CN111918665A - Il-2缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及IL‑2缀合物、其可药用盐、包含该IL‑2缀合物或其可药用盐的药物组合物和它们的用途。

Description

IL-2缀合物
本发明涉及IL-2缀合物、其可药用盐、含有该IL-2缀合物或其可药用盐的药物组合物和它们的用途。
在健康人中，免疫系统经常可以区分健康细胞和癌性细胞。当确定指定细胞为癌性细胞后，免疫系统通常将其消除。但是，当免疫系统受到例如急性或慢性缺陷的损害或被击败时，由于受损的免疫系统不能区分、然后消除癌细胞而导致癌症发展。在癌症患者中，给患者施用免疫调节蛋白可以帮助激活该患者的免疫系统，从而增强免疫系统消除癌细胞的能力。通过这种方式，癌症的进一步生长被减缓，癌症的潜在扩散被抑制，或甚至消除癌症。
一种用于治疗罹患某种癌症的患者的这类免疫调节蛋白是白介素-2。白介素-2(IL-2)是天然存在的细胞因子，具有作为自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞增殖和功能活性的刺激剂的活性。IL-2在免疫效应细胞的产生、分化、存活和内稳态中发挥关键作用。IL-2由活化CD4+辅助T细胞合成，并且IL-2通过不同的受体相互作用可以调节针对免疫或耐受的免疫应答。
IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合来发挥作用。α-(CD25)、β-(CD122)和常见的γ-(γc,CD132)亚基的联合产生三聚的高亲和性IL-2R。二聚的中等亲和性IL-2Rβγ由β-和γ-亚基组成，以低50倍的亲和力与IL-2结合。CD25不是IL-2信号传导所必需的，但是给三聚受体赋予了高亲和性，而β-和γ-亚基介导信号转导。IL-2Rβγ在NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和静息CD4+和CD8+T细胞上表达，而IL-2Rαβγ在活化T和NK细胞上瞬时诱导，并在T调节细胞上组成性表达。IL-2扩展和激活先天性和适应性效应细胞的能力是其抗肿瘤活性的基础。
在患者中，IL-2可以刺激抗肿瘤效应，其特征是，当以高剂量(即，在人中，对于每个周期而言，600 000-720 000IU/kg体重，每天三次，直至14个剂量)给予时，细胞毒性淋巴细胞、包括效应T和NK细胞增加。推测在此疗法期间，在施用高剂量后IL-2激活所有T细胞；当疗法周期结束并且IL-2水平降低到某点时，IL-2将变得有限，并且对于剩下的野生型IL-2而言，表达IL-2Rαβγ的T调节(Treg)细胞将胜过表达IL-2Rβγ的效应T细胞。
重组人IL-2阿地白介素是FDA在1992年批准的第一种癌症免疫疗法。对于转移性黑素瘤和肾癌而言，通过使用适当的支持性护理，阿地白介素已经显示约10％的患者完全消退了癌症。具有完全响应的患者中大约有70％已经被治愈，在最初治疗后保持完全消退超过25年。
基于其抗肿瘤功效，高剂量IL-2(阿地白介素)已经被批准用于转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤患者。但是，其抗肿瘤免疫性由于严重的心血管、肺、肝、胃肠、神经和血液副作用而是剂量受限的，因此只能在专业中心给予患者。同样，一旦施用的IL-2水平降至低于IL-2Rβγ活性所需的水平，将会有助于表达高亲和性IL-2Rαβγ的Tregs的激活，这可限制抗肿瘤免疫性。
临床前实验表明，IL-2诱导的肺水肿(作为血管渗漏综合征的模型)可由IL-2与肺内皮细胞上的CD25相互作用而引起，并且可以通过CD25阻断抗体、遗传破坏或使用IL-2-抗体复合物而消除。IL-2诱导血管渗漏综合征的另一种所建议的机制涉及嗜酸粒细胞的激活，因为这些细胞可表达IL-2Rαβγ并且患者中的IL-2疗法伴有全身嗜酸粒细胞和IL-5水平增加。
负责抑制导致免疫耐受的免疫应答的CD4+调节T细胞(Treg细胞)优先表达IL-2R的IL-2Rαβγ形式。因此，施用结合IL-2Rαβγ和作为IL-2Rαβγ激动剂的化合物可有望抑制免疫应答，由此还可以干扰癌症患者的抗肿瘤应答。
显著增强抗肿瘤免疫应答的效应CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞优先表达IL-2R的IL-2Rβγ形式。因此，施用结合IL-2Rβγ和作为IL-2Rβγ激动剂的化合物可有望增强对抗肿瘤的免疫应答(例如，通过增加CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的增殖和效应活性)。
因此，施用IL-2Rβγ选择性激动剂(与IL-2Rα的结合降低或没有结合，或者与IL-2Rβγ的结合增强)对于患有某些癌症的患者将是有益的，因为这样做有望减少全身性血管渗漏副作用如肺水肿，提供了改进的治疗窗口。而且，IL-2Rβγ选择性激动剂将具有避免在低剂量时选择性激活免疫抑制性的调节T细胞的益处，对于对抗Tregs和CD4+效应T细胞、细胞毒性CD8+效应T细胞和NK细胞而言效力是类似的，由此提供了更大的可能来增强患者的免疫系统以消除癌细胞。
最佳地，这种IL-2Rβγ选择性激动剂在施用后还将显示出相对长的暴露，由此进一步改善患者对治疗的应答。通过施用免疫抑制途径的拮抗剂(例如CTLA-4和PD-1的拮抗剂)或通过施用免疫激动剂如TLR配体或者激动免疫激活受体的物质如41BB(CD137)、OX40、ICOS、CD40、CD28、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、LFA1、CD16、CD64、CD32A和CD3激活受体激动剂或者招募抗体导向细胞毒性(Antibody Directed Cellular Cytotoxicity,ADCC)的抗体，可以进一步增强经由施用IL-2βγ选择性激动剂对癌症患者中免疫系统的效应臂(effector arm)的加强。
肿瘤反应性T细胞的过继转移已经发展为能够在患者中诱导抗肿瘤免疫性的临床有用的疗法。但是，用过继性T细胞转移(ACT)疗法治疗癌症的广泛应用具有一些局限性，包括产生足够数量的细胞用于输注以及转移的T细胞不能在体内持久和保持功能。在临床上，共同施用T细胞生长因子白介素-2(IL-2)可改善移植T细胞的存活、功能和抗肿瘤活性。但是，使用IL-2来增强ACT由于IL-2的多效性质而变得复杂，其诱导免疫刺激性和抑制性T细胞应答两者，并且可能引起严重的毒性。
已经尝试了解决IL-2的毒性问题。在一种情况中，已经尝试了配制方法，参见例如美国专利号6,706,289和国际专利申请公开WO 02/00243和WO99/60128。在其它方法中，已经提出了一些IL-2缀合物，参见例如美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502。另外，已经提出了一些可逆的IL-2缀合物，参见例如WO12065086A1。
但是，尽管有这些方法，仍然需要给癌症患者提供更安全治疗的IL-2缀合物。
因此，本发明的目的是至少部分地克服上述缺点。
该目的通过式(Ia)或(Ib)的IL-2缀合物或其可药用盐得以实现，
Figure BDA0002700814740000031
其中
-D是偏倚IL-2部分，所述偏倚IL-2部分包含IL-2部分，和对于所述偏倚IL-2部分而言，所述偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD比所述偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD的比例高于阿地白介素对IL-2Rαβ的KD比阿地白介素对IL-2Rβ的KD的比例；
-L1-是共价和可逆连接至-D的连接基部分；
-L2-是化学键或者是间隔基部分；
-Z是聚合部分或被取代的脂肪酸部分；
x是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的整数；且
y是选自2、3、4和5的整数。
在本发明内，术语以如下含义进行使用：
如本文所用的术语“白介素-2”或“IL-2”指所有IL-2蛋白质，优选来自哺乳动物种属，更优选来自灵长类种属和最优选来自人，以及它们的变体、类似物、直向同源物(ortholog)、同源物(homolog)和衍生物及其片段，其特征在于在淋巴细胞产生、存活和内稳态中发挥关键作用。术语“IL-2”还包括IL-2的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。
人IL-2具有SEQ ID NO:1的序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
未经加工的人IL-2另外地包含N-端20个氨基酸的信号肽，其在成熟IL-2分子中不存在。
优选地和除非另有说明，术语“IL-2”优选指阿地白介素，即人IL-2的变体，其中SEQ ID NO:1的人IL-2中存在的位置1处的氨基酸(丙氨酸)已经缺失(desA1)和存在于SEQID NO:1的人IL-2的位置125处的半胱氨酸被换为丝氨酸(C125S)。阿地白介素的序列显示在SEQ ID NO:2中：
PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
如本文所用的术语“IL-2蛋白质变体”或“IL-2变体”指与参考IL-2蛋白质不同的来自相同种属的蛋白质。优选地，这类参考IL-2蛋白质序列是SEQ ID NO:2的序列。通常，差异是有限的，以便参考和变体的氨基酸序列总体上是密切相似的和在很多区域是相同的。优选地，IL-2蛋白质变体与参考IL-2蛋白质、优选SEQ ID NO:2的IL-2蛋白质至少70％、80％、90％或95％同一。具有至少例如与查询氨基酸序列95％“同一”的氨基酸序列的蛋白质意欲指：主题蛋白质的氨基酸序列与查询序列相同，除了主题蛋白质序列可包括对查询氨基酸序列的每100个氨基酸而言至多五个氨基酸改变。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基(N-端)或羧基端(C-端)位置或那些末端位置之间的任意位置，单独地散布在参考序列中的残基中或参考序列内的一个或多个连续基团中。查询序列可以是参考序列的整个氨基酸序列或其任意指定的片段，如本文所述。优选地，查询序列是SEQ IDNO:2的序列。
这类IL-2蛋白质变体可以是天然存在的变体，例如通过占据染色体或生物体上给定基因座的IL-2的数种供选形式之一编码的天然存在的等位基因变体，或者通过源自单个初级转录物的天然存在的剪接变体编码的同工型。或者，IL-2蛋白质变体可以是尚未知晓天然存在的和可以通过本领域已知的诱变技术制得的变体。
本领域已知，可以从生物活性肽或蛋白质的N-端或C-端或者从内部位置、即N-和C-端氨基酸之间的位置删除一个或多个氨基酸，而生物学功能没有实质性损失。术语IL-2蛋白质变体还包括这类N-端、C-端和/或内部缺失。
本领域技术人员还认识到，可以改变IL-2蛋白质的一些氨基酸序列而不显著影响肽的结构或功能。这些突变体包括根据本领域已知的通用规则选择的对活性具有很小影响的缺失、插入、倒位、重复和取代。例如，Bowie等人,1990,Science 247:1306-1310提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指导，该文献通过引入整体并入本文，其中作者指出，有两种主要方法用于研究氨基酸序列对变化的耐受。
如本文所用的术语“IL-2类似物”指不同和不相关生物体的IL-2，它们在各生物体中发挥相同功能，但并非起源于生物体的祖先所共有的祖先结构。而是单独地出现类似的IL-2，后来演变为发挥相同或类似的功能。换言之，类似的IL-2蛋白质是具有非常不同、但是发挥相同生物学活性的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用的术语“IL-2直向同源物”(ortholog)指两个不同种属内的IL-2，它们的序列通过祖先种属中共同的同源IL-2彼此相关，但是已经进化成彼此不同。
如本文所用的术语“IL-2同源物”(homolog)指不同生物体的IL-2，它们在各生物体中发挥相同功能，并且起源于生物体的祖先共同具有的祖先结构。换言之，同源IL-2蛋白质是发挥相同生物学活性的具有非常相似的氨基酸序列的蛋白质。优选地，IL-2蛋白质同源物可以被定义为呈现出与参考IL-2蛋白质、优选SEQ ID NO:2的IL-2蛋白质至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％同一性的蛋白质。
如本文所用的术语“IL-2蛋白质片段”指包含IL-2蛋白质、优选SEQ ID NO:2的蛋白质的氨基酸序列的一部分的连续段的任意肽。更特别地，IL-2蛋白质片段包含IL-2蛋白质、更优选SEQ ID NO:2的蛋白质的至少50个、例如至少60个、至少70个或至少80个连续氨基酸。
术语“IL-2”还包括具有上述序列、但是具有包括酰胺和非酰胺链接(例如酯链接)两者的主链的聚(氨基酸)缀合物，例如缩肽。缩肽是其中主链包括酰胺(肽)和酯键两者的氨基酸残基链。因此，如本文所用的术语“侧链”指连接至氨基酸部分的α-碳的部分(如果氨基酸部分通过胺键连接，例如在肽或蛋白质中)或指连接指聚(氨基酸)缀合物的主链的任意的含碳原子的部分(例如在缩肽的情况中)。优选地，术语“IL-2”指具有通过酰胺(肽)键形成的主链的蛋白质。
由于术语IL-2包括IL-2的上述变体、类似物、直向同源物、同源物、衍生物和片段，所有对参考序列内具体位置的称谓还包括在IL-2部分的这些变体、类似物、直向同源物、同源物、衍生物和片段中的等同位置，即使没有具体提及。
如本文所用的术语“偏倚IL-2”(biased IL-2)指其中所述偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD比所述偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD的比例大于SEQ ID NO:2的阿地白介素对IL-2Rαβ的KD比阿地白介素对IL-2Rβ的KD的比例的经修饰IL-2。这通过下式表示：
Figure BDA0002700814740000061
其中
Figure BDA0002700814740000062
Figure BDA0002700814740000063
其中
“KD偏倚IL-2对IL-2Rαβ”是偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD，
“KD偏倚IL-2对IL-2Rαβ”是偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD，
“KD阿地白介素对IL-2Rαβ”是阿地白介素对IL-2Rαβ的KD，和
“KD阿地白介素对IL-2Rβ”是阿地白介素对IL-2Rβ的KD。
测定偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD、偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD、阿地白介素对IL-2Rαβ的KD和阿地白介素对IL-2Rβ的KD所需的结合亲和力/动力学可以采用在Biacore仪器(GEHealthcare)上如下测定的表面等离振子共振(SPR)来评估：通过共价涂抗人Fc抗体制备了在CM5(或C1或CM4)芯片上的人Fc捕获表面，或者使用蛋白质A芯片。接下来，在芯片上固定IL-2Rβ-Fc或者IL2-Rα-Fc与IL2-Rβ-Fc的适宜混合物、例如1:1混合物。为了测量亲和力/动力学常数，例如对IL-2化合物而言在1.5nM至2μM之间或在100nM至1μM之间开始制备分析物的系列稀释(结束于例如0.03nM至100nM或0.1nM至1nM)。分析物各自暴露于受体修饰的芯片上达适宜量的时间，例如1-30分钟，可以例如是2分钟或可以是3分钟，然后洗涤适宜量的时间，例如2-60分钟，例如可以是10分钟。将由稀释系列获得的结合曲线拟合为1:1动力学模型以将所观察的响应单位(R)与缔合和解离速率常数ka和kd相关联：
Figure BDA0002700814740000071
其中
t是时间；
C是分析物的浓度；且
Rmax是最大表面结合能力。
如果经由动力学1:1模型测定，则解离和缔合速率的比例提供了平衡解离常数KD。
或者，将由稀释系列获得的结合曲线拟合为1:1稳态相互作用模型，其由稳态结合水平(Req)对分析浓度(C)的曲线计算了对1:1相互作用而言的KD：
Figure BDA0002700814740000072
其中
Req是稳态结合水平；
C是分析物的浓度；且
Rmax是最大表面结合能力。
可以理解，不是每个计算方法对于每种偏倚IL-2分子都是可能的。如果例如反应过快，则使用1:1动力学模型可能是不可能的，可以使用1:1稳态相互作用模型。如果例如没有获得平衡，则使用1:1相互作用模型可能是不可能的，可以使用1:1动力学模型。
可以理解，测定偏倚IL-2、而不是本发明的IL-2缀合物的偏倚IL-2对IL2Rαβ和IL2Rβ的KD。因此，KD测定在不存在-L1-、-L2-和-Z部分的情况下发生，优选在合成本发明的IL-2缀合物之前，除了当IL-2缀合物是翻译融合蛋白时，在这种情况中，KD在释放偏倚IL-2之后、例如在蛋白酶裂解或化学裂解之后测定。
该偏倚IL-2包含蛋白质部分，所述蛋白质部分是IL-2部分、优选具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的IL-2部分，其包含至少一个氨基酸突变或至少一个缺失或至少一个修饰部分Mmod、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个修饰部分Mmod，或其任意组合。Mmod部分可以是蛋白质部分或非蛋白质部分。如果偏倚IL-2包含多于一个Mmod部分，则这些可以是相同或不同的。在一些实施方案中，IL-2部分具有SEQ ID NO:1的序列。
在本发明的IL-2缀合物中，偏倚IL-2以相应的偏倚IL-2部分的形式存在，本发明的IL-2缀合物当释放所有-Z部分、即当裂解偏倚IL-2部分、-D和-L1-之间的可逆链接时释放偏倚IL-2。
如本文所用的术语“亲和力”指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如配体)之间的非共价相互作用之和的强度。除非另有说明，否则本文所用的术语“亲和力”指固有结合亲和力，其反映了结合对成员之间(例如受体和配体之间)的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用平衡解离常数(KD)表示，其为在平衡状态下测定的解离和缔合速率常数(分别为kd和ka)的比值。因此，等价亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比例保持相同。亲和力可以通过本领域已知的充分确立的方法、包括本文所述的那些来测定。
如本文所用的术语“IL-2受体的α-亚基”和“IL-2Rα”指人CD25。
如本文所用的术语“IL-2受体的β-亚基”和“IL-2Rβ”指人CD122。
如本文所用的术语“IL-2受体的α-和β-亚基”、“IL-2R的α-和β-亚基”和“IL-2Rαβ”指IL-2Rα和IL-2Rβ的混合物、例如1:1混合物。
本发明的IL-2缀合物释放偏倚IL-2，即本发明的IL-2缀合物是偏倚IL-2的前药。如本文所用的术语“前药”指通过连接基部分(其还可以称为“可逆前药连接基”)可逆地和共价地链接至专门的保护基的生物活性部分，例如偏倚IL-2部分，所述连接基部分包括与生物活性部分的可逆链接，和其中专门的保护基改变或消除生物活性部分的母体分子中、即相应的药物中不期望的性质。这还包括增强药物中期望的性质和抑制不期望的性质。专门的无毒保护基被称为“载体”。前药以相应药物的形式释放出可逆和共价结合的生物活性部分。换言之，前药是包含生物活性部分的缀合物，所述生物活性部分经由可逆的前药连接基部分的共价和可逆缀合是直接的或通过间隔基部分进行的。“生物活性部分”的另一个术语是“药物部分”。
如本文所用的有关第一部分与第二部分连接的术语“可逆”或“可降解”指连接所述第一部分和第二部分的链接在生理条件(为pH7.4、37℃的水性缓冲液)下是可裂解的，半衰期为1小时至3个月，优选1小时至2个月，甚至更优选1小时至1个月。裂解可以是酶促的或非酶促的，优选是非酶促的。因此，有关第一部分与第二部分连接的术语“稳定”或“永久”指连接所述第一部分和第二部分的链接在生理条件下裂解的半衰期为长于3个月。
如本文所用的术语“修饰部分”优选指取代基或聚合部分。
如本文所用的术语“二硫桥连”指在二硫桥的两个硫原子之间插入部分。这是如下实现的：使用在两个硫羟反应活性官能团之间具有所述部分的试剂，使各硫羟反应活性官能团与二硫桥的硫原子之一反应，以便所述部分在二硫键已经还原后插入在所述硫原子之间。如果肽或蛋白质中存在多于一个二硫桥，则二硫桥可以插入在一个二硫桥的硫原子之间，或者可以插入在不同二硫桥的硫原子之间。这类二硫桥可以是肽或蛋白质中天然存在的，或者可以是已经人工引入的，例如通过将现有的氨基酸部分替换为半胱氨酸部分或通过向肽或蛋白质中添加半胱氨酸部分。
如本文所用的术语“试剂”指化学化合物，其包含至少一个官能团用于与另一种化学化合物或药物的官能团反应。可以理解，包含官能团(例如伯胺或仲胺或羟基官能团)的药物也是试剂。
如本文所用的术语“部分”指分子的一部分，其与相应的试剂相比缺少一个或多个原子。如果例如式“H-X-H”的试剂与另一种试剂反应并且成为反应产物的一部分，则反应产物的相应部分具有结构“H-X-”或“-X-”，而各个“-”指与其它部分连接。因此，生物活性部分作为药物从可逆链接中释放出。
可以理解，如果序列或原子基团化学结构以其中原子基团连接至两个部分或使部分间隔的方式提供，所述序列或化学结构可以以任一方向连接至两个部分，另有明确说明除外。例如，“-C(O)N(R1)-”部分可以作为“-C(O)N(R1)-”或作为“-N(R1)C(O)-”连接至两个部分或使部分被间隔。类似地，
Figure BDA0002700814740000101
部分可以作为
Figure BDA0002700814740000102
或作为
Figure BDA0002700814740000103
连接至两个部分或使部分间隔。
如本文所用的术语“取代”指分子或部分的一个或多个-H原子被不同的原子或原子基团所替代，后者称为“取代基”。
如本文所用的术语“取代基”优选指选自如下的部分：卤素、-CN、-COORx1、-ORx1、-C(O)Rx1、-C(O)N(Rx1Rx1a)、-S(O)2N(Rx1Rx1a)、-S(O)N(Rx1Rx1a)、-S(O)2Rx1、-S(O)Rx1、-N(Rx1)S(O)2N(Rx1aRx1b)、-SRx1、-N(Rx1Rx1a)、-NO2、-OC(O)Rx1、-N(Rx1)C(O)Rx1a、-N(Rx1)S(O)2Rx1a、-N(Rx1)S(O)Rx1a、-N(Rx1)C(O)ORx1a、-N(Rx1)C(O)N(Rx1aRx1b)、-OC(O)N(Rx1Rx1a)、-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Rx2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T0-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Rx3)-、-S(O)2N(Rx3)-、-S(O)N(Rx3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-、-S-、-N(Rx3)-、-OC(ORx3)(Rx3a)-、-N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-和-OC(O)N(Rx3)-的基团所间隔；
-Rx1、-Rx1a、-Rx1b相互独立地选自-H、-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Rx2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T0-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Rx3)-、-S(O)2N(Rx3)-、-S(O)N(Rx3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-、-S-、-N(Rx3)-、-OC(ORx3)(Rx3a)-、-N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-和-OC(O)N(Rx3)-的基团所间隔；
T0各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基和8-至11-元杂双环基；其中T0各自独立地任选被一个或多个相同或不同的-Rx2取代；
-Rx2各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COORx4、-ORx4、-C(O)Rx4、-C(O)N(Rx4Rx4a)、-S(O)2N(Rx4Rx4a)、-S(O)N(Rx4Rx4a)、-S(O)2Rx4、-S(O)Rx4、-N(Rx4)S(O)2N(Rx4aRx4b)、-SRx4、-N(Rx4Rx4a)、-NO2、-OC(O)Rx4、-N(Rx4)C(O)Rx4a、-N(Rx4)S(O)2Rx4a、-N(Rx4)S(O)Rx4a、-N(Rx4)C(O)ORx4a、-N(Rx4)C(O)N(Rx4aRx4b)、-OC(O)N(Rx4Rx4a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
-Rx3、-Rx3a、-Rx4、-Rx4a、-Rx4b各自独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
优选地，任选被取代的分子的最多6个-H原子独立地被取代基取代，例如5个-H原子独立地被取代基取代，4个-H原子独立地被取代基取代，3个-H原子独立地被取代基取代，2个-H原子独立地被取代基取代，或1个-H原子独立地被取代基取代。
如本文所用的术语“脂肪酸”指具有脂肪族尾的饱和或不饱和一元羧酸，其可以包括4-28个碳原子。脂肪酸可以是饱和或不饱和的、直链或支链的。术语“脂肪酸变体”指其中一些碳原子可以被其它原子或原子基团替换的经修饰的脂肪酸，其可以是被取代的。
如本文所用的术语“肽”指通过肽(酰胺)链接连接的至少2个和一直到50个、包括50个氨基酸单体部分的链。术语“肽”还包括模拟肽(peptidomimetics)如D-肽、类肽或β-肽，涵盖具有至多50个、包括50个单体部分的这类模拟肽链。
如本文所用的术语“蛋白质”指具有通过肽链接连接的多于50个氨基酸单体部分(其还可以被称为“氨基酸残基”)的链，其中优选不多于12000个氨基酸单体通过肽链接连接，例如不多于10000个氨基酸单体部分、不多于8000个氨基酸单体部分、不多于5000个氨基酸单体部分或不多于2000个氨基酸单体部分。
如本文所用的术语“约”在与数值联合时用于指数值加上和减去不多于所述数值的25％、更优选不多于所述数值的20％、更优选不多于所述数值的10％的范围，包括端点。例如，短语“约200”用于指200+/-25％的包括端点的范围，即150至250的包括端点的范围；优选200+/-20％的包括端点的范围，即160至240的包括端点的范围；甚至更优选200+/-10％的包括端点的范围，即180至220的包括端点的范围。可以理解，作为“约50％”给出的百分比不是指“50％+/-25％”、即25至75％的包括端点的范围，而是“约50％”指37.5至62.5％的包括端点的范围，即加上和减去数值50的25％。
如本文所用的术语“聚合物”指包含通过化学键以直链、环状、支链、交联或树枝状方式或其组合连接的重复结构单元、即单体的分子，其可以是合成或生物来源或两者的组合。可以理解，聚合物还可以包含一个或多个其它化学基团和/或一个或多个部分，例如一个或多个官能团。同样，还可以理解，肽或蛋白质是聚合物，即使各个氨基酸残基的侧链可能不同。优选地，可溶性聚合物具有至少0.5kDa的分子量、例如至少1kDa的分子量、例如至少2kDa的分子量、例如至少3kDa的分子量或至少5kDa的分子量。如果聚合物是可溶的，其优选具有至多1000kDa的分子量、例如至多750kDa、例如至多500kDa、例如至多300kDa、例如至多200kDa、例如至多100kDa。可以理解，对于不溶性聚合物如水凝胶，不能提供有意义的分子量范围。
如本文所用的术语“聚合”指包含一个或多个聚合物或一个或多个聚合物部分的试剂或部分。聚合试剂或部分还可以任选地包含一个或多个其它部分，其优选选自：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；和
·选自如下的链接
Figure BDA0002700814740000121
其中
虚线表示与部分或试剂的剩余部分连接，和
-R和-Ra相互独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
本领域技术人员理解，由聚合反应获得的聚合产物不是都具有相同的分子量，而且呈现出分子量分布。因此，如本文所用的分子量范围、分子量、聚合物中单体的数量范围和聚合物中单体的数量指数均分子量和单体数量平均数，即，聚合物或聚合部分的分子量的算术平均值和聚合物或聚合部分的单体数量的算术平均值。
相应地，在包含“x”个单体单元的聚合部分中，对“x”指定的任意整数因此相应于单体的算术平均数量。对“x”指定的任意整数范围提供了单体的算术平均数量所处的整数范围。对“x”指定为“约x”的整数指单体的算术平均数量处于x+/-25％、优选x+/-20％和更优选x+/-10％的整数范围中。
如本文所用的术语“数均分子量”指个体聚合物的分子量的普通算术平均值。
如本文所用的与部分或试剂相关的术语“基于PEG的”指所述部分或试剂包含PEG。优选地，基于PEG的部分或试剂包含至少10％(w/w)PEG，例如至少20％(w/w)PEG，例如至少30％(w/w)PEG，例如至少40％(w/w)PEG，例如至少50％(w/w)，例如至少60(w/w)PEG，例如至少70％(w/w)PEG，例如至少80％(w/w)PEG，例如至少90％(w/w)PEG，例如至少95％。基于PEG的部分或试剂的剩余重量百分比是其它部分，优选选自如下部分和链接：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；和
·选自如下的链接
Figure BDA0002700814740000131
其中
虚线表示与部分或试剂的剩余部分连接，和
-R和-Ra相互独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
术语“基于透明质酸的”相应地进行使用。
如本文所用的与部分或试剂相关的术语“包含至少X％PEG的基于PEG的”指所述部分或试剂包含至少X％(w/w)乙二醇单元(-CH2CH2O-)，其中乙二醇单元可以是逐个嵌段、交替排列的或者可以在部分或试剂内随机分布，优选所述部分或试剂的所有乙二醇单元存在于一个嵌段中；基于PEG的部分或试剂的剩余重量百分比是其它部分，优选选自如下部分和链接：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢化萘基；和
·选自如下的链接
Figure BDA0002700814740000141
其中
虚线表示与部分或试剂的剩余部分连接，和
-R和-Ra相互独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
术语“包含至少X％透明质酸的基于透明质酸的”相应地进行使用。
如本文所用的术语“水凝胶”指由均聚物或共聚物组成的亲水或两亲性聚合网络，其由于存在疏水性相互作用、氢键、离子相互作用和/或共价化学交联而是不溶性的。交联提供了网络结构和物理完整性。
术语“间隔”指部分插入在两个碳原子之间或者——如果插入是在部分的末端之一时——在碳或杂原子和氢原子之间，优选在碳和氢原子之间。
如本文所用的术语“C1-4烷基”单独或组合指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子的末端，直链或支链C1-4烷基的实例有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。当分子的两个部分通过C1-4烷基连接时，则该C1-4烷基基团的实例有-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的各自氢可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，C1-4烷基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
如本文所用的术语“C1-6烷基”单独或组合指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子的末端，直链和支链C1-6烷基基团的实例有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基。当分子的两个部分通过C1-6烷基连接时，则该C1-6烷基基团的实例有-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-和-C(CH3)2-。C1-6碳的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，C1-6烷基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
因此，“C1-10烷基”、“C1-20烷基”或“C1-50烷基”分别指具有1至10、1至20或1至50个碳原子的烷基链，其中C1-10、C1-20或C1-50碳的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，C1-10或C1-50烷基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
如本文所用的术语“C2-6烯基”单独或组合指具有2-6个碳原子的包含至少一条碳-碳双键的直链或支链烃部分。如果存在于分子的末端，其实例有-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个部分通过C2-6烯基连接时，则该C2-6烯基的实例有-CH＝CH-。C2-6烯基部分的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，C2-6烯基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
因此，术语“C2-10烯基”、“C2-20烯基”或“C2-50烯基”单独或组合指具有2-10、2-20或2-50个碳原子的包含至少一条碳-碳双键的直链或支链烃部分。C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基基团的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
如本文所用的术语“C2-6炔基”单独或组合指具有2-6个碳原子的包含至少一条碳-碳三键的直链或支链烃部分。如果存在于分子的末端，其实例有-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个部分通过炔基连接时，则实例是-C≡C-。C2-6炔基基团的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，可以发生一条或多条双键。任选地，C2-6炔基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
因此，如本文所用的术语“C2-10炔基”、“C2-20炔基”和“C2-50炔基”单独或组合指分别具有2-10、2-20或2-50个碳原子的包含至少一条碳-碳三键的直链或支链烃部分。C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基基团的各个氢原子可以任选被如上文定义的取代基替换。任选地，可以发生一条或多条双键。任选地，C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基可以被一个或多个如下文定义的部分间隔。
如上文提及，C1-4烷基、C1-6烷基、C1-10烷基、C1-20烷基、C1-50烷基、C2-6烯基、C2-10烯基、C2-20烯基、C2-50烯基、C2-6炔基、C2-10炔基、C2-20烯基或C2-50炔基可以任选被一个或多个部分间隔，所述部分优选选自：
Figure BDA0002700814740000161
其中
虚线表示与部分或试剂的剩余部分连接；且
-R和-Ra相互独立地选自-H和甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
如本文所用的术语“C3-10环烷基”指具有3-10个碳原子的环状烷基链，其可以是饱和或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基。C3-10环烷基碳的各个氢原子可以被如上文定义的取代基替换。术语“C3-10环烷基”还包括桥连双环如降冰片烷或降冰片烯。
术语“8-至30-元碳多环基”或“8-至30-元碳多环”指具有8-30个环原子的两个或更多个环的环状部分，其中两个邻环享有至少一个环原子，可以含有直到最大数目的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)。优选地，8-至30-元碳多环基指两个、三个、四个或五个环的环状部分，更优选两个、三个或四个环的环状部分。
如本文所用的术语“3-至10-元杂环基”或“3-至10-元杂环”指具有3、4、5、6、7、8、9或10个环原子的环，其可以含有直到最大数目的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子直到4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替换和其中环经由碳或氮原子连接至分子的剩余部分。3-至10-元杂环的实例包括但不限于氮丙啶、环氧乙烷、硫杂丙环、氮杂环丙烯、环氧乙烷、硫杂丙烯环、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯烷、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、异噁唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂
Figure BDA0002700814740000173
和高哌嗪。3-至10-元杂环基或3-至10-元杂环基团的各个氢原子可以被如下文定义的取代基替换。
如本文所用的术语“8-至11-元杂双环基”或“8-至11-元杂双环”指具有8-11个环原子的两个环的杂环状部分，其中至少一个环原子是两个环共享的，其可以含有直到最大数目的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子直至6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替换和其中环经由碳或氮原子连接至分子的剩余部分。8-至11-元杂双环的实例有吲哚、吲哚啉、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂
Figure BDA0002700814740000174
嘌呤和蝶啶。术语8-至11-元杂双环还包括两个环的螺环结构如1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷或桥连杂环如8-氮杂双环[3.2.1]辛烷。8-至11-元杂双环基或8-至11-元杂双环碳的各个氢原子可以被如下文定义的取代基替换。
类似地，术语“8-至30-元杂多环基”或“8-至30-元杂多环”指具有8-30个环原子的多于两个环、优选三个、四个或五个环的杂环状部分，其中两个邻环享有至少一个环原子，可以含有直到最大数目的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子直至10个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替换和其中环经由碳或氮原子连接至分子的剩余部分。
可以理解，与如下结构的部分相关的短语“Rx/Ry对连同它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基或3-至10-元杂环基”
Figure BDA0002700814740000171
指Rx和Ry形成如下结构：
Figure BDA0002700814740000172
其中R是C3-10环烷基或3-至10-元杂环基。
还可以理解，与如下结构的部分相关的短语“Rx/Ry对连同它们所连接的原子一起形成环A”
Figure BDA0002700814740000181
指Rx和Ry形成如下结构：
Figure BDA0002700814740000182
如本文所用的“卤素”指氟、氯、溴或碘。通常优选卤素是氟或氯。
如本文所用的术语“官能团”指可以与其它原子基团反应的原子基团。示例性的官能团例如有羧酸(-(C＝O)OH)、伯或仲胺(-NH2、-NH-)、马来酰亚胺、硫醇(-SH)、磺酸(-(O＝S＝O)OH)、甲酸酯或碳酸酯、氨甲酸酯基(-O(C＝O)N<)、羟基(-OH)、醛(-(C＝O)H)、酮(-(C＝O)-)、肼(>N-N<)、异氰酸酯基、异硫氰酸酯基、磷酸(-O(P＝O)OHOH)、膦酸(-O(P＝O)OHH)、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基、芳基氟化物、羟胺、二硫、磺酰胺、硫酸、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、环氧乙烷和氮丙啶。
当本发明的IL-2缀合物包含一个或多个酸性或碱性基团时，本发明还包括它们相应的药学上或毒理学上可接受的盐，特别是它们的可药用盐。因此，包含酸性基团的本发明的IL-2缀合物可以按照本发明使用，例如作为碱金属盐、碱土金属盐或铵盐使用。这类盐的更精确实例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺如例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸形成的盐。可以存在包含一个或多个碱性基团(即可以被质子化的基团)的本发明的IL-2缀合物，并且可以以它们与无机或有机酸的加成盐的形式按照本发明进行使用。适宜酸的实例包括氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸和其它本领域技术人员已知的酸。对本领域技术人员而言，已知其它方法用于将碱性基团转化为阳离子，例如胺基团的烷基化产生带正电荷的铵基团和盐的适当的抗衡离子。如果本发明的IL-2缀合物同时包含酸性和碱性基团，则本发明除了所提及的盐形式外还包括内盐或内铵盐(betaines)(两性离子)。可以通过本领域技术人员已知的惯常方法获得各自的盐，例如通过使这些前药与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中接触，或通过与其它盐进行阴离子交换或与阳离子交换。本发明还包括本发明的IL-2缀合物的所有盐，它们由于生理相容性低而不适宜直接用于药物中，但是可以用作例如化学反应的中间体或用于制备可药用盐。
术语“可药用”指当施用于患者时不引起伤害的物质，优选指被管理机构如EMA(欧洲)和/或FDA(US)和/或任意其它国家管理机构批准用于动物、优选用于人的物质。
如本文所用的术语“赋形剂”指与治疗物质如药物或前药一起施用的稀释剂、佐剂或载体。这类药物赋形剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经口施用时，水是优选的赋形剂。当药物组合物经静脉内施用时，盐水和右旋糖水溶液是优选的赋形剂。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液优选用作可注射溶液的液体赋形剂。适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望的话，药物组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂如乙酸盐、琥珀酸盐、tris、碳酸盐、磷酸盐、HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代基)乙磺酸)或可以含有洗涤剂如吐温、泊洛沙姆、泊洛沙明(poloxamines)、CHAPS、伊格帕尔(Igepal)或氨基酸等，例如甘氨酸、赖氨酸或组氨酸。这些药物组合物可以采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、小丸、胶囊、粉末、缓释制剂等的形式。药物组合物可以用传统的粘合剂和赋形剂如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准的赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这类组合物将含有治疗有效量的药物或生物活性部分以及适量的赋形剂以便提供用于适当适用于患者的形式。制剂应当适应施用模式。
通常，术语“包含”还涵盖“由…组成”
比例偏倚IL-2比比例阿地白介素的比例大于1、优选大于2、优选大于3、优选大于4和甚至更优选大于5。在一些实施方案中，比例偏倚IL-2比比例阿地白介素的比例大于10、大于20、大于50、大于70、大于100或大于150。
偏倚IL-2部分-D是IL-2部分、优选阿地白介素，包括
(a)至少一个修饰部分Mmod的稳定连接，其可以相同或不同；或
(b)至少一个氨基酸突变；或
(c)至少一个缺失；或
(a)、(b)和(c)的任意组合。
(a)、(b)和(c)中列出的修饰中的至少一个存在于-D中，并且确保在偏倚IL-2部分中比例偏倚IL-2大于比例阿地白介素。但是，可以理解，IL-2部分也可以包含(a)、(b)和(c)中列出的修饰中的一个或多个，其当单独看时不确保比例偏倚IL-2大于比例阿地白介素。这类另外的修饰可以例如提供改善的-D生产或储存特性。
在一个实施方案中，偏倚IL-2部分包含至少一个修饰部分Mmod向IL-2部分的稳定连接。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分在IL-2部分中包含至少一个氨基酸突变。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分在IL-2部分中包含至少一个缺失。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分包含至少一个修饰部分Mmod向IL-2部分的稳定连接和在IL-2部分的至少一个氨基酸突变。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分包含至少一个修饰部分Mmod向IL-2部分的稳定连接和在IL-2部分中的至少一个缺失。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分在IL-2部分中包含至少一个氨基酸突变和至少一个缺失。在另一个实施方案中，偏倚IL-2部分包含至少一个修饰部分Mmod向IL-2部分的稳定连接和在IL-2部分中的至少一个氨基酸突变和至少一个缺失。
偏倚IL-2部分可以包含至少一个修饰部分Mmod向IL-2部分的稳定连接。Mmod的连接可以处于IL-2部分的N-端、C-端、氨基酸侧链或内部位置。该Mmod部分可以优选是取代基或聚合部分。在一些实施方案中，Mmod的连接处于IL-2部分的N-端。在一些实施方案中，Mmod的连接处于IL-2部分的C-端。在一些实施方案中，Mmod的连接处于IL-2部分的氨基酸侧链。在一些实施方案中，Mmod的连接处于IL-2部分的内部位置。如果多于一个Mmod部分连接至IL-2部分，则连接可以发生在选自N-端、C-端、氨基酸残基侧链和内部位置的连接位置的任何组合处。
在一个实施方案中，Mmod是取代基。优选地，该取代基具有15Da至1kDa的分子量。
在一个实施方案中，该Mmod部分可以以二硫桥连的形式引入。优选地，该二硫桥连在两个半胱氨酸残基的硫醇基团之间形成。该二硫桥连是处于内部位置的修饰部分的连接的一个实例。在一个实施方案中，这些半胱氨酸残基可以是天然存在的半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，半胱氨酸残基中的一个或两个不是天然存在的，而是加入或插入到IL-2部分、优选SEQ ID NO:2的IL-2部分中，或者替代IL-2部分、优选SEQ ID NO:2的IL-2部分的天然存在的氨基酸残基。
获得该二硫桥连的优选方式公开在Jones等人(J.Am.Chem.Soc.,2012,134(3),第1847-1852页)、WO2011/018611、WO2011/018612和WO2011/018613中。
优选该二硫桥连发生在与IL-2Rα结合所牵涉的位置。因此，优选地，二硫桥连导致了偏倚IL-2部分与IL-2Rαβ的亲和力与阿地白介素相比降低。
在一个实施方案中，二硫桥连在C57和C104之间形成，如果IL-2部分具有SEQ IDNO:2的序列的话。
在另一个实施方案中，Mmod是聚合部分。该聚合部分可以包含直链、支链或多臂聚合物。在一个实施方案中，聚合物是直链聚合物。在另一个实施方案中，聚合物是支链聚合物。该支链聚合物优选具有一个、两个、三个、四个或五个分支点。从各分支点优选伸出两个、三个或四个聚合物臂。在另一个实施方案中，聚合物是多臂聚合物。该多臂聚合物优选具有3、4、5、6、7或8个聚合臂。
如果Mmod是聚合部分，则该聚合部分优选具有0.5kDa至1000kDa、例如1kDa至1000kDa、更优选2kDa至500kDa、甚至更优选3kDa至200kDa、最优选5kDa至120kDa的分子量或具有7-40kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约0.5kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约1kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约2kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约3kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约4kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约5kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有约7.5kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约10kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约15kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约20kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约30kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约40kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约50kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约70kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约80kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约90kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有约100kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有0.5kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有1kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有2kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有3kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有4kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有5kDa的分子量。在一个实施方案中，该聚合物具有7.5kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有10kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有15kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有20kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有30kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有40kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有50kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有70kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有80kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有90kDa的分子量。在另一个实施方案中，该聚合部分具有100kDa的分子量。
如果Mmod是聚合部分，则该聚合部分优选包含选自如下的聚合物：2-甲基丙烯酰基-氧基乙基磷酰基cholins、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷基氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺型胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(门冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙基磷酸酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟基乙基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基-噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(乌拉坦)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、右旋糖酐、糊精、明胶、透明质酸和衍生物、官能化透明质酸、海藻酸盐、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖醛酸、淀粉、羟基烷基淀粉、羟基乙基淀粉和其它基于碳水化合物的聚合物、木聚糖及其共聚物。
在一个实施方案中，Mmod是基于PEG的聚合物。
在另一个实施方案中，Mmod是基于透明质酸的聚合物。
在另一个实施方案中，Mmod包含肽或蛋白质部分。在一个实施方案中，该肽或蛋白质部分Mmod可以是与偏倚IL-2中的IL-2部分的翻译融合。在另一个实施方案中，该肽或蛋白质部分Mmod可以与偏倚IL-2中的IL-2部分化学缀合。优选地，该肽或蛋白质部分Mmod不是IL-2的片段或IL-2-部分。
肽或蛋白质部分形式的Mmod可以是合成或天然的蛋白质部分或其一部分或变体。示例性的非-IL-2部分包括白蛋白；抗体结构域，例如Fc结构域或免疫球蛋白的抗原结合结构域；CTP，和CD25；各自是其天然存在的形式或者是其变体或片段。
与IL-2部分融合的肽或蛋白质部分Mmod可以在N-端或C-端处连接，或者可以在IL-2部分的内部位置插入。可以理解，多于一个肽或蛋白质部分Mmod可以翻译融合至或化学缀合至和/或插入在IL-2部分中。所述多于一个肽或蛋白质部分Mmod可以具有相同或不同的序列。例如，偏倚IL-2部分可以具有翻译融合或化学缀合至IL-2部分的N-端的第一个肽或蛋白质部分Mmod和翻译融合或化学缀合至IL-2部分的C-端的第二个肽或蛋白质部分Mmod。在另一个实例中，偏倚IL-2部分可以包含翻译融合或化学缀合至IL-2部分的N-端的第一个肽或蛋白质部分Mmod和翻译插入或化学缀合至IL-2部分的内部位置的第二个肽或蛋白质部分Mmod。在另一个实例中，偏倚IL-2部分可以包含翻译融合或化学缀合至IL-2部分的C-端的第一个肽或蛋白质部分Mmod和翻译插入或化学缀合至IL-2部分的内部位置的第二个肽或蛋白质部分Mmod。在更进一步的实例中，偏倚IL-2部分可以包含翻译融合或化学缀合至IL-2部分的N-端的第一个肽或蛋白质部分Mmod、翻译融合或化学缀合至IL-2部分的C-端的第二个肽或蛋白质部分Mmod和翻译插入或化学缀合至IL-2部分的内部位置的第三个肽或蛋白质部分Mmod。
Mmod的连接可以在IL-2部分的蛋白质性(proteinogenic)或非蛋白质性(non-proteinogenic)的氨基酸残基处。在一些实施方案中，Mmod的连接发生于蛋白质性氨基酸。这类蛋白质性氨基酸残基优选选自半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸。在一些实施方案中，Mmod的连接发生于非蛋白质性氨基酸。如果修饰部分连接至非蛋白质性氨基酸残基，则可以理解，该非蛋白质性氨基酸残基被人工引入到IL-2部分中。该非蛋白质性氨基酸残基可以是具有可用于缀合Mmod至IL-2部分的官能团的任意非蛋白质性氨基酸残基。在一些实施方案中，该非蛋白质性氨基酸在它们的侧链包含选自如下的官能团：羰基；羰基衍生物，例如羰基样基团、被标记的羰基基团和被保护的羰基基团；叠氮化物；肟；和羟胺。
在一些实施方案中，该非蛋白质性氨基酸是如WO2006/069246A2中所述的非蛋白质性氨基酸，所述非蛋白质性氨基酸通过引用并入此处。在一些实施方案中，非蛋白质性氨基酸具有WO2006/069246A2中如下所述的结构：[00265]至[00283]的式(I)，[00284]的式(XXX)，[00285]的式(XXX-A)，[00286]的式(XXX-B)，[00287]的式(XXXI)，[00288]的式(XXXI-A)，[00289]的式(XXXI-B)，[00290]的式(XXXII)，[00291]的式(XXXII-A)，[00292]的式(XXXII-B)，[00293]的式(XXXX)，[00294]的式(XXXXI)，错误标记为[0100]、即[00294]和[00295]之间的段落的式(XXXXII)，[00295]和[00296]的式(XXXXIII)，[00302]至[00305]的式(XIV)，[00306]和[00307]的式(XV)，[00310]至[00312]的式(XI)，[00313]的式(XII)，[00314]和[00315]的式(XII)，[00316]的式(XIV)，[00317]的式(XVI)，[00318]和[00319]的式(XVI)，[00320]和[00321]的式(XVIII)，或[00530]的式(XXIX)，所述非蛋白质性氨基酸通过引用并入本文。
在一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的赖氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的K7、K8、K31、K34、K42、K47、K48、K53、K63、K75和K96的赖氨酸残基或在SEQ IDNO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的赖氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的赖氨酸残基处。可以理解，SEQ IDNO:2的赖氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的赖氨酸残基，则多于11个赖氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到SEQ ID NO:2的该同源物或变体中存在的最大数目的赖氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的五个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的五个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的六个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的六个赖氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的苏氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的T2、T6、T9、T36、T40、T50、T100、T101、T110、T112、T122、T130和T132的苏氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的苏氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的苏氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的苏氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的苏氨酸残基，则多于13个苏氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的苏氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ IDNO:2或其同源物或变体的一个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的五个Mmod部分连接至SEQ IDNO:1或其同源物或变体的五个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的六个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的六个苏氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的丝氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的S3、S4、S5、S74、S86、S98、S124、S126和S129的丝氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的丝氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的丝氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的丝氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的丝氨酸残基，则多于9个丝氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的丝氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的五个Mmod部分连接至SEQ ID NO:1或其同源物或变体的五个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的六个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的六个丝氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的酪氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的Y30、Y44和Y106的酪氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的酪氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的酪氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的酪氨酸残基中的1、2或3个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的酪氨酸残基，则多于3个酪氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的酪氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个酪氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个酪氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个酪氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的组氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的H15、H54和H78的组氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的组氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的组氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的组氨酸残基中的1、2或3个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的组氨酸残基，则多于3个组氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的组氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个组氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个组氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个组氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的色氨酸残基处，例如基于SEQID NO:2的W120位置的色氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的色氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的色氨酸残基处。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQID NO:2的IL-2部分多的色氨酸残基，则多于一个色氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的色氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个色氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的门冬氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的D19、D83和D108的门冬氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的门冬氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的门冬氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的门冬氨酸残基中的1、2或3个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ IDNO:2的IL-2部分多的门冬氨酸残基，则多于3个门冬氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的门冬氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个门冬氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个门冬氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个门冬氨酸残基。
在一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的谷氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的E14、E51、E59、E60、E61、E66、E67、E94、E99、E105、E109和E115的谷氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的谷氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的谷氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的谷氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的谷氨酸残基，则多于12个谷氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的谷氨酸残基可用于连接一个或多个修饰部分。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的五个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的五个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的六个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的六个谷氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的精氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的R37、R80、R82和R119的精氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的精氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的精氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的精氨酸残基中的1、2、3或4个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ IDNO:2的IL-2部分多的精氨酸残基，则多于4个精氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的精氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个精氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个精氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个精氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个精氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的半胱氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的C57和C104的半胱氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的半胱氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的半胱氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基中的1或2个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ IDNO:2的IL-2部分多的半胱氨酸残基，则多于2个半胱氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的半胱氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个半胱氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的蛋氨酸残基处，例如选自基于SEQ ID NO:2的M22、M38、M45和M103的蛋氨酸残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的蛋氨酸残基时，连接还可以发生在该另外的蛋氨酸残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的蛋氨酸残基中的1、2、3或4个可用于连接一个或多个修饰部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的蛋氨酸残基，则多于4个蛋氨酸残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的蛋氨酸残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个蛋氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个蛋氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个蛋氨酸残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个蛋氨酸残基。
在另一个实施方案中，Mmod的连接发生在IL-2部分的谷氨酰胺残基，例如选自基于SEQ ID NO:2的Q10、Q12、Q21、Q56、Q73和Q125的谷氨酰胺残基或在SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的谷氨酰胺残基时，连接还可以发生在该另外的谷氨酰胺残基处。可以理解，SEQ ID NO:2的谷氨酰胺残基中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个可用于连接Mmod。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且包含比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的谷氨酰胺残基，则多于6个谷氨酰胺残基可用于连接Mmod，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的谷氨酰胺残基可用于连接Mmod。在一个实施方案中，一个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的一个谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的两个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的两个谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的三个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的三个谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的四个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的四个谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，可以相同或不同的五个Mmod部分连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的五个谷氨酰胺残基。在另一个实施方案中，六个残基Mmod可以相同或不同的连接至SEQ ID NO:2或其同源物或变体的六个谷氨酰胺残基。
可以理解，在一些实施方案中，偏倚IL-2部分可以具有连接至多于一个类型的氨基酸残基、例如半胱氨酸和赖氨酸的Mmod部分。
Mmod与IL-2部分的连接是经由稳定的共价链接的。在一些实施方案中，IL-2部分和Mmod部分之间的链接是经由酰胺的。在一些实施方案中，IL-2部分和Mmod部分之间的链接是经由
Figure BDA0002700814740000301
部分的。
优选地，至少一个Mmod部分的连接发生在已知在与IL-2Rα的连接中牵涉的IL-2部分的氨基酸位置处。因此，优选地，至少一个Mmod部分的连接导致了IL-2部分、优选SEQ IDNO:2的IL-2部分的变体与IL-2Rαβ的亲和力与阿地白介素相比显著降低，即，产生了偏倚IL-2部分。
优选地，Mmod的连接发生在选自基于SEQ ID NO:2的K34、R37、M38、T40、F41、K42、F43、Y44、E61和L71的氨基酸位置或其同源物或变体的相应位置。甚至更优选地，Mmod的连接发生在选自基于SEQ ID NO:2的F41、Y44、E61和L71的氨基酸位置或其同源物或变体的相应位置。可以理解，不是所有这些氨基酸位置都包括将允许直接缀合Mmod的官能团，在这些氨基酸位置连接Mmod之前可以需要一些步骤，例如将天然存在的氨基酸用不同的氨基酸替换或进行一些化学修饰。因此，Mmod的连接可以在这些位置中在天然存在的氨基酸处或在该具体位置替换天然存在的氨基酸的氨基酸处发生，连接部位可以是蛋白质性或非蛋白质性氨基酸，这两者的实施如上文所述。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置K34或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置R37或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置M38或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置T40或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置F41或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置K42或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置F43或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQID NO:2的氨基酸位置Y44或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置E61或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，Mmod的连接发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置L71或其同源物或变体的相应位置。
在一些实施方案中，Mmod具有式(A-1)
Figure BDA0002700814740000311
其中
-FG-是链接；
-SP-是间隔基部分；且
-POL是聚合物。
在一些实施方案中，式(A-1)的-FG-是
Figure BDA0002700814740000312
其中标有星号的虚线指与IL-2部分的硫连接，未标记的虚线指与-SP-连接。所述硫可以是半胱氨酸的侧链提供的硫。
在一些实施方案中，式(A-1)的-FG-是
Figure BDA0002700814740000313
其中标有星号的虚线指与IL-2部分的氮连接，未标记的虚线指与-SP-连接。所述氮可以是来自IL-2部分的N-端胺的氮或赖氨酸的侧链的氮。在一些实施方案中，所述氮是IL-2部分的N-端胺的氮。在一些实施方案中，该氮是IL-2部分的赖氨酸的侧链的氮。
在一些实施方案中，式(A-1)的-FG-是
Figure BDA0002700814740000314
其中标有星号的虚线指与IL-2部分的氮的硫连接，未标记的虚线指与-SP-连接，和a1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。所述硫可以是半胱氨酸的侧链提供的硫，所述氮可以是来自IL-2部分的N-端胺的氮或赖氨酸的侧链的氮。在一些实施方案中，标有星号的虚线指与硫连接，所述硫通过半胱氨酸的侧链提供。在一些实施方案中，a1是1至8的整数。在一些实施方案中，a1是1至6的整数。在一些实施方案中，a1是1至4的整数。在一些实施方案中，a1是1。在一些实施方案中，a1是2。在一些实施方案中，a1是3。在一些实施方案中，a1是4。在一些实施方案中，a1是5。在一些实施方案中，a1是6。
在一些实施方案中，式(A-1)的-FG-是
Figure BDA0002700814740000321
其中标有星号的虚线指与IL-2部分的氮的硫连接，未标记的虚线指与-SP-连接；和a2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。在一些实施方案中，a2是1至8的整数。在一些实施方案中，a2是1至6的整数。在一些实施方案中，a2是1至4的整数。在一些实施方案中，a2是1。在一些实施方案中，a2是2。在一些实施方案中，a2是3。在一些实施方案中，a2是4。在一些实施方案中，a2是5。在一些实施方案中，a2是6。所述硫可以是半胱氨酸的侧链提供的硫，所述氮可以是来自IL-2部分的N-端胺的氮或赖氨酸的侧链的氮。在一些实施方案中，标有星号的虚线指与硫连接，所述硫通过半胱氨酸的侧链提供。
在一些实施方案中，式(A-1)的-SP-选自C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R9取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)-的基团所间隔；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的R9取代；
-R9各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11a、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
-R10、-R10a、-R11、-R11a和-R11b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一些实施方案中，式(A-1)的-SP-是C1-20烷基，所述C1-20烷基任选被一个或多个-R9取代和所述C1-20烷基任选被一个或多个选自-O-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)-的基团所间隔；其中-R9各自选自C1-6烷基；和-R10和-R10a各自独立地选自-H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，式(A-1)的-SP-是C1-10烷基，所述C1-10烷基任选被一个或多个-R9取代和所述C1-10烷基任选被一个或多个选自-O-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)-的基团所间隔；其中-R9各自选自C1-6烷基；和-R10和-R10a各自独立地选自-H和C1-6烷基。
在一些实施方案中，式(A-1)的-POL是基于PEG的聚合物。在一些实施方案中，-POL具有式(A-1i)
Figure BDA0002700814740000331
其中
虚线指与-SP-连接；
m是0或1；
p是12-22700的整数；且
q选自1、2、3、4、5和6。
在一些实施方案中，式(A-1i)的m是0。在一些实施方案中，式(A-1i)的m是1。
在一些实施方案中，式(A-1i)的p是23至227000、例如45至11300、或69至4540、或114至2700的整数。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约12。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约23。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约46。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约68。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约90。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约112。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约170。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约227。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约340。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约450。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约680。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约900。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约1130。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约1350。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约1590。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约1800。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约2045。在一些实施方案中，式(A-1i)的p是约2275。
在一些实施方案中，式(A-1i)的q是1。在一些实施方案中，式(A-1i)的q是2。在一些实施方案中，式(A-1i)的q是3。在一些实施方案中，式(A-1i)的q是4。在一些实施方案中，式(A-1i)的q是5。在一些实施方案中，式(A-1i)的q是6。
在一些实施方案中，式(A-1)的-POL具有式(A-1ii)
Figure BDA0002700814740000341
其中
虚线指与-SP-连接；
FG是官能团；
m是0或1；
p是12-22700的整数；且
q选自1、2、3、4、5和6。
如果式(A-1)的Mmod部分将缀合至其它部分、例如一个或多个-L1-L2-Z部分，则-POL部分以官能团结束是有利的。可以理解，如果-POL具有式(A-1ii)，则该化合物是试剂，并且在将这类一个或多个部分、例如一个或多个-L1-L2-Z部分缀合至该试剂的官能团后，FG不再存在，但是已经用所述一个或多个其它部分的试剂形式中存在的适宜官能团形成了链接。
还可以理解，将部分缀合至Mmod、例如-L1-L2-Z部分的其它连接部位也是可能的。
在一些实施方案中，式(A-1ii)的m是0。在一些实施方案中，式(A-1ii)的m是1。
在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为23至227000、例如45至11300、或69至4540、或114至2700的整数。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约12。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约23。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约46。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约68。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约90。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约112。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约170。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约227。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约340。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约450。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约680。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约900。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约1130。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约1350。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约1590。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约1800。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约2045。在一些实施方案中，式(A-1ii)的p为约2275。
在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为1。在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为2。在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为3。在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为4。在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为5。在一些实施方案中，式(A-1ii)的q为6。
如果其它部分、例如-L1-L2-Z部分经由式(A-1)的-POL部分缀合至Mmod，则-POL部分可以具有式(A-1iii)、(A-1iv)、(A-1v)或(A-1vi)：
Figure BDA0002700814740000351
其中
标有星号的虚线指与其它部分、例如-L1-L2-Z部分连接；
未标记的虚线指与-SP-连接；且
m、p和q如式(A-1i)中所定义进行使用。
在一些实施方案中，其它部分、例如-L1-L2-Z部分经由式(A-1)的-POL部分缀合至Mmod，产生式(A-1iii)的-POL的部分。在一些实施方案中，其它部分、例如-L1-L2-Z部分经由式(A-1)的-POL部分缀合至Mmod，产生式(A-1iv)的-POL的部分。在一些实施方案中，其它部分、例如-L1-L2-Z部分经由式(A-1)的-POL部分缀合至Mmod，产生式(A-1v)的-POL的部分。在一些实施方案中，其它部分、例如-L1-L2-Z部分经由式(A-1)的-POL部分缀合至Mmod，产生式(A-1vi)的-POL的部分。
在一些实施方案中，式(A-1)的-POL是基于透明质酸的聚合物。
在一些实施方案中，Mmod具有式(A-1a)
Figure BDA0002700814740000361
其中
标有星号的虚线指与IL-2部分的氨基酸残基的侧链的硫连接；
b1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
b2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；且
b3是12-22700的整数。
在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是1。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是3。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是4。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是5。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是6。
在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是1。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是2。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是3。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是4。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是5。在一些实施方案中，式(A-1a)的b2是6。
在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是23至227000、例如45至11300、或69至4540、或114至2700的整数。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约12。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约23。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约46。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约68。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约90。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约112。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约170。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约227。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约340。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约450。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约680。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约900。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约1130。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约1350。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约1590。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约1800。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约2045。在一些实施方案中，式(A-1a)的b3是约2275。
在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约12。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约23。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约46。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约68。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约90。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约112。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约170。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约227。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约340。在一些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，和式(A-1a)的b3是约450。
在一些实施方案中，Mmod具有式(A-1b)
Figure BDA0002700814740000371
其中
标有星号的虚线指与IL-2部分的氨基酸残基的侧链的硫连接；
c1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
c2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；且
c3是12-22700的整数。
在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是1。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是3。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是4。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是5。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是6。
在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是1。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是2。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是3。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是4。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是5。在一些实施方案中，式(A-1b)的c2是6。
在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是23至227000、例如45至11300、或69至4540、或114至2700的整数。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约12。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约23。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约46。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约68。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约90。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约112。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约170。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约227。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约340。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约450。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约680。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约900。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约1130。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约1350。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约1590。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约1800。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约2045。在一些实施方案中，式(A-1b)的c3是约2275。
在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约12。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约23。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约46。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约68。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约90。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约112。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约170。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约227。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约340。在一些实施方案中，式(A-1b)的c1是2，式(A-1b)的c2是3，和式(A-1b)的c3是约450。
在一些实施方案中，Mmod具有式(A-1c)
Figure BDA0002700814740000391
其中
标有星号的虚线指与IL-2部分的氨基酸残基的侧链的硫连接；
d1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
d2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；且
d3是12-22700的整数。
在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是1。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是3。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是4。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是5。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是6。
在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是1至8的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是1至6的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是1至4的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是1。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是2。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是3。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是4。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是5。在一些实施方案中，式(A-1c)的d2是6。
在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是23至227000、例如45至11300、或69至4540、114至2700、或160至900的整数。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约12。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约23。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约46。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约68。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约90。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约112。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约170。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约227。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约340。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约450。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约680。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约900。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约1130。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约1350。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约1590。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约1800。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约2045。在一些实施方案中，式(A-1c)的d3是约2275。
在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1cd)的d3是约12。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约23。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约46。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约68。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约90。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约112。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约170。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约227。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约340。在一些实施方案中，式(A-1c)的d1是2，式(A-1c)的d2是3，和式(A-1c)的d3是约450。
偏倚IL-2部分可以包含含有至少一个氨基酸突变、例如一个氨基酸突变、两个氨基酸突变、三个氨基酸突变、四个氨基酸突变、五个氨基酸突变、六个氨基酸突变、七个氨基酸突变、八个氨基酸突变、九个氨基酸突变或十个氨基酸突变的IL-2部分。该氨基酸突变优选发生在与IL-2Rα结合所牵涉的位置。因此，优选地，所述至少氨基酸突变导致偏倚IL-2部分对IL-2Rαβ的亲和力与阿地白介素相比降低。
优选地，所述至少一个氨基酸突变发生在选自基于SEQ ID NO:2的K34、R37、M38、T40、F41、K42、F43、Y44、E61和L71的氨基酸位置或其同源物或变体的相应位置。甚至更优选地，所述至少一个氨基酸突变发生在选自基于SEQ ID NO:2的F41、Y44、E61和L71的氨基酸位置或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置K34或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置R37或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置M38或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置T40或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置F41或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置K42或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置F43或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置Y44或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置E61或其同源物或变体的相应位置。在一些实施方案中，所述至少一个氨基酸突变发生在基于SEQ ID NO:2的氨基酸位置L71或其同源物或变体的相应位置。
在一些实施方案中，该突变是用选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基替换天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被丙氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被精氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被天冬酰胺替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被门冬氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被半胱氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被谷氨酰胺替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被谷氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被甘氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被组氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被赖氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被丝氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被苏氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被色氨酸替换。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被酪氨酸替换。在一些实施方案中，该突变是用选自精氨酸、门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸残基替换天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，该突变是用选自半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的氨基酸残基替换天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，天然存在的氨基酸被非蛋白质性氨基酸替换。该非蛋白质性氨基酸的实施方案如上文所述。
在一个实施方案中，偏倚IL-2部分的IL-2包含选自基于SEQ ID NO:2的K34A、K34C、K34G、K34S、K34T、K34Q、K34E、K34N、K34D、K34H、K34W、K34Y和K34R或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34A突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34C突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34G突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34S突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34T突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34Q突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34E突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34D突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34H突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34W突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34Y突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含K34R突变。
在一个实施方案中，偏倚IL-2的IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的R37A、R37C、R37G、R37S、R37T、R37Q、R37E、R37N、R37D、R37H、R37W、R37Y和R37K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37A突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37C突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37G突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37S突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37T突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37Q突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37E突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37N突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37D突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37H突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37K突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37W突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37Y突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含R37K突变。
在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸突变选自基于SEQ ID NO:2的F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R、F41K、Y44A、Y44C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R、Y44K、L71C、L71G、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R和L71K或其同源物或变体的相应位置。
在一些实施方案中，偏倚IL-2的IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R、F41H、F41W、F41Y和F41K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R和F41K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一个实施方案中，IL-2部分包含F41A突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41C突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41S突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41T突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41Q突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41E突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41N突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41D突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41R突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41H突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41W突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41Y突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41K突变。
在一些实施方案中，IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的Y44A、Y44C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R、Y44H、Y44W和Y44K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的Y44A、Y44C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R和Y44K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一个实施方案中，IL-2部分包含Y44A突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44C突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44S突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44T突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44Q突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44E突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44N突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44D突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44R突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44H突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44W突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y44K突变。
在一些实施方案中，IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的L71G、L71C、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R、L71H、L71W、L71Y和L71K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一些实施方案中，IL-2部分包含选自基于SEQ ID NO:2的L71G、L71C、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R和L71K或其同源物或变体的相应位置的氨基酸突变。在一个实施方案中，IL-2部分包含L72G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72C突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72A突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72S突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72T突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72Q突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72E突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72N突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72D突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72R突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72H突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72W突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72Y突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含L72K突变。
在另一个实施方案中，IL-2部分包含选自F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R和F41K的氨基酸突变和选自Y44A、Y44C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R和Y44K的另一个氨基酸突变，基于SEQ ID NO:2，或其同源物或变体的相应位置。在一个实施方案中，IL-2部分包含F41A和Y44A突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41C突变和Y44A突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41A和Y44C突变。
在另一个实施方案中，IL-2部分包含选自F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R和F41K的氨基酸突变和选自L71G、L71C、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R和L71K的另一个氨基酸突变，基于SEQ ID NO:2，或其同源物或变体的相应位置。在一个实施方案中，IL-2部分包含F42A和L72G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F42C和L72G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F42A和L72C突变。
在另一个实施方案中，IL-2部分包含选自Y44A、Y44C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R和Y44K的氨基酸突变和选自L71G、L71C、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R和L71K的另一个氨基酸突变，基于SEQ ID NO:2，或其同源物或变体的相应位置。在一个实施方案中，IL-2部分包含Y45A和L72G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y45C和L72G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含Y45A和L72C突变。
在另一个实施方案中，IL-2部分包含选自F41A、F41C、F41G、F41S、F41T、F41Q、F41E、F41N、F41D、F41R和F41K的氨基酸突变；选自Y44A、Y41C、Y44G、Y44S、Y44T、Y44Q、Y44E、Y44N、Y44D、Y44R和Y44K的另一个氨基酸突变和选自L71G、L71C、L71A、L71S、L71T、L71Q、L71E、L71N、L71D、L71R和L71K的另一个氨基酸突变，基于SEQ ID NO:2，或其同源物或变体的相应位置。在一个实施方案中，IL-2部分包含F41A、Y44A和L71G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41C、Y44A和L71G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41A、Y44C和L71G突变。在另一个实施方案中，IL-2部分包含F41A、Y44C和L71C突变。
IL-2部分可以另外地或供选地包含消除O-糖基化位点的氨基酸突变。优选地，该氨基酸突变处于相应于阿地白介素的残基2的位置，甚至更优选该氨基酸突变选自T2A、T2G、T2Q、T2E、T2N、T2D、T2R、T2K和T2P，最优选是T2A，基于SEQ ID NO:2，或其同源物或变体的相应位置。
IL-2部分可以另外地或供选地包含一个或多个另外的氨基酸突变，其可以提供另外的益处，例如表达或稳定性增加。例如，阿地白介素的位置103的蛋氨酸可以被中性氨基酸如丙氨酸替换，如US 5,206,344中所述。
在一些实施方案中，偏倚IL-2部分是包含至少一个氨基酸突变和至少一个修饰部分Mmod的稳定连接的IL-2部分，例如一个氨基酸突变和一个Mmod部分、一个氨基酸突变和两个Mmod部分、两个氨基酸突变和一个Mmod部分、三个氨基酸突变和一个Mmod部分、或一个氨基酸突变和三个Mmod部分。可以理解，氨基酸突变和Mmod部分的数目可以相互独立地选择，可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。在一些实施方案中，氨基酸突变和Mmod部分的数目相互独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是1。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是2。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是3。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是4。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是5。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是6。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是1。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是2。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是3。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是4。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是5。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是6。Mmod部分和突变位点/突变的实施方案如上文所述。
在一些实施方案中，偏倚IL-2部分是包含至少一个氨基酸突变和至少一个连接至该突变氨基酸的Mmod部分的IL-2部分。可以理解：氨基酸突变和Mmod部分的数目可以不相同；其它Mmod部分可以在非突变氨基酸残基处缀合至IL-2部分；不是所有的突变氨基酸残基可以缀合至Mmod部分，只要有至少一个Mmod部分缀合至一个突变氨基酸残基。因此，氨基酸突变和Mmod部分的数目可以相互独立地选择，可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。在一些实施方案中，氨基酸突变和Mmod部分的数目相互独立地选自1、2、3、4、5、6、7和8。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是1。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是2。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是3。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是4。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是5。在一些实施方案中，氨基酸突变的数目是6。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是1。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是2。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是3。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是4。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是5。在一些实施方案中，Mmod部分的数目是6。Mmod部分和突变位点/突变的实施方案如上所述。
在一些实施方案中，偏倚IL-2部分是在选自K34、R37、M38、T40、F41、K42、F43、Y44、E61和L71的位置包含至少一个氨基酸突变的IL-2部分，其中天然存在的氨基酸被半胱氨酸替换，产生了突变K34C、R37C、M38C、T40C、F41C、K42C、F43C、Y44C、E61C和L71C，和其中至少一个Mmod部分缀合至该半胱氨酸的硫。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含K34C突变和另外地包含缀合至在位置34处替换赖氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含R37C突变和另外地包含缀合至在位置37处替换精氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含M38C突变和另外地包含缀合至在位置38处替换蛋氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含T40C突变和另外地包含缀合至在位置40处替换苏氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含F41C突变和另外地包含缀合至在位置41处替换苯丙氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含K42C突变和另外地包含缀合至在位置42处替换赖氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含F43C突变和另外地包含缀合至在位置43处替换苯丙氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含Y44C突变和另外地包含缀合至在位置44处替换酪氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含E61C突变和另外地包含缀合至在位置61处替换谷氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含L71C突变和另外地包含缀合至在位置71处替换赖氨酸的半胱氨酸的硫的Mmod部分。在一些实施方案中，偏倚IL-2部分包含选自K34C、R37C、M38C、T40C、F41C、K42C、F43C、Y44C、E61C和L71C的一个突变，其中一个Mmod部分缀合至替换天然存在的氨基酸(即例如在R37C突变的情况下在位置37处的精氨酸)的半胱氨酸的硫。
IL-2部分可以包含至少一个缺失(参见第(c)点)。可以理解，该缺失优选涉及SEQID NO:2的序列。该缺失可以是天然存在的缺失，例如剪接变体的形式，或者可以是人工引入的缺失。一个这类天然存在的剪接变体是IL-2δ2突变体(参见Tsytsikov等人.,JBC1996、271(38):23055-23060)，其中外显子2被排除，并且其产生了基于SEQ ID NO:1的序列的氨基酸残基N30至K49的缺失，这相应于基于SEQ ID NO:2的序列的氨基酸残基N29至K48的缺失。
优选地，该缺失发生在与IL-2Rα结合所牵涉的位置处。因此，优选地，所述至少一个缺失导致了偏倚IL-2部分对IL-2Rαβ的亲和力与阿地白介素相比降低。
在一个实施方案中，-D包含IL-2部分、优选具有序列SEQ ID NO:2的IL-2部分，其包含至少一个引入半胱氨酸残基的突变和另外地包含连接至所述半胱氨酸突变的修饰部分Mmod。优选地，半胱氨酸突变选自K34C、R37C、M38C、T40C、F41C、K42C、F43C、Y44C、E61C和L71C。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是K34C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是R37C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是M38C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是T40C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是F41C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是K42C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是F43C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是Y44C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是E61C突变。在一些实施方案中，半胱氨酸突变是L71C突变。
在一个实施方案中，IL-2部分如Levin等人描述的superkine(Nature,2012,484:529-535)。优选地，除了上述修饰或作为上述修饰的供选，该IL-2部分包含氨基酸残基Q73、L79、R80、L84、I85和I91的突变中的一个或多个，特别是包含选自Q73H、L79F、R80D、L84V、I85V和I91F的突变中的一个或多个。在一个实施方案中，除了上述修饰或作为上述修饰的供选，IL-2部分包含Q73H、L79F、R80D、L84V、I85V和I91F突变。在另一个实施方案中，除了上述修饰或作为上述修饰的供选，IL-2部分包含L79F、R80D、L84V、I85V和I91F突变。如果IL-2部分是基于superkine的，则相应的偏倚IL-2对IL-2Rβ的亲和力高于阿地白介素。
本发明的IL-2缀合物包含至少一个共价和可逆连接的聚合部分和/或被取代的脂肪酸部分-Z。
出人意料地发现，添加这类至少一个共价和可逆连接的聚合部分和/或被取代的脂肪酸部分能够进一步延长偏倚IL-2部分的循环半衰期，而其可逆连接确保了在所述至少一个共价和可逆连接的聚合部分或被取代的脂肪酸部分裂解后对IL-2Rβ有足够的亲和力。
在一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物包含一个-Z部分，其为被取代的脂肪酸或为聚合部分。在一个实施方案中，-Z是被取代的脂肪酸。在另一个实施方案中，-Z是聚合部分。
在另一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物包含两个-Z部分，其可以相同或不同。在一个实施方案中，两个-Z部分是被取代的脂肪酸，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，两个-Z部分是聚合部分，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，一个-Z部分是被取代的脂肪酸和另一个-Z部分是聚合部分。
在另一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物包含三个-Z部分，其可以相同或不同。在一个实施方案中，所有三个-Z部分是被取代的脂肪酸，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，所有三个-Z部分是聚合部分，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，一个或两个-Z部分是被取代的脂肪酸和剩余的-Z部分是聚合部分。
在另一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物包含四个-Z部分，其可以相同或不同。在一个实施方案中，所有四个-Z部分是被取代的脂肪酸，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，所有四个-Z部分是聚合部分，其可以相同或不同。在另一个实施方案中，一个、两个或三个-Z部分是被取代的脂肪酸和剩余的-Z部分是聚合部分。
如果-Z是被取代的脂肪酸部分，其优选是WO 2005/027978A2和WO2014/060512A1中公开的被取代的脂肪酸部分，所述文献通过引用并入本文。
如果-Z是聚合部分，则该聚合部分优选具有1kDa至1000kDa、更优选2kDa至500kDa、甚至更优选3kDa至200kDa、甚至更优选5kDa至120kDa、甚至更优选10kDa至100kDa和最优选15kDa至80kDa的分子量。在一个实施方案中，-Z是具有约2kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约5kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约10kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约15kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约20kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约30kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约40kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约50kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约60kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约70kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约80kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约90kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有约100kDa分子量的聚合部分。在一个实施方案中，-Z是具有2kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有5kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有10kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有15kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有20kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有30kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有40kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有50kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有60kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有70kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有80kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有90kDa分子量的聚合部分。在另一个实施方案中，-Z是具有100kDa分子量的聚合部分。
如果-Z是聚合部分，则该聚合部分优选包括选自如下的聚合物：2-甲基丙烯酰基-氧基乙基磷酰基cholins、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷基氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺型胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(门冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙基磷酸酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟基乙基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基-噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(乌拉坦)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、右旋糖酐、糊精、明胶、透明质酸和衍生物、官能化透明质酸、海藻酸盐、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖醛酸、淀粉、羟基烷基淀粉、羟基乙基淀粉和其它基于碳水化合物的聚合物、木聚糖及其共聚物。
在一个实施方案中，-Z是肽或蛋白质部分。优选地，该肽或蛋白质部分不是IL-2-部分或其片段。该肽或蛋白质部分-Z可以经由-L1-L2-化学缀合至-D或可以经由可逆连接基部分-L1-翻译融合至-D，其中-L1-是肽或蛋白质部分和-L2-优选是化学键。在一个实施方案中，该肽或蛋白质部分-Z经由-L1-L2-化学缀合至-D。在另一个实施方案中，该肽或蛋白质部分-Z经由可逆连接基部分-L1-翻译融合至-D，其中L1-是肽或蛋白质部分和-L2-优选是化学键。可以理解，该肽或蛋白质可逆连接基部分-L1-可以是酶促或非酶促降解的。为了促进酶促降解，-L1-可以包含蛋白酶识别位点。
如果-Z是肽或蛋白质部分，其优选选自包含绒毛膜促性腺激素的羧基端肽的部分，如US 2012/0035101A1中所述，该文献通过引用并入本文；白蛋白部分；无规卷曲蛋白质部分和Fc融合蛋白质部分。
在一个实施方案中，-Z包含无规卷曲肽或蛋白质部分。
优选地，该无规卷曲肽或蛋白质部分包含至少25个氨基酸残基和至多2000个氨基酸。甚至更优选地，该无规卷曲肽或蛋白质部分包含至少30个氨基酸残基和至多1500个氨基酸残基。甚至更优选地，该无规卷曲肽或蛋白质部分包含至少50个氨基酸残基和至多500个氨基酸残基。
在优选的实施方案中，-Z包含无规卷曲蛋白质部分，其中形成所述无规卷曲蛋白质部分的氨基酸总数的至少80％、优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％和最优选至少99％选自丙氨酸和脯氨酸。甚至更优选地，该无规卷曲蛋白质部分的氨基酸残基总数的至少10％、但是低于75％、优选低于65％是脯氨酸残基。优选地，该无规卷曲蛋白质部分如WO2011/144756A1中所述，其通过引用整体并入本文。甚至更优选地，-Z包含至少一个选自如下的部分：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:61，如WO2011/144756中所述，该文献通过引用并入本文。包含含有丙氨酸和脯氨酸的该无规卷曲蛋白质的部分将称为“PA”或“PA部分”。
因此，在一个实施方案中，-Z包含PA部分。
在另一个实施方案中，-Z包含无规卷曲蛋白质部分，其中形成所述无规卷曲蛋白质部分的氨基酸总数的至少80％、优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％和最优选至少99％选自丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸。甚至更优选地，该无规卷曲蛋白质部分的氨基酸残基总数的至少4％、但是低于40％是脯氨酸残基。优选地，该无规卷曲蛋白质部分如WO2008/155134A1中所述，其通过引用整体并入本文。甚至更优选地，-Z包含至少一个选自如下的部分：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:56，如WO 2008/155134A1中所公开，该文献通过引用并入本文。包含含有丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸的该无规卷曲蛋白质部分的部分将称为“PAS”或“PAS部分”。
因此，在一个实施方案中，-Z包含PAS部分。
在另一个实施方案中，-Z包含无规卷曲蛋白质部分，其中形成所述无规卷曲蛋白质部分的氨基酸总数的至少80％、优选至少85％、甚至更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％和最优选至少99％选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸。优选地，该无规卷曲蛋白质部分如WO2010/091122A1中所述，该文献通过引用并入本文。甚至更优选地，-Z包含至少一个选自如下的部分：SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184；SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、SEQ IDNO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199、SEQ IDNO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ IDNO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ IDNO:759、SEQ ID NO:760、SEQ ID NO:761、SEQ ID NO:762、SEQ ID NO:763、SEQ ID NO:764、SEQ ID NO:765、SEQ ID NO:766、SEQ ID NO:767、SEQ ID NO:768、SEQ ID NO:769、SEQ IDNO:770、SEQ ID NO:771、SEQ ID NO:772、SEQ ID NO:773、SEQ ID NO:774、SEQ ID NO:775、SEQ ID NO:776、SEQ ID NO:777、SEQ ID NO:778、SEQ ID NO:779、SEQ ID NO:1715、SEQ IDNO:1716、SEQ ID NO:1718、SEQ ID NO:1719、SEQ ID NO:1720、SEQ ID NO:1721和SEQ IDNO:1722，如WO2010/091122A1中所述，该文献通过引用并入本文。根据WO 2010/091122A1中的指定，包含含有丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸的该无规卷曲蛋白质部分的部分将称为“XTEN”或“XTEN部分”。
因此，在一个实施方案中，-Z包含XTEN部分。
在另一个实施方案中，-Z是基于透明质酸的聚合物。
在另一个实施方案中，-Z是基于PEG的部分，例如直链、支链或多臂的基于PEG的部分。在一个实施方案中，-Z是支链的基于PEG的部分。优选地，该支链的基于PEG的部分-Z是具有一个、两个、三个、四个、五个或六个分支点的支链的基于PEG的部分。优选地，-Z是具有一个、两个或三个分支点的支链的基于PEG的部分。在一个实施方案中，-Z是具有一个分支点的支链的基于PEG的部分。在另一个实施方案中，-Z是具有两个分支点的支链的基于PEG的部分。在另一个实施方案中，-Z是具有三个分支点的支链的基于PEG的部分。
各分支点优选独立地选自-N<、-CH<和>C<。
在一些实施方案中，-Z包含式(A)的部分：
Figure BDA0002700814740000521
其中
-BP1<、-BP2<、-BP3<相互独立地选自-N<和-C(R8)<；
R8选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少40％PEG和具有3至40kDa的分子量的基于PEG的链；
-C1-、-C2-相互独立地选自C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R9取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)-的基团所间隔；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的R9取代；
R9各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11a、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
R10、R10a、R11、R11a和R11b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少50％PEG和具有3至40kDa的分子量的基于PEG的链。在一些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少60％PEG和具有3至40kDa的分子量的基于PEG的链。在一些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少70％PEG和具有3至40kDa的分子量的基于PEG的链。在一些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少80％PEG和具有3至40kDa的分子量的基于PEG的链。
在一些实施方案中，式(A)的P1、P2、P3和P4部分的分子量各自独立地为5至30kDa、例如5至25kDa、或8至20kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约5kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约7kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约10kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约12kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约15kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约20kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约25kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是约30kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是7kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是10kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是12kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是15kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是20kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是25kDa。在一些实施方案中，P1、P2、P3或P4部分的分子量可以是30kDa。
在一些实施方案中，式(A)的P1、P2、P3和P4具有相同结构。
在一些实施方案中，式(A)的BP1是–N<。
在一些实施方案中，式(A)的BP2和BP2具有相同结构。在一些实施方案中，式(A)的BP2和BP2均为–CH<。
在一些实施方案中，式(A)的C1和C2具有相同结构。在一些实施方案中，式(A)的C1和C2是被一个或多个选自-O-、-C(O)N(R10)-和3-至10元杂环基的基团间隔的C1-50烷基；其中3-至10元杂环基被至少一个氧代基(＝O)取代。
在一些实施方案中，式(A)的C1和C2具有式(A-a)
Figure BDA0002700814740000541
其中
标有星号的虚线指与BP1连接；
未标记的虚线指分别与BP2或BP3连接；
q1选自1、2、3、4、5、6、7和8；
q2选自1、2、3、4和5；
q3选自1、2、3、4、5、6、7和8；且
q4选自1、2和3。
在一些实施方案中，式(A-a)的q1选自4、5、6、7和8。在一些实施方案中，式(A-a)的q1选自5、6和7。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是1。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是2。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是3。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是4。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是5。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是6。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是7。在一些实施方案中，式(A-a)的q1是8。
在一些实施方案中，式(A-a)的q2选自1、2和3。在一些实施方案中，式(A-a)的q2是1。在一些实施方案中，式(A-a)的q2是2。在一些实施方案中，式(A-a)的q2是3。在一些实施方案中，式(A-a)的q2是4。在一些实施方案中，式(A-a)的q2是5。
在一些实施方案中，式(A-a)的q3选自2、3、4和5。在一些实施方案中，式(A-a)的q3选自2、3和4。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是1。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是2。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是3。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是4。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是5。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是6。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是7。在一些实施方案中，式(A-a)的q3是8。
在一些实施方案中，式(A-a)的q4是1。在一些实施方案中，式(A-a)的q4是2。在一些实施方案中，式(A-a)的q4是3。
在一些实施方案中，式(A)的P1、P2、P3和P4相互独立地是式(A-b)
Figure BDA0002700814740000551
其中
虚线指与-Z的剩余部分连接；
m是0或1；
p是70至900的整数；且
q选自1、2、3、4、5和6。
在一些实施方案中，式(A-b)的m是0。在一些实施方案中，式(A-b)的m是1。
在一些实施方案中，式(A-b)的p是115至680的整数。在一些实施方案中，式(A-b)的p是115至560的整数。在一些实施方案中，式(A-b)的p是185至450的整数。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约115。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约160。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约225。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约270。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约340。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约450。在一些实施方案中，式(A-b)的p是约560。
在一些实施方案中，式(A-b)的q是1。在一些实施方案中，式(A-b)的q是2。在一些实施方案中，式(A-b)的q是3。在一些实施方案中，式(A-b)的q是4。在一些实施方案中，式(A-b)的q是5。在一些实施方案中，式(A-b)的q是6。
在一些实施方案中，-Z包含式(A-c)的部分：
Figure BDA0002700814740000561
其中p1、p2、p3、p4相互独立地是70至900的整数。
在一些实施方案中，式(A-c)的p1是115至680的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是115至560的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是185至450的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是220至240的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约115。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约160。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约225。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约270。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约340。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约450。在一些实施方案中，式(A-c)的p1是约560。
在一些实施方案中，式(A-c)的p2是115至680的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是115至560的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是185至450的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是220至240的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约115。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约160。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约225。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约270。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约340。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约450。在一些实施方案中，式(A-c)的p2是约560。
在一些实施方案中，式(A-c)的p3是115至680的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是115至560的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是185至450的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是220至240的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约115。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约160。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约225。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约270。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约340。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约450。在一些实施方案中，式(A-c)的p3是约560。
在一些实施方案中，式(A-c)的p4是115至680的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是115至560的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是185至450的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是220至240的整数。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约115。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约160。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约225。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约270。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约340。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约450。在一些实施方案中，式(A-c)的p4是约560。
在一些实施方案中，式(A-c)的p1、p2、p3和p4是相等的。在一些实施方案中，p1、p2、p3和p4的范围是220至240。
在一个实施方案中，-Z是如WO 2012/02047A1中公开的部分，该文献通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，-Z是如WO 2013/024048A1中公开的部分，该文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，-Z是水不溶性的。在一些实施方案中，-Z是水凝胶。
在一些实施方案中，该水凝胶包含选自如下的聚合物：2-甲基丙烯酰基-氧基乙基磷酰基cholins、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷基氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺型胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(门冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚(酯)、聚(乙烯)、聚(乙二醇)如聚(乙二醇)和聚(丙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙基磷酸酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟基乙基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基-噁唑啉)、聚(羟基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟基丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚(乌拉坦)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、壳多糖、壳聚糖、右旋糖酐、糊精、明胶、透明质酸和衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖醛酸、淀粉、羟基烷基淀粉、羟基乙基淀粉和其它基于碳水化合物的聚合物、木聚糖及其共聚物。
在一些实施方案中，-Z是基于聚(亚烷基二醇)的或基于透明质酸的水凝胶。
在一些实施方案中，-Z是基于聚(丙二醇)的水凝胶。
在一些实施方案中，-Z是基于PEG的水凝胶。
在一些实施方案中，-Z是如WO2011/012715A1或WO2014/056926A1中所述的基于PEG的水凝胶，该文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，-Z是基于透明质酸的水凝胶。
在一些实施方案中，-Z是如WO2018/175788A1中所述的基于透明质酸的水凝胶，该文献通过引用并入本文。
-L1-部分可以经由IL-2部分、特别是经由IL-2部分的氨基酸残基或经由-D中存在的修饰部分Mmod连接至-D。在一个实施方案中，-L1-经由IL-2部分、特别是经由IL-2部分的氨基酸残基连接至-D。在另一个实施方案中，-L1-经由-D中存在的修饰部分Mmod连接至-D。可以理解，一个或多个-L1-部分可以连接至Mmod部分。
在一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物中存在的所有-L1-部分连接至-D的氨基酸残基。
如果-L1-连接至IL-2部分的氨基酸残基，该氨基酸残基可以是-D的蛋白质性或非蛋白质性氨基酸残基。在一个实施方案中，-L1-连接至非蛋白质性氨基酸残基、优选如上所述的非蛋白质性氨基酸。在另一个实施方案中，-L1-的连接是连接至蛋白质性氨基酸残基。如果连接发生在蛋白质性氨基酸残基，则所述蛋白质性氨基酸残基在一些实施方案中选自半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸。在一些实施方案中，这类蛋白质性氨基酸残基选自半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、门冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。
在一个实施方案中，-L1-连接至-D的半胱氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的C57和C104的半胱氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的半胱氨酸残基时，连接还可以发生在该半胱氨酸残基上，该半胱氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基中的一个或两个可用于分别连接一个或两个-Z部分至-D。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的半胱氨酸残基，则多于两个半胱氨酸残基可用于连接-Z，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的半胱氨酸残基可用于连接-Z。在一个实施方案中，一个-Z部分连接至一个半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-Z部分连接至两个半胱氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至-D的组氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的H15、H54和H78的组氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的组氨酸残基时，连接还可以发生在该组氨酸残基上，该组氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的组氨酸残基中的一个、两个或三个可用于分别连接一个、两个或三个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的组氨酸残基，则多于三个组氨酸残基可用于连接-L1-至-D，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的组氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个组氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个组氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个组氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至赖氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的K7、K8、K31、K34、K42、K47、K48、K53、K63、K75或K96的赖氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的赖氨酸残基时，连接还可以发生在该赖氨酸残基上，该赖氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的赖氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个可用于分别连接1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ IDNO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的赖氨酸残基，则多于11个赖氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的赖氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至五个赖氨酸残基。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至六个赖氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至色氨酸残基、例如基于SEQ ID NO:2的位置W120的色氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQID NO:2相比包含一个或多个另外的色氨酸残基时，连接还可以发生在该色氨酸残基上，该色氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。如果IL-2部分是SEQ IDNO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的色氨酸残基，则多于一个色氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的色氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个色氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至丝氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的S3、S4、S5、S74、S86、S98、S124、S126和S129的丝氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的丝氨酸残基，连接还可以发生在该丝氨酸残基上，该丝氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的丝氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8或9个可用于连接-L1-。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的丝氨酸残基，则多于9个丝氨酸残基可用于连接-L1-至-D，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的丝氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至五个丝氨酸残基。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至六个丝氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至苏氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的T2、T6、T9、T36、T40、T50、T100、T102、T110、T112、T122、T130和T132的苏氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的苏氨酸残基时，连接还可以发生在该苏氨酸残基上，该苏氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的苏氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个可用于分别连接1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的苏氨酸残基，则多于13个苏氨酸残基可用于连接-L1-至-D，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的苏氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分接至三个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至五个苏氨酸残基。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至六个苏氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至酪氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的Y30、Y44和Y106的酪氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的酪氨酸残基时，连接还可以发生在该酪氨酸残基上，该酪氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQID NO:2的酪氨酸残基中的1、2或3个可用于连接1、2或3个-L1-部分至-D。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的酪氨酸残基，则多于3个酪氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的酪氨酸残基可用于连接-L1-至-D。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个酪氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个酪氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个酪氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至门冬氨酸残基，例如选自基于SEQ ID NO:2的D19、D83和D108的门冬氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的门冬氨酸残基时，连接还可以发生在该门冬氨酸残基上，该门冬氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的门冬氨酸残基中的1、2或3个可用于分别连接1、2或3个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的门冬氨酸残基，则多于3个门冬氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的门冬氨酸残基可用于连接-L1-至-D。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个门冬氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个门冬氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个门冬氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至谷氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的E14、E51、E59、E60、E61、E66、E67、E94、E99、E105、E109和E115的谷氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的谷氨酸残基时，连接还可以发生在该谷氨酸残基上，该谷氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的谷氨酸残基中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个可用于连接1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的谷氨酸残基，则多于12个谷氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的谷氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至五个谷氨酸残基。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至六个谷氨酸残基。
在另一个实施方案中，-L1-连接至精氨酸残基、例如选自基于SEQ ID NO:2的R37、R80、R82和R119的精氨酸残基或SEQ ID NO:2的同源物或变体的相应位置。当IL-2的同源物或变体与SEQ ID NO:2相比包含一个或多个另外的精氨酸残基时，连接还可以发生在该精氨酸残基上，该精氨酸残基可以是天然存在的或可以是添加、插入或突变的结果。可以理解，SEQ ID NO:2的精氨酸残基中的1、2、3或4个可用于连接1、2、3或4个-L1-部分。如果IL-2部分是SEQ ID NO:2的同源物或变体并且具有比SEQ ID NO:2的IL-2部分多的精氨酸残基，则多于4个精氨酸残基可用于连接-L1-，即，一直到该同源物或变体中存在的最大数目的精氨酸残基可用于连接-L1-。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至一个精氨酸残基。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个精氨酸残基。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至四个精氨酸残基。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个酪氨酸残基。
在另一个实施方案中，至少一个-L1-部分连接至-D的氨基酸残基和剩余的一个或多个-L1-部分连接至-D中存在的修饰部分。
在另一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物中存在的所有-L1-部分连接至-D中存在的修饰部分。在一个实施方案中，一个-L1-部分连接至-D的一个修饰部分。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至一个修饰部分，即连接至相同的修饰部分。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至一个修饰部分。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至一个修饰部分。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至一个修饰部分。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至一个修饰部分。在另一个实施方案中，总共两个-L1-部分连接至两个修饰部分，即，每个修饰部分一个-L1-部分。在另一个实施方案中，总共三个-L1-部分连接至三个修饰部分，即，每个修饰部分一个-L1-部分。在另一个实施方案中，总共四个-L1-部分连接至四个修饰部分，即，每个修饰部分连接一个-L1-部分。在另一个实施方案中，总共五个-L1-部分连接至五个修饰部分，即每个修饰部分一个部分。在另一个实施方案中，总共六个-L1-部分连接至六个修饰部分，即每个修饰部分连接一个-L1-。
在一个实施方案中，-L1-具有如WO 2009/095479A2中公开的结构。因此，在一个实施方案中，-L1-部分具有式(II)：
Figure BDA0002700814740000631
其中虚线指通过形成酰胺键与-D的氮连接；
-X-是-C(R4R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4R4a)-C(R5R5a)-；-C(R5R5a)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-O-；-O-C(R4R4a)-；或-C(R7R7a)-；
X1是C；或S(O)；
-X2-是-C(R8R8a)-；或-C(R8R8a)-C(R9R9a)-；
＝X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R4、-R4a、-R5、-R5a、-R6、-R8、-R8a、-R9、-R9a独立地选自-H；和C1-6烷基；
-R3、-R3a独立地选自-H；和C1-6烷基，条件是在-R3、-R3a之一或两者不是-H的情况中，它们通过SP3-杂化碳原子与它们所连接的N连接；
-R7是-N(R10R10a)；或-NR10-(C＝O)-R11；
-R7a、-R10、-R10a、-R11相互独立地是-H；或C1-6烷基；
任选地，-R1a/-R4a、-R1a/-R5a、-R1a/-R7a、-R4a/-R5a、-R8a/-R9a对中的一对或多对形成化学键；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R4/-R4a、-R5/-R5a、-R8/-R8a、-R9/-R9a对中的一对或多对连同它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基；或3-至10-元杂环基；
任选地，-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7a、-R4/-R5、-R4/-R6、-R8/-R9、-R2/-R3对中的一对或多对连同它们所连接的原子一起形成环A；
任选地，R3/R3a连同它们所连接的氮原子一起形成3-至10-元杂环；
A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；3-至10-元杂环基；和8-至11-元杂双环基；且
其中-L1-被至少一个-L2-Z取代，和其中-L1-任选被进一步取代，条件是式(II)中标有星号的氢不被-L2-Z或取代基替换。
优选地，式(II)中的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在一个实施方案中，式(II)中的-L1-未被进一步取代。
可以理解，如果式(II)的-R3/-R3a连同它们所连接的氮原子一起形成3-至10-元杂环，则仅可以形成其中直接连接氮的原子是SP3-杂化碳原子的这类3-至10-元杂环。换言之，通过-R3/-R3a连同它们所连接的氮原子形成的这类3-至10-元杂环具有如下结构：
Figure BDA0002700814740000641
其中
虚线指与-L1-的剩余部分连接；
环包含3至10个原子，包括至少一个氮；且
R#和R##表示SP3-杂化碳原子。
还可以理解，3-至10-元杂环可以被进一步取代。
通过式(II)的-R3/-R3a连同它们所连接的氮原子形成的适宜的3-至10-元杂环的示例性实施方案如下：
Figure BDA0002700814740000642
其中
虚线表示与分子的剩余部分连接；和
-R选自-H和C1-6烷基。
式(II)的-L1-可以任选被进一步取代。通常，可以使用任意取代基，只要裂解原则不受影响，即，式(II)中标有星号的氢不被替换，和式(II)的如下部分的氮保持伯胺、仲胺或叔胺的部分，
Figure BDA0002700814740000651
即，-R3和-R3a相互独立地是-H或通过SP3-杂化碳原子连接至-N<。
在一个实施方案中，式(II)的-R1或-R1a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R2或-R2a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R3或-R3a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R4被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R5或-R5a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R6被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R7或-R7a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R8或-R8a被-L2-Z或-L2-Z’取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R9或-R9a被-L2-Z或-L2-Z’取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有如WO2016/020373A1中公开的结构。因此，在一个实施方案中，-L1-部分具有式(III)：
Figure BDA0002700814740000652
其中
虚线指分别通过形成酰胺或酯链接与-D的伯或仲胺或羟基连接；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R3和-R3a相互独立地选自-H、-C(R8R8aR8b)、-C(＝O)R8、-C≡N、-C(＝NR8)R8a、-CR8(＝CR8aR8b)、-C≡CR8和-T；
-R4、-R5和-R5a相互独立地选自-H、-C(R9R9aR9b)和-T；
a1和a2相互独立地是0或1；
-R6、-R6a、-R7、-R7a、-R8、-R8a、-R8b、-R9、-R9a、-R9b各自相互独立地选自-H、卤素、-CN、-COOR10、-OR10、-C(O)R10、-C(O)N(R10R10a)、-S(O)2N(R10R10a)、-S(O)N(R10R10a)、-S(O)2R10、-S(O)R10、-N(R10)S(O)2N(R10aR10b)、-SR10、-N(R10R10a)、-NO2、-OC(O)R10、-N(R10)C(O)R10a、-N(R10)S(O)2R10a、-N(R10)S(O)R10a、-N(R10)C(O)OR10a、-N(R10)C(O)N(R10aR10b)、-OC(O)N(R10R10a)、-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基；其中-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个相同或不同的-R11取代，和其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R12)-、-S(O)2N(R12)-、-S(O)N(R12)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R12)S(O)2N(R12a)-、-S-、-N(R12)-、-OC(OR12)(R12a)-、-N(R12)C(O)N(R12a)-和-OC(O)N(R12)-的基团所间隔；
-R10、-R10a、-R10b各自独立地选自-H、-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基；其中-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个相同或不同的-R11取代，和其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R12)-、-S(O)2N(R12)-、-S(O)N(R12)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R12)S(O)2N(R12a)-、-S-、-N(R12)-、-OC(OR12)(R12a)-、-N(R12)C(O)N(R12a)-和-OC(O)N(R12)-的基团所间隔；
T各自相互独立选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基和8-至11-元杂双环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的-R11取代；
-R11各自相互独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COOR13、-OR13、-C(O)R13、-C(O)N(R13R13a)、-S(O)2N(R13R13a)、-S(O)N(R13R13a)、-S(O)2R13、-S(O)R13、-N(R13)S(O)2N(R13aR13b)、-SR13、-N(R13R13a)、-NO2、-OC(O)R13、-N(R13)C(O)R13a、-N(R13)S(O)2R13a、-N(R13)S(O)R13a、-N(R13)C(O)OR13a、-N(R13)C(O)N(R13aR13b)、-OC(O)N(R13R13a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
-R12、-R12a、-R13、-R13a、-R13b各自独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R3/-R3a、-R6/-R6a、-R7/-R7a对中的一对或多对连同它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基或3-至10-元杂环基；
任选地，-R1/-R2、-R1/-R3、-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7、-R2/-R3、-R2/-R4、-R2/-R5、-R2/-R6、-R2/-R7、-R3/-R4、-R3/-R5、-R3/-R6、-R3/-R7、-R4/-R5、-R4/-R6、-R4/-R7、-R5/-R6、-R5/-R7、-R6/-R7对中的一对或多对连同它们所连接的原子一起形成环A；
A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；3-至10-元杂环基；和8-至11-元杂双环基；
其中-L1-被至少一个-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
式(III)的-L1-的任选的进一步取代基优选如上文所述。
优选地，式(III)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在一个实施方案中，式(III)的-L1-未被进一步取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有如EP1536334B1、WO2009/009712A1、WO2008/034122A1、WO2009/143412A2、WO2011/082368A2和US8618124B2中公开的结构，这些文献通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，-L1-具有如US8946405B2和US8754190B2公开的结构，这些文献通过引用并入本文。因此，在另一个实施方案中，-L1-具有式(IV)：
Figure BDA0002700814740000671
其中
虚线指通过选自-OH、-SH和-NH2的-D的官能团与-D连接；
m是0或1；
-R1和-R2中的至少一个或两个相互独立地选自-CN、-NO2、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的烯基、任选被取代的炔基、-C(O)R3、-S(O)R3、-S(O)2R3和-SR4，
-R1和-R2中的一个且仅一个选自-H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基烷基和任选被取代的杂芳基烷基；
-R3选自-H、任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳基烷基、任选被取代的杂芳基、任选被取代的杂芳基烷基、-OR9和-N(R9)2；
-R4选自任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳基烷基、任选被取代的杂芳基和任选被取代的杂芳基烷基；
-R5各自独立地选自-H、任选被取代的烷基、任选被取代的烯基烷基、任选被取代的炔基烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳基烷基、任选被取代的杂芳基和任选被取代的杂芳基烷基；
-R9选自-H和任选被取代的烷基；
-Y-不存在且-X-是-O-或-S-；或者
-Y-是-N(Q)CH2-且-X-是-O-；
Q选自任选被取代的烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳基烷基、任选被取代的杂芳基和任选被取代的杂芳基烷基；
任选地，-R1和-R2可以一起形成3至8-元环；且
任选地，两个-R9连同它们所连接的氮形成杂环；
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
仅在式(IV)的上下文中，所用术语具有如下含义：
如此处所用的术语“烷基”包括具有1至8个碳或在一些实施方案中具有1至6个或1至4个碳原子的直链、支链或环状饱和烃基团。
术语“烷氧基”包括与氧键合的烷基基团，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基等。
术语“烯基”包括具有碳-碳双键的非芳族不饱和烃。
术语“炔基”包括具有碳-碳三键的非芳族不饱和烃。
术语“芳基”包括具有6至18个碳、优选6至10个碳的芳族烃基团，包括诸如苯基、萘基和蒽基的基团。术语“杂芳基”包括包含3-15个碳的含有至少一个N、O或S原子的芳族环，优选包含3-7个碳的含有至少一个N、O或S原子的芳族环，包括诸如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等的基团。
在一些实例中，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可以通过亚烷基链接连接至分子的剩余部分。在那些情况中，取代基将被称为烯基烷基、炔基烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，表明亚烷基部分在烯基、炔基、芳基或杂芳基部分和所述烯基、炔基、芳基或杂芳基所连接的分子之间。
术语“卤素”包括溴、氟、氯和碘。
术语“杂环”指包含3-7个碳原子和至少一个N、O或S原子的4-8元芳族或非芳族环。实例包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷和四氢呋喃基以及上文对术语“杂芳基”所提供的示例性基团。
当环系是任选取代的时，适宜的取代基选自烷基、烯基、炔基或另外的环，各自任选被进一步取代。任意基团、包括上文任意基团上的任选取代基包括卤素、硝基、氰基、-OR、-SR、-NR2、-OCOR、-NRCOR、-COOR、-CONR2、-SOR、-SO2R、-SONR2、-SO2NR2，其中R各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，或者两个R基团连同它们所连接的原子一起形成环。
优选地，式(IV)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有如WO2013/036857A1中公开的结构，该文献通过引用并入本文。因此，在另一个实施方案中，-L1-具有式(V)：
Figure BDA0002700814740000691
其中
虚线指经由-D的胺官能团与-D连接；
-R1选自任选被取代的C1-C6直链、支链或环状烷基；任选被取代的芳基；任选被取代的杂芳基；烷氧基；和-NR5 2；
-R2选自-H；任选被取代的C1-C6烷基；任选被取代的芳基；和任选被取代的杂芳基；
-R3选自-H；任选被取代的C1-C6烷基；任选被取代的芳基；和任选被取代的杂芳基；
-R4选自-H；任选被取代的C1-C6烷基；任选被取代的芳基；和任选被取代的杂芳基；
-R5各自相互独立地选自-H；任选被取代的C1-C6烷基；任选被取代的芳基；和任选被取代的杂芳基；或当一起时两个-R5可以是环烷基或环杂烷基；
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
仅在式(V)的上下文中，所用术语具有如下含义：
“烷基”、“烯基”和“炔基”包括具有1-8个碳或1-6个碳或1-4个碳的直链、支链或环状烃基团，其中烷基是饱和烃，烯基包括一条或多条碳-碳双键，炔基包括一条或多条碳-碳三键。除非另有说明，否则它们含有1-6个C。
“芳基”包括具有6-18个碳、优选6-10个碳的芳族烃基团，包括诸如苯基、萘基和蒽的基团。“杂芳基”包括包含3-15个碳的含有至少一个N、O或S原子的芳族环，优选3-7个碳的含有至少一个N、O或S原子的芳族环，包括诸如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基(thiszolyl)、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等的基团。
术语“取代”指烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基基团包括一个或多个取代基基团代替一个或多个氢原子。取代基通常可以选自卤素，包括F、Cl、Br和I；低级烷基，包括直链、支链和环状；低级卤代烷基，包括氟烷基、氯烷基、溴烷基和碘烷基；OH；低级烷氧基，包括直链、支链和环状；SH；低级烷基硫基，包括直链、支链和环状；氨基、烷基氨基、二烷基氨基，硅烷基，包括烷基硅烷基、烷氧基硅烷基和芳基硅烷基；硝基；氰基；羰基；羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、氨基羰基；氨基酰基；氨甲酸酯基；脲；硫代氨甲酸酯；硫脲；酮；砜；磺酰胺；芳基，包括苯基、萘基和蒽基；杂芳基，包括5-元杂芳基，包括吡咯、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、噻二唑、三唑、噁二唑和四唑，6-元杂芳基，包括吡啶、嘧啶、吡嗪，和稠合杂芳基，包括苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并咪唑、吲哚、苯并噻唑、苯并异噁唑和苯并异噻唑。
优选地，式(V)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有如US7585837B2中公开的结构，该文献通过引用并入本文。因此，在另一个实施方案中，-L1-具有式(VI)：
Figure BDA0002700814740000701
其中
虚线指经由-D的胺官能团与-D连接；
R1和R2独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤素、硝基、-SO3H、-SO2NHR5、氨基、铵、羧基、PO3H2和OPO3H2；
R3、R4和R5独立地选自氢、烷基和芳基；
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
适于式(VI)的取代基是烷基(例如C1-6烷基)、烯基(例如C2-6烯基)、炔基(例如C2-6炔基)、芳基(例如苯基)、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基(例如芳族4-7元杂环)或卤素部分。
仅在式(VI)的上下文中，所用术语具有如下含义：
术语“烷基”、“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“芳基”、“烷芳基”和“芳烷基”指具有1-8个、优选1-4个碳原子的烷基基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基，和具有6-10个碳原子的芳基基团，例如苯基和萘基。术语“卤素”包括溴、氟、氯和碘。
优选地，式(VI)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有如WO2002/089789A1中公开的结构，该文献通过引用并入本文。因此，在另一个实施方案中，-L1-具有式(VII)：
Figure BDA0002700814740000711
其中
虚线指经由-D的胺官能团与-D连接；
L1是双官能团连接基，
Y1和Y2独立地是O、S或NR7；
R2、R3、R4、R5、R6和R7独立地选自氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6被取代的烷基、C3-8被取代的环烷基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、被取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
Ar是当包括在式(VII)中时形成被多取代的芳族烃或多取代的杂环基团的部分；
X是化学键或被主动转运至靶细胞中的部分、疏水部分或它们的组合，
y是0或1；
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
仅在式(VII)的上下文中，所用术语具有如下含义：
术语“烷基”应理解为包括例如直链、支链、被取代的C1-12烷基、包括烷氧基、C3-8环烷基或被取代的环烷基等。
术语“取代”应理解为包括在官能团或化合物内添加一个或多个原子或用一个或多个不同原子替换一个或多个原子。
被取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；被取代的环烷基包括诸如4-氯环己基的部分；芳基包括诸如萘基的部分；被取代的芳基包括诸如3-溴-苯基的部分；芳烷基包括诸如甲苯基的部分；杂烷基包括诸如乙基噻吩的部分；被取代的杂烷基包括诸如3-甲氧基噻吩的部分；烷氧基包括诸如甲氧基的部分；和苯氧基包括诸如3-硝基苯氧基的部分。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。
优选地，式(VII)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在另一个实施方案中，-L1-包括式(VIII)的亚结构
Figure BDA0002700814740000721
其中
标有星号的虚线指通过形成酰胺键与-D的氮连接；
未标记的虚线指与-L1-的剩余部分连接；和
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
优选地，式(VIII)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在一个实施方案中，式(VIII)的-L1-未被进一步取代。
在另一个实施方案中，-L1-包括式(IX)的亚结构
Figure BDA0002700814740000722
其中
标有星号的虚线指通过形成氨甲酸酯键与-D的氮连接；
未标记的虚线指与-L1-的剩余部分连接；和
其中-L1-被-L2-Z取代和其中-L1-任选被进一步取代。
优选地，式(IX)的-L1-被一个-L2-Z部分取代。
在一个实施方案中，式(IX)的-L1-未被进一步取代。
在一个实施方案中，-L1-具有式(IX-a)：
Figure BDA0002700814740000723
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接和未标记的虚线指与-L2-Z连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1选自＝O和＝S；
-Y2-选自-O-和-S-；
-Y3-选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
＝Y5选自＝O和＝S；
-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-W-选自C1-20烷基，任选被一个或多个选自C3-10环烷基、8-至30-元碳多环基、3-至10-元杂环基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-的基团所间隔；
-Nu是亲核基团，选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure BDA0002700814740000731
-Ar-选自
Figure BDA0002700814740000741
其中
虚线指与-L1-的剩余部分连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，和
-Z2-是-N(R7)-；且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中-L1-任选被进一步取代。
在一个实施方案中，式(IX-a)的-L1-未被进一步取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有式(IX-b)：
Figure BDA0002700814740000742
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接和未标记的虚线指与-L2-Z连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1选自＝O和＝S；
-Y2-选自-O-和-S-；
-Y3-选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
＝Y5选自＝O和＝S；
-R2、-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-W-选自C1-20烷基，任选被一个或多个选自C3-10环烷基、8-至30-元碳多环基、3-至10-元杂环基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-的基团所间隔；
-Nu是亲核基团，选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure BDA0002700814740000751
-Ar-选自
Figure BDA0002700814740000761
其中
虚线指与-L1-的剩余部分连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，和
-Z2-是-N(R7)-；且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中-L1-任选被进一步取代。
在一个实施方案中，式(IX-b)的-L1-未被进一步取代。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的＝Y1是＝O。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y2-是-O-。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y3-是-O-。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y4-是-NR5-。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的＝Y5是＝O。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n是0或1。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n是0。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n是1。
在一些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基和乙基。在一些实施方案中，式(IX-b)的-R2是-H。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基和乙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3是-H。
在优选的实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4选自甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4选自甲基和乙基。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5选自甲基和乙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5是甲基。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基和乙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a均为-H。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的Ar是苯基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的Ar是
Figure BDA0002700814740000771
其中虚线指与式(IX-a)和(IX-b)部分的剩余部分连接。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是C1-20烷基，任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-所间隔。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是C1-10烷基，任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-所间隔。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是C1-6烷基，任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-所间隔。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是
Figure BDA0002700814740000772
其中虚线指分别与式(IX-a)或(IX-b)部分的剩余部分连接。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Nu是-N(R7R7a)。
在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自甲基或乙基。在一些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b均为甲基。
在一些实施方案中，-L1-具有式(IX-c)
Figure BDA0002700814740000781
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接；
未标记的虚线指与-L2-Z连接；且
s1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。
在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是选自1、2、3、4和5的整数。在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是1。在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是2。在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是3。在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是4。在一些实施方案中，式(IX-c)的s1是5。
在一些实施方案中，-L1-具有式(IX-d)
Figure BDA0002700814740000782
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接；和
未标记的虚线指与-L2-Z连接。
-L1-部分可以经由任意类型的链接连接至-D，条件是其是可逆的。优选地，-L1-经由选自酰胺、酯、氨甲酸酯、缩醛、缩醛胺、亚胺、肟、腙、二硫和酰基胍的链接连接至-D。甚至更优选地，-L1-经由选自酰胺、酯、氨甲酸酯和酰基胍的链接连接至-D。可以理解，这些链接可能本身不是可逆的，而是可逆性可以是-L1-中存在的一些原子基团或部分的作用。
在一个实施方案中，-L1-经由酯链接连接至-D。
在另一个实施方案中，-L1-经由氨甲酸酯链接连接至-D。
在另一个实施方案中，-L1-经由酰基胍连接至-D。
在优选的实施方案中，-L1-经由酰胺链接连接至-D。
在一些实施方案中，-L1-经由-D的赖氨酸残基的侧链的胺官能团的氮连接至-D。在一些实施方案中，-L1-经由-D的赖氨酸残基的侧链的胺官能团的氮连接至-D，和在-D和-L1-之间形成的链接是氨甲酸酯。对于这类赖氨酸残基的实施方案如上文所述。
在一个实施方案中，-L2-是化学键。
在另一个实施方案中，-L2-是间隔基部分。
在一些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团所间隔；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-的基团所间隔；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代；
-Ry2各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团所间隔；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基；其中-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-的基团所间隔；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代-；
-Ry2选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自相互独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团所间隔；
-Ry1和-Ry1a独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；
-Ry2各自独立地选自卤素和C1-6烷基；且
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自相互独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在一些实施方案中，-L2-是C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-O-、-T-和-C(O)N(Ry1)-的基团所间隔；和所述C1-20烷基链任选被一个或多个独立地选自-OH、-T和-C(O)N(Ry6Ry6a)的基团取代；其中-Ry1、-Ry6、-Ry6a独立地选自H和C1-4烷基和其中T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基。
在一些实施方案中，-L2-具有14g/mol至750g/mol的分子量。
在一些实施方案中，-L2-包含选自如下的部分
Figure BDA0002700814740000811
Figure BDA0002700814740000821
其中
虚线分别指与-L1-、-L2-的剩余部分或-Z连接；且
-R和-Ra相互独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
在一些实施方案中，-L2-具有式(IX-e)
Figure BDA0002700814740000822
其中
标有星号的虚线指与-L1-连接；
未标记的虚线指与-Z连接；且
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是1。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是2。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是3。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是4。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是5。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是6。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是7。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是8。
在一些实施方案中，-L1-L2-部分具有式(IX-f)
Figure BDA0002700814740000831
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接；
未标记的虚线指与-Z连接；
s1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；且
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
因此，在式(IX-f)化合物中形成的-L1-和-D部分之间的链接是氨甲酸酯。
在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是选自1、2、3、4和5的整数。在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是1。在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是2。在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是3。在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是4。在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是5。
在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是1。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是2。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是3。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是4。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是5。在一些实施方案中，式(IX-e)的s2是6。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是7。在一些实施方案中，式(IX-f)的s2是8。
在一些实施方案中，式(IX-f)的s1是3和式(IX-f)的s2是3。
在一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物具有式(Ia)。在一个实施方案中，x是1。在另一个实施方案中，x是2。在另一个实施方案中，x是3。在另一个实施方案中，x是4。
在另一个实施方案中，本发明的IL-2缀合物具有式(Ib)。在一个实施方案中，y是2。在另一个实施方案中，y是3。在另一个实施方案中，y是4。
本发明的另一方面是包含至少一种本发明的IL-2缀合物和至少一种赋形剂的药物组合物。
优选地，包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物具有pH3至pH8、包括端点的pH。
在一个实施方案中，包含至少一种本发明的IL-2缀合物和至少一种赋形剂的药物组合物是液体制剂。
在另一个实施方案中，包含至少一种本发明的IL-2缀合物和至少一种赋形剂的药物组合物是干制剂。
这类液体或干药物组合物包含至少一种赋形剂。用于胃肠外制剂的赋形剂可以分类为例如缓冲剂、等渗改性剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、增粘剂/粘度增强剂或其它助剂。但是，在一些情况中，一种赋形剂可能具有双重或三重功能。优选地，本发明的药物组合物中所包含的所述至少一种赋形剂选自：
(i)缓冲剂：生理上耐受的缓冲剂以将pH维持在所需范围内，例如磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物、丙酮酸盐；也可以使用抗酸剂，例如Mg(OH)2或ZnCO3；
(ii)等渗改性剂：使由于注射部位的渗透压差导致的细胞损害所产生的疼痛最轻；有效浓度可以通过渗透压法、采用对血清而言285-315mOsmol/kg的假定渗透压来确定；
(iii)防腐剂和/或抗微生物剂：多剂量胃肠外制剂需要添加足够浓度的防腐剂以使患者在注射时被感染的风险最小，已经建立了相应的监管要求；典型的防腐剂包括间甲苯酚、苯酚、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、氯代丁醇、苯甲醇、硝酸苯汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵；
(iv)稳定剂：通过增强蛋白质稳定力、通过使变性状态去稳定或通过使赋形剂与蛋白质直接结合来实现稳定；稳定剂可以是氨基酸，例如丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸，糖，例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖，多元醇，例如甘油、甘露醇、山梨糖醇，盐，例如磷酸钾、硫酸钠，螯合剂，例如EDTA、六磷酸盐，配体，例如二价金属离子(锌、钙等)、其它盐或有机分子，例如酚衍生物；另外，可以使用低聚物或聚合物，例如环糊精、葡聚糖、树枝状聚合物、PEG或PVP或鱼精蛋白或HSA；
(v)抗吸附剂：主要是离子型或非离子型表面活性剂或其它蛋白质或可溶性聚合物用于涂层或竞争性吸附至制剂容器的内表面；例如，泊洛沙姆(普流罗尼克F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酯20和80、葡聚糖、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HSA和明胶；选择的赋形剂浓度和类型取决于将避免的作用，但是通常在刚刚高于CMC值在界面形成单层表面活性剂；
(vi)氧化保护剂：抗氧化剂，例如抗坏血酸、ectoine、蛋氨酸、谷胱甘肽、一硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯和维生素E；也可以使用螯合剂，例如柠檬酸、EDTA、六磷酸盐和巯基乙酸。
(vii)增粘剂或粘度增强剂：延迟小瓶和注射器中颗粒的沉降，用于促进颗粒的混合和重新混悬和用于使混悬液更容易注射(即，对注射器柱塞的作用力小)；适宜的增粘剂或粘度增强剂有例如卡波姆增粘剂，例如卡波姆940、Carbopol Ultrez 10，纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素,HPMC)或二乙基氨基乙基纤维素(DEAE或DEAE-C)，胶体硅酸镁(Veegum)或硅酸钠，羟基磷灰石凝胶，磷酸三钙凝胶，黄原胶，角叉菜胶如Satiagum UTC 30，脂族聚羟酸，例如聚(D,L-或L-乳酸)(PLA)和聚乙醇酸(PGA)和它们的共聚物(PLGA)，D,L-丙交酯、乙交酯和己内酯的三元共聚物，泊洛沙姆，亲水性聚(氧乙烯)嵌段和疏水性聚(氧丙烯)嵌段以构成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如
Figure BDA0002700814740000851
)，聚醚酯共聚物如聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯共聚物，乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)，葡聚糖或其衍生物，葡聚糖与PEG的组合，聚二甲基硅氧烷，胶原，壳聚糖，聚乙烯醇(PVA)和衍生物，聚烷基二酰亚胺，聚(丙烯酰胺-共-二烯丙基二甲基铵(DADMA))，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，糖胺聚糖(GAGs)如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸类肝素、透明质烷，由疏水性A嵌段如聚丙交酯(PLA)或聚(丙交酯-共-乙交酯)和亲水性B嵌段如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮组成的ABA三嵌段或AB嵌段共聚物；这类嵌段共聚物以及上文所述的泊洛沙姆可表现出相反的热胶凝行为(在室温下为流体状态以促进施用，在注射后在体温下高于溶液-凝胶转变温度时为凝胶状态)；
(viii)分散剂或扩散剂：通过间隙内空间的细胞外基质的成分水解而改变结缔组织的通透性，例如但不限于透明质酸，其为一种在结缔组织的细胞间空间发现的多糖；分散剂如但不限于透明质酸酶暂时性地降低细胞外基质的粘度和促进注射药物的扩散；和
(ix)其它助剂：例如润湿剂、粘度调节剂、抗生素、透明质酸酶；酸和碱，例如盐酸和氢氧化钠，是在生产期间调节pH所需要的助剂。
本发明的另一方面是用作药物的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物。
本发明的另一方面是用于治疗可用IL-2治疗的疾病的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物。
优选地，所述疾病是癌症。甚至更优选地，所述疾病选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌症、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓样白血病和白血病。甚至更优选的是选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑素瘤、肾细胞癌、膀胱上皮癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌和肉瘤的疾病。
优选的肉瘤类型包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、胃肠道间质肿瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
在一个实施方案中，用于治疗可用IL-2治疗的疾病的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂；和激动免疫激活受体如41BB(CD137)、OX40、ICOS、CD40、CD28、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、LFA1、CD16、CD64、CD32A和CD3的物质。在一个实施方案中，用于治疗可用IL-2治疗的疾病的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；和Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂。IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物与一种或多种另外的药物的施用可以是单个事件或者可以重复多次。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是帕博利珠单抗(pembrolizumab)。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗(nivolumab)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿妥珠单抗。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗(avelumab)。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹木单抗。在另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是替西木单抗(tremelimumab)。
在另一个实施方案中，IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物在CAR-T疗法之前、与之同时或在其之后施用于患者。与CAR-T疗法组合的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物的施用可以是单个事件或者可以重复多次。
优选地，用于在治疗中使用的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物被施用于哺乳动物患者、优选人类患者。
本发明的另一方面是IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗可用IL-2治疗的疾病。
优选地，所述疾病是癌症。甚至更优选地，所述疾病选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌症、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓样白血病和白血病。甚至更优选的是选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑素瘤、肾细胞癌、膀胱上皮癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌和肉瘤的疾病。
优选的肉瘤类型包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、胃肠道间质肿瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
在一个实施方案中，药剂在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂；和激动免疫激活受体如41BB(CD137)、OX40、ICOS、CD40、CD28、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、LFA1、CD16、CD64、CD32A和CD3的物质。药剂与一种或多种另外的药物的该施用可以是单个事件或者可以重复多次。在一个实施方案中，药剂在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；和Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂。药剂与一种或多种另外的药物的该施用可以是单个事件或者可以重复多次。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是帕博利珠单抗。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿妥珠单抗。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是德瓦鲁单抗。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹木单抗。在另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是替西木单抗。
在另一个实施方案中，药剂在CAR-T疗法之前、与之同时或在其之后施用于患者。与CAR-T疗法组合的药剂的施用可以是单个事件或者可以重复多次。
优选地，药剂施用于哺乳动物患者、更优选人类患者。
本发明的另一方面是在需要该治疗的哺乳动物患者、优选人类患者中治疗、控制、延缓或预防一种或多种可用IL-2治疗的疾病的方法，该方法包括给需要其的所述患者施用治疗有效量的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含本发明的IL-2缀合物的药物组合物。
优选地，所述一种或多种可用IL-2治疗的疾病是癌症。甚至更优选地，所述疾病选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌症、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓样白血病和白血病。甚至更优选的是选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、黑素瘤、肾细胞癌、膀胱上皮癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌和肉瘤的疾病。
优选的肉瘤类型包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、胃肠道间质肿瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。
在一个实施方案中，IL-2缀合物或其可药用盐或者包含本发明的IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂；和激动免疫激活受体如41BB(CD137)、OX40、ICOS、CD40、CD28、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、LFA1、CD16、CD64、CD32A和CD3的物质。IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物与一种或多种另外的药物的施用可以是单个事件或者可以重复多次。在一个实施方案中，IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种另外的药物施用之前、与之同时或在其之后施用于患者，所述一种或多种另外的药物优选选自：PD-1抑制剂；PD-L1抑制剂；CTLA-4抑制剂；癌症疫苗，例如肿瘤细胞疫苗、抗原疫苗、树突细胞疫苗、基于载体的疫苗；和Toll-样受体激动剂(TLR)，包括靶向于TLR2、TLR3、TLR2/4、TLR4、TLR5、TLR7/8和TLR9的激动剂。IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物与一种或多种另外的药物的施用可以是单个事件或者可以重复多次。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是帕博利珠单抗。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂是纳武单抗。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿妥珠单抗。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿维鲁单抗。在另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是德瓦鲁单抗。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹木单抗。在另一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是替西木单抗。
在另一个实施方案中，IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物在CAR-T疗法之前、与之同时或在其之后施用于患者。与CAR-T疗法组合的IL-2缀合物或其可药用盐或者包含至少一种本发明的IL-2缀合物的药物组合物的施用可以是单个事件或者可以重复多次。
本发明的另外方法是施用IL-2缀合物、其可药用盐或本发明的药物组合物的方法，其中该方法包括如下施用IL-2缀合物、其可药用盐或本发明的药物组合物的步骤：经由局部、肠内或胃肠外施用，和通过外部应用、注射或输注的方法，包括关节内、关节周、皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、鞘内、囊内、眶内、玻璃体内、鼓室内、膀胱内、心内、经气管、表皮下、囊下、蛛网膜下、椎内、脑室内、胸骨内注射和输注，经由允许递送本发明等至脑组织或脑液的植入装置而直接递送至脑(例如Ommaya Reservoir)、直接脑室内注射或输注、注射或输注入脑或脑相关区域、注射入脉络膜下空间、眶后注射和眼点滴，优选经由皮下注射。
在一个实施方案中，本发明涉及IL-2缀合物或其可药用盐或本发明的药物组合物，用于经由皮下注射治疗一种或多种可用IL-2治疗的疾病。在另一个实施方案中，本发明涉及IL-2缀合物或其可药用盐或本发明的药物组合物，用于经由皮下注射治疗一种或多种可用IL-2治疗的疾病。
材料
0.7kDa PEG马来酰亚胺(MeO-dPEG(12)-mal,马来酰亚氨基-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)丙酰胺,CAS724722-89-8)获自IrisBiotech GmbH,Marktredwitz,德国。2kDa PEG-马来酰亚胺(Sunbright ME-020-MA,CAS883993-35-9)、5kDa PEG-马来酰亚胺(Sunbright ME-050MA,CAS 883993-35-9)、10kDaPEG-马来酰亚胺(Sunbright ME-100MA,CAS 883993-35-9)和20kDa PEG-马来酰亚胺(Sunbright ME-200MA0B,CAS883993-35-9)获自NOF Europe N.V.,Grobbendonk,比利时。
10kDa PEG胺(Sunbright ME-100EA,CAS 80506-64-5)可获自NOF Europe N.V.,Grobbendonk,比利时。
重组人IL-2(阿地白介素,目录号AF-200-02)获自Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA。
微生物转谷氨酰胺酶(目录号T001)和MTG阻断剂(目录号C102)获自Zedira GmbH,Darmstadt,德国。
10kDa Mal-PEG-NH2(目录号PHB-943)可以例如获自Creative PEGWorks,ChapellHill,NC,USA。
方法
实施例1：IL-2变体的制备
从外部供应商定制和获得IL-2变体(突变蛋白)，其中从E.coli进行蛋白质表达，继之以本领域技术人员已知的标准纯化策略。制备了如下蛋白质：
Figure BDA0002700814740000911
Figure BDA0002700814740000921
实施例2：0.7kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物2的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的约2mL 0.2mg/mL IL-2突变蛋白1a经由离心过滤器浓缩至0.47mL的终体积，浓度为0.85mg/mL，如通过UV(A280)测定。在约pH7.5如下进行缀合。将在50mM乙酸pH3中的0.385mg 1a(0.455mL,0.85mg/mL)与0.36vol.eq.(164μL)的0.5M磷酸钠pH8、16μL 37mM乙酸、132mM磷酸钠pH7和3mol eq.(5μL)的15.1mM马来酰亚氨基-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十七烷-37-基)丙酰胺在水中混合。将溶液小心振摇，于环境温度静置15分钟。经由MS证实1a向各单缀合物的定量转化。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex 200Increase10/300GL(24mL体积)柱从反应混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000922
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。采用离心过滤器将优势含有所述缀合物的一个级分浓缩，最后得到2，为0.45mL蛋白质溶液，其蛋白质含量为0.22mg/mL，纯度大约为79％，如通过SEC所测定。
实施例3：2kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物3的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的约2mL 0.2mg/mL IL-2突变蛋白1a经由离心过滤器浓缩至0.34mL的终体积，浓度为1.16mg/mL，如通过A280测定。在约pH 7如下进行缀合。将在50mM乙酸pH3中的0.38mg 1a(0.33mL,1.16mg/mL)与0.36vol.eq.(118μL)的0.5M磷酸钠pH8和20mol eq.(20μL)的24.8mM 2kDa PEG-Mal在水中混合。将溶液小心振摇，于环境温度孵育15分钟。将0.82mL如WO2014056923第159页实施例29中所述的硫醇官能化水凝胶混悬液(水凝胶含量为21.8mg/mL和硫醇含量为3μmol/mL,就2kDa PEG马来酰亚胺而言相当于5moleq.硫醇)转移至装配有PE烧结漏斗的2mL PP反应器中。将反应混合物转移至反应容器中，于环境温度在轻柔搅拌下孵育30分钟以使过量的PEG-马来酰亚胺与水凝胶结合。排出含有蛋白质的溶液，经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex 75Increase 10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出蛋白质缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000931
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。采用离心过滤器将含有所述缀合物的级分浓缩，得到0.37mL 2kDa PEG IL-2突变蛋白缀合物3，蛋白质浓度为0.27mg/mL，根据SEC的纯度为78％。
实施例4：5kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物4的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的约2mL 0.2mg/mL IL-2突变蛋白1a经由离心过滤器浓缩至0.36mL的终体积，浓度为1.01mg/mL，如通过A280测定。在约pH 7.5如下进行缀合。将在50mM乙酸pH3中的0.35mg蛋白质(0.35mL,1.01mg/mL)与0.36vol.eq.(125μL)的0.5M磷酸钠pH 8和3mol eq.(9.8μL,活性校正)的7.49mM 5kDa PEG-马来酰亚胺在水中混合。将溶液小心振摇，于环境温度孵育15分钟。为了淬灭过量的PEG-马来酰亚胺，向缀合混合物中加入相对于1a(10μL)而言6mol eq.的13.8mM L-半胱氨酸水溶液。将溶液小心振摇，于环境温度孵育2.5小时。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex75Increase 10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000932
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH7.4，流速为0.75mL/min。汇集优势含有缀合物的级分，采用离心过滤器进行浓缩，得到0.42mL 5kDa PEG IL-2突变蛋白缀合物4，蛋白质浓度为0.30mg/mL。经由SEC和RP-HPLC分析所分离的缀合物。通过纯化步骤不能获得杂质的定量排出，如RP-HPLC所显示。在215nm根据SEC分析，缀合物4的近似纯度测定为68％。
实施例5：10kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物5的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的约2mL 0.2mg/mL IL-2突变蛋白1a经由离心过滤器浓缩至0.35mL的终体积，浓度为1.03mg/mL，如通过A280测定。在约pH 7.5如下进行缀合。将在50mM乙酸pH3中的0.34mg蛋白质(0.33mL,1.03mg/mL)与0.36vol.eq.(120μL)的0.5M磷酸钠pH 8和3mol eq.(5μL)的13.54mM 10kDa PEG-马来酰亚胺在水中混合。将溶液小心振摇，于环境温度孵育15分钟。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex200Increase10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000941
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。汇集优势含有缀合物的级分，采用离心过滤器进行浓缩，得到0.55mL 10kDa PEG IL-2突变蛋白缀合物5，蛋白质浓度为0.22mg/mL。经由SEC和RP-HPLC分析所分离的缀合物。通过纯化步骤不能获得杂质的定量排出。在215nm根据SEC分析，缀合物5的近似纯度测定为57％，主要杂质是过量的PEG-Mal。
实施例6：20kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物6的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的约2mL 0.2mg/mL IL-2突变蛋白1a经由离心过滤器浓缩至0.33mL的终体积，浓度为1.11mg/mL，如通过A280测定。在约pH 7.5如下进行缀合。将在50mM乙酸pH3中的0.35mg蛋白质(0.32mL,1.11mg/mL)与0.36vol.eq.(115μL)的0.5M磷酸钠pH 8、6μL 37mM乙酸、132mM磷酸钠pH 7和3mol eq.(10μL)的6.96mM 20kDa PEG-马来酰亚胺在水中混合。将溶液小心振摇，于环境温度孵育15分钟。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex 200Increase 10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000942
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH7.4，流速为0.75mL/min。汇集优势含有缀合物的级分，采用离心过滤器进行浓缩，得到0.67mL 20kDa PEG IL-2突变蛋白缀合物6，蛋白质浓度为0.18mg/mL。经由SEC和RP-HPLC分析所分离的缀合物。通过纯化步骤不能获得杂质的定量排出。在215nm根据RP-HPLC分析，缀合物6的近似纯度测定为44％，主要杂质是过量的PEG-Mal。
实施例7：5kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物7的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的1.1mL 0.66mg/mL IL-2突变蛋白1c与0.15vol.eq.(165μL)0.5M磷酸钠pH 8和141μL 0.6M盐酸羟胺、0.5M磷酸钠pH 6.4混合。将所得反应混合物于25℃孵育过夜。采用离心过滤器将溶液浓缩，得到0.67mL的终体积，浓度为0.99mg/mL，如通过A280测定。如下进行缀合。将在58mM磷酸钠、约57mM盐酸羟胺、39mM乙酸pH 6.5中的0.65mg蛋白质(0.66mL,0.99mg/mL)与6mol eq.(320μL)81mM 5kDa PEG-马来酰亚胺在水中混合。将所得反应混合物于环境温度孵育2.25小时。随后，采用离心过滤器将缓冲液交换为37mM乙酸、132mM磷酸盐pH 7，得到0.75mL的终体积。向反应溶液中加入1.5mol eq.(80μL)81mM 5kDa PEG-马来酰亚胺水溶液，然后3.5小时后加入3mol eq.(160μL)81mM 5kDa PEG-马来酰亚胺水溶液。将所得反应混合物于环境温度孵育过夜。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex 75Increase 10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000951
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。将所收集的含缀合物的级分采用离心过滤器进行浓缩，得到0.45mL 5kDa PEG IL-2突变蛋白7，为0.25mg/mL。经由SEC和RP-HPLC分析所分离的缀合物。通过纯化步骤不能获得杂质的排出，导致它们存在于缀合物样品中，缀合物7的近似纯度根据SEC为60％。
实施例8：10kDa PEG-IL-2突变蛋白缀合物8的制备
将在50mM乙酸pH3中配制的1.1mL 0.66mg/mL IL-2突变蛋白1c与0.15vol.eq.(165μL)0.5M磷酸钠pH 8和141μL 0.5M盐酸羟胺、0.5M磷酸钠pH 7混合。将所得反应混合物于25℃孵育过夜。采用离心过滤器将溶液浓缩，得到0.48mL的终体积，浓度为1.42mg/mL，如通过A280测定。如下进行缀合。将在64mM磷酸钠、50mM盐酸羟胺、39mM乙酸pH 6.5-7.0中的0.678mg蛋白质(0.48mL,1.42mg/mL)与3mol eq.(18μL)7.42mM 10kDa PEG10-马来酰亚胺在水中混合。将所得反应混合物小心振摇，于环境温度孵育15分钟。向缀合混合物中添加另外的3mol eq.(17.9μL)7.42mM PEG-马来酰亚胺水溶液，然后于环境温度孵育15分钟。经由尺寸排阻色谱法(SEC)采用GE Healthcare Superdex 200Increase10/300GL(24mL体积)柱从缀合混合物中分离出缀合物，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000952
系统，流动相为10mM HEPES、150mM氯化钠、0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。通过RP-HPLC分析所收集的级分，汇集含缀合物的级分，采用离心过滤器进行浓缩，得到0.57mL 10kDa PEG IL-2突变蛋白8，为0.50mg/mL。经由SEC和RP-HPLC分析所分离的缀合物。通过纯化步骤不能实现从原料中定量排出杂质，导致它们存在于缀合物样品中，如RP-HPLC所示。缀合物8的近似纯度根据在280nm处RP-HPLC测定为25％，主要杂质是过量的PEG-Mal。
实施例9：PEG IL-2突变蛋白缀合物的SPR分析
采用表面等离振子共振(SPR)光谱法、用Biacore仪器(T200,GE Healthcare)、用固定的IL-2受体亚基细胞外结构域评估了阿地白介素和偏倚IL-2化合物的结合动力学。简言之，用N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照供应商的指示活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,GE Healthcare)。还按照供应商的指示进行单克隆鼠抗人IgG(Fc)抗体的固定(GE Healthcare,指令号BR-1008-39)。
对于测定至IL-2Rα的结合动力学，使用如下的芯片制备：将人IL-2受体α,Fc-Tag(Symansis,新西兰)稀释于HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Surfactant P20,pH 7.4)中至约0.67μg/mL，在10μL/min流速固定60s，获得80-100个响应单位(RU)。
对于测定至IL-2Rβ的结合动力学，使用如下的芯片制备：将人IL-2受体β,Fc-Tag(Symansis,新西兰)稀释于HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Surfactant P20,pH 7.4)中至约0.80μg/mL，在10μL/min流速固定60s，获得140-180个响应单位(RU)。
对于测定至IL-2Rαβ复合物的结合动力学，使用如下的芯片制备：将人IL-2受体α,Fc-Tag(Symansis,新西兰)和人IL-2受体β,Fc-Tag(Symansis,新西兰)混合，稀释于HBS-EP运行缓冲液(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Surfactant P20,pH 7.4)中至各自约1.33μg/mL，在10μL/min流速固定60s，获得360-440个响应单位(RU)。
对于所有三种受体亚基设置上的动力学测定，以多循环动力学分析了阿地白介素或偏倚IL-2化合物，因此以至少五个不同的在HBS-EP运行缓冲液中的浓度于25℃进样(30μL/min流速,120秒接触时间,600秒解离时间)。双参考数据(从参考流细胞和仅缓冲液样品中减去数据)如果可能的话经由1:1结合模型或经由稳态分析进行动力学分析(BiacoreT200 Evaluation Software,3.1版)以测定KD和如果可能的话ka和kd。采用流速为30μL/min的3M MgCl2达30秒进行每个循环后的重生。
所得数据概括在表1中。
表1：与IL-2受体亚基的SPR结合数据概述
Figure BDA0002700814740000971
实施例10：偏倚比例的计算
如本文所用的术语“偏倚IL-2”指其中所述偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD比所述偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD的比例大于阿地白介素对IL-2Rαβ的KD比阿地白介素对IL-2Rβ的KD的比例的经修饰IL-2。这通过下式描述：
Figure BDA0002700814740000972
其中
Figure BDA0002700814740000973
Figure BDA0002700814740000974
其中
“KD偏倚IL-2对IL-2Rαβ”是偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD，
“KD偏倚IL-2对IL-2Rαβ”是偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD，
“KD阿地白介素对IL-2Rαβ”是阿地白介素对IL-2Rαβ的KD，和
“KD阿地白介素对IL-2Rβ”是阿地白介素对IL-2Rβ的KD。
采用上述公式计算了以下比例，概括在表2中。
表2：对于不同IL-2突变蛋白缀合物的比例偏倚IL-2/比例阿地白介素
化合物 比例<sub>偏倚IL-2</sub>/比例<sub>阿地白介素</sub>
6 >100
5 >120
4 >140
3 >340
8 n.d.
7 >140
实施例11：10kDa PEG-IL-2缀合物9的制备
采用连接至
Figure BDA0002700814740000981
系统的HiTrap脱盐柱将重组人IL-2进行缓冲液交换至0.2MTris/HCl,pH 7.5中。之后，基于Sato等人,Bioconjugate Chem 2001,12(5),701-710，采用微生物转谷氨酰胺酶(MTG)使IL-2进行酶促PEG化。将5μM浓度的IL-2于25℃在1.25mM浓度的10kDa PEG胺(10kDa甲氧基-PEG-(CH2)2-NH2)和0.2个单位/mL浓度的MTG的存在下在0.2MTris/HCl,pH7.5中孵育12小时。通过尺寸排阻色谱法、采用GE Healthcare Superdex200Increase 10/300GL柱从反应混合物中纯化出10kDa PEG IL-2缀合物(9)，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000982
系统，流动相为10mM HEPES,150mM氯化钠,0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。
实施例12：10kDa PEG-IL-2缀合物10的制备
将重组人IL-2(2.7mg/mL,在50mM乙酸中,pH3.0)与一个体积当量的140mM HEPES,300mM NaCl,6mM EDTA钠,0.1％Tween 20,pH 8.2混合，产生在70mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA钠,0.05％Tween 20,25mm AcOH,pH7.4中的1.35mg/mL IL-2。采用微生物转谷氨酰胺酶(MTG)使IL-2进行酶促PEG化。为此目的，将0.1mg/mL浓度的IL-2于37℃在70mMHEPES,150mM NaCl,3mM EDTA钠,0.05％Tween 20,25mm AcOH,pH7.4中、在1mM 10kDa PEG胺(10kDa甲氧基-PEG-(CH2)2-NH2)和1U/mL MTG的存在下孵育4小时。之后，加入MTG阻滞剂至0.5mM终浓度，将反应混合物孵育另外30分钟。通过尺寸排阻色谱法、采用GE HealthcareSuperdex 200Increase 10/300GL柱从反应混合物中纯化出10kDa PEG IL-2缀合物(10)，所述柱子连接至
Figure BDA0002700814740000983
系统，流动相为10mM HEPES,150mM氯化钠,0.05％Tween 20,pH 7.4，流速为0.75mL/min。
实施例13：偏倚IL-2突变蛋白聚合物前药11的制备
将PEG IL-2突变蛋白进行缓冲液交换至100mM硼酸钠pH9中，浓缩至约2.5mg/mLIL-2eq的浓度。将相对于IL-2突变蛋白的量5倍摩尔过量的40kDa mPEG-连接基试剂(如在专利WO 2016079114实施例2中所述)溶于与将用于缀合反应的蛋白质溶液相比等体积的水中。将蛋白质溶液(2.5mg/mL IL-2eq.)和40kDa mPEG-连接基溶液(32g/L)混合，于14-16℃孵育2小时。通过CIEX分离偏倚IL-2突变蛋白聚合物前药11，经由SEC进行分析。
实施例14：新缀合物12的制备
将40kDa mPEG-连接基试剂(如专利WO 2016079114实施例2中所述)溶于水中，产生32g/L溶液。将10kDa Mal-PEG-NH2溶于0.1M磷酸钠,6mM EDTA钠,pH 7.4中至1mM的终浓度。将两种溶液以1:1的体积比混合，于环境温度孵育2小时。之后，向反应混合物中添加0.5体积当量(就40kDa mPEG-连接基试剂和10kDa Mal-PEG-NH2的反应混合物的体积而言)的IL-2突变蛋白1a在50mM磷酸钠,3mM EDTA钠,pH 7.4中的2mg/mL浓度的溶液，于环境温度孵育1小时。通过阳离子交换色谱法从反应混合物中分离出40+10kDa PEG IL-2突变蛋白缀合物12，通过尺寸排阻色谱法进行分析。
缩略语
A280 在280nm波长处的吸收
AcOH 乙酸
CIEX 阳离子交换
E.coli 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
EDC N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐
EDTA 乙二胺四乙酸
eq. 当量
HBS-EP 10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Surfactant P20,pH 7.4
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
IL-2 白介素-2
IL-2R 白介素-2受体
Mal 马来酰亚胺
mol.eq. 分子当量
mPEG 甲氧基PEG
MS 质谱法
MTG 微生物转谷氨酰胺酶
NaCl 氯化钠
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
PEG 聚乙二醇
PTFE 聚四氟乙烯
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻
RP-HPLC 反相高效液相色谱法
SEC 尺寸排阻色谱法
SPR 表面等离振子共振
Tween 20 聚乙二醇山梨坦单月桂酸酯
Figure IDA0002700814840000011
Figure IDA0002700814840000021
Figure IDA0002700814840000031
Figure IDA0002700814840000041
Figure IDA0002700814840000051
Figure IDA0002700814840000061

Claims (33)

1.式(Ia)或(Ib)的IL-2缀合物或其可药用盐，
Figure FDA0002700814730000011
其中
-D是偏倚IL-2部分，所述偏倚IL-2部分包含IL-2部分，和对于所述偏倚IL-2部分而言，所述偏倚IL-2对IL-2Rαβ的KD比所述偏倚IL-2对IL-2Rβ的KD的比例高于阿地白介素对IL-2Rαβ的KD比阿地白介素对IL-2Rβ的KD的比例；
-L1-是共价和可逆连接至-D的连接基部分；
-L2-是化学键或者是间隔基部分；
-Z是聚合部分或被取代的脂肪酸部分；
x是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的整数；且
y是选自2、3、4和5的整数。
2.权利要求1的IL-2缀合物或其可药用盐，其中所述偏倚IL-2部分-D是包含如下的IL-2部分：
(a)至少一个修饰部分Mmod的稳定连接，其可以相同或不同；或
(b)至少一个氨基酸突变；或
(c)至少一个缺失；或
(a)、(b)和(c)的任意组合。
3.权利要求1或2的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2部分在基于SEQ ID NO:2的位置K34、R37、M38、T40、F41、K42、F43、Y44、E61或L71处包含至少一个氨基酸突变。
4.权利要求1-3任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2部分包含至少一个选自基于SEQ ID NO:2的K34C、R37C、M38C、T40C、F41C、K42C、F43C、Y44C、E61C和L71C的氨基酸突变。
5.权利要求1-4任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2部分具有SEQ ID NO:2的序列和包含R37C突变。
6.权利要求1-5任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2部分包含至少一个修饰部分Mmod的稳定连接和至少一个氨基酸突变的组合。
7.权利要求2-6任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中Mmod部分连接至半胱氨酸。
8.权利要求2-7任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2部分具有SEQ ID NO:2的序列和包含R37C突变，和其中Mmod部分缀合至位置R37C处的半胱氨酸的硫。
9.权利要求1-8任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中IL-2缀合物具有式(Ia)，其中x为1。
10.权利要求2-9任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中Mmod是聚合部分。
11.权利要求2-10任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中Mmod具有式(A-1)
Figure FDA0002700814730000021
其中
-FG-是链接；
-SP-是间隔基部分；且
-POL是聚合物。
12.权利要求2-11任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中Mmod具有式(A-1a)
Figure FDA0002700814730000031
其中
标有星号的虚线指与IL-2部分的氨基酸残基的侧链的硫连接；
b1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；
b2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数；且
b3是12-22700的整数。
13.权利要求1-12任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-Z是聚合部分。
14.权利要求1-13任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-Z包含式(A)的部分
Figure FDA0002700814730000032
其中
-BP1<、-BP2<、-BP3<相互独立地选自-N<和-C(R8)<；
R8选自H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是基于PEG的链，其包含至少40％的PEG和具有3至40kDa的分子量；
-C1-、-C2-相互独立地选自C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R9取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)-的基团所间隔；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的R9取代；
R9各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11a、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
R10、R10a、R11、R11a和R11b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
15.权利要求14的IL-2缀合物或其可药用盐，其中式(A)的C1和C2具有式(A-a)
Figure FDA0002700814730000041
其中
标有星号的虚线指与BP1连接；
未标记的虚线指分别与BP2或BP3连接；
q1选自1、2、3、4、5、6、7和8；
q2选自1、2、3、4和5；
q3选自1、2、3、4、5、6、7和8；且
q4选自1、2和3。
16.权利要求14或15的IL-2缀合物或其可药用盐，其中式(A)的P1、P2、P3和P4各自独立地是式(A-b)
Figure FDA0002700814730000042
其中
虚线指与-Z的剩余部分连接；
m是0或1；
p是70至900的整数；且
q选自1、2、3、4、5和6。
17.权利要求14-16任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中式(A)的BP1是-N<。
18.权利要求14-17任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中式(A)的BP2和BP2均为-CH<。
19.权利要求1-18任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-Z包含式(A-c)的部分：
Figure FDA0002700814730000051
其中
p1、p2、p3、p4各自独立地是70至900的整数。
20.权利要求1-19任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L1-连接至IL-2部分的氨基酸残基。
21.权利要求1-20任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L1-连接至IL-2部分的氨基酸残基，所述氨基酸残基选自半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸。
22.权利要求1-21任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中L1-连接至选自基于SEQ IDNO:2的K7、K8、K31、K34、K42、K47、K48、K53、K63、K75和K96的赖氨酸残基。
23.权利要求1-22任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L1-具有式(IX-a)：
Figure FDA0002700814730000061
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接，未标记的虚线指与-L2-Z连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1选自＝O和＝S；
-Y2-选自-O-和-S-；
-Y3-、-Y5-相互独立地选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基；
-W-选自任选被一个或多个选自C3-10环烷基、8-至30-元碳多环基、3-至10-元杂环基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-的基团所间隔的C1-20烷基；
-Nu是亲核基团，选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure FDA0002700814730000071
-Ar-选自
Figure FDA0002700814730000072
其中
虚线指与-L1-的剩余部分连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，且
-Z2-是-N(R7)-；且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中-L1-任选被进一步取代。
24.权利要求1-23任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L1-具有式(IX-c)
Figure FDA0002700814730000081
其中
标有星号的虚线指与-D的氮连接；未标记的虚线指与-L2-Z连接；且
s1是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数。
25.权利要求1-24任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团所间隔；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，和其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自如下的基团所间隔：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-；
T各自独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基；其中T各自独立地任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代；
-Ry2各自独立地选自卤素、-CN、氧代基(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；且
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
26.权利要求1-25任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L2-是C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-O-、-T-和-C(O)N(Ry1)-的基团所间隔；和所述C1-20烷基链任选被一个或多个独立地选自-OH、-T和-C(O)N(Ry6Ry6a)的基团所取代；其中-Ry1、-Ry6、-Ry6a独立地选自H和C1-4烷基和其中T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3-至10-元杂环基、8-至11-元杂双环基、8-至30-元碳多环基和8-至30-元杂多环基。
27.权利要求1-26任一项的IL-2缀合物或其可药用盐，其中-L2-具有式(IX-e)
Figure FDA0002700814730000091
其中
标有星号的虚线指与-L1-连接；
未标记的虚线指与-Z连接；且
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
28.药物组合物，其包含至少一种权利要求1-27任一项的IL-2缀合物或其可药用盐和至少一种赋形剂。
29.用作药剂的权利要求1-27任一项的IL-2缀合物或其可药用盐或权利要求28的药物组合物。
30.用于治疗可用IL-2治疗的疾病的权利要求1-27任一项的IL-2缀合物或其可药用盐或权利要求28的药物组合物。
31.权利要求30的用于所述用途的IL-2缀合物或其可药用盐或药物组合物，其中可用IL-2治疗的疾病选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌症、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓样白血病和白血病。
32.在需要治疗的哺乳动物患者、优选人类患者中治疗、控制、延缓或预防一种或多种可用IL-2治疗的疾病的方法，该方法包括给需要其的所述患者施用治疗有效量的权利要求1-27任一项的IL-2缀合物或其可药用盐或权利要求28的药物组合物。
33.权利要求32的方法，其中所述疾病选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌症、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、膀胱上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓样白血病和白血病。
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