 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, T 세포를 양성 또는 음성 선택 및 농축 방법을 사용하여 분리시키거나 선택하여 집단 중에 T 세포를 농축시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 집단은 CD4+, CD8+ 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유한다. 다른 적합한 유형의 T 세포는 본 명세서에 기재된 것들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포는 인간 암 환자로부터의 1차 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 환자는 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암, 수모세포종 및 이들의 조합으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 앓고 있다.
일부 실시태양에서, 재조합 수용체(예를 들어, 유전자 조작된 항원 수용체)를 암호화하는 핵산 및 HPK-1 유전자를 붕괴시키기 위한 작용제(예를 들어, 본 명세서의 Cas9/gRNA RNP)의, T 세포 집단 중의 세포에의 도입은 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 수용체(예를 들어, CAR) 및 상기 작용제(예를 들어, 본 명세서의 Cas9/gRNA RNP)의 도입에 이어서, 상기 세포를, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포의 확대 및/또는 증식을 자극하는 조건하에서 배양한다.
일부 실시태양에서, 본 개시는 또한 입양 세포 요법에서 면역 세포, 예를 들어 T 세포 기능을 증대시키는 방법, 예를 들어 시간에 걸쳐 지속성 또는 이식된 세포에의 노출을 유지시키면서, 투여된 유전자 조작된(예를 들어, CAR+) 세포의 활성 및 효능 증가에 의해 개선된 효능을 제공하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은, 예를 들어 면역 세포에 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시킴으로써, 상기 면역 세포 중의 HPK-1 유전자를 붕괴시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포에 (a) 본 명세서의 gRNA 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, (b) 본 명세서의 Cas9 단백질 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, 또는 (a) 및 (b)의 조합을 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포에 본 명세서의 gRNA/Cas9 복합체를 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 붕괴된 HPK-1 유전자를 갖는 면역 세포, 예를 들어 CAR-발현 T 세포는 몇몇 입수 가능한 방법에 비해, 피실험자에게 생체내 투여시 증가된 확대 및/또는 지속성을 나타낸다.
일부 실시태양에서, 본 개시는 또한 면역 세포 집단(예를 들어, T 세포 집단, 예를 들어 Car-T 세포)의 세포독성을 증대시키고/거나, 탈진을 억제하고/거나, 비장 및/또는 종양내 침윤을 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 면역 세포 집단을, HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴(예를 들어, 유전자 녹아웃)를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 인간 환자로부터 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단을 수득하는 단계(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이); (b) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; (c) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜, 상기 작용제 도입전의 세포 집단에 비해 증대된 세포독성, 감소된 탈진, 및/또는 증대된 비장 및/또는 종양내 침윤을 갖는 HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포(예를 들어, T 세포) 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 본 명세서에 기재된 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계 추가로 포함한다. 적합한 작용제는 본 명세서에 기재된 것들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 (a) 본 명세서의 gRNA 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, (b) 본 명세서의 Cas9 단백질 중 임의의 하나 이상, 또는 상기 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터, 또는 (a) 및 (b)의 조합을 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 면역 세포에 본 명세서의 gRNA/Cas9 복합체를 도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서의 방법에 의해 생성된 HPK-1 유전자 붕괴된 T 세포 집단은 본 명세서에 기재된 바와 같이, HPK-1 유전자 녹아웃 효율, 탈진 마커, PD-1, TIM-3 및/또는 Lag-3의 발현, 세포자멸 마커 애넥신 V의 발현, 세포독성 마커 CD107a의 발현과 같은 특징 중 어느 하나를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 유전자 녹아웃 효율은, 예를 들어 실시예 4에 기재된 T7E1 분석에 따른 방법 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 의해 측정된 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 면역 세포 집단은 Car-T 세포 집단이다. 일부 실시태양에서, 상기 Car-T 집단은 상기 세포의 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 세포 표면상에 재조합 수용체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 예를 들어 키메릭 항원 수용체)를 포함함을 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은, 예를 들어 실시예 4에 기재된 T7E1 분석에 따른 방법 및/또는 실시예 5의 웨스턴 블럿 방법에 의해 측정된 약 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율을 갖는 Car-T 세포 집단을 생성시킨다.
본 명세서에 상세히 나타낸 바와 같이, 뜻밖에도, 면역 세포, 예를 들어 Car-T 세포 중의 HPK-1 유전자를 붕괴시킴으로써, 상기 면역 세포는 증대된 세포독성, 증가된 지속성 및 감소된 탈진, 및/또는 증대된 비장 및/또는 종양내 침윤을 나타낸다. 상기와 같은 효과는 또한 피실험자에게 투여시 생체내에서 관찰되었다. 예를 들어, 하나의 동물 연구에서, HPK-1 녹아웃 Car-T 세포는 야생형 Car-T 세포 또는 PD-1 녹아웃 Car-T 세포에 비해 상기 처리된 동물의 혈장에서 훨씬 더 높은 수준으로 남아있는 것으로 밝혀졌다. 투여된 세포의 지속성 정도를, 예를 들어 qPCR, 유식 세포측정 분석, 또는 세포-기반 분석에 의해 피실험자에게 투여 후에 검출하거나 정량분석할 수 있다. 이는, 예를 들어 입양 면역요법에서, 본 명세서의 조성물 및 방법과 관련된 장점들을 추가로 예시한다.
본 개시에 비추어, 당해 분야의 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서의 방법은 임의의 특정한 면역 세포 또는 특정 CAR로 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 상업적으로 입수할 수 있는 Car-T 세포를 또한 본 명세서의 방법을 사용하여, 예를 들어 HPK-1 유전자를 녹아웃시켜 그의 면역요법 기능을 더욱 개선시키도록, 예를 들어 T 세포 탈진을 감소시키도록 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 킴리아(티사젠렉류셀) 또는 예스카르타(악시카브타젠 실로류셀)용 Car-T 세포를 본 명세서의 방법에 의해 HPK-1 유전자를 녹아웃시키도록 변형시킬 수 있다. 본 명세서에 논의되는 바와 같이, 상기와 같은 실시태양에서, HPK-1 유전자의 유전학적 변형을 위한 작용제의 도입은 킴리아 또는 예스카르타의 경우 CD19 CAR을 암호화하는 핵산의 도입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다.
예를 들어, 패키지 삽입에 따라, 예스카르타를 제조하기 위해서, 환자 자신의 T 세포를 수확하고 레트로바이러스 형질도입에 의해, CD28 및 CD3-제타 보조-자극 도메인에 연결된 쥐 항-CD19 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전학적으로 변형시킨다. 상기 항-CD19 CAR-T 세포를 확대시키고 다시 환자에게 주입시키며, 이때 상기는 CD19-발현 표적 세포를 인식하여 제거할 수 있다.
보다 구체적으로, 예스카르타를, 표준 백혈구성분채집술 시술을 통해 수득되는 환자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 제조할 수 있다. 상기 단핵 세포는 T 세포가 풍부하며 이를 IL-2의 존재하에서 항-CD3 항체로 활성화시키고, 이어서 항-CD19 CAR 트랜스유전자를 함유하는 복제 무능 레트로바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 상기 형질도입된 T 세포를 세포 배양물에서 확대시키고, 세척하고, 현탁액으로 제형화하고, 동결보존하였다. 상기 생성물은 환자 특이적 주입 주머니 중에서 동결된 현탁액으로서 배송 전에 멸균 검사를 통과해야 한다.
킴리아(상표)(티사젠렉류셀)는 항-CD19 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하도록 렌티바이러스 벡터를 사용하여 유전자 변형시킨 자기유래 T 세포로 구성된 CD19-지향된 유전자 변형된 자기유래 T 세포 면역요법이다. 상기 CAR은 CD19에 특이적인 쥐 단쇄 항체 단편(scFv)에 이어서, CD8 힌지, 및 4-1BB(CD137) 및 CD3 제타에 대한 세포내 신호전달 도메인에 융합된 막관통 영역으로 구성된다.
킴리아는 표준 백혈구성분채집술 시술을 통해 수득되는 환자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 제조될 수 있다. 상기 단핵 세포는 T 세포가 풍부하며, 이어서 이를 항-CD19 CAR 트랜스유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 활성화시킨다. 상기 형질도입된 T 세포를 세포 배양물에서 확대시키고, 세척하고, 현탁액으로 제형화하고, 이어서 동결보존하였다. 상기 생성물은 환자 특이적 주입 주머니 중에서 동결된 현탁액으로서 배송 전에 멸균 검사를 통과해야 한다. 상기 생성물을 투여 전에 해동시킨다.
일부 실시태양에서, 킴리아(티사젠렉류셀) 또는 예스카르타(악시카브타젠 실로류셀)에 대한 Car-T 세포를, 항CD19 CAR 트랜스유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 도입과 동시에 또는 상기와 순차적으로, HPK-1 유전자를 녹아웃시킬 수 있는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된, 예를 들어 본 명세서에 기재된 gRNA/Cas9)를 도입시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이어서, 상기 수득된 세포를 킴리아 또는 예스카르타의 제조 과정과 유사하게 세포 배양물에서 확대시키고, 세척하고, 제형화할 수 있다.
약학 조성물 및 치료 방법
변형된 면역 세포, 예를 들어 Car-T 세포는 최근에 몇몇 암의 치료에 승인되었다. 예를 들어, 예스카르타는 제2선 이상의 전신 요법 후에 재발된 또는 불응성인 큰 B-세포 림프종, 예를 들어 달리 명시되지 않으면 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 원발성 종격동 큰 B-세포 림프종, 고도의 B-세포 림프종, 및 소포성 림프종으로부터 발생하는 DLBCL을 갖는 성인 환자의 치료에 지시되는 CD19-지향된 유전학적으로 변형된 자기유래 T 세포 면역요법이다. 유사하게, 킴리아는 불응성이거나 2회 이상 재발된 B-세포 전구체 급성 림프모구성 백혈병(ALL)이 있는 25세 이하의 환자; 제2선 이상의 전신 요법 후에 재발된 또는 불응성(r/r)인 큰 B-세포 림프종, 예를 들어 달리 명시되지 않으면 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 고도의 B-세포 림프종, 및 소포성 림프종으로부터 발생하는 DLBCL을 갖는 성인 환자의 치료에 지시되는 CD19-지향된 유전학적으로 변형된 자기유래 T 세포 면역요법이다.
본 명세서에서 논의되는 바와 같이, 면역 세포, 예를 들어 Car-T 세포(예를 들어, 예스카르타 또는 킴리아용 세포) 중의 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴는 면역요법 기능을 더욱 향상시킬 수 있고, 예를 들어 세포독성을 증가시키고 탈진을 감소시킬 수 있다.
상응하게, 본 명세서는 또한, 예를 들어 암 치료와 같은 입양 면역요법에 사용하기 위한, 상기 세포, 세포 집단, 예를 들어 본 명세서의 방법 중 어느 하나에 의해 생성되는 세포 및 집단을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물 및 제형은 일반적으로 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다.
"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 상기 제형이 투여되는 피실험자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 피실험자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다. 담체는, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 일부 실시태양에서, 상기 담체의 선택은 부분적으로, 특정한 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다.
적합한 보존제는, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 나트륨 벤조에이트, 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다. 일부 실시태양에서, 2개 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 상기 보존제 또는 그의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다.
적합한 완충제는, 예를 들어 시트르산, 나트륨 시트레이트, 인산, 칼륨 포스페이트, 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2개 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 상기 완충제 또는 그의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물의 약 0.001 중량% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세히 기재되어 있다.
일부 실시태양에서 상기 약학 조성물은 상기 세포를 질병 또는 상태의 치료 또는 예방에 유효한 양으로, 예를 들어 치료 유효량 또는 예방 유효량으로 함유한다. 일부 실시태양에서 치료 또는 예방 효능을, 치료된 피실험자의 주기적인 평가에 의해 모니터링한다. 목적하는 투여량을 상기 세포의 단일 일시주사 투여에 의해, 상기 세포의 수회 일시주사 투여에 의해, 또는 상기 세포의 연속적인 주입 투여에 의해 전달할 수 있다.
상기 세포 및 조성물을 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 상기 세포의 투여는 자가조직성 또는 이종조직성일 수 있다. 예를 들어, 면역반응성 세포 또는 전구세포를 한 명의 피실험자로부터 수득하고, 동일한 피실험자, 또는 상이하지만 적합한 피실험자에게 투여할 수 있다. 말초 혈액 유래된 면역반응성 세포 또는 그의 자손(예를 들어, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래된)을, 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사, 또는 비경구 투여를 포함한 국소화된 주사를 통해 투여할 수 있다. 치료학적 조성물(예를 들어, 유전자 변형된 면역반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)의 투여시, 이를 일반적으로 주사 가능한 단위 투여형(용액, 현탁액, 유화액)으로 제형화할 것이다.
일부 실시태양에서 조성물을, 일부 실시태양에서 선택된 pH로 완충될 수도 있는, 멸균 액체 제제, 예를 들어 등장성 수용액, 현탁액, 유화액, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공한다. 멸균 주사성 용액은 상기 세포를 용매 중에, 예를 들어 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과의 혼합물 중에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 조성물은 투여 경로 및 목적하는 제제에 따라 보조 물질, 예를 들어 습윤, 분산 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 젤화제 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 풍미제, 및/또는 착색제를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서 적합한 제제의 제조를 위해 표준 교과서를 찾아볼 수 있다.
조성물의 안정성 및 멸균성을 증대시키는 다양한 첨가제, 예를 들어 항균 보존제, 산화방지제, 킬레이트제 및 완충제를 첨가할 수 있다.
미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사성 약제 형태의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 발생할 수 있다. 생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 완수될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 개시는 암을 포함한 질병, 상태 및 질환의 치료 또는 예방을 위해 피실험자, 예를 들어 인간 환자에게 세포 및 조성물을 투여하는 방법, 예를 들어 치료학적 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포, 집단 및 조성물을, 예를 들어 입양 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법을 통해, 치료하고자 하는 특정 질병 또는 상태를 갖는 피실험자 또는 환자에게 투여한다. 일부 실시태양에서, 본 명세서의 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물, 예를 들어 Car-T 세포 및 배양 및/또는 다른 가공 단계에 이은 최종 생성 조성물을 피실험자, 예를 들어 질병 또는 상태를 갖는 또는 그 위험이 있는 피실험자에게 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 이에 의해, 예를 들어 조작된 T 세포에 의해 인식된 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 줄임으로써, 상기 질병 또는 상태를 치료하고, 예를 들어 그의 하나 이상의 증상을 개선시킨다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 본 명세서의 HPK-1 유전학적 붕괴를 갖는 면역 세포 또는 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 (a) 치료가 필요한 피실험자로부터 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 수득하는 단계; (b) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계; (c) 상기 면역 세포를 상기 작용제와 배양하고 임의로 확대시켜 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 제공하는 단계; (d) 상기 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 상기 피실험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (e) 상기 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 재조합 수용체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 핵산, 또는 그의 생성물을 도입시키는 단계 추가로 포함한다. 상기 (b) 및 (e)의 도입 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 일어날 수 있다. 적합한 작용제 및 재조합 수용체는 본 명세서에 기재된 것들을 포함한다.
입양 세포요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 상기 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포요법 방법은, 예를 들어 미국특허 출원 공보 제2003/0170238호(Gruenberg et al); 미국특허 제4,690,915호(Rosenberg); 문헌[Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933]; 문헌[Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9]; 문헌[Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조하시오.
일부 실시태양에서, 상기 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법을 자가이식에 의해 수행하며, 여기에서 상기 세포는 상기 세포 요법을 수용하는 피실험자로부터, 또는 상기와 같은 피실험자로부터 유래된 샘플로부터 단리되고/되거나 달리 제조된다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 세포는 치료 및 상기 세포가 필요한 피실험자, 예를 들어 환자로부터 유래되고, 후속의 단리 및 처리가 동일한 피실험자에게 투여된다.
일부 실시태양에서, 상기 세포 요법, 예를 들어 입양 T 세포 요법을 동종이계 이식에 의해 수행하며, 여기에서 상기 세포는 상기 세포 요법을 수용하고자 하거나 최종적으로 수용하는 피실험자와 다른 피실험자, 예를 들어 1차 피실험자로부터 단리되고/되거나 달리 제조된다. 이어서, 상기와 같은 실시태양에서, 상기 세포는 동일한 종의 상이한 피실험자, 예를 들어 2차 피실험자에게 투여된다. 일부 실시태양에서, 상기 1차 및 2차 피실험자는 유전학적으로 일치한다. 일부 실시태양에서, 상기 1차 및 2차 피실험자는 유전학적으로 유사하다. 일부 실시태양에서, 상기 2차 피실험자는 상기 1차 피실험자와 동일한 HLA 부류 또는 상위타입을 발현한다.
본 명세서의 방법에 의해 치료되기에 적합한 질병 또는 질환은 종양, 예를 들어 고형 종양, 혈액암, 및 흑색종, 및 감염성 질병, 예를 들어 바이러스 또는 다른 병원체, 예를 들어 HIV, HCV, HBV, CMV에 의한 감염, 및 기생충 질병을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 상태는 종양, 암, 악성질병, 신생물, 또는 다른 증식성 질병 또는 질환이다. 상기와 같은 질병은 비제한적으로, 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성-림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종암, 골암, 뇌암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉육종, 수모세포종, 골육종, 활막육종 및/또는 중피종일 수 있는 암 또는 종양인 질병 또는 상태를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 희귀 타이로신 키나제 수용체 ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성 암항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자로 이루어진 군 중에서 선택된 항원과 관련된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 CD19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2 및/또는 메소텔린을 발현하는 세포와 관련될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 적합한 투여량은 치료하고자 하는 질병의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 세포가 예방을 목적으로 또는 치료를 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 피실험자의 임상적 병력 및 세포에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 수 있다. 상기 조성물 및 세포는 일부 실시태양에서, 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 피실험자에게 적합하게 투여된다.
상기 세포를 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 일시주사에 의해, 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사, 안내 주사, 눈주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사, 결막하 주사, 테논하(sub-Tenon) 주사, 안구뒤 주사, 안구주위 주사, 또는 후방 공막인접 전달에 의해 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 비경구, 폐내 및 비내로, 및 경우에 따라 국소 치료를 위해 병변내 투여에 의해 투여한다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 세포를 병용 치료의 부분으로서, 예를 들어 또 다른 치료학적 중재, 예를 들어 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 작용제, 예를 들어 세포독성제 또는 치료제와 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여한다. 상기 세포를 일부 실시태양에서 하나 이상의 추가적인 치료제와, 또는 또 다른 치료학적 중제와 함께, 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 공-투여한다. 일부 상황에서, 상기 세포를, 세포 집단이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 증대시키거나, 이와 역으로 증대시키기에 충분히 가까운 시간으로 또 다른 요법과 공-투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 상기 하나 이상의 추가적인 치료제 이전에 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 상기 하나 이상의 추가적인 치료제 후에 투여한다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는, 예를 들어 지속성을 증대시키기 위해서 사이토카인, 예를 들어 IL-2를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 화학요법제의 투여를 포함한다.
상기 세포의 투여에 이어서, 일부 실시태양에서 상기 조작된 세포 집단의 생물학적 활성을, 예를 들어 다수의 공지된 방법 중 어느 하나에 의해 측정할 수 있다. 평가하기 위한 매개변수는 생체내에서, 예를 들어 영상화에 의해, 또는 생체외에서, 예를 들어 ELISA 또는 유식 세포측정에 의해, 항원에 대한 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 특이적인 결합을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 세포를 파괴하는 상기 조작된 세포의 능력을 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)] 및 문헌[Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포독성 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포의 생물학적 활성을 하나 이상의 사이토카인, 예를 들어 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정한다. 일부 실시태양에서, 상기 생물학적 활성을 임상 결과, 예를 들어 종양 부담 또는 하중의 감소를 평가함으로써 측정한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 조작된 세포를 그의 치료학적 또는 예방학적 효능이 증가하도록 다수의 방식으로 추가로 변형시킨다. 예를 들어, 상기 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR을 링커를 통해 표적화 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 접합시킬 수 있다. 표적 부분에 화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 접합시키는 실행은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어 문헌[Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)], 및 미국특허 제5,087,616호를 참조하시오.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약"이란 용어는 본 기술 분야의 숙련가에게 쉽게 공지되는 각 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 대한 실시태양을 포함(및 기재)한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 분명히 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 단수형 표현은 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"를 의미한다.
본 개시 전체를 통해, 청구된 발명의 요지의 다양한 실시태양을 범위 포맷으로 나타낸다. 상기 범위 포맷의 기재가 단지 편의성 및 간략성을 위한 것이며 상기 청구된 발명의 요지의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석되어서는 안 됨은 물론이다. 상응하게, 범위의 기재는 모든 가능한 하위-범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 사잇값 및 상기 서술된 범위 중의 임의의 다른 서술된 값 또는 사잇값은 상기 청구된 발명의 요지내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 상기 보다 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 상기 서술된 범위내의 임의의 특별히 제외된 한계가 가해진, 상기 청구된 발명의 요지내에 포함된다. 상기 서술된 범위가 상기 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위가 또한 상기 청구된 발명의 요지 중에 포함된다. 이를 상기 범위의 폭에 상관없이 적용한다. 간략성을 위해서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약" 등의 용어에 이어서 또는 "이상" 전에 일련의 숫자가 오는 경우에, 이들 숫자 각각에 상기와 같은 용어가 선행하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상은 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상 또는 약 80% 이상으로서 이해해야 한다. 또한 간략성을 위해서, 기호 "%"는 문맥상 동일한 분모가 의도됨이 명백할 때 가끔은 생략될 수도 있다. 예를 들어, 백분율을 기재하는 경우, 약 50, 60, . . . , 또는 90%는 약 50%, 약 60%, . . . , 또는 약 90%로서 이해해야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)" 및 "일치성 퍼센트"는 아미노산 서열(참조 폴리펩타이드 서열)에 관하여 사용될 때, 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해 상기 서열들, 및 필요한 경우 도입되는 끊김을 정렬시킨 후에, 상기 서열 일치성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 참조 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열(예를 들어, 스트렙트아비딘 뮤테인) 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트의 측정을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬에 적합한 매개변수를 측정할 수 있다.
2개 서열간의 상동성 또는 서열 일치성(이들 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다)의 계산을 하기와 같이 수행한다. 서열들을 최적의 비교를 위해 정렬시킨다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 어느 하나 또는 둘 다에 끊김을 도입시킬 수 있으며 비-상동성 서열을 비교를 목적으로 무시할 수 있다). 최적의 정렬은 12의 끊김 벌점, 4의 끊김 연장 벌점, 및 5의 프레임 이동 끊김 벌점을 갖는 블러썸(Blossum) 62 채점 행렬을 갖는 GCG 소프트웨어 패키지로 GAP 프로그램을 사용하여 가장 좋은 점수로서 결정된다. 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열 중의 하나의 위치를, 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 차지하는 경우, 이들 분자는 그 위치에서 일치한다. 2개 서열간의 일치성 퍼센트는 상기 서열들에 의해 공유된 일치하는 위치의 수의 함수이다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드 중 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산에 의한 교체를 포함할 수 있다. 아미노산은 일반적으로 하기의 공통 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, He;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원의, 또 다른 부류의 구성원과의 교환을 수반할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "비-상동 말단 접합" 또는 "NHEJ"는 결찰 매개된 복구 및/또는 비-주형 매개된 복구, 예를 들어 정규 NHEJ(cNHEJ), 대체 NHEJ(altNHEJ), 미세상동-매개된 말단 접합(MMEJ), 단일가닥 어닐링(SSA), 및 합성-의존성 미세상동-매개된 말단 접합(SD-MMEJ)을 지칭한다.
"gRNA 분자"는 세포의 표적 핵산, 예를 들어 게놈 DNA상의 자리에 대한 gRNA 분자/Cas9 분자 복합체의 특이적인 표적화 또는 귀소를 촉진하는 핵산을 지칭한다.
본 명세서에서 분자의 변형과 관련하여 사용되는 바와 같은 "교체" 또는 "교체된"은 공정 제한을 요하는 것이 아니라 단지 교체 개체가 존재함을 가리킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 피실험자는 임의의 살아있는 유기체, 예를 들어 인간 및 다른 포유동물을 포함한다. 포유동물은 비제한적으로 인간, 및 비-인간 동물, 예를 들어 농장 동물, 스포츠 동물, 설치류 및 반려동물을 포함한다. 상기 용어는 비제한적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트 또는 햄스터), 토끼, 기니피그, 소, 말, 고양이, 개, 양, 및 염소)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 피실험자는 인간이다. 다른 실시태양에서, 상기 피실험자는 가금류이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여, 2개 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 상기는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 질병 또는 상태 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상, 부작용 또는 결과, 또는 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병적인 결과의 감소, 전이의 예방, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 상기 용어는 질병의 완전한 치유, 또는 임의의 증상 또는 모든 증상이나 결과에 대한 영향의 완전한 제거를 의미하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "예방하는"은 질병의 소인이 있을 수 있지만 아직 상기 질병으로 진단되지 않은 피실험자에서 상기 질병의 발생 또는 재발에 관하여 예방학을 제공함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능 또는 활성을 "억제하다"는 관심 조건 또는 매개변수를 제외하고 달리 동일한 상태에 비해, 또는 한편으로 또 다른 상태에 비해, 상기 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 상기 세포 부재하에서의 상기 종양의 성장 속도에 비해 상기 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 상황에서, 작용제, 예를 들어 약학 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은 필요한 투여량/양에서 필요한 기간 동안, 목적하는 결과, 예를 들어 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형 또는 세포의 "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안, 목적하는 치료학적 결과, 예를 들어 질병, 상태 또는 질환의 치료, 및/또는 상기 치료의 약동학적 또는 약역학적 효과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 상기 치료 유효량은 인자, 예를 들어 피실험자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 투여되는 세포의 집단에 따라 변할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 제공된 방법은 상기 세포 및/또는 조성물을 유효량으로, 예를 들어 치료 유효량으로 투여함을 수반한다.
"예방학적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안, 목적하는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량은 질병 이전에 또는 질병의 초기 단계에서 피실험자에 사용되기 때문에, 상기 예방학적 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다. 보다 낮은 종양 부담의 상황에서, 상기 예방학적 유효량은 일부 실시태양에서 상기 치료 유효량보다 높을 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 언급할 때 "농축"은, 예를 들어 조성물 또는 조성물 부피 중의 세포의 총수에 비해, 또는 다른 세포 유형에 비해, 예를 들어 세포 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 근거한 양성 선택, 또는 고갈시키고자 하는 상기 세포 집단 또는 세포상에 존재하지 않는 마커에 근거한 음성 선택에 의한 상기 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율의 증가를 지칭한다. 상기 용어는 상기 조성물로부터 다른 세포, 세포 유형, 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않으며 그렇게 농축된 세포가 상기 농축된 조성물 중에 존재하거나 심지어 100%에 가깝게 존재하도록 농축됨을 필요로 하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포상에서 또는 세포 중에서 검출가능한 존재를 지칭한다. 표면 마커를 언급하는 경우, 상기 용어는 유식 세포측정에 의해 검출된, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출되는 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기에서 상기 염색은, 달리 동일한 조건하에서 아이소타입-합치된 대조용 또는 형광 마이너스 원(FMO) 게이팅 대조용과 동일한 과정을 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 상기 마커에 양성인 것으로 공지된 세포의 경우와 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포의 경우보다 실질적으로 높은 수준에서 유식 세포측정에 의해 검출가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포상에서 또는 세포 중에서 실질적으로 검출가능한 존재의 부재를 지칭한다. 표면 마커를 언급하는 경우, 상기 용어는 유식 세포측정에 의해 검출된, 예를 들어 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기에서 상기 염색은, 달리 동일한 조건하에서 아이소타입-합치된 대조용 또는 형광 마이너스 원(FMO) 게이팅 대조용과 동일한 과정을 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 상기 마커에 양성인 것으로 공지된 세포의 경우보다 실질적으로 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포의 경우에 비해 실질적으로 유사한 수준에서 유식 세포측정에 의해 검출되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 상기 벡터가 연결되는 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 명세서에서 "발현 벡터"라 칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 당해 분야의 모든 용어, 기호 및 다른 과학기술 용어 또는 전문용어는 청구된 발명의 요지가 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖고자 한다. 일부의 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 즉시 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서 상기와 같은 정의의 포함이 반드시 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되지는 않는다.
본 출원에서 지칭되는 간행물, 예를 들어 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스는 개별적인 간행물이 개별적으로 참고로 인용되는 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 내용 전체가 참고로 인용된다. 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참고로 인용된 특허, 출원, 공개 출원 및 다른 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 달리 불일치하는 경우, 본 명세서에 제시된 정의가 본 명세서에 참고로 인용된 정의보다 우세하다.
예시적인 실시태양
하나의 실시태양에서, 본 발명은 HPK-1 유전자의 유전학적 변형 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 HPK-1 단백질의 기능이 불활성화되거나 그의 활성이 감소되도록 상기 HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 작업이 단순하며, 녹아웃 효율이 높고, T 세포의 종양 사멸 활성을 증대시키는데 유효하다. 본 발명의 방법에 의해 변형된 T 세포는 광범위한 임상적 적용 전망을 갖는다.
본 명세서에서 유전학적 변형은 유전자 녹아웃, 부분적인 유전자 결실, 유전자 교체, 및 삽입을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 변형은 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 유전학적으로 변형시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 편집 기술을 사용하여 HPK-1 유전자를 변형시킴을 포함한다. 다양한 유전자 편집 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 유전자 편집 기술은 배아 줄기세포-기반 DNA 상동성 재조합 기술, CRISPR/Cas9 기술, 아연 집게 뉴클레아제 기술, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 기술, 귀소 엔도뉴클레아제 또는 다른 분자 생물학 기술을 포함하며; 바람직하게는 상기 유전학적 변형을 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 사용하여 수행한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 HPK-1 유전자를, 상기 HPK-1 유전자를 표적화하는 gRNA로 녹아웃시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 표적화한다. 상기 gRNA 및 Cas9 단백질은 전형적으로 HPK-1 유전자 녹아웃에 함께 사용된다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 gRNA의 제조를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA의 제조 방법은 (1) gRNA 로딩 플라스미드를 구성하는 단계; 및 (2) 상기 gRNA를 시험관내에서 전사시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 단계 (1)은 상기 gRNA 암호화 가닥 및 상보적 가닥을 합성하고, 상기 암호화 가닥과 상보적 가닥을 어닐링함으로써 형성된 이중가닥 DNA를 pUC57 벡터에 삽입하고, 이를 T7 프로모터의 조절하에 두어 pUC57kan-T7-gRNA를 구성함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 단계 (2)는 효소적 절단 및 서열분석을 통해 식별된 gRNA 로딩 플라스미드 pUC57kan-T7-gRNA를 정제하고, T7 RNA 시험관내 전사 키트를 사용하여 HPK-1 gRNA/HPK-1 gRNA를 시험관내 전사시키고, 상기 전사 생성물을 정제시켜 gRNA를 수득함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 HPK-1 gRNA/HPK-1 gRNA에 대한 시험관내 전사를 T7 RNA 시험관내 전사 키트를 사용하여 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA의 이중가닥 DNA 주형 서열은 하기 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 바와 같다:
F:5'-AGG ACCTGGTGGCACTGAAGA-3'(서열번호 3)
R: 5'-AAAC CTTCAGTGCCACCAGGTC-3'(서열번호 4).
일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 서열 GACCTGGTGGCACTGAAGA의 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 방법은 단핵 세포의 HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시키는 단계를 포함하며; 바람직하게, 상기 단핵 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포이고; 보다 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이고; 보다 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 CD3+ T 세포이다. 가장 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 외인성 키메릭 항원 수용체를 추가로 발현한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (1) HPK-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 제조하는 단계; (2) Cas9 단백질을 제조하는 단계; (3) 단핵 세포를 시험관내에서 배양 및 확대시키는 단계; 및 (4) 상기 단계 (1)의 gRNA 및 상기 단계 (2)의 Cas9 단백질을 상기 단계 (3)의 단핵 세포내에 동시-형질감염시키는 단계를 포함한다.
녹아웃 효율을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 단계 (4)에서 동시-형질감염 후에 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 식별함을 추가로 포함하며, 바람직하게는 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 PCR-효소적 절단 및/또는 웨스턴 블럿 방법에 의해 식별한다. 일부 실시태양에서, 상기 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별할 수 있다: PCR 증폭을 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 PCR 생성물에 열 변성, 어닐링 및 복원을 가한 다음 T7 엔도뉴클레아제 처리를 가하고, 절단 효율을 아가로스 젤 전기영동으로 식별하고; 한편으로, 상기 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별한다: 상기 단핵 세포 중의 전체 단백질을 추출하고, SDS-PAGE를 가하고, 멤브레인으로 옮기고, 1차 항체로서 항-HPK-1 항체로 웨스턴 블럿을 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (5) 상기 단계 (4)에서 수득된 gRNA 및 Cas9 단백질로 동시-형질감염된 단핵 세포에서 인간 유래된 키메릭 항원 수용체CAR)를 발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 유래된 키메릭 항원 수용체는 CAR19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2, 메소텔린이다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 또한 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법 또는 단핵 세포의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법을 또한 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 (1) HPK-1을 표적화하는 gRNA를 제조하는 단계; (2) Cas9 단백질을 제조하는 단계; (3) 인간 말초 혈액 단핵 세포를 시험관내에서 배양 및 확대시키는 단계; 및 (4) 상기 단계 (1)의 gRNA 및 상기 단계 (2)의 Cas9 단백질을 상기 단계 (3)의 인간 말초 혈액 단핵 세포내에 동시-형질감염시는 단계를 포함한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 바람직하게 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포이며, 보다 바람직하게 상기 말초 혈액 단핵 세포는 CD3+ T 세포이다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 외인성 키메릭 항원 수용체를 추가로 발현한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 상기 방법은 상기 단계 (4)에서 수득된 gRNA 및 Cas9 단백질로 형질감염된 CD3+ 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 유래된 CAR을 발현시키는 단계 (5)를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 인간 유래된 키메릭 항원 수용체는 CAR19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2, 메소텔린이다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 상기 단계 (4)는 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 식별함을 추가로 포함한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 바람직하게는 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 PCR-효소적 절단 및/또는 웨스턴 블럿 방법에 의해 식별한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별한다: PCR 증폭을 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 PCR 생성물에 열 변성, 어닐링 및 복원을 가한 다음 T7 엔도뉴클레아제 처리를 가하고, 절단 효율을 아가로스 젤 전기영동으로 식별한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포의 사멸 활성을 증대시키는 방법에서, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별한다: 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 전체 단백질을 추출하고, SDS-PAGE를 가하고, 멤브레인으로 옮기고, 1차 항체로서 항-HPK-1 항체로 웨스턴 블럿을 수행한다.
더욱이, 본 발명은 (1) HPK-1을 표적화하는 gRNA를 제조하는 단계; (2) Cas9 단백질을 제조하는 단계; (3) 인간 말초 혈액 단핵 세포를 시험관내에서 배양 및 확대시키는 단계; 및 (4) 상기 단계 (1)의 gRNA 및 상기 단계 (2)의 Cas9 단백질을 상기 단계 (3)의 인간 말초 혈액 단핵 세포내에 동시-형질감염시는 단계를 포함하는, 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 바람직하게 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포이며, 보다 바람직하게 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 CD3+ T 세포이다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 외인성 키메릭 항원 수용체를 추가로 발현한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 상기 방법은 상기 단계 (4)에서 수득된 gRNA 및 Cas9 단백질로 형질감염된 CD3+ 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 유래된 CAR을 발현시키는 단계 (5)를 추가로 포함하며, 바람직하게, 상기 인간 유래된 키메릭 항원 수용체는 CAR19이다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 상기 단계 (4)는 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 식별함을 추가로 포함한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 바람직하게는 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 PCR-효소적 절단 및/또는 웨스턴 블럿 방법에 의해 식별한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별한다: PCR 증폭을 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 PCR 생성물에 열 변성, 어닐링 및 복원을 가한 다음 T7 엔도뉴클레아제 처리를 가하고, 절단 효율을 아가로스 젤 전기영동으로 식별한다.
본 발명의 말초 혈액 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 분비 수준을 증가시키는 방법에서, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별한다: 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 전체 단백질을 추출하고, SDS-PAGE를 가하고, 멤브레인으로 옮기고, 1차 항체로서 항-HPK-1 항체로 웨스턴 블럿을 수행한다.
두 번째 실시태양에서, 본 발명은 또한 HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시키기 위한 시약을 제공하며, 상기 HPK-1 유전자를, HPK-1 단백질의 기능이 불활성화되거나 그의 활성이 감소되도록 상기 시약에 의해 유전학적으로 변형시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 녹아웃, 부분적인 유전자 결실, 유전자 교체, 및 삽입을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 변형은 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 유전학적으로 변형시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 편집 기술을 사용하여 HPK-1 유전자를 변형시킴을 포함하며; 바람직하게, 상기 유전자 편집 기술은 배아 줄기세포-기반 DNA 상동성 재조합 기술, CRISPR/Cas9 기술, 아연 집게 뉴클레아제 기술, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 기술, 귀소 엔도뉴클레아제 또는 다른 분자 생물학 기술을 포함하며; 보다 바람직하게, 상기 유전학적 변형을 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 사용하여 수행한다. 일부 실시태양에서, 상기 시약은 HPK-1 유전자를 표적화하여 상기 HPK-1 유전자를 녹아웃시키는 gRNA이며; 바람직하게, 상기 gRNA는 상기 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 표적화한다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA는 서열번호 1에 제시된 서열과 짝을 이룰 수 있다(상기 서열에 상보적이다). 일부 실시태양에서, 상기 gRNA의 제조 방법은 (1) gRNA 로딩 플라스미드를 구성하고; (2) 상기 gRNA를 시험관내에서 전사시킴을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 단계 (1)은 상기 gRNA 암호화 가닥 및 상보적 가닥을 합성하고, 상기 암호화 가닥과 상보적 가닥을 어닐링함으로써 형성된 이중가닥 DNA를 pUC57 벡터에 삽입하고, 이를 T7 프로모터의 조절하에 두어 pUC57kan-T7-gRNA를 구성함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 단계 (2)는 효소적 절단 및 서열분석을 통해 식별된 gRNA 로딩 플라스미드 pUC57kan-T7-gRNA를 정제하고, T7 RNA 시험관내 전사 키트를 사용하여 HPK-1 gRNA/HPK-1 gRNA를 시험관내 전사시키고, 상기 전사 생성물을 정제시켜 gRNA를 수득함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 gRNA의 이중가닥 DNA 주형 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 바와 같다.
일부 실시태양에서, 상기 작용제는 Cas9 단백질을 추가로 포함하며; 바람직하게 상기 Cas9는 재조합적으로 발현된다. 일부 실시태양에서, 상기 Cas9 단백질은 하기의 방법에 의해 생성된다: (1) 인간 Cas9 단백질의 아미노산 서열에 따라 코돈 최적화 후에 전장 인간 Cas9 cDNA를 제조하는 단계; (2) 상기 단계 (1)의 전장 인간 Cas9 cDNA의 5' 및 3' 단부에 핵 국소화 신호를 가하여 재조합 발현 플라스미드를 구성하는 단계; (3) 상기 재조합 발현 플라스미드를 숙주 세포에 도입시켜 재조합 Cas9 단백질을 발현시키는 단계; (4) 상기 재조합적으로 발현된 Cas9 단백질을 정제 및 농축시키는 단계; 및 (5) 정제 태그를 절제하고 약 160 kD의 Cas9 단백질을 회수하는 단계.
일부 실시태양에서, 상기 시약은 키메릭 항원 수용체를 추가로 포함한다.
세 번째 실시태양에서, 본 발명은 유전학적 변형에서 상기 시약 중 어느 하나의 용도를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 용도는 단핵 세포 중 HPK-1 유전자의 녹아웃, 또는 단핵 세포의 사멸 활성의 증가, 또는 단핵 세포 중 Th1 사이토카인 수준의 증가를 위한 것이다.
네 번째 실시태양에서, 본 발명은 본 명세서의 방법 중 어느 하나에 의해 제조된 단핵 세포를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 단핵 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포이고, 바람직하게 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포이고, 보다 바람직하게는 CD3+ T 세포, 더욱 바람직하게는 외인성 인간 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포, 가장 바람직하게는 CAR19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2, 메소텔린 등에 특이적인 단쇄 항체로 키메라화된 CD3+ T 세포이다.
변형되지 않은 말초 혈액 단핵 세포에 비해, HPK-1 유전자가 결실된 본 발명의 말초 혈액 단핵 세포는 보다 강한 사멸 능력, 및 보다 높은 Th1 사이토카인 분비 수준을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 단핵 세포는 종양에 대한 특이성을 갖는다.
다섯 번째 실시태양에서, 본 발명은 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자를 변형시키거나 상기 단핵 세포의 사멸 활성을 증가시키거나, 상기 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 수준을 증가시키기 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기 시약 중 어느 하나 또는 상기 단핵 세포 중 어느 하나의 용도를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 종양의 치료를 위한 것이다. 바람직하게, 상기 종양은 림프종 또는 고형 종양이다.
여섯 번째 실시태양에서, 본 발명은 또한 상기 시약 중 어느 하나 또는 상기 단핵 세포 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 기술적 해법은 적어도 하기의 장점을 갖는다: (1) 작업이 용이하고 녹아웃 효율이 높다. 본 발명에서 HPK-1을 효율적으로 표적화할 수 있는 gRNA를, 다수의 실험을 통해 T 세포 게놈 HPK-1의 제2 엑손상에 위치한 표적 서열을 획득함으로써 설계한다. 본 발명의 방법은 다른 녹아웃 방법에 비해 작업이 용이하며 시험관내 배양된 T 세포의 변형에 적합하다. 다른 표적 서열에 비해, 본 발명의 표적 서열은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술에 특히 적합하며, CRISPR/Cas9 기술에 의해 T 세포의 HPK-1을 효율적으로 녹아웃시킬 수 있다. (2) T 세포 활성화 정도가 높으며, 종양 사멸 효과가 양호하다. 본 발명의 변형된 T 세포는 더 빨리 증식할 뿐만 아니라, 세포당 더 강한 종양 사멸 활성을 갖는다. 상기 종양 사멸 활성의 실험 결과는 본 발명의 변형된 T 세포의 종양 사멸 활성이 PD1 변형된 T 세포보다 더 높거나 훨씬 더 현저하게 높다. (3) 다른 T 세포 변형 기술과 병용하여 상승작용적인 종양 사멸 활성을 성취할 수 있다. 본 발명에서, HPK-1 유전자의 CRISPR/Cas9 녹아웃의 T 세포 변형 기술을 CAR-T 기술과 병용하여 상승작용적 효과를 갖는다. 시험관내 사멸 실험 분석을 통해, 본 발명은 단일 CAR-T의 기술적 효과보다 우수할 뿐만 아니라, PD-1 녹아웃과 결합된 CAR-T의 기술적 효과보다 우수하다. (4) T 세포의 고갈을 억제할 수 있다. 본 발명에서, T 세포의 HPK-1 유전자를 CRISPR/Cas9에 의해 녹아웃시키며, 유식 세포측정 분석은 HPK-1의 녹다운이 PD1 및 TIM3 발현 수준의 하향-조절을 유도할 수 있음을 나타낸다. 따라서, HPK-1 녹아웃은 T 세포 고갈을 억제함으로써 표적 세포를 사멸하고 사이토카인을 분비하는 T 세포의 능력을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
대안의 예시적인 실시태양 1 내지 34
하기는 본 개시의 일부 추가의 예시적인 실시태양을 나타낸다:
1. HPK-1 유전자의 유전학적 변형 방법으로서, 상기 방법은 HPK-1 단백질의 기능이 불활성화되거나 그의 활성이 감소되도록 상기 HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시킴을 포함함을 특징으로 한다.
2. 실시태양 1에 따른 방법에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 녹아웃, 부분적인 유전자 결실, 유전자 교체, 및 삽입을 포함함을 특징으로 한다.
3. 실시태양 1 또는 2에 따른 방법에서, 상기 유전학적 변형은 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 유전학적으로 변형시킴을 포함함을 특징으로 한다.
4. 실시태양 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 편집 기술을 사용하여 HPK-1 유전자를 변형시킴을 포함함을 특징으로 한다.
5. 실시태양 4에 따른 방법에서, 상기 유전자 편집 기술은 배아 줄기세포-기반 DNA 상동성 재조합 기술, CRISPR/Cas9 기술, 아연 집게 뉴클레아제 기술, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 기술, 귀소 엔도뉴클레아제 또는 다른 분자 생물학 기술을 포함하며; 바람직하게는 상기 유전학적 변형을 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 사용하여 수행함을 특징으로 한다.
6. 실시태양 5에 따른 방법에서, 상기 방법은 HPK-1 유전자를, 상기 HPK-1 유전자를 표적화하는 gRNA로 녹아웃시킴을 포함함을 특징으로 한다.
7. 실시태양 6에 따른 방법에서, 상기 gRNA는 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 표적화함을 특징으로 한다.
8. 실시태양 6 또는 7에 따른 방법에서, 상기 gRNA 및 Cas9 단백질은 함께 HPK-1 유전자를 녹아웃시킴을 특징으로 한다.
9. 실시태양 6 내지 8 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 gRNA의 제조 방법은 (1) gRNA 로딩 플라스미드의 구성; 및 (2) 상기 gRNA의 시험관내 전사를 포함하고; 여기에서 상기 단계 (1)은 상기 gRNA 암호화 가닥 및 상보적 가닥을 합성하고, 상기 암호화 가닥과 상보적 가닥을 어닐링함으로써 형성된 이중가닥 DNA를 pUC57 벡터에 삽입하고, 이를 T7 프로모터의 조절하에 두어 pUC57kan-T7-gRNA를 구성함을 포함하고; 상기 단계 (2)는 효소적 절단 및 서열분석을 통해 식별된 gRNA 로딩 플라스미드 pUC57kan-T7-gRNA를 정제하고, T7 RNA 시험관내 전사 키트를 사용하여 HPK-1 gRNA/HPK-1 gRNA를 시험관내 전사시키고, 상기 전사 생성물을 정제시켜 gRNA를 수득함을 포함함을 특징으로 한다.
10. 실시태양 9에 따른 방법에서, 상기 gRNA의 이중가닥 DNA 주형 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 바와 같음을 특징으로 한다.
11. 실시태양 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 유전자 변형은 단핵 세포의 HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시킴을 포함하며; 바람직하게, 상기 단핵 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포이고; 보다 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이고; 보다 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 CD3+ T 세포이고; 가장 바람직하게, 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 외인성 키메릭 항원 수용체를 추가로 발현함을 특징으로 한다.
12. 실시태양 11에 따른 방법에서, 상기 방법은 (1) HPK-1 유전자를 표적화하는 gRNA를 제조하는 단계; (2) Cas9 단백질을 제조하는 단계; (3) 단핵 세포를 시험관내에서 배양 및 확대시키는 단계; 및 (4) 상기 단계 (1)의 gRNA 및 상기 단계 (2)의 Cas9 단백질을 상기 단계 (3)의 단핵 세포내에 동시-형질감염시는 단계를 포함함을 특징으로 한다.
13. 실시태양 12에 따른 방법에서, 상기 방법은 단계 (4)에서 동시-형질감염 후에 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 식별함을 추가로 포함하며, 바람직하게는 인간 말초 혈액 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 PCR-효소적 절단 및/또는 웨스턴 블럿 방법에 의해 식별함을 특징으로 한다.
14. 실시태양 13에 따른 방법에서, 상기 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별할 수 있다: PCR 증폭을 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 프라이머를 사용하여 수행하고, 상기 PCR 생성물에 열 변성, 어닐링 및 복원을 가한 다음 T7 엔도뉴클레아제 처리를 가하고, 절단 효율을 아가로스 젤 전기영동으로 식별하고; 한편으로, 상기 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃 효율을 하기의 과정으로 식별함을 특징으로 한다: 상기 단핵 세포 중의 전체 단백질을 추출하고, SDS-PAGE를 가하고, 멤브레인으로 옮기고, 1차 항체로서 항-HPK-1 항체로 웨스턴 블럿을 수행한다.
15. 실시태양 12 내지 14 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 방법은 상기 단계 (4)에서 수득된 gRNA 및 Cas9 단백질로 동시-형질감염된 단핵 세포에서 인간 유래된 키메릭 항원 수용체CAR)를 발현시키는 단계 (5)를 추가로 포함함을 특징으로 한다.
16. 실시태양 15에 따른 방법에서, 상기 인간 유래된 키메릭 항원 수용체는 CAR19임을 특징으로 한다.
17. HPK-1 유전자를 유전학적으로 변형시키기 위한 시약으로서, 상기 HPK-1 유전자를, HPK-1 단백질의 기능이 불활성화되거나 그의 활성이 감소되도록 상기 시약에 의해 유전학적으로 변형시킴을 특징으로 한다.
18. 실시태양 17에 따른 시약에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 녹아웃, 부분적인 유전자 결실, 유전자 교체, 및 삽입을 포함함을 특징으로 한다.
19. 실시태양 17 내지 18 중 어느 하나에 따른 시약에서, 상기 유전학적 변형은 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 유전학적으로 변형시킴을 포함함을 특징으로 한다.
20. 실시태양 17 내지 19 중 어느 하나에 따른 시약에서, 상기 유전학적 변형은 유전자 편집 기술을 사용하여 HPK-1 유전자를 변형시킴을 포함하며; 바람직하게, 상기 유전자 편집 기술은 배아 줄기세포-기반 DNA 상동성 재조합 기술, CRISPR/Cas9 기술, 아연 집게 뉴클레아제 기술, 전사 활성제-유사 효과기 뉴클레아제 기술, 귀소 엔도뉴클레아제 또는 다른 분자 생물학 기술을 포함하며; 보다 바람직하게, 상기 유전학적 변형을 CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 기술을 사용하여 수행함을 특징으로 한다.
21. 실시태양 20에 따른 시약에서, 상기 시약은 HPK-1 유전자를 표적화하여 상기 HPK-1 유전자를 녹아웃시키는 gRNA이며; 바람직하게, 상기 gRNA는 상기 HPK-1 유전자의 제2 엑손을 표적화함을 특징으로 한다.
22. 실시태양 21에 따른 시약에서, 상기 gRNA는 서열번호 1에 제시된 서열과 짝을 이룰 수 있음을 특징으로 한다.
23. 실시태양 21 또는 22에 따른 시약에서, 상기 gRNA의 제조 방법은 (1) gRNA 로딩 플라스미드의 구성; 및 (2) 상기 gRNA의 시험관내 전사를 포함하고, 여기에서 상기 단계 (1)은 상기 gRNA 암호화 가닥 및 상보적 가닥을 합성하고, 상기 암호화 가닥과 상보적 가닥을 어닐링함으로써 형성된 이중가닥 DNA를 pUC57 벡터에 삽입하고, 이를 T7 프로모터의 조절하에 두어 pUC57kan-T7-gRNA를 구성함을 포함하고; 상기 단계 (2)는 효소적 절단 및 서열분석을 통해 식별된 gRNA 로딩 플라스미드 pUC57kan-T7-gRNA를 정제하고, T7 RNA 시험관내 전사 키트를 사용하여 HPK-1 gRNA/HPK-1 gRNA를 시험관내 전사시키고, 상기 전사 생성물을 정제시켜 gRNA를 수득함을 포함함을 특징으로 한다.
24. 실시태양 23에 따른 시약에서, 상기 gRNA의 이중가닥 DNA 주형 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 바와 같음을 특징으로 한다.
25. 실시태양 21 내지 24 중 어느 하나에 따른 시약에서, 상기 작용제는 Cas9 단백질을 추가로 포함하며; 바람직하게 상기 Cas9는 재조합적으로 발현됨을 특징으로 한다.
26. 실시태양 25에 따른 시약에서, 상기 Cas9 단백질은 하기의 방법에 의해 생성됨을 특징으로 한다:
(1) 인간 Cas9 단백질의 아미노산 서열에 따라 코돈 최적화 후에 전장 인간 Cas9 cDNA를 제조하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 전장 인간 Cas9 cDNA의 5' 및 3' 단부에 핵 국소화 신호를 가하여 재조합 발현 플라스미드를 구성하는 단계;
(3) 상기 재조합 발현 플라스미드를 숙주 세포에 도입시켜 재조합 Cas9 단백질을 발현시키는 단계;
(4) 상기 재조합적으로 발현된 Cas9 단백질을 정제 및 농축시키는 단계; 및
(5) 정제 태그를 절제하고 약 160 kD의 Cas9 단백질을 회수하는 단계.
27. 실시태양 21 내지 26 중 어느 하나에 따른 시약에서, 상기 시약은 키메릭 항원 수용체를 추가로 포함함을 특징으로 한다.
28. 유전학적 변형에서 실시태양 17 내지 27 중 어느 하나에 따른 시약의 용도.
29. 실시태양 28에 따른 용도에서, 상기 용도는 단핵 세포 중 HPK-1 유전자의 녹아웃, 또는 단핵 세포의 사멸 활성의 증가, 또는 단핵 세포 중 Th1 사이토카인 수준의 증가를 위한 것임을 특징으로 한다.
30. 실시태양 1 내지 16 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 단핵 세포.
31. 실시태양 30에 따른 단핵 세포에서, 상기 단핵 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포이고, 바람직하게 상기 인간 말초 혈액 단핵 세포는 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포이고, 보다 바람직하게는 CD3+ T 세포, 더욱 바람직하게는 외인성 인간 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CD3+ T 세포, 가장 바람직하게는 CAR19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2, 메소텔린 등에 특이적인 단쇄 항체로 키메라화된 CD3+ T 세포임을 특징으로 한다.
32. 약학 조성물의 제조를 위한 실시태양 17 내지 27 중 어느 하나에 따른 시약 또는 실시태양 30 또는 31에 따른 단핵 세포의 용도로서, 상기 약학 조성물은 단핵 세포 중의 HPK-1 유전자를 변형시키거나 단핵 세포의 사멸 활성을 증가시키거나, 단핵 세포 중의 Th1 사이토카인 수준을 증가시키기 위한 것임을 특징으로 한다.
33. 실시태양 32에 따른 용도에서, 상기 약학 조성물은 종양의 치료를 위한 것이고, 바람직하게, 상기 종양은 림프종 또는 고형 종양임을 특징으로 한다.
34. 실시태양 17 내지 27 중 어느 하나에 따른 시약 또는 실시태양 30 또는 31에 따른 단핵 세포를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
실시예
본 개시의 예시적인 실시태양을 첨부되는 도면을 참조하여 하기에 보다 상세히 기재할 것이다. 본 개시의 예시적인 실시태양을 도면에 도시하지만, 상기 개시가 다양한 형태로 구현될 수 있고 본 명세서에 제시된 실시태양들에 의해 제한되어서는 안 됨을 알아야 한다. 오히려, 이들 실시태양은 본 개시가 보다 충분히 이해되고 상기 개시의 범위가 당해 분야의 숙련가들에게 충분히 전달될 수 있도록 제공된다.
실시예
일반적인 방법 및 물질
본 명세서의 실시예에 사용되는 시약은 일반적으로 상업적으로 입수 가능하거나 당해 분야의 표준 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 사용되는 다양한 항체를 하기와 같이 상업적으로 입수할 수 있다:
Figure 112020039475846-pct00002
세포주: 세포주 라지(Raji), 다우디(Daudi)，K562，U266，RPMI8226 및 주르캣 세포를 RPMI1640에서 배양하고 293T를 37℃에서 5% CO2 배양기 중에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 중에서 배양하였다. 인간 PBMC를 37℃에서 5% CO2 배양기 중에서 X-VIVO15 중에서 배양하였다.
렌티바이러스 벡터 생성 및 형질도입: CD19 CAR, Her2 CAR 및 BCMA CAR-암호화 렌티바이러스 상등액을 렌티-293T 세포주의 일시적인 형질감염을 통해 생성시켰다. 간단히, 렌티-293T 세포를 상기 CAR 및 렌티바이러스 외막 단백질을 암호화하는 플라스미드로 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 통해 형질감염시켰다. 상등액을 형질감염후 48 및 72h째에 수집하였다.
T 세포 단리 및 변형: 인간 T 세포를 앞서 기재된 바와 같이 활성화시키고 형질도입시켰다. 간단히, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 공여자 말초 혈액 또는 류코팩(leukopack)(시징(xijing) 병원)으로부터 단리하였다. 모든 실험을 모든 관련된 윤리 규제를 준수하고 IRB 095091에 따라 수행하였다. PBMC를 형질도입전 2d 동안 5 ㎍/㎖ CD3 항체, 3 ㎍/㎖ CD28 항체 및 100 IU/㎖의 IL-2로 활성화시켰다. 마우스 T 세포를 비장으로부터 기계적으로 단리하고 IL-2 및 5 ㎍/㎖ CD3 항체, 3 ㎍/㎖ CD28 항체를 사용하여 활성화시켰다. 레트로넥틴(RetroNectin)-코팅된 플레이트(타카라바이오(TakaraBio))상에서 3 연속일로 활성화된 PBMC 및 레트로바이러스 상등액의 원심분리에 의해 형질도입을 성취하였다.
mRNA 시험관내 전사 및 Cas9 단백질 정제: T7 엠스크립트(mscript) 시스템 키트(앰비온(Ambion))를 사용하여 시험관내 전사 RNA를 생성시켰다. Cas9 단백질 정제: Cas9 유전자를 공지된 과정에 따라 pGEX4T-1 플라스미드(인비트로젠(Invitrogen))내로 클로닝하였다. pGEX4T-1-Cas9 플라스미드를 1단계 클로닝 키트(바자임(vazyme))를 사용하여 구성하였다. 상기 단백질을 대장균 BL21 로제타(Rosetta) 2(DE3)에서 발현시켰다. 배양물(2 L)을 37℃에서 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 34 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 테리픽 브로쓰(Terrific Broth) 배지에서 A600이 0.6에 도달할 때까지 증식시켰다. 상기 배양물에 0.2 mM 아이소프로필-1-티오-β-d-갈락토피라노사이드를 보충하고 일정하게 진탕시키면서 16℃에서 16h 동안 배양을 계속하였다. 상기 세포를 원심분리에 의해 수확하고 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 모든 후속 단계를 4℃에서 수행하였다. 해동된 세균을, 완전한 EDTA 무 프로테아제 억제제 정제(로슈)가 보충된 30 ㎖의 완충제 A(20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 200 mM Li2SO4, 10 mM 이미다졸) 중에 재현탁시켰다. 트리톤 X-100을 0.1%의 최종 농도로 가하였다. 30분 후에, 용해물을 초음파 처리하여 점도를 감소시켰다. 불용성 물질을 벡크만(Beckman) JA-3050 로터에서 17,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 배치 중에 결합된 용해성 추출물을, 완충제 A로 예비-평형화시킨 5 ㎖의 Ni2+-나이트릴로트라이아세트산-아가로스 수지(퀴아겐(Qiagen))와 1시간 동안 혼합하였다. 상기 수지를 원심분리에 의해 회수하고, 이어서 완충제 A로 광범위하게 세척하였다. 결합된 단백질을, 증가하는 농도의 이미다졸을 함유하는 IMAC 완충제(50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 10% 글리세롤)의 분액으로 단계적으로 용출시켰다. His6-MBP 태그된 Cas9 폴리펩타이드를 함유하는 200 mM 이미다졸 용출물을 함께 모았다. 상기 His6-MBP 친화성 태그를, 20 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤에 대해 밤새 투석시키는 동안 TEV 프로테아제에 의한 절단에 의해 제거하였다. 태그없는 Cas9 단백질을 5 ㎖ SP 세파로스(Sepharose) HiTrap 컬럼(지이 라이프 사이언시즈)을 사용함으로써 융합 태그로부터 분리시켰다. 상기 단백질을, 20 mM 트리스 HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 1 mM TCEP, 및 5% 글리세롤 중의 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/300 GL을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제시켰다. 상기 크기 배제로부터의 용출 피크를 분액하고, 동결시키고, -80℃에서 보관하였다.
유전자 표적화: T 세포 활성화 개시후 48h째에, 상기 T 세포를 BTX EM830(하버드 아파라투스(Harvard Apparatus) BTX)을 사용하여 Cas9 단백질 및 gRNA의 전자전달(electrotransfer)에 의해 형질감염시켰다. 1x106 세포를 3 ㎍의 Cas9 및 2 ㎍의 gRNA와 혼합하여 0.2 ㎝ 큐벳에 넣었다. 전기천공에 이어서 세포를 배양 배지에 희석하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. CAR-렌티 바이러스를, 표시된 감염 다중도(1x105 내지 1x106 범위)로 전기천공 후 2 내지 4h째에 상기 배양물에 가하였다. 후속적으로, 편집된 세포를 표준 조건을 사용하여 배양하였다(37℃ 및 필요에 따라 2 내지 3일마다 보충하여 ㎖당 약 1x106 세포의 밀도를 유지시킨 T 세포 생육 배지에서 확대시켰다).
생체내 마우스 연구: NOD-SCIDg/(NSG) 마우스를 챨스 리버 레보라토리즈(Charles River Laboratories)(중국 소재)로부터 수득할 수 있다. 모든 마우스를 칭화(Tsinghua) 대학 실험 동물 연구 센터 및 동물실험 윤리 위원회의 지침에 따라 수용하였다. 모든 동물을 무균 조건하에서 유지시키고 국제 실험동물 보호 정책 및 승인에 대한 평가 및 인가 협회에 따라 보호하였다.
생체내 생물발광 영상화: PBS 중에 현탁된 D-루시페린(퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 월썸 소재)(15 ㎎/㎖)을 수집 5분 전에 i.p. 주사하였다(150 ㎎/㎏). 생물발광 영상을 제노젠(Xenogen) IVIS 스펙트럼 영상화 시스템(제노젠, 미국 캘리포니아주 앨라메다 소재)상에서 수집하였다. 라이브 상 소프트웨어 버전 3.0(제노젠)을 사용하여 생물발광 영상화 데이터 세트를 수집하고 정량분석하였다.
유식 세포측정: 마우스로부터 분리된 종양을 가위로 다지고, 이어서 종양 해리 키트로 절단하고 gentleMACS(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용하여 분쇄하여 단세포 현탁액을 생성시켰다. 비장으로부터의 세포를, 비장을 70 ㎛ 필터를 통해 분쇄시킴으로써 단리하였다. 상기 세포를 세척하고, 이어서 암실에서 15분간 항체로 염색하고. 이어서 유식 세포측정에 의해 검출하였다. 세포내 염색을 위해서, 세포를 고정 및 투과화 키트(비디 바이오사이언시즈)를 사용하여 추가로 투과화하고 항체에 의해 염색하였다. 모든 샘플을 LSR 포르테사(Fortessa) 또는 FACS AriaII(비디 바이오사이언시즈)로 분석하고 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. CAR을 THETM NWSHPQFEK 태그 항체, FITC 및 인간 CD3 항체로 검출하였다. Her2 및 BCMA CAR을 비오틴화된 단백질 L(피어스 프로테인 바이올로지(Pierce Protein Biology)) 및 인간 CD3 항체로 검출하였다. CAR-T 세포 표현형 데이터를 제공하는 모든 FACS 플롯을 게이팅된 CAR+ 세포상에서 수행하였다. 모의-형질도입된 T 세포의 경우, 전체 T 세포 집단을 분석에 사용하였다.
인간 CAR-T 세포의 세포독성 분석: 표적을 사멸시키는 CAR-T 세포의 능력을 12-h 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석에서 시험하였다. 형질도입된 T 세포 및 UTD T 세포를 해동시키고, 37℃에서 24h 동안 6-웰 플레이트 중의 T 세포 배지에서 휴지시켰다. 효과기 및 표적을 지시된 효과기:표적(E:T) 비로 함께 혼합하고 검은색 벽 96-웰 편평바닥 플레이트 중의 T 세포 배지에서 웰당 200 ㎕의 총 부피로 3x104 표적 세포와 함께 배양하였다. 12h 후에, 모든 시험 및 대조용 웰로부터 50 ㎕ 분액을 새로운 96-웰 투명 편평바닥 플레이트로 옮기고, 50㎕의 사이토톡스 96(등록상표) 시약(프로메가)을 각각의 샘플 분액에 가하였다. 상기 플레이트를 호일 또는 불투명한 상자로 덮어 빛을 차단시키고 실온에서 30분간 배양하였다. 50 ㎕의 정지액을 상기 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하고, 마지막으로 주사바늘을 사용하여 임의의 큰 기포를 터뜨리고, 상기 정지액 첨가후 1시간 이내에 490 ㎚ 또는 492 ㎚에서 흡광도를 기록하였다. 하기의 식에서 보정된 값을 사용하여 세포독성 퍼센트를 계산한다: 세포독성 퍼센트 = 100 x 실험상 LDH 방출(OD490)/최대 LDH 방출(OD490).
ELISA 분석: 표적 세포를 세척하고 x-vivo15 배지에 1x106 세포/㎖로 현탁시켰다. 중요하게, 100 ㎖의 각각의 표적 세포 유형을 96-웰 환저 플레이트(코닝(Corning))에 3회 중복하여 가하였다. 효과기 T 세포를 세척하고 x-vivo15 배지에 1x106 세포/㎖로 재현탁시키고. 이어서 100 ㎖의 T 세포를 지시된 웰 중의 표적 세포와 합하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 6 내지 12시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 상등액을 수확하고 ELISA 분석(이바이오사이언스)을 수행하였다.
모든 마우스를 안락사시켰으며; 전혈을 수집하고 실온에서 1h 동안 응고되게 하였다. 혈청을 5,000 rpm에서의 원심분리에 의해 수확하고 동결 보관하였다(-80℃). 인터류킨 2(IL-2), IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-10에 대한 루미넥스(Luminex) 분석을 루미넥스 분석 키트 제품 설명서(알앤디 시스템스)에 따라 수행하였다.
웨스턴 블럿: 1x 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일(CST) 및 0.5 mM 나트륨 바나데이트(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs))를 갖는 150 ㎕의 RIPA 완충제(PBS, 1% NP40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트[SDS]) 중에 5x106의 세척된 세포를 용해시키고, 이어서 얼음상에서 30분간 배양함으로써 CAR-T 세포의 전 세포 용해물을 생성시켰다. 샘플을 4℃에서 5분간 초음파 처리하여 DNA를 전단하였다. 이어서 웨스턴 블럿을, 항-HPK-1 항체 또는 항-PD-1 항체 프라이머리를 사용하여, 원심분리된 샘플의 상등액상에서 수행하였다.
실시예 1. gRNA의 설계 및 합성
1. 가이드 RNA의 설계
gRNA 로딩된 플라스미드는 pUC57kan-T7-gRNA이었으며, HPK-1을 표적화하는 gRNA를 설계하고, PD1을 표적화하는 gRNA를 대조용으로서 사용하였다. 게놈과 짝을 이루는 HPK-1을 특이적으로 표적화하는 gRNA의 서열은 GACCTGGTGGCACTGAAGA(HPK-1의 제2 엑손 중에 위치함, 서열번호 1)이고; 게놈과 짝을 이루는 PD1을 특이적으로 표적화하는 gRNA의 서열은 GGCCAGGATGGTTCTTAGGT(PD1의 제1 엑손 중에 위치함, 서열번호 2)이다.
HPK-1 gRNA: F: 5'-TAGG ACCTGGTGGCACTGAAGA-3'(서열번호 3)
R: 5'-AAAC TCTTCAGTGCCACCAGGTC-3'(서열번호 4)
PD1 gRNA: F: 5'-TAGG GCCAGGATGGTTCTTAGGT-3'(서열번호 5)
R: 5'-AAAC CCTAAGAACCATCCTGGCC-3'(서열번호 6).
gRNA 암호화 가닥 및 상보적 가닥을 합성하고, HPK-1 gRNA 및 PD1 gRNA의 2개의 DNA 가닥을 어닐링시킴으로써 이중가닥 DNA를 형성시키고, 이를 T7 프로모터의 조절하에 pUC57 플라스미드 벡터내에 삽입하여 pUC57kan-T7-HPK-1gRNA 및 pUC57kan-T7-PD1gRNA를 구성하였으며, 상기는 T7 프로모터, gRNA 표적화 서열 및 키메릭 gRNA 스캐폴드를 함유한다.
2. 가이드 RNA에서 메신저 RNA로의 시험관내 전사
서열분석으로 확인된 정확한 플라스미드 pUC57kan-T7-HPK-1gRNA 및 pUC57kan-T7-PD1gRNA를 DraI로 절단하여 gRNA 전사 주형을 수득하였으며, 이어서 상기 gRNA 전사 주형의 정제를 정제 키트를 사용하여 수행하였다. 상기 정제된 생성물에, T7RNA키트 전사 키트(앰비온_ mMESSAGE _mMA-CHINE_T7)를 사용하여 HPK-1gRNA/HPK-1gRNA의 시험관내 전사를 수행하고, 전사 생성물을 RNA 정제 키트(MEGAclear(상표) ki, 앰비온)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 gRNA를 아가로스 젤 전기영동에 의해 식별하고 결과를 도 1에 도시한다. 상기 gRNA의 농도 및 순도를 나노드롭(NanoDrop) 2000 초미세 분광광도계에 의해 검출하고, gRNA를 분액하고 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다.
추가적인 gRNA를 설계하고 합성하고 정제하였다. 이들 gRNA는 HPK-1 유전자 중의 하기의 표적 서열을 표적화하는 서열을 갖는다:
Figure 112020039475846-pct00003
이들 gRNA를 일부 실시예에서 상술한 바와 같이 서열번호 1을 표적화하는 gRNA 대신에 사용할 수 있다. 도 25는 실시예 4의 방법에 의해 시험된, 각각의 이들 gRNA를 사용하는 전형적인 HPK-1 유전자 편집 효율을 도시한다. 도 25에서, NC는 대조용이고, 3#는 서열번호 15를 표적화하는 gRNA의 결과를 도시하고; 4#는 서열번호 11을 표적화하는 gRNA의 결과를 도시하고; 5#는 서열번호 12를 표적화하는 gRNA의 결과를 도시하고; 6#는 서열번호 1을 표적화하는 gRNA의 결과를 도시하고; 1#는 서열번호 13을 표적화하는 gRNA의 결과를 도시하고; 2#는 서열번호 14를 표적화하는 gRNA의 결과를 도시한다.
실시예 2. Cas9 단백질의 재조합 발현 및 정제
인간화된 Cas9를 문헌 보고된 과정에 따라 제조하였다(서열은 서열번호 18 및 19에 제공된다). 문헌[Chang, N. et al., Cell Research 23:465-472 (2013)]은 상기 문헌 중에 보고된 인간화된, 코돈-최적화된 Cas9 cDNA의 서열 및 단백질 서열을 포함하여 내용 전체가 참고로 인용된다. 간단히, Cas9 로딩용 플라스미드는 PGEX4T-1이고, 상기 코돈-최적화된 전장 인간 cas9 cDNA를 PCR에 의해 수득하였다. 주형은 플라스미드 PUC19-T7-CAS9이었다. 핵 국소화 신호(NLS)를 상기 Cas9 서열의 5' 및 3' 단부에 가하여 cas9 단백질의 핵 수입을 용이하게 하였다.
상기 플라스미드를 성공적으로 구성한 후에, CAS9 단백질을 대장균에 의해 발현시키고, GST 컬럼에 의해 정제시키고, 단백질을 농축시키고 수집하고, GST 태그를 트롬빈에 의해 절제하였으며, 신호 단백질 밴드가 160 kd 밴드 부근에서 관찰되었다(도 2).
실시예 3. 인간 말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 확대 및 형질감염
인간 말초 혈액 단핵 세포를 원심분리 및 피콜(Ficoll)(등록상표) 나트륨 메트리조에이트 용액을 사용하는 빠른 분리 방법에 의해 추출하였다. CD3-양성 말초 혈액 단핵 세포를 CD3 자기 비드로 분류하고, T 세포를 CD3/28 항체로 활성화시키고, 37℃/5% CO2의 조건하에서 100 U/㎖ IL-2를 함유하는 LONZA-X-VIVO 15 배지에서 2일 배양 후에 바이러스 형질감염 및 세포의 전기천공을 수행하였다.
상기 cas9 단백질 및 gRNA mRNA를 일정 비율로 혼합하고 실온에서 10분간 정치시키고, 한편으로 4.0 x 106 CD3+ T 세포(CD3/CD28 항체와 함께 48시간 동안 시험관내에서 활성화됨)를 15 ㎖ 원심분리기 튜브로 옮겼다. 상기 세포를 500xg에서 5분간 원심분리시키고, 400 ul opti-배지(cas9 및 gRNA의 혼합물 함유)로 재현탁시켰다. 세포 혼합물을 4 ㎜ 틈을 갖는 BTX 큐벳으로 옮기고, 10분간 얼음상에 두고, 상기 큐벳을 전기충격 형질전환(electrotransformation)을 위해 BTX 제미니(Gemini) X2 전기천공기에 넣었다. 상기 전기충격 형질전환 조건은 500V 및 1ms이다. 전기천공 종료 직후에, 세포 현탁액을 37℃로 예열된 IL-2(100 IU/㎖) 함유 배지(LONZA-X-VIVO 15)에 가하였다. 상기 전기충격 형질전환 후 4시간째에, 인간 유래된 CD19 CAR을 운반하는 바이러스를 10의 MOI 값으로 가하고, 폴리브렌을 상기 배지에 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 가하였다. 상기 바이러스 첨가후 24시간째에, 배지를 교환하고, 이어서 세포 계대배양을 이틀마다 수행하였다.
실시예 4. 효소 절단에 의한 유전자 녹아웃 효율의 식별(T7E1 분석)
3일의 세포 전기충격 형질전환 후에, 세포를 수확하고 세포 게놈을 추출하였다. 돌연변이 부위(CRISPR/Cas9의 표적 부위)를 갖는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 두 쌍의 프라이머 1# 및 2#를 설계하였으며, 여기에서 1# 프라이머는 HPK-1gRNA에 의해 형질전환된 세포 게놈의 PCR 증폭에 사용되었고, 2# 프라이머는 PD1gRNA에 의해 형질전환된 세포 게놈의 PCR 증폭에 사용되었다. 두 쌍의 프라이머 서열은 하기와 같다:
1#: F:5'-agcgagagtgaggaggggg-3'(서열번호 7)
R:5'-ttcatcaccagagataactccc-3'(서열번호 8)
2#: F:5'-ccaccctctccccagtcctaccccctcctcacccctcct-3'(서열번호 9)
R:5'-ggtccctccagacccctcgctccgggacccctgggctgc-3'(서열번호 10).
상기 증폭에 의해 수득된 PCR 생성물에 PCR 장치를 사용하여 열 변성, 어닐링 및 복원 처리를 가하며, 설정 과정은 하기와 같다:
95℃ 3분,
85℃ 1.5분(온도 감소율 0.1℃/s),
75℃ 1.5분(0.1℃/s),
65℃ 1.5분(0.1℃/s)
...
25℃ 1.5분(0.1℃/s),
4℃.
상기 처리된 PCR 생성물 혼합물에 T7 엔도뉴클레아제 1(NEB)을 가하고, 37℃에서 15분간 방치하고, 아가로스 젤 전기영동(2% 아가로스 젤)을 가하여 절단 효율을 측정하였다. 결과를 도 3에 도시한다.
실시예 5. 웨스턴 블럿 방법에 의한 유전자 녹아웃 효율의 식별
세포를 전기충격 형질전환시킨 후 3일째에, 상기 세포를 수집하고, 세포 단백질을 추출하고, HPK-1 및 β-액틴의 발현을 웨스턴 블럿에 의해 검출하였다. 결과를 도 4에 도시한다. 특정 그룹들을 하기 표에 나타낸다:
Figure 112020039475846-pct00004
인간 말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 확대, 전기충격 형질전환 및 바이러스 형질감염 단계는 실시예 3에 상세히 기재되어 있다.
도 4는 CAR19+HPK-1+/- T 세포에서의 HPK-1의 발현 수준이 T 세포, CAR19+ T 세포 및 CAR19+PD+/- T 세포에 비해 현저하게 감소됨을 도시한다. 도 26은 웨스턴 블럿에 의해 측정된 녹아웃 효율의 전형적인 정량분석을 도시한다.
실시예 6. 유식 세포측정에 의한 CAR19의 형질감염 효율 및 PD1의 발현의 검출
세포를 바이러스로 형질감염시킨 후 7일째에, 1x106 세포를 각 그룹으로부터 채취하고, 4℃에서 빛 차단하에 항체와 배양시킨 후 Car 및 HPK-1의 발현을 검출하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 특정 그룹들을 하기 표에 나타낸다:
Figure 112020039475846-pct00005
인간 말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 확대, 전기충격 형질전환 및 바이러스 형질감염 단계는 실시예 3에 상세히 기재되어 있다.
도 5는 CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포의 표면상의 PD1 수용체의 발현이 단순히 CAR19 T 세포의 경우보다 현저하게 감소되었음을 도시한다. CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포의 표면상의 PD1 수용체 발현 수준은 현저한 차이 없이 유사하였다.
실시예 7. T 세포 사멸 실험
효과기 세포는 상기 전기충격 형질감염 및 바이러스 형질감염에 의해 형질감염된 CD3+ 인간 T 세포이며, 표적 세포는 각각 라지, 다우디, K562 인간 악성 림프종 세포주이다. 100 ㎕의 상기 표적 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고, 24시간 후에 100 ㎕의 효과기 세포(1x106 세포/㎖)를 가하고, 각 샘플에 대해 3개의 복제 웰을 만들었다. 상기 세포를 12h 동안 37℃에서 CO2 배양기 중에서 5%의 부피 분획으로 배양함으로써 상등액을 수집하였다. 상기 세포 상등액 중의 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 함량을 프로메가 사이토톡스 96(등록상표) 비-방사성 세포 사멸 시험 키트를 사용하여 측정하였다. 미세-진동기상에서 5분간 진탕시킨 후에, 490 ㎚의 파장에서 미세플레이트 판독기에 의해 상기를 검출하고, 세포 사멸 기능을 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure 112020039475846-pct00006
특정한 그룹들을 하기 표에 나타낸다:
Figure 112020039475846-pct00007
인간 말초 혈액 단핵 세포의 시험관내 확대, 전기충격 형질전환 및 바이러스 형질감염 단계는 실시예 3에 상세히 기재되어 있다.
3개의 인간 악성 림프종 세포주에 대한 T 세포의 사멸 효과를 도 6에 도시한다. 도 6에서, CAR19+HPK-1+/- T 세포는 거의 모든 효과기 대 표적 비(효과기 대 표적 비가 5:1인 K562 세포주를 제외하고)에서 3개의 인간 악성 림프종 세포주에 대해 최고의 사멸 효과를 갖는다. 라지 및 다우디 세포주의 경우 둘 다, 1:1 및 5:1의 효과기 대 표적 비에서, CAR19+HPK-1+/- T 세포의 사멸 효과가 다른 그룹들의 경우와 현저하게 상이하며, 10:1의 효과기 대 표적 비에서, CAR19+HPK-1+/- T 세포의 사멸 효과는 다른 그룹들의 경우에 비해 대단히 현저하게 상이하다.
실시예 8: T 세포에 의한 분비된 사이토카인의 검출
CAR19+CD3+ 인간 T 세포 및 3개의 표적 세포(라지, 다우디, K562)를 2:1의 비로 12시간 동안 공-배양하고, 이어서 상등액을 수집하고, 상기 상등액 중의 IFN-γ 및 IL-2의 함량을 각각 이바이오사이언스의 Elisa 검출 키트를 사용하여 검출하였다. 결과를 도 7에 도시한다.
도 7에서, 라지 및 다우디에 대한 CAR19+HPK-1+/- T 세포의 사멸 효과는 다른 그룹들의 경우보다 더 높다. 라지에 대한 CAR19+HPK-1+/- T 세포 및 CAR19+PD1+/- T 세포의 사멸 효과는 다른 그룹들의 경우와 대단히 현저하게 상이하다. 다우디에 대한 CAR19+HPK-1+/- T 세포의 사멸 효과는 다른 그룹들의 경우와 대단히 현저하게 상이하고, 다우디에 대한 CAR19+PD1+/- T 세포의 사멸 효과는 다른 그룹들의 경우와 현저하게 상이하다.
실시예 9. 인간 림프종의 마우스 모델에 대한 T 세포의 효과
시험 동물: 암컷 NOD SCID 마우스. 모든 마우스를 칭화 대학 실험동물 연구 센터 및 동물실험 윤리 위원회의 지침에 따라 수용하였다. 모든 동물을 무균 조건하에서 유지시키고 국제 실험동물 보호 정책 및 승인에 대한 평가 및 인가 협회에 따라 보호하였다.
시험 방법: 도 12는 생체내 동물 연구의 일반적인 스케줄을 도시한다. 간단히, 6- 내지 10-주령의 NOD-SCIDg/(NSG) 마우스에게 0일째에 오른쪽 옆구리에서 1x106 라지 종양 세포를 피하 주사하였다. 상기 마우스를, 모든 종양의 부피가 대략 100 ㎣이도록 라지 종양 접종후 4일째에 꼬리 정맥을 통해 1x106 T 세포 또는 CD19 CAR-T 세포로 처리하였다. 종양을 7일마다 측정하였다. 연속 측정일에 측정될 수 있는 가시적이거나 촉진 가능한 종양이 없는 마우스를 "완전한 퇴행"으로서 간주하였다. 동물이 고통의 징후를 나타내거나 전체 종양 크기가 2,500 ㎣에 도달한 경우 상기 동물을 안락사시켰다.
40마리의 암컷 NOD SCID 마우스를 각 그룹당 8마리씩 6개의 그룹으로 무작위 분류하였다. 각각의 마우스 그룹을 피하 주사에 의해 라지 세포로 접종하여 인간 림프종의 마우스 모델을 구성하였다. 대조군은 블랭크 대조군이었으며, 200 ㎕의 생리 식염수를 상기 투여되는 세포 대신에 사용하였다. T 세포 처리 그룹은 음성 대조군이었으며, 투여되는 세포는 1x106 T 세포였다. Car-T WT 처리 그룹에 투여하기 위한 T 세포는 1x106 CAR-T 세포였다. Car-T HPK-1 KO 처리 그룹에 투여하기 위한 세포는 1x106 HPK-1-/- CAR-T 세포였다. Car-T PD1 KO 처리 그룹에 투여하기 위한 세포는 1x106 PD1-/- CAR-T 세포였다. 각각의 마우스 그룹에게 단일 용량으로 투여하였다.
(1) 종양 부피의 측정
상기 마우스의 종양 부피를 투여 전에 측정하고, 상기 마우스 종양의 긴 직경 및 짧은 직경을 투여후 1주일에 2회 측정하였으며, 이에 의해 상기 종양 부피를 계산하고 기록하였다. 상기 종양 부피는 마우스에서 종양의 증식을 반영할 수 있다. 상기 종양의 긴 직경 및 짧은 직경을 버니어 캘리퍼스로 측정하였다: 종양 부피(㎣) = 종양 긴 직경(㎜) x 종양 짧은 직경2(㎟) x 0.5. 다양한 용량 그룹간의 차이 및 각 투여 그룹과 음성 대조군간의 차이를 비교하였다.
(2) 생체내 영상화 검출
상기 마우스에 대해 생체내 영상화 검출을 수행하였다. 상기 마우스를 검출 전에 면도하고, 펜토바비탈 나트륨 용액(15 ㎍/체중 g)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 각각의 마우스 그룹에게 200 ㎕의 15 g/L 플루오레세인 용액을 복강내 주사하고, 5분 후에 생체내 영상화 관찰을 수행하였다.
(3) CAR-T 증식 분석
상기 마우스의 말초 혈액을 투여에 앞서 채취하고, 상기 마우스의 말초 혈액 중 CD3 양성 세포의 백분율을 측정하고, 상기 마우스의 말초 혈액을 투여후 10일마다 채취하여 상기 마우스의 말초 혈액 중 CD3 양성 세포를 측정하였다. 상기 CD3 양성 세포의 양은 상기 마우스의 말초 혈액 중 CAR-T 세포의 증식을 반영한다. 상기 마우스의 말초 혈액 중 CD3 양성 세포의 백분율을 유식 세포측정에 의해 측정하였다. 상기 마우스의 꼬리 정맥을 수술용 블레이드로 절단하여 채혈하고 약 100 ㎕의 말초 혈액을 20 ㎕의 0.5 M EDTA 응고방지액을 함유하는 1.5 ㎖ EP 튜브에 수집하였다. 철저히 혼합 후에, 100 ㎕의 PBS를 가하고 400 g에서 5분간 원심분리시키고, 상등액을 버리고, 펠릿을 1 ㎖의 적혈구 용해물로 재현탁시키고 4℃의 냉장고에 15분간 두어 적혈구를 완전히 용해시켰다. 400 g에서 5분간 원심분리 후에, 상등액을 버리고 펠릿을 200 ㎕의 PBS로 2회 세척하고, 200 ㎕의 PBS에 재현탁시키고, 철저히 혼합하고, 이어서 유식 세포측정에 의해 검출하였다. 다양한 용량 그룹간의 차이 및 각각의 투여 그룹과 음성 대조군간의 차이를 비교하였다.
(4) 침윤성 종양 조직의 CAR-T 세포의 표현형의 측정
종양 조직 중 침윤성 car-t 세포상에서 PD1/Tim3/Lag-3/CD107a/애넥신 V의 발현을 종양 접종 후 28일째에 유식 세포측정에 의해 검출하였다.
시험 결과
(1) 종양 부피의 측정
도 8은 각각의 마우스 그룹의 종양 부피를 도시한다. 도 8에 도시된 바와 같이, Car-T WT 처리 그룹, Car-T HPK-1 KO 처리 그룹, 및 Car-T PD1 KO 처리 그룹의 종양 부피는 모두 상기 T 세포 처리 그룹의 경우에 비해 감소한 반면, 상기 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹의 마우스의 종양 부피가 가장 작았다.
(2) 생체내 영상화 검출
도 9는 각각의 마우스 그룹의 생체내 영상화 결과를 도시한다. 도 9로부터, Car-T WT 처리 그룹, Car-T HPK-1 KO 처리 그룹, 및 Car-T PD1 KO 처리 그룹의 치료학적 효과가 모두 상기 T 세포 처리 그룹의 경우에 비해 양호한 반면, 상기 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹의 마우스의 치료학적 효과가 가장 높음을 알 수 있다.
(3) CAR-T 증식 분석
도 10은 각 그룹의 마우스의 투여후 마우스의 말초 혈액 중 CD19CART 세포의 백분율을 도시한다. 도 10에 도시된 바와 같이, Car-T WT 처리 그룹, Car-T HPK-1 KO 처리 그룹, Car-T PD1 KO 처리 그룹 중 말초 혈액 CART 세포의 백분율은 모두 상기 T 세포 처리 그룹에서의 경우보다 크며, 이는 상기 Car-T 세포가 마우스에서 증식함을 가리킨다. 그러나, 도 10에 도시된 바와 같이, 10일째에, 상기 T PD1 KO 및 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹 중 Car-T 세포의 수는 상기 Car-T WT 처리 그룹에서의 경우보다 현저하게 더 높다. 20, 30 및 40일의 처리 후에, 상기 Car-T WT 처리 그룹 및 Car-T PD1 KO 처리 그룹에서 마우스의 말초 혈액 중 Car-T 세포의 수는 10일 처리 후의 경우에 비해 현저하게 감소한다. 상기 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹 중 세포의 수는 하향-조절되지만, 상기 Car-T WT 처리 그룹 및 Car-T PD1 KO 처리 그룹의 경우보다 현저하게 더 높다.
(4) CAR-T 세포 표현형 및 기능의 검출
도 11은 각각의 마우스 그룹에서 투여 후 28일째의 마우스 종양 중 Car-T 세포의 표현형을 도시한다. 도 10에 도시된 바와 같이, T 세포 세포자멸 및 세포 사멸 실험에서, Car-T WT 처리 그룹에 비해, 상기 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹은 적은 세포자멸 및 증대된 사멸 기능을 나타내는 반면, 상기 Car-T PD1 KO 처리 그룹은 상기 Car-T WT 처리 그룹에 비해 그다지 차이가 없다. T 세포 고갈의 표면 마커 분자 PD1/Tim3/Lag-3은 Car-T WT 처리 그룹에 비해 Car-T HPK-1 KO 처리 그룹에서 현저하게 하향조절되는 반면, Car-T PD1 KO 처리 그룹에서는 오직 PD1만이 Car-T WT 처리 그룹에 비해 현저하게 감소되고, 다른 것들은 그다지 차이가 없다.
실시예 10. Her2 CAR-T 세포 중 HPK-1 유전자 녹아웃
Her2 CAR-T 세포는 또한 생체외 확대 연구 중에 탈진을 경험한다. 도 13A 내지 13D를 참조하시오. 본 실시예는 Her2 CAR-T 세포에 대한 HPK-1 유전자 녹아웃의 효과를 나타낸다.
HPK-1 유전자 녹아웃을 갖는 Her2 CAR-T 세포의 제조는 본 명세서에 기재된 일반적인 방법 및 물질 섹션에 기재된 과정에 따랐다. 상기 녹아웃에 사용된 gRNA는 HPK-1 유전자의 표적 도메인을 표적화하는 서열(서열번호 1을 갖는다)을 포함한다. Cas9 단백질을 실시예 2에 기재된 과정에 따라 제조하고 단리하였다. PD-1 녹아웃 Her2 CAR-T 세포를 실시예 1에 나타낸 바와 동일한 gRNA를 사용하여 제조하고 대조용으로서 사용하였다. 상기 Her2 CAR-T 세포는 4-1BB/CD3ζ 신호전달 모듈을 함유하는 HER2-CAR을 발현한다. 세포 확대는 실시예 3에 기재된 바와 유사한 과정을 따른다.
HPK-1 녹아웃 효율을 웨스턴 블럿에 의해 실시예 5에 기재된 바와 동일한 과정에 따라 평가하고 Her2 Car 발현을 FACS에 의해 평가하였다. 도 14A 내지 14C에 도시된 바와 같이, HPK-1 녹아웃은 T 세포상의 Her2 CAR의 형질도입 및 발현에 영향을 미치지 않는다. 도 14B는 또한 gRNA/Cas9가 Her2 CAR-T 세포 중의 HPK-1 유전자의 녹아웃에 유효함을 도시한다. CD19 CAR-T 세포에서 관찰된 바와 유사하게, HPK-1 유전자의 녹아웃은 또한 T 세포 표면상의 PD1의 발현을 현저하게 감소시켰으며, 이는 PD-1 녹아웃 CAR-T 세포와 실질적으로 동일하다.
실시예 11. HPK-1 유전자 녹아웃 Her2 CAR-T 세포의 생체내 효능
본 실시예는 HPK-1 녹아웃 Her2 CAR-T 세포의 생체내 양상을 연구한다.
6- 내지 10-주령의 NSG 마우스에게 0일째에 5x106 SKOV-3 종양 세포를 i.p. 접종하였다. 상기 마우스를, 모든 종양의 부피가 약 100 ㎣이도록 SKOV-3 종양 접종후 10일째에 꼬리 정맥을 통해 1x106 T 세포 또는 Her CAR-T 세포로 처리하였다. 종양을 3 내지 4일마다 측정하였다. 연속 측정일에 측정될 수 있는 가시적이거나 촉진 가능한 종양이 없는 마우스를 "완전한 퇴행"으로서 간주하였다. 동물이 고통의 징후를 나타내거나 전체 종양 크기가 2,500 ㎣에 도달한 경우 상기 동물을 안락사시켰다.
결과를 도 15 내지 18에 도시하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, HPK-1 녹아웃은 상기 종양 모델에서 Her2 CAR-T 세포의 효능을 현저하게 증대시킨다. HPK-1- Her2 CAR-T 세포로 처리된 마우스는 28일의 기간에 걸쳐 최저의 종양 성장 및 또한 현저하게 연장된 생존을 경험하였다. 다른 한편으로, 야생형 Her2 CAR-T 세포에 비해 PD1-Her2 CAR-T 세포의 개선은 덜 현저하였다. 추가의 연구는 또한 HPK-1 녹아웃이 종양(도 16 참조) 및 비장(도 17 참조)을 침윤시키는 Her2 CAR-T 세포의 능력을 증대시킴을 입증한다.
CD19 CAR-T 세포에 대해 관찰된 시험관내 탈진 마커 연구와 유사하게, HPK-1 녹아웃이 생체내에서 Her2 CAR-T 세포의 탈진을 개선시킴이 또한 밝혀졌다. 도 18을 참조하시오.
실시예 12. BCMA CAR-T 세포 중 HPK-1 유전자 녹아웃
본 실시예는 BCMA CAR-T 세포상의 HPK-1 유전자 녹아웃을 연구한다.
HPK-1 유전자 녹아웃을 갖는 BCMA CAR-T 세포의 제조는 본 명세서에 기재된 일반적인 방법 및 물질 섹션에 기재된 과정에 따랐다. 상기 녹아웃에 사용된 gRNA는 HPK-1 유전자의 표적 도메인을 표적화하는 서열(서열번호 1을 갖는다)을 포함한다. Cas9 단백질을 실시예 2에 기재된 과정에 따라 제조하고 단리하였다. PD-1 녹아웃 BCMA CAR-T 세포를 실시예 1에 나타낸 바와 동일한 gRNA를 사용하여 제조하고 대조용으로서 사용하였다. 세포 확대는 실시예 3에 기재된 바와 유사한 과정을 따른다.
HPK-1 녹아웃 효율을 웨스턴 블럿에 의해 실시예 5에 기재된 바와 동일한 과정에 따라 평가하고 BCMA Car 발현을 FACS에 의해 평가하였다. 도 19A에 도시된 바와 같이, 렌티바이러스를 사용하는 BCMA 형질도입은 성공적이었다. 도 19B는 또한 gRNA/Cas9가 BCMA CAR-T 세포 중 HPK-1 유전자의 녹아웃에 유효함을 나타낸다. CD19 CAR-T 세포에서 관찰된 바와 유사하게, HPK-1 유전자의 녹아웃은 또한 T 세포 표면상의 PD1의 발현을 현저하게 감소시켰으며, 이는 PD-1 녹아웃 CAR-T 세포와 실질적으로 동일하다. 도 20을 참조하시오.
실시예 13. HPK-1 유전자 녹아웃 BCMA CAR-T 세포의 시험관내 효능
본 실시예는 HPK-1 녹아웃 BCMA CAR-T 세포의 시험관내 양상을 연구한다.
본 세포독성 연구는 실시예 7에 기재된 과정에 따라 수행되었다. 간단히, T 세포 및 CAR-BCMA T 세포를 U266, RPMI8226, K562 및 K562-BCMA와 공-배양하고, 12h 배양 후에, 세포독성을 측정하였다. 결과를 도 21에 도시하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, HPK-1 녹아웃은 다양한 세포주에서 BCMA CAR-T 세포의 세포독성을 현저하게 증대시킨다. 세포독성의 개선이 또한 PD-1 녹아웃보다 더 큰 것으로 관찰된다. 도 22는 또한 HPK-1 편집된 BCMA CAR-T 세포가 시험관내에서 증대된 증식을 나타냄을 도시한다.
실시예 14. HPK-1 유전자 녹아웃 BCMA CAR-T 세포의 생체내 효능
본 실시예는 HPK-1 녹아웃 BCMA CAR-T 세포의 생체내 양상을 연구한다.
6-주령의 NSG 마우스에게 10 ㎣의 다수의 골수종 종양 조직을 이식하였다. 상기 마우스를 상기 종양이 100 ㎣에 도달한 후 30일째에 2x106 T 세포 또는 BCMA CAR-T 세포로 꼬리 정맥을 통해 처리하였다. 종양을 3 내지 4일마다 측정하였다. 연속 측정일에 측정될 수 있는 가시적이거나 촉진 가능한 종양이 없는 마우스를 "완전한 퇴행"으로서 간주하였다. 동물이 고통의 징후를 나타내거나 전체 종양 크기가 2,500 ㎣에 도달한 경우 상기 동물을 안락사시켰다.
결과를 도 23에 도시하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, HPK-1 녹아웃은 상기 종양 모델에서 BCMA CAR-T 세포의 효능을 현저하게 증대시킨다. HPK-1- BCMA CAR-T 세포로 처리된 마우스는 33일의 기간에 걸쳐 최저의 종양 성장을 경험한다. 도 23은 또한 HPK-1 녹아웃이 BCMA CAR-T 세포의 항종양 효과의 증대에 있어서 PD1 녹아웃보다 더 유효함을 보인다.
Her2 CAR-T 세포에 대해 관찰된 시험관내 탈진 마커 연구와 유사하게, HPK-1 녹아웃이 생체내에서 BCMA CAR-T 세포의 탈진을 개선시킴이 또한 밝혀졌다. 도 24를 참조하시오.
상기는 단지 본 발명의 바람직한 실시태양일 뿐이며, 본 발명의 범위는 상기로 제한되지 않는다. 당해 분야의 숙련가들이 본 발명에 의해 개시된 기술적 범위내에서 쉽게 생각할 수 있는 변형 및 변화를 본 발명의 범위에 포함하고자 한다. 따라서, 본 발명의 보호 범위는 청구항의 보호 범위에 의해 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> BEIJING YUFAN BIOTECHNOLOGIES CO., LTD. <120> A gRNA TARGETING HPK1 AND A METHOD FOR EDITING HPK1 GENE <130> 1 <140> PCT/CN2018/106636 <141> 2018-09-20 <150> CN 201710853090.2 <151> 2017-09-20 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gacctggtgg cactgaaga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ggccaggatg gttcttaggt 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tagggacctg gtggcactga aga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 4 aaactcttca gtgccaccag gtc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 5 taggggccag gatggttctt aggt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 6 aaacacctaa gaaccatcct ggcc 24 <210> 7 <211> 19 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 7 agcgagagtg aggaggggg 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA/RNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ttcatcacca gagataactc cc 22 <210> 9 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Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr 945 950 955 960 Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys 965 970 975 Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val 980 985 990 Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala 995 1000 1005 Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser 1010 1015 1020 Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met 1025 1030 1035 Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr 1040 1045 1050 Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr 1055 1060 1065 Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn 1070 1075 1080 Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala 1085 1090 1095 Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys 1100 1105 1110 Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu 1115 1120 1125 Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp 1130 1135 1140 Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr 1145 1150 1155 Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys 1160 1165 1170 Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg 1175 1180 1185 Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly 1190 1195 1200 Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr 1205 1210 1215 Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1220 1225 1230 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys 1235 1240 1245 Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys 1250 1255 1260 Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln 1265 1270 1275 His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe 1280 1285 1290 Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu 1295 1300 1305 Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala 1310 1315 1320 Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro 1325 1330 1335 Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr 1340 1345 1350 Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser 1355 1360 1365 Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly 1370 1375 1380 Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys 1385 1390 1395 Lys Lys Lys 1400

Claims (99)

  1. HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴, 및 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 갖는 면역 세포로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 gRNA가, 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖고,
    T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포인,
    면역 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    유전학적 붕괴가 HPK-1 유전자의 불활성화, 감소된 활성 또는 감소된 발현을 생성시키는 상기 HPK-1 유전자 중의 결실, 돌연변이 또는 삽입을 포함하는, 면역 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    유전학적 붕괴가 HPK-1 유전자의 하나 이상의 엑손 중 적어도 일부의 결실을 포함하는, 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서,
    유전학적 붕괴가, HPK-1 유전자 중의 삽입 및 결실(인델)을 수행하는 비-상동 말단 연결(NHEJ)에 의해 복구되는 상기 HPK-1 유전자 중의 이중가닥 절단(DSB)의 생성을 포함하는, 면역 세포.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    작용제가 Cas9 단백질, 또는 Cas9 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 면역 세포.
  12. 제1항에 있어서,
    작용제가 Cas9 분자, 및 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 gRNA의 복합체를 포함하는, 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    Cas9가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9인, 면역 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    Cas9가 핵 국소화 서열의 삽입에 의해 변형된, 면역 세포.
  15. 제1항에 있어서,
    면역 세포 중 다른 유전자가 실질적으로 붕괴되지 않는, 면역 세포.
  16. 제1항에 있어서,
    면역 세포에서 PD-1 또는 PDL-1 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 유전학적 붕괴를 추가로 포함하는 면역 세포.
  17. 제1항에 있어서,
    피실험자로부터의 1차 세포인 면역 세포.
  18. 제1항에 있어서,
    CD3 양성인 면역 세포.
  19. 제1항에 있어서,
    T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK T 세포, 알파 베타 T 세포 또는 감마 델타 T 세포로부터 선택되는 면역 세포.
  20. 제1항에 있어서,
    암을 앓고 있는 피실험자의 1차 세포로부터 유래되고, 상기 암이 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 또는 수모세포종인, 면역 세포.
  21. 제1항에 있어서,
    면역 세포의 표면상에서 발현되는 재조합 수용체, 또는 상기 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 재조합 수용체가 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 수용체가 항원에 결합 시에 상기 면역 세포가 세포독성을 유도하거나, 증식하거나, 사이토카인을 분비할 수 있는, 면역 세포.
  22. 제21항에 있어서,
    재조합 수용체가 재조합 T 세포 수용체 또는 키메릭 항원 수용체인, 면역 세포.
  23. 제21항에 있어서,
    재조합 수용체가 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스(Lewis) Y, Ll-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(CEA), 전립선 특이항원, PSMA, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름 종양(Wilms Tumor) 1(WT-1), 사이클린 Al(CCNA1), BCMA 및 인터류킨 12 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는, 면역 세포.
  24. 제21항에 있어서,
    재조합 수용체가 CD19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2 또는 메소텔린에 특이적으로 결합하는, 면역 세포.
  25. 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는, 제1항에 따른 면역 세포를 포함하는 세포 집단:
    (1) 세포 집단 중 세포의 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는 것;
    (2) 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세포 집단 중의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율;
    (3) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것;
    (4) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신(Annexin) V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 및
    (5) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 높은 것.
  26. 제25항에 있어서,
    세포의 50%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이 세포 표면상에서 면역 세포의 표면상에서 발현되는 재조합 수용체를 발현하고, 상기 재조합 수용체가 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 재조합 수용체가 항원에 결합 시에 상기 면역 세포가 세포독성을 유도하거나, 증식하거나, 사이토카인을 분비할 수 있는, 세포 집단.
  27. 제26항에 있어서,
    재조합 수용체가 재조합 T 세포 수용체 또는 키메릭 항원 수용체인, 세포 집단.
  28. 제26항에 있어서,
    재조합 수용체가 RORl, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-폴레이트 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD276, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, ErbB3, ErbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스(Lewis) Y, Ll-세포 부착 분자(CD171), MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양태아 항원, TAG72, VEGF-R2, 태아성암항원(CEA), 전립선 특이항원, PSMA, 에스트로젠 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, MAGE A3, CE7, 빌름 종양(Wilms Tumor) 1(WT-1), 사이클린 Al(CCNA1), BCMA 및 인터류킨 12 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 항원에 특이적으로 결합하는, 세포 집단.
  29. 제26항에 있어서,
    재조합 수용체가 CD19, BCMA, 인테그린 αVβ6, MUC1, EGFRvIII, HER2, EGFR, GD2 또는 메소텔린에 특이적으로 결합하는, 세포 집단.
  30. 제1항 내지 제4항 및 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포 또는 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 암 또는 종양이 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성-림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종암, 골암, 뇌암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉육종, 수모세포종, 골육종, 활막육종 또는 중피종인, 약학 조성물.
  32. 세포에서 HPK-1 유전자의 발현을 감소시키거나 감소시킬 수 있는 하나 이상의 분자를 암호화하는 핵산 분자로서,
    상기 하나 이상의 분자가 gRNA이거나, gRNA를 포함하거나, gRNA를 암호화하고,
    상기 gRNA가, 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖는,
    핵산 분자.
  33. 제32항에 있어서,
    발현 카세트인, 핵산 분자.
  34. 제32항에 있어서,
    서열번호 3 및 4에 제시된 서열을 포함하는 이중가닥 DNA 분자인 핵산 분자.
  35. 제32항에 있어서,
    항원 수용체(CAR)를 암호화하는 제2 핵산을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  36. 제35항에 있어서,
    제2 핵산이 제2 발현 카세트인, 핵산 분자.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  38. 제37항에 있어서,
    플라스미드 벡터이거나, 플라스미드 벡터를 포함하는 벡터.
  39. 제37항에 있어서,
    바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 감마레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 벡터이거나, 상기 벡터를 포함하는 벡터.
  40. HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA로서,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, gRNA.
  41. 삭제
  42. 제40항에 있어서,
    모듈식 gRNA인 gRNA.
  43. 제40항에 있어서,
    단분자/키메릭 gRNA인 gRNA.
  44. 삭제
  45. 제40항에 따른 gRNA 및 Cas9 분자를 포함하는 Cas9/gRNA 분자 복합체.
  46. 제45항에 있어서,
    Cas9 분자가 하나 이상의 핵 국소화 서열로 조작된 Cas9인, Cas9/gRNA 분자 복합체.
  47. 제45항에 있어서,
    Cas9 분자가 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자인, Cas9/gRNA 분자 복합체.
  48. 제45항에 있어서,
    HPK-1 유전자의 표적 도메인을 절단시킬 수 있는 Cas9/gRNA 분자 복합체.
  49. 제45항에 있어서,
    HPK-1 유전자 중에 이중가닥 절단(DSB)을 생성시킬 수 있는 Cas9/gRNA 분자 복합체.
  50. 제40항에 따른 gRNA,
    상기 gRNA를 암호화하는 핵산,
    제40항에 따른 gRNA 및 Cas9 분자를 포함하는 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는
    상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자
    를 포함하는,
    T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포인,
    면역 세포.
  51. 면역 세포에 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계를 포함하는, 유전자 조작된 면역 세포의 생성 방법으로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 면역 세포가 단리된 T 세포, 단리된 NK 세포 또는 단리된 수지상 세포인,
    방법.
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 제51항에 있어서,
    상기 작용제가 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  56. 제51항에 있어서,
    도입이 상기 면역 세포를 시험관내에서 상기 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제51항에 있어서,
    도입이 전기천공을 포함하는, 방법.
  58. 제51항에 있어서,
    상기 면역 세포에 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자를 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  59. 제51항에 있어서,
    상기 면역 세포가 피실험자로부터의 1차 세포인, 방법.
  60. 삭제
  61. 제51항에 있어서,
    상기 면역 세포가 CD3 양성인, 방법.
  62. 제51항에 있어서,
    상기 T 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, CAR-T 세포, NK T 세포, 알파 베타 T 세포 또는 감마 델타 T 세포로부터 선택되는, 방법.
  63. 제51항에 있어서,
    다수의 면역 세포상에서 수행되는, 방법.
  64. 제51항에 따른 방법에 의해 생성된 면역 세포 또는 세포 집단.
  65. T 세포를 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포의 변경 방법으로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 T 세포가 단리된 T 세포인,
    방법.
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 제65항에 있어서,
    상기 작용제가 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  69. 제65항에 있어서,
    상기 T 세포가 암, 또는 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종으로 이루어진 군 중에서 선택된 암을 앓고 있는 피실험자로부터 유래되는, 방법.
  70. 제65항에 있어서,
    상기 작용제와의 접촉이 시험관내 또는 생체외 접촉인, 방법.
  71. 제65항에 있어서,
    상기 T 세포를 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 재조합 수용체를 암호화하는 핵산과, 상기 핵산을 상기 T 세포에 도입시키는 조건하에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제65항에 따른 방법에 의해 생성된 변경된 T 세포 또는 세포 집단.
  73. 면역 세포 집단의 세포독성을 증대시키거나, 탈진을 억제하거나, 비장, 종양 또는 비장 및 종양 둘다 내의 침윤을 증대시키는 방법으로서,
    상기 면역 세포 집단을 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 면역 세포가 단리된 T 세포, 단리된 NK 세포 또는 단리된 수지상 세포인,
    방법.
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 제73항에 있어서,
    상기 작용제가 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  77. 제73항에 있어서,
    접촉이 면역 세포에서 HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 유도하여 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는 세포 집단을 제공하기에 유효한, 방법:
    (1) 세포 집단 중 세포의 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는 것;
    (2) 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세포 집단 중의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율;
    (3) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 접촉전에 측정된 면역 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것;
    (4) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신 V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 접촉전에 측정된 면역 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 및
    (5) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 접촉전에 측정된 면역 세포 집단에서의 경우보다 높은 것.
  78. 제73항에 있어서,
    HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 함유하는 면역 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제73항에 있어서,
    HPK-1 유전자의 유전학적 붕괴를 함유하는 면역 세포를 확대시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 확대가 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 확대인, 방법.
  80. 제73항에 있어서,
    상기 면역 세포 집단이 CAR-T 세포 집단인, 방법.
  81. (a) 단리된 인간 면역 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 면역 세포에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계;
    (c) 상기 면역 세포를 상기 작용제와 배양하여 HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포 집단을 제공하는 단계
    를 포함하는, 면역 세포의 생성 방법으로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 면역 세포가 T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포인,
    방법.
  82. (a) 단리된 인간 면역 세포 집단을 제공하는 단계;
    (b) 상기 면역 세포 집단에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계;
    (c) 상기 면역 세포를 상기 작용제와 배양하여, 상기 작용제 도입전의 세포 집단에 비해 증대된 세포독성, 감소된 탈진, 또는 비장, 종양 또는 비장 및 종양 둘다 내의 증대된 침윤을 갖는 HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포 집단을 제공하는 단계
    를 포함하는, 면역 세포 집단의 세포독성을 증대시키거나, 탈진을 억제하거나, 비장, 종양 또는 비장 및 종양 둘다 내의 침윤을 증대시키는 방법으로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하고,
    상기 면역 세포가 T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포인,
    방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    단계 (c)가 면역 세포를 확대하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  84. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    상기 면역 세포를 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 재조합 수용체를 암호화하는 핵산과, 상기 핵산을 상기 면역 세포에 도입시키는 조건하에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 접촉이 상기 작용제의 도입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 발생할 수 있는, 방법.
  85. 삭제
  86. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    상기 작용제가 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  87. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    상기 인간 환자가 암을 앓고 있고, 상기 암이 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비-호지킨 림프종(NHL), 미만성 대세포 림프종(DLCL), 다발성 골수종, 신세포 암종(RCC), 신경모세포종, 대장암, 유방암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 또는 수모세포종인, 방법.
  88. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    HPK-1 유전자 붕괴된 면역 세포 집단이 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는, 방법:
    (1) 세포 집단 중 세포의 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않고; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및 기능성 HPK-1 유전자를 함유하지 않는 것;
    (2) 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세포 집단 중의 HPK-1 유전자 녹아웃 효율;
    (3) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것;
    (4) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신 V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 및
    (5) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 높은 것.
  89. (a) 세포 집단 중 세포의 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상이 내인성 HPK-1 폴리펩타이드를 발현하지 않거나; 인접한 HPK-1 유전자, HPK-1 유전자 및 기능성 HPK-1 유전자로부터 선택되는 하나 이상을 함유하지 않는 것; 및
    (b) 세포의 50%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이 세포 표면상에서 키메릭 항원 수용체를 발현하는 것
    을 특징으로 하는 CAR-T 세포 집단으로서,
    gRNA 또는 상기 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 작용제와 함께 배양되고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는,
    CAR-T 세포 집단.
  90. 제89항에 있어서,
    (a) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 PD-1, TIM-3 또는 Lag-3을 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것;
    (b) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 애넥신 V를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 낮은 것; 또는
    (c) 유식 세포측정에 의해 측정된, 세포 표면상에서 CD107a를 발현하는 세포 집단 중 세포의 백분율이 대조용 세포 집단에서의 경우보다 높은 것
    을 추가의 특징으로 하는 CAR-T 세포 집단.
  91. 암 환자로부터의 T 세포 및 상기 T 세포에서 HPK-1 유전자를 녹아웃시키기 위한 수단을 포함하는 조성물로서,
    상기 수단이 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 gRNA가 HPK-1 유전자의 표적 도메인에 상보적이거나, 상기 도메인에 결합하거나, 상기 도메인을 인식하거나, 상기 도메인에 하이브리드화하는 표적화 도메인을 포함하고,
    상기 gRNA의 표적화 도메인이 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는,
    조성물.
  92. 제91항에 있어서,
    T 세포가 암 환자로부터의 1차 T 세포, CAR-T 세포, 또는 NK T 세포인, 조성물.
  93. 제1항 내지 제4항 및 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포; 제1항 내지 제4항 및 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포 또는 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 세포 집단, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학 조성물; 제50항 또는 제64항에 따른 면역 세포 또는 세포 집단; 제72항에 따른 변경된 T 세포 또는 세포 집단; 제89항 또는 제90항에 따른 CAR-T 세포 집단; 또는 제91항 또는 제92항에 따른 조성물을 치료 유효량으로 인간을 제외한 치료가 필요한 피실험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양의 치료 방법.
  94. (a) 인간을 제외한 치료가 필요한 피실험자로부터 면역 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 면역 세포에서 HPK-1 유전학적 붕괴를 유도하거나 유도할 수 있는 작용제를 도입시키는 단계;
    (c) 상기 면역 세포를 상기 작용제와 배양하여 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 제공하는 단계; 및
    (d) 상기 피실험자에게 상기 HPK-1 유전자 붕괴된 세포 집단을 투여하는 단계
    를 포함하는, 암 또는 종양의 치료 방법으로서,
    상기 작용제가 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 gRNA가, 서열번호 1 및 11 내지 15 중에서 선택된 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는 표적화 도메인을 갖고,
    상기 면역 세포가 T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포인,
    방법.
  95. 제94항에 있어서,
    면역 세포를 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 재조합 수용체를 암호화하는 핵산과, 상기 핵산을 상기 면역 세포에 도입시키는 조건하에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 접촉이 상기 작용제의 도입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 발생할 수 있는, 방법.
  96. 제94항에 있어서,
    단계 (c)가 면역 세포를 확대하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제94항에 있어서,
    작용제가 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 Cas9/gRNA 분자 복합체, 또는 상기 Cas9 및 gRNA를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는, 방법.
  98. 제93항에 있어서,
    상기 암 또는 종양이 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성-림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종암, 골암, 뇌암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉육종, 수모세포종, 골육종, 활막육종 또는 중피종인, 방법.
  99. 제94항에 있어서,
    상기 암 또는 종양이 백혈병, 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성-림프모구성 백혈병(ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 저등급 B 세포 림프종, B 세포암, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종암, 골암, 뇌암, 상피암, 신세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉육종, 수모세포종, 골육종, 활막육종 또는 중피종인, 방법.
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