TW202402308A - 玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法 - Google Patents

玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202402308A
TW202402308A TW112120351A TW112120351A TW202402308A TW 202402308 A TW202402308 A TW 202402308A TW 112120351 A TW112120351 A TW 112120351A TW 112120351 A TW112120351 A TW 112120351A TW 202402308 A TW202402308 A TW 202402308A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
hyaluronic acid
acid derivative
group
peptide
mentioned
Prior art date
Application number
TW112120351A
Other languages
English (en)
Inventor
藪内昂平
中井貴士
百瀬文康
珠玖洋
Original Assignee
日商旭化成股份有限公司
國立大學法人三重大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商旭化成股份有限公司, 國立大學法人三重大學 filed Critical 日商旭化成股份有限公司
Publication of TW202402308A publication Critical patent/TW202402308A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本發明之導入有固醇基之玻尿酸衍生物根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之面積A1與A2之比A1/A2為0.90以上。 將由自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點(Kb)向基準線(B)所作之垂線與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點(Ub)至上述玻尿酸衍生物之層析圖之終點為止之曲線、自上述折射率強度極大點(Kb)向上述基準線(B)所作之垂線、及基準線(B)所包圍之面積值設為A2，將由上述玻尿酸衍生物之層析圖之起點至上述交點(Ub)為止之曲線、自上述折射率強度極大點(Kb)向上述基準線(B)所作之垂線、及基準線(B)所包圍之面積值設為A1。

Description

玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法
本發明係關於一種玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法。 本案基於2022年5月31日於日本提出申請之特願2022-088995號主張優先權，並將其內容引用至此。
近年來，以蛋白質或肽、核酸作為活性成分之醫藥品即生物醫藥品正被實用化，其數量逐年持續增長。生物醫藥品能夠滿足利用先前之低分子醫藥無法滿足之未滿足醫療需求。然而，存在如下課題：難以自消化道或黏膜等吸收，並且在體內不穩定，血中半衰期較短。因此，生物醫藥品需要藉由注射而多次投予，對於患者與醫療相關人員而言負擔均較大。因此，業界謀求一種能夠於不損及藥理活性之情況下將生物醫藥品膠囊化而於生物體內緩慢釋放有效成分之藥物基材(緩釋性藥物遞送系統基材)。
於此種背景下，於專利文獻1中提出有一種安全性優異之包含玻尿酸衍生物之緩釋性藥物遞送系統基材。該玻尿酸衍生物於水溶液中自發地締合，能夠將藥物、尤其是生物醫藥品於維持其生物活性之狀態下效率良好地封入，於生理鹽水濃度下凝集(或亦於生理鹽水濃度下分散)，並且血中滯留性良好。該玻尿酸衍生物尤其是於使用生物醫藥品作為有效成分之情形時，可用作能夠於維持藥理活性之狀態下將較多藥物效率良好地封入之載體、及血中滯留性優異之血中緩釋載體以及靶向載體，亦可成為能夠持續地緩釋藥物之局部(例如皮下等)緩釋載體。
又，亦報告有使用上述玻尿酸衍生物作為載體之癌疫苗(例如參照專利文獻2等)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2010/053140號 [專利文獻2]國際公開第2020/158771號
[發明所欲解決之問題]
然而，專利文獻2等中所使用之玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈較廣，且不均，對於玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈與向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性或該免疫細胞之活化能力之關聯性未進行具體研究，尚有改良之餘地。
本發明係鑒於上述情況而完成，提供一種與藥效成分製劑化時向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異之玻尿酸衍生物、及使用上述玻尿酸衍生物之醫藥組合物及其製造方法。 [解決問題之技術手段]
即，本發明包括以下態樣。 (1)一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之面積A1與A2之比A1/A2為0.90以上。 (i)將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線、與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點設為Ub； (ii)將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由上述Ub至終點之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A2，將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由起點至上述Ub之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A1。 (2)如(1)所記載之玻尿酸衍生物，其中根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之距離Da與Db之比Da/Db超過0.00且為1.20以下。 (i)自作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之層析圖上的折射率強度極大點Ka向基準線B作垂線，將與基準線之交點設為Ba，將上述折射率強度極大點Ka與上述Ba之間之長度設為La； (ii)將折射率強度成為La/20之層析圖上之2點中溶出時間較早者設為點R1，將溶出時間較晚者設為點S1； (iv)將連結上述點R1與上述點S1之直線D1與自上述折射率強度極大點Ka向基準線B所作之垂線之交點設為Ta，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述直線D1之交點設為Tb； (v)將上述點R1與上述Ta之距離設為Da，將上述Ta與上述Tb之距離設為Db。 (3)如(1)或(2)所記載之玻尿酸衍生物，其中上述面積A1與A2之比A1/A2為1.70以上。 (4)一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖所算出之玻尿酸衍生物之折射率強度極大點下之保持時間Pt相對於作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的折射率強度極大點下之保持時間Pr之比Pt/Pr為0.5以上且未達1.0。 (5)一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，基於以各分子量為2 kDa、4 kDa、8 kDa、18 kDa、40 kDa、及150 kDa之聚丙烯酸作為標準物質所製作之校準曲線所算出之玻尿酸衍生物之重量平均分子量為11萬以上且未達50萬。 (6)如(1)至(5)中任一項所記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物具有1個以上下述通式(I)所表示之重複單元。
[化1]
(式中，R 1、R 2、R 3、及R 4分別獨立地選自由氫原子、C 1-6烷基、甲醯基及C 1-6烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意胺基酸殘基之肽連接子； X 1為選自由以下之式所表示之基所組成之群中之基： -NR b-R、 -NR b-COO-R、 -NR b-CO-R、 -NR b-CO-NR c-R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Y a-S-R、 -O-CO-Y b-S-R、 -NR b-CO-Y b-S-R、及 -S-S-R； R a、R b及R c分別獨立地選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，此處該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NR f-所組成之群中之基； R f選自由氫原子、C 1-12烷基、胺基C 2-12烷基及羥基C 2-12烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為固醇基； Y為C 2-30伸烷基、或-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-，此處，該伸烷基可插入選自由-O-、-NR g-及-S-S-所組成之群中之基； R g選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Y a為C 1-5伸烷基； Y b為C 2-8伸烷基或C 2-8伸烯基； m為1以上100以下之整數)。
(7)如(1)至(6)中任一項所記載之玻尿酸衍生物，其中上述固醇基為膽固醇基。 (8)如(1)至(7)中任一項所記載之玻尿酸衍生物，其中相對於構成上述玻尿酸衍生物之二糖之重複單元的，固醇基之導入率為30%以上60%以下。 (9)如(1)至(8)中任一項所記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為4,000以上1,000,000以下。 (10)如(9)所記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為5000以上25,000以下。 (11)一種醫藥組合物，其含有如(1)至(10)中任一項所記載之玻尿酸衍生物、及藥效成分。 (12)如(11)所記載之醫藥組合物，其用於預防或治療選自由癌症、感染症、及免疫疾病所組成之群中之1種以上疾病。 (13)如(11)或(12)所記載之醫藥組合物，其含有選自由癌抗原、源自感染症之抗原、及免疫疾病中之自體抗原所組成之群中之至少一者作為上述藥效成分，且進而含有佐劑。 (14)如(11)至(13)中任一項所記載之醫藥組合物，其含有癌抗原或源自感染症之抗原作為上述藥效成分，且進而含有佐劑。 (15)一種醫藥組合物之製造方法，該醫藥組合物含有如(1)至(10)中任一項所記載之玻尿酸衍生物、及藥效成分，該醫藥組合物之製造方法包括： 製備步驟，將上述藥效成分溶解於有機溶劑或含有有機溶劑之水中，而製備含有上述藥效成分之油相；及 混合步驟，以上述油相與含有上述玻尿酸衍生物之水相之混合比以體積比計成為20：100～0.01：100之方式進行混合。 (16)如(15)所記載之醫藥組合物之製造方法，其中含有上述玻尿酸衍生物之水相之pH值為6.00以上11.00以下。 [發明之效果]
根據上述態樣之玻尿酸衍生物，能夠提供一種與藥效成分製劑化時向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異之玻尿酸衍生物。上述態樣之醫藥組合物含有上述玻尿酸衍生物，向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異。上述態樣之醫藥組合物之製造方法使用上述玻尿酸衍生物，可獲得向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異之醫藥組合物。
以下，對本發明之實施方式(以下稱為「本實施方式」)進行詳細說明，但本發明並不限定於此，可於不脫離其要旨之範圍內進行各種變形。
以下，對本說明書中所使用之用語進行說明。
本說明書中所使用之用語「C 1-20烷基」意指碳數1以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如包括：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基等「C 1-4烷基」，進而包括：正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、2-乙基丁基等。C 1-20烷基亦包括碳數為1以上12以下之C 1-12烷基、碳數為1以上6以下之C 1-6烷基。
本說明書中所使用之用語「C 1-6烷基羰基」意指烷基部分為已提及之C 1-6烷基之烷基羰基，例如包括：乙醯基、丙醯基、正丙基羰基、異丙基羰基、正丁基羰基、第二丁基羰基、異丁基羰基、第三丁基羰基等「C 1-4烷基羰基」。
本說明書中所使用之用語「胺基C 2-20烷基」意指具有胺基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如胺基可位於烷基之末端之碳原子上。胺基C 2-20烷基亦包括碳數為2以上12以下之胺基C 2-12烷基。
本說明書中所使用之用語「羥基C 2-20烷基」意指具有羥基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如羥基可位於烷基之末端之碳原子上。羥基C 2-20烷基亦包括碳數為2以上12以下之羥基C 2-12烷基。
本說明書中所使用之用語「C 2-30伸烷基」意指碳數2以上30以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如包括：伸乙基、伸丙基等，包括碳數為2以上20以下之C 2-20伸烷基、碳數為2以上8以下之C 2-8伸烷基、基「-(CH 2) n-」(此處，n為2以上30以下，較佳為2以上20以下，更佳為2以上15以下)。
本說明書中所使用之用語「C 1-5伸烷基」意指碳數1以上5以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如包括：亞甲基、伸乙基、伸丙基等。
本說明書中所提及之用語「C 2-8伸烯基」意指碳數2以上8以下之直鏈狀或支鏈狀之含有1個以上雙鍵之二價飽和烴基，例如包括：-CH=CH-、-C(CH 3)=CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基、辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。於存在幾何異構性之情形時，亦包括各自之異構物及該等之混合物。
≪玻尿酸衍生物≫ 本發明之第一實施方式之玻尿酸衍生物係被導入有固醇基者，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之圖1所示之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之面積A1與A2之比A1/A2為0.90以上。 (i)將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點設為Ub，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線之交點設為Bb； (ii)將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由上述Ub至終點之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A2，將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由起點至上述Ub之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A1。
進而，本實施方式之玻尿酸衍生物較佳為根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之圖2所示之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之距離Da與Db之比Da/Db超過0.00且為1.20以下。 (i)自作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之層析圖上的折射率強度極大點Ka向基準線B作垂線，將與基準線之交點設為Ba，將上述折射率強度極大點Ka與上述Ba之間之長度設為La； (ii)將折射率強度成為La/20之層析圖上之2點中溶出時間較早者設為點R1，將溶出時間較晚者設為點S1； (iii)將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線之交點設為Bb； (iv)將連結上述點R1與上述點S1之直線D1與自上述折射率強度極大點Ka向基準線B所作之垂線之交點設為Ta，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述直線D1之交點設為Tb； (v)將上述點R1與上述Ta之距離設為Da，將上述Ta與上述Tb之距離設為Db。 於(ii)中，於折射率強度成為La/20之層析圖上之點存在3點以上之情形時，將最靠近起點之交點設為R1，將最靠近終點之交點設為S1。
本實施方式之玻尿酸衍生物與先前之玻尿酸衍生物不同，於粒子尺寸分佈中，包含相對較多之特定之粒子尺寸之玻尿酸衍生物，將粒子尺寸分佈控制為較陡峭。發明者等人發現，藉由將該粒子尺寸分佈經控制之玻尿酸衍生物與藥效成分製劑化，而如下文所述之實施例所示般，與粒子尺寸分佈未經控制之玻尿酸衍生物、或自先前起作為載體所使用之膽固醇化聚三葡萄糖(CHP)相比，向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力顯著優異，從而完成本發明。
作為此處提及之免疫細胞，較佳為骨髓系細胞，更佳為巨噬細胞或樹狀細胞(DC)，進而較佳為DC，尤佳為標準型1型樹狀細胞(cDC1)。
巨噬細胞及樹狀細胞均具有抗原呈現能力。樹狀細胞為最強力之抗原呈現細胞，負責淋巴組織及非淋巴組織中之T細胞及自然殺手細胞之增生及功能之調整。樹狀細胞存在若干亞型，特異性地表現趨化因子受體XCR1、選擇性地表現C型凝集素內噬作用受體CLEC9A之cDC1具有較高之交叉呈現能力，因此將抗原高效地搭載於第一型MHC(major histocompatibility complex，主要組織相容性複合物)分子(參考文獻1：NoubadeR et al., “Beyond cDC1: EmergingRoles of DC Crosstalk in Cancer Immunity”, Front Immunol., Vol. 10, Article 1014, pp. 1-13. 2019.)。同時藉由表現共同刺激分子，能夠將攻擊感染了病毒或細菌之細胞或癌細胞之T細胞(細胞毒殺性T細胞(CTL))活化。 即，提高向巨噬細胞或DC(較佳為cDC1)之抗原傳遞性會提高癌之預防或治療、感染症之預防或治療之效果。
又，巨噬細胞及DC可將抗原搭載於第二型MHC分子。由此將輔助T細胞活化，促進利用B細胞之抗體產生。 即，提高向巨噬細胞或DC(較佳為cDC1)之抗原傳遞性會提高感染症之預防或治療、免疫疾病之治療之效果。
又，作為免疫細胞之活化能力，意指如上所述之提高、促進、或增強細胞之活性之性質，其中，較佳為提高、促進或維持DC(較佳為cDC1)中之共同刺激分子之表現之性質。作為共同刺激分子，可例舉：CD80、CD86等。藉由提高、促進或維持該等共同刺激分子之表現，能夠顯著地誘導T細胞(細胞毒殺性T細胞(CTL))。因此，本實施方式之玻尿酸衍生物較佳為於與藥效成分製劑化時能夠提高、促進或維持DC(較佳為cDC1)中之CD80及CD86兩者之表現。
本實施方式之玻尿酸衍生物於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。藉此，推測其為提高、促進、或增強免疫細胞之活性者。再者，藉由與上述機制不同之機制可獲得所需之效果之情形亦包含於技術範圍內。
即，本實施方式之玻尿酸衍生物亦可稱為向免疫細胞之藥效成分之傳遞提高劑、傳遞促進劑、或傳遞增強劑。或亦可稱為向免疫細胞之藥效成分之吸收提高劑、促進劑、或增強劑。 又，包含本實施方式之玻尿酸衍生物及藥效成分之下文所述之醫藥組合物亦可稱為免疫細胞之活化用組合物、DC(較佳為cDC1)中之共同刺激分子之表現提高用組合物、表現促進用組合物或表現維持用組合物。
本實施方式之玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈可藉由凝膠滲透層析法進行測定，為如上述般控制之粒子尺寸分佈可以根據凝膠滲透層析圖並藉由以下所示之方法所算出之面積A1與A2之比A1/A2表示。 上述凝膠滲透層析法測定中作為標準物質所使用之聚丙烯酸較佳為聚丙烯酸鈉，具體而言，更佳為Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa系列(聚丙烯酸鈉)。
利用凝膠滲透層析法進行之玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈之測定可藉由以下方法進行。 製備1 mg/mL之玻尿酸衍生物水溶液、2 mg/mL之聚丙烯酸標準物質水溶液，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定。 (測定條件) 裝置：高速GPC(凝膠滲透層析)裝置 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI(示差折射率檢測器) 溫度：30℃
圖1係本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖之一例。以下參照圖1對面積A1及A2之算出方法進行詳細說明。
(i)於圖1中記載有本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖、及作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的凝膠滲透層析圖。首先，將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點設為Ub，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線B之交點設為Bb。此處，將開始測定時之折射率強度設為零，將自此處起水平地作出之線設為基準線。例如，在開始測定前以折射率強度之增減落入±0.5 mV之範圍內之方式進行調整，以折射率強度在5分鐘內落入0.5 mV以下之增減之方式進行調整。例如，將折射率強度增加量超過相當於雜訊值之5倍之量3次的最初之點設為層析圖之「起點」，將溶出時間設為0分鐘。例如，將折射率強度成為最大極大折射率強度之1000分之1的點設為層析圖之「終點」，於折射率強度達不到最大極大折射率強度之1000分之1之情形時，將「Tlim」設為「終點」。「Tlim」設為測定2 kDa之聚丙烯酸時表現出極大折射率強度之溶出時間。 於本裝置中，每隔0.00167分鐘算出折射率強度。
(ii)其次，將玻尿酸衍生物之層析圖中由交點Ub至終點之曲線、自折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線(交點Ub至交點Bb之直線)、及基準線B所包圍之面積值設為A2，將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由起點至上述Ub之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線(交點Ub至交點Bb之直線)、及基準線B所包圍之面積值設為A1。 此處，各面積值係使用GPC工作站EcoSEC Elite-WS之解析應用程式而算出。 於算出各面積值時，將由凝膠滲透層析法所使用之展開溶劑等產生之峰、或者由所使用之管柱或裝置引起之基準線之波動產生之偽峰排除在外。
圖1所示之面積A1與A2之比A1/A2為0.90以上，更佳為1.00以上，更佳為1.10以上，更佳為1.20以上，更佳為1.30以上，更佳為1.40以上、1.50以上，進而較佳為1.60以上，尤佳為1.70以上。藉由面積A1與A2之比A1/A2為上述下限值以上，可相對較多地含有粒子尺寸較大之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。
另一方面，關於A1/A2之上限值，面積A1之比率較面積A2越高越佳。即，於圖1中，越處於基準線之左側(溶出時間變短)，粒子尺寸越大，越處於右側(溶出時間變長)，粒子尺寸越小，因此粒子尺寸較大者之比率較粒子尺寸較小者越高越佳。因此，A1/A2之上限值並無特別限定，例如可為7.0以下、6.0以下、或5.0以下。
本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖之形狀並無特別限定，可存在2個以上玻尿酸衍生物之折射率強度之極大點(峰頂)。雖然沒有特別限定，但可於自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線之兩側(左右)分別具有1個以上玻尿酸衍生物之折射率強度之極大點(峰頂)。此時，自折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線之左側的玻尿酸衍生物之折射率強度之極大點(峰頂)處的折射率強度可大於自折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線之右側的玻尿酸衍生物之折射率強度之極大點(峰頂)處的折射率強度。又，相對於右側之極大點(峰頂)處之折射率強度的左側之極大點(峰頂)處之折射率強度並無特別限定，可為1.0倍以上、2.0倍以上、3.0倍以上、5.0倍以上、或10.0倍以上，上限可較大，例如可為1000倍以下、100倍以下、50.0倍以下、20.0倍以下、10.0倍以下、2.0倍以下、或1.5倍以下。
又，本實施方式之玻尿酸衍生物為如上述般控制之粒子尺寸分佈亦可藉由以下所示之距離Da與Db之比Da/Db進行定義。
圖2係本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖之一例，圖2所示之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖及作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的凝膠滲透層析圖與圖1相同。然而，於圖2中，新增有作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之凝膠滲透層析圖，對各種交點等進行了定義，該方面不同於上述圖1。以下參照圖2對距離Da及Db之算出方法進行詳細說明。
(i)首先，自作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之層析圖上的折射率強度極大點Ka向基準線B作垂線，將與基準線之交點設為Ba，將上述折射率強度極大點Ka與上述Ba之間之長度設為La。
(ii)其次，將折射率強度成為La/20之層析圖上之2點中溶出時間較早者設為點R1，將溶出時間較晚者設為點S1。
(iii)繼而，將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線之交點設為Bb。
(iv)繼而，將連結上述點R1與上述點S1之直線D1與自上述折射率強度極大點Ka向基準線B所作之垂線之交點設為Ta，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述直線D1之交點設為Tb。
(v)最後，將上述點R1與上述Ta之距離設為Da，將上述Ta與上述Tb之距離設為Db。
圖2所示之距離Da與Db之比Da/Db較佳為超過0.00且為1.20以下，更佳為0.10以上、1.00以下，更佳為0.20以上、0.8以下，進而較佳為0.30以上、0.95以下，進而更佳為0.40以上、0.94以下，尤佳為0.50以上、0.93以下。藉由距離Da與Db之比Da/Db為上述範圍內，可相對較多地含有粒子尺寸大於作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。
於本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖中，橫軸表示溶出時間，縱軸表示使用示差折射率計所獲得之折射率強度，可具有任意數量之折射率極大點。本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖較佳為具有1～5個極大點之粒子尺寸分佈，更佳為具有1～3個極大點之粒子尺寸分佈。又，可具有極小點，亦可不具有極小點。 進而，於本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖中，由使用示差折射率計所獲得之折射率強度與溶出時間表示之層析圖可為左右非對稱，亦可為對稱。
本實施方式之玻尿酸衍生物係藉由玻尿酸衍生物中之固醇基於水中自締合，且單個分子或複數個分子締合，而形成奈米尺寸之水凝膠。
於玻尿酸衍生物中，固醇基可直接與玻尿酸結合，亦可經由連接子結合。
此處提及之「連接子」可使用可藉由基因工程導入之任意之肽連接子、或合成化合物連接子，於玻尿酸衍生物中，較佳為肽連接子。肽連接子之長度並無特別限定，可根據目的由從業者適當選擇，較佳之長度為2個胺基酸以上(上限並無特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。玻尿酸衍生物所含之肽連接子可全部使用長度相同之肽連接子，亦可使用長度不同之肽連接子。
[固醇基] 本說明書中所使用之用語「固醇基」只要為具有類固醇骨架之基，則無特別限制。此處，作為類固醇，具體而言可例舉：膽固醇、膽固烷醇、菜油固醇、麥角甾烷醇(ergostanol)、豆固烷醇、糞固醇、豆固醇、穀固醇、羊毛固醇、麥角固醇、西米杜鵑醇、膽汁酸、睾固酮、雌二醇、黃體素、皮質醇、可體松、醛固酮、皮質固酮、去氧皮質固酮等。作為固醇基，可例舉：膽固醇基、豆固醇基、羊毛固醇基、麥角固醇基等，其中，較佳為膽固醇基(尤其是膽甾-5-烯-3β-基)。
玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)並無特別限定，就增加每1分子玻尿酸衍生物之固醇基導入數、形成與藥效成分之複合體之觀點，又，就提高分子之交聯而提高血中之滯留性之觀點而言，較佳為分子量相對較大之玻尿酸衍生物。作為此種玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)，較佳為4000(4k)以上1,000,000(1,000k)以下，更佳為5k以上500k以下，進而較佳為6k以上500k以下，進而更佳為7k以上300k以下，進而更佳為7k以上100k以下，進而更佳為7k以上50k以下，進而更佳為7k以上25k以下，尤佳為8k以上15k以下。或作為玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)，更佳為5k以上25k以下。藉由玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為上述下限值以上，能夠進一步提高分子之交聯，而進一步提高血中之滯留性。另一方面，藉由玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為上述上限值以下，能夠抑制黏度之上升，而能夠使更高濃度之玻尿酸衍生物溶解於醫藥組合物中。玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)通常可藉由使用具有對應之分子量之原料進行調節。
此處所提及之「玻尿酸衍生物之分子量(絕對分子量)」係藉由尺寸排除層析法多角度光散射檢測器(SEC-MALS)所確定之重量平均分子量(絕對分子量)。
於上述藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖中，玻尿酸衍生物之折射率強度極大點(峰頂)之保持時間Pt相對於作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的折射率強度極大點(峰頂)之保持時間Pr(溶出時間Bb)之比Pt/Pr並無特別限定，Pt/Pr較佳為0.5以上且未達1.0，更佳為0.7以上且未達0.95，進而更佳為0.75以上且未達0.92。於比Pt/Pr為上述範圍內之情形時，可相對較多地含有粒子尺寸較大之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。 再者，於上述藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖中，於存在複數個玻尿酸衍生物之折射率強度極大點(峰頂)之情形時，採用折射率強度成為最大之折射率強度極大點(峰頂)處之溶出時間作為上述玻尿酸衍生物之折射率強度極大點(峰頂)之保持時間Pt。 又，上述凝膠滲透層析法測定中用作標準物質之聚丙烯酸較佳為聚丙烯酸鈉，具體而言，更佳為Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa系列(聚丙烯酸鈉)。
玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)並無特別限定，玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)較佳為11萬以上，更佳為11萬以上且未達50萬，進而更佳為13萬以上且未達30萬，最佳為14萬以上且未達25萬。於玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)成為上述範圍內之情形時，可相對較多地含有粒子尺寸較大之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。 另一方面，於玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)超過上述上限值之情形時，存在黏性增大而難以作為製劑使用之情形。
上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)係根據上述藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，基於以各分子量為2 kDa、4 kDa、8 kDa、18 kDa、40 kDa、及150 kDa之聚丙烯酸(PSS-Paa2k(2 kDa)、4k(4 kDa)、8k(8 kDa)、18k(18 kDa)、40k(40 kDa)、150k(150 kDa)(PSS Polymer Standard service GmbH公司製造))作為標準物質所製作之校準曲線，依照下述式：At3＋Bt2＋Ct＋D而算出。
作為較佳之玻尿酸衍生物，具體而言，例如可例舉具有1個以上下述通式(I)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(I)」)之玻尿酸衍生物等。
[化2]
(式中，R 1、R 2、R 3、及R 4分別獨立地選自由氫原子、C 1-6烷基、甲醯基及C 1-6烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意胺基酸殘基之肽連接子； X 1為選自由以下之式所表示之基所組成之群中之基： -NR b-R、 -NR b-COO-R、 -NR b-CO-R、 -NR b-CO-NR c-R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Y a-S-R、 -O-CO-Y b-S-R、 -NR b-CO-Y b-S-R、及 -S-S-R； R a、R b及R c分別獨立地選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，此處該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NR f-所組成之群中之基； R f選自由氫原子、C 1-12烷基、胺基C 2-12烷基及羥基C 2-12烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為固醇基； Y為C 2-30伸烷基、或-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-，此處，該伸烷基可插入選自由-O-、-NR g-及-S-S-所組成之群中之基； R g選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Y a為C 1-5伸烷基； Y b為C 2-8伸烷基或C 2-8伸烯基； m為1以上100以下之整數)。
上述玻尿酸衍生物較佳為含有1個以上下述通式(Ia)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(Ia)」)作為重複單元(I)。
[化3]
(式中，R 1、R 2、R 3、及R 4分別獨立地選自由氫原子、C 1-6烷基、甲醯基及C 1-6烷基羰基所組成之群； X為-NR a-Y-NR b-COO-R所表示之疏水性基； R a及R b分別獨立地選自由氫原子及C 1-6烷基所組成之群； R為固醇基； Y為C 2-30伸烷基、或-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-， m為1以上100以下之整數)
此處，於玻尿酸衍生物分別含有2個以上重複單元(I)或重複單元(Ia)之情形時，該重複單元可相同，亦可不同。
玻尿酸衍生物可於重複單元(I)或重複單元(Ia)以外之位置被修飾，例如可將羥基轉化為-O(C 1-6烷基)、-O(甲醯基)、-O(C 1-6烷基羰基)等，可將羧基轉化為醯胺或酯，亦可形成鹽。
[重複單元(I)] 通式(I)中之基「-Z-N(R a)Y-X 1」較佳為選自由以下之式所表示之基所組成之群： -NH-(CH 2) mz-NH-R； -NH-(CH 2) mz-NH-COO-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-NH-COO-R； -NH-(CH 2) mz-COO-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-COO-R、 -NH-(CH 2) mz-O-COO-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-O-COO-R、 -NH-(CH 2) mz-S-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-S-R； -NH-(CH 2) mz-O-CO-CH(R 8)-CH 2-S-R； -NH-(CH 2) mz-NHCO-CH(R 8)-CH 2-S-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-NHCO-CH(R 8)-CH 2-S-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-O-CO-CH(R 8)-CH 2-S-R； -NH-(CH 2) mz-S-S-R；及 -Z-NR a-Y-NR b-COO-R (此處，mz為2以上30以下之整數，R 8為氫原子或甲基，R及m如本說明書中已定義者)， 更佳為選自由 -NH-(CH 2) mz-NH-COO-R； -NH-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-NH-COO-R；及 -NH-(CH 2) mz-S-S-R (此處，mz、R、及m如本說明書中已定義者) 所組成之群。
(Z) 於通式(I)中，Z較佳為直接鍵。 於其他態樣中，於Z為肽連接子之情形時，X 1較佳為-NR b-COO-R。 進而，於其他態樣中，Z可為以-NH-[CH(-Z a)-CONH] n - 1-CH(-Z a)-CO-表示之肽連接子，此處，n為2以上30以下之整數，Z a分別獨立地表示以H 2N-CH(-Z a)-COOH之形式表示之α-胺基酸中之取代基。該肽連接子藉由N末端結合於葡萄糖醛酸部分之羧基，藉由C末端結合於基-N(-R a)-Y-X 1。作為可用作該肽連接子之胺基酸殘基之胺基酸之例，可例舉α-胺基酸，例如可例舉：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸(Gly)、組胺酸、異白胺酸、白胺酸(Leu)、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸等天然型(L型)之胺基酸、該等之D體等，可使用包括合成之胺基酸在內之全部α-胺基酸。即，作為Z a，例如可例舉：-CH 3、H 2NC(NH)NH(CH 2) 3-、H 2NCOCH 2-等。又，n個Z可相同亦可不同。n為2以上30以下之整數，較佳為2以上10以下，更佳為2以上4以下。作為肽連接子之較佳之例，例如可例舉：-Gly-Phe-Leu-Gly-、-Asn-Phe-Phe-、-Phe-Phe-、Phe-Gly-等。
(Y) 於通式(I)中，Y較佳為選自由-(CH 2) n1-及-(CH 2CH 2O) m1-CH 2CH 2-(此處，n1為2以上20以下之整數，較佳為2以上15以下之整數，更佳為2以上12以下之整數，進而較佳為2以上6以下之整數。m1為1以上4以下之整數)所組成之群中之基。具體而言，較佳為-(CH 2) 2-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 8-、-(CH 2) 12-、或-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-。又，就於純水中或低鹽濃度下實現較高之溶解性，並且於生理鹽水濃度下表現出較高之沈澱形成能力之觀點而言，Y較佳為選自由-(CH 2) 2-、-(CH 2) 6-、-(CH 2) 8-及-(CH 2) 12-所組成之群中之基，更佳為-(CH 2) 6-。
Y例如可為：-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-S-S-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-、-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-S-S-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-、-CH 2CH 2O-CH 2CH 2-S-S-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-、-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-S-S-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-等。
(Y a) 作為Y a，較佳為-CH 2-或-CH 2-CH 2-。
(Y b) 作為Y b，較佳為-CH 2-CH 2-、-CH(CH 3)CH 2-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基或辛-2,4,6-三烯-1,8-二基，更佳為-CH 2-CH 2-或-CH(CH 3)CH 2-。
作為基「-Z-N(R a)Y-X 1」之具體例，可例舉：-NH-(CH 2) 2-NH-CO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 4-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 3-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-NH-(CH 2) 3-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 4-NH-(CH 2) 3-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH 2)-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH 2)-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 3-NH 2)-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH 2)-CO-NH-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH 2)-CO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 3-NH-(CH 2) 4-N(-(CH 2) 3-NH 2)-膽固醇基等。作為較佳之基「-Z-N(R a)Y-X 1」，R a、R b及R c為氫原子，Y為直鏈狀之C 2-30伸烷基或-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-，Y a為直鏈狀之C 1-5伸烷基，或者Y b為直鏈狀之C 2-8伸烷基或直鏈狀之C 2-8伸烯基。
[重複單元(Ia)] 於通式(Ia)中，X較佳為-NH-(CH 2) 2-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 6-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 12-NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-NH-COO-膽固醇基，更佳為-NH-(CH 2) 2-NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH 2) 6-NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH 2CH 2O) 2-CH 2CH 2-NH-COO-膽固醇基，進而更佳為-NH-(CH 2) 6-NH-COO-膽固醇基。
除了重複單元(I)以外，玻尿酸衍生物可進而含有通式(II)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(II)」)。
[化4]
(式中，R 1a、R 2a、R 3a、及R 4a分別獨立地選自由氫原子、C 1-6烷基、甲醯基及C 1-6烷基羰基所組成之群； X a選自由羥基及-O-Q +所組成之群；此處，Q +為抗衡陽離子)
此處，於玻尿酸衍生物含有2個以上重複單元(II)之情形時，該重複單元可相同，亦可不同。 於其他態樣中，玻尿酸衍生物可為實質上包含重複單元(I)、重複單元(Ia)及重複單元(II)之玻尿酸衍生物。
[重複單元(II)] 於通式(II)中，Q +只要為於水中與羧基形成鹽之抗衡陽離子，則無特別限定，於為二價以上之情形時，根據價數而與複數個羧基形成鹽。 作為抗衡陽離子之例，可例舉：鋰離子、鈉離子、銣離子、銫離子、鎂離子、鈣離子等金屬離子；式：N +R jR kR lR m(式中，R j、R k、R l及R m分別獨立地選自由氫原子及C 1-6烷基所組成之群)所表示之銨離子等。 其中，Q +較佳為鈉離子、鉀離子、或四烷基銨離子(例如四正丁基銨離子等)。 上述式中，R j、R k、R l及R m較佳為選自由C 1-6烷基所組成之群中之相同之基，較佳為正丁基。
較佳為R 1、R 2、R 3、及R 4、以及R 1a、R 2a、R 3a、及R 4a全部為氫原子。又，較佳為R a及R b均為氫原子。
其中，玻尿酸衍生物較佳為實質上含有重複單元(I)及重複單元(II)之玻尿酸衍生物。玻尿酸衍生物係該衍生物所含之包含D-葡萄糖醛酸與N-乙醯基-D-葡糖胺之二糖之重複單元中的例如80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上為重複單元(I)及重複單元(II)。玻尿酸衍生物可僅由重複單元(I)及重複單元(II)構成，亦可僅由重複單元(I)構成。
於本實施方式之玻尿酸衍生物中，固醇基對構成玻尿酸衍生物之二糖之重複單元的導入率(以下有時簡稱為「固醇基導入率」)較佳為15%以上60%以下，較佳為20%以上60%以下，較佳為30%以上60%以下，更佳為30%以上55%以下，進而較佳為35%以上50%以下，尤佳為35%以上45%以下。 藉由固醇基導入率為上述下限值以上，能夠於生物體內保持不沈澱而穩定之水凝膠。另一方面，藉由為上述上限值以下，可將水凝膠之平均粒徑設為上述範圍內。
固醇基導入率可藉由 1H-NMR測定進行測定。即，可使用玻尿酸衍生物成分之 1H-NMR圖譜中來自玻尿酸衍生物之固醇基之峰之積分值、及來自玻尿酸衍生物所含之N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的峰(COCH 3，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)之積分值，基於以下之式進行計算。再者，式中n H表示與峰相對應之氫原子之數。 上述 1H-NMR例如可使用0.02 N之DCl DMSO-d 6/D 2O混液(2 N之DCl D 2O：DMSO-d 6＝1：99)作為測定溶劑，於測定溫度85℃實施。 再者，由於來自膽固醇基之峰(5H)與包含來自葡糖胺之乙醯基之峰的1.6～2.0 ppm附近之峰重疊，故而可以1.6～2.0 ppm附近之峰之積分值減去來自膽固醇基甲基之峰(0.7 ppm)之積分值的5/3所算出之值(即積分值(1.6～2.0 ppm)－積分值(0.7 ppm)×5/3)作為來自玻尿酸之乙醯基之積分值，而用於導入率之計算。
[固醇基導入率](%) ＝[(來自固醇基之峰積分值×3/n H)/(來自N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基之峰積分值)]×100
＜玻尿酸衍生物之製造方法＞ 玻尿酸衍生物例如可藉由將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺，並導入固醇基而獲得。又，相對於原料之玻尿酸或其衍生物，對具有進行反應之固醇基之化合物之調配量進行調整，藉此可控制固醇基導入率。
作為將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺並導入固醇基之方法，具體而言，例如可例舉如下方法：將原料之玻尿酸或其衍生物、較佳為僅由重複單元(II)構成之玻尿酸或其衍生物離子交換為四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)，於合適之縮合劑之存在下，於溶劑中使該玻尿酸鹽與導入了式：「HNR a-Y-NR b-R、NHR a-Y-NR b-COO-R、HNR a-Y-NR b-COO-R、HNR a-Y-NR b-CO-R、HNR a-Y-NR b-CO-NR c-R、HNR a-Y-COO-R、HNR a-Y-O-COO-R、HNR a-Y-S-R、HNR a-Y-CO-Y a-S-R、HNR a-Y-O-CO-Y b-S-R、HNR a-Y-NR b-CO-Y b-S-R、HNR a-Y-S-S-R、或-Z-NR a-Y-NR b-COO-R(式中，R a、R b、R c、Y、Y a、Y b、Z及R如本說明書已定義者)」所表示之固醇基(尤其是膽固醇基)之胺進行反應。
上述反應中可使用之縮合劑並無特別限定，例如可例舉：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤)-4-甲基嗎啉鎓(DMT-MM)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三𠯤(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三-吡咯啶基-鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(EDC)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)等。
雖然沒有特別限定，但於在水及有機溶劑之混合溶劑中反應亦高效地進行之方面而言，較佳為DMT-MM。又，藉由使用DMT-MM作為縮合劑，於大量羥基共存之系統中，可抑制酯鍵之形成，並且高選擇性地進行胺基與羧基之醯胺鍵形成。藉由使用該縮合劑，例如可防止作為溶劑之醇與玻尿酸部分之羧基進行反應、或同時存在於玻尿酸部分之羧基與羥基於分子內或分子間結合而形成不需要之交聯。
作為固醇基導入反應中所使用之溶劑，可例舉：水、DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇、多元醇、乙腈、DMF(dimethylformamide，二甲基甲醯胺)、THF(tetrahydrofuran，四氫呋喃)、二氯甲烷、氯仿、己烷、二乙基醚、乙酸乙酯、及該等之混合溶劑等。 作為多元醇，可為二元醇，亦可為三元醇。 作為二元醇，例如可例舉：乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、新戊二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇等。 作為三元醇，例如可例舉：甘油、三羥甲基丙烷等。
或亦可將原料之玻尿酸或其衍生物離子交換為四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)，於合適之縮合劑之存在下，於溶劑中使該玻尿酸鹽與間隔子部分進行反應(此時可視需要進行保護及去保護反應)，對原料之玻尿酸或其衍生物之羧基(-COOH)進行轉化，其後與合適之試劑進行反應。以下示出由羧基衍生之基與反應試劑之組合之例。 -CONR a-Y-NR bH＋Hal-R； -CONR a-Y-NR bH＋Hal-COOR； -CONR a-Y-NR bH＋HOCO-R； -CONR a-Y-NR bH＋Hal-CO-R； -CONR a-Y-NR b-COOH＋HNR c-R； -CONR a-Y-NR b-CO-NR cH＋Hal-R； -CONR a-Y-NR bH＋HOCO-NR c-R； -CONR a-Y-NR bH＋Hal-CO-NR c-R； -CONR a-Y-COOH＋HO-R； -CONR a-Y-OH＋Hal-COO-R； -CONR a-Y-OCOOH＋HO-R； -CONR a-Y-OCOOH＋Hal-R； -CONR a-Y-OCO-Hal＋HO-R； -CONR a-Y-SH＋Hal-R； -CONR a-Y-Hal＋HS-R； -CONR a-Y-CO-Y a-Hal＋HS-R； -CONR a-Y-CO-Y a-SH＋Hal-R； -CONR a-Y-O-CO-CH=CH 2＋HS-R； -CONR a-Y-NR b-CO-CH(CH 3)=CH 2＋HS-R； -CONR a-Y-SH＋HS-R； -COZ-OH＋HNR a-Y-NR b-COO-R； -COZ-NR a-Y-NR bH＋Hal-COO-R (式中，R a、R b、R c、Y、Y a、Y b、及Z如本說明書已定義者，Hal表示選自由氟原子、氯原子、溴原子及碘所組成之群中之鹵素原子)。
作為反應形式，可例舉：脫鹵化氫反應、縮合反應、脫水反應、麥可加成等親核加成反應、氧化性之二硫化物形成反應等，該等係周知之反應，從業者可適當選擇，發現較佳之反應條件而進行。於轉化體或反應物具有羧基之情形時，亦可製成N-羥基琥珀醯亞胺(以下亦稱為「NHS」)酯而進行反應。
又，可例舉如下方法：使原料之玻尿酸或其衍生物之羧基與2-胺基乙基2-吡啶基二硫化物進行反應，製備被導入有末端具有經脫離基修飾之巰基之間隔子之玻尿酸衍生物，使其與硫代膽固醇進行親核取代反應，而形成雙硫鍵。
進而，亦可例舉如下方法：製備對玻尿酸或其衍生物之羧基導入間隔子之一部分而成者、及對固醇基導入間隔子之一部分而成者，並使該等反應。具體例之一部分如上所述，進而，於對Y插入-S-S-之情形時，亦可例舉如下方法：分別製備對玻尿酸之羧基導入末端具有巰基之間隔子而成之玻尿酸衍生物、及導入末端具有巰基之間隔子而成之固醇基，並使該等進行氧化性反應而形成雙硫鍵。此時，亦可使其中一巰基與2-巰基吡啶反應而製成二硫化物後，使其與另一巰基進行取代。
又，於製備玻尿酸衍生物後，可進一步導入其他取代基。例如，亦可藉由將實質上包含重複單元(I)及重複單元(II)之玻尿酸衍生物中之羧基的0.1莫耳%以上99.5莫耳%以下、較佳為40莫耳%以上65莫耳%以下轉化為-CO-X z[此處，X z選自由以下之基所組成之群： -NH-(CH 2) p1-O-CO-C(R 17)=CH 2； -NH-(CH 2) p1-O-CO-CH(R 17)-CH 2-S-CH 2-CH(OH)-CH(OH)-CH 2-SH； -NH-(CH 2) p1-SH； -NH-(CH 2) p1-NH-CO-C(R 17)=CH 2； -NH-(CH 2) p1-NH-C(=NH)-(CH 2) 3-SH； -NH-(CH 2) p1-NH-CO-(CH 2) r-SH； -NH-(CH 2) p1-NH-CO-CH(R 17)-CH 2-S-CH 2-CH(OH)-CH(OH)-CH 2-SH； -NH-(CH 2) p1-NH-CO-CH(NH 2)-CH 2-SH； -NH-(CH 2) p1-NH-CO-CH(NH 2)-(CH 2) 2-SH； -NH-NH-CO-(CH 2) 4-CO-NH-NH-C(=NH)-(CH 2) 3-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-O-CO-C(R 17)=CH 2； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-O-CO-CH(R 17)-CH 2-S-CH 2-CH(OH)-CH(OH)-CH 2-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-CO-C(R 17)=CH 2； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-C(=NH)-(CH 2) 3-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-CO-(CH 2) r-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-CO-CH(R 17)-CH 2-S-CH 2-CH(OH)-CH(OH)-CH 2-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-CO-CH(NH 2)-CH 2-SH； -NH-(CH 2-CH 2-O) q-CH 2-CH 2-NH-CO-CH(NH 2)-(CH 2) 2-SH； -NH-CH(CO 2H)-(CH 2)-SH； -NH-CH(CO 2H)-(CH 2) 2-SH；及 -NH-CH(CO 2H)-(CH 2) 2-CONH-CH(CONH-CH 2-CO 2H)-CH 2-SH (此處，R 17為氫原子或C 1-6烷基，p1表示2以上10以下之整數，q表示1以上100以下之整數，r表示1以上3以下之整數)]， 而於分子內或包含其他分子之分子間進行化學交聯，進行凝膠化。
於藉由透析將粒子尺寸控制為特定之範圍之情形時，可藉由利用MWCO(區分分子量)300 kDa之透析膜透析1次以上9次以下、較佳為3次以上9次以下、更佳為6次以上9次以下，獲得具有面積比A1/A2滿足0.9以上之粒子尺寸分佈之玻尿酸衍生物。關於透析之次數，只要面積比A1/A2滿足0.9以上，則從業者可適當選擇任意之次數。視情形亦可藉由9次以上之透析進行區分。
此時，作為獲得具有面積比A1/A2滿足0.9以上之粒子尺寸分佈之玻尿酸衍生物的方法，並不僅限定於透析。例如亦可藉由利用超過濾膜或微濾膜之離心過濾分離、分取純化HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)、分取純化GPC、利用超離心之分離、利用離子交換樹脂之分離、利用膜蒸餾之分離、利用有機或無機膜之膜分離、藉由利用活性碳或沸石、MOF(Metal Organic Frameworks，金屬有機框架)之吸附脫附法之分離、利用TFF(Tangential Flow Filtration，切向流過濾)之分離、使用過濾器之送液、加壓或減壓過濾分離、使用鹽析等之沈澱分離法、使用玻尿酸受體之分離等同樣地去除作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa，Polymer Standards Service-USA公司製造，ORDER No.PSS-Paa50k)之粒子尺寸分佈以下之玻尿酸衍生物，而獲得具有面積比A1/A2滿足0.9以上之粒子尺寸分佈之玻尿酸衍生物
所獲得之玻尿酸衍生物可加以乾燥。作為乾燥方法，例如可例舉：通風乾燥、恆溫槽中之乾燥、減壓乾燥、熱風循環式乾燥、冷凍乾燥等。其中，較佳為冷凍乾燥。於進行冷凍乾燥之情形時，玻尿酸衍生物就更有效地抑制該玻尿酸衍生物所形成之微粒子之粒徑之增大的觀點，較佳為進而包含冷凍保護劑。
冷凍保護劑只要為作為「冷凍保護劑」或「冷凍乾燥保護劑」而已知者，則無特別限定，例如可例舉：二糖類、山梨醇、葡聚糖、聚乙二醇、丙二醇、甘油(glycerine)、甘油(glycerol)、聚乙烯基吡咯啶酮、二甲基亞碸等。
作為二糖類，並無特別限定，例如可例舉：蔗糖、乳酮糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維雙糖、曲二糖、黑麴黴糖、異麥芽糖、異海藻糖、新海藻糖、槐二糖、海帶二糖、龍膽二糖、松二糖、麥芽酮糖、巴拉金糖、龍膽二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、車前二糖、新乳糖、半乳蔗糖、海蔥二糖、新橙皮糖、芸香糖、蘆丁酮糖、蠶豆糖、木二糖、櫻草糖等。其中，因被廣泛用作冷凍保護劑，故而較佳為蔗糖、海藻糖、麥芽糖、或乳糖。又，就作為醫藥品添加物之使用實績、或更有效地抑制冷凍乾燥時之玻尿酸衍生物所形成之微粒子之粒徑之增大的觀點而言，更佳為蔗糖。
冷凍保護劑可以固體之狀態添加，亦可以溶解於水等溶劑中之狀態添加。
冷凍保護劑之添加量並無特別限定，相對於玻尿酸衍生物100質量份，較佳為20質量份以上。藉由冷凍保護劑之添加量為上述下限值以上，可獲得更充分之粒徑增大抑制效果。另一方面，冷凍保護劑之添加量之上限並無特別限定，例如可設為100,000質量份。
冷凍乾燥中所使用之裝置亦無特別限定，例如可使用市售之冷凍乾燥機。其中，就控制真空度之觀點而言，較佳為於冷凍乾燥中能夠監控裝置內之真空度之冷凍乾燥機，又，就控制容器內溫度之觀點而言，較佳為棚式冷凍乾燥機。
本發明之第二實施方式之玻尿酸衍生物係一種其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且於藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖中，玻尿酸衍生物之折射率強度極大點(峰頂)下之保持時間Pt相對於作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的折射率強度極大點(峰頂)下之保持時間Pr之比Pt/Pr為0.5以上且未達1.0，更佳為0.7以上且未達0.95，最佳為0.75以上且未達0.92。藉由比Pt/Pr為上述範圍，可相對較多地含有粒子尺寸較大之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。
於上述凝膠滲透層析法測定中，作為標準物質所使用之聚丙烯酸較佳為聚丙烯酸鈉，具體而言，更佳為Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa50k(聚丙烯酸鈉)。 藉由上述凝膠滲透層析法進行之測定例如可藉由以下方法進行。 製備1 mg/mL之玻尿酸衍生物水溶液、2 mg/mL之聚丙烯酸標準物質水溶液，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定。 (測定條件) 裝置：高速GPC(凝膠滲透層析)裝置 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI(示差折射率檢測器) 溫度：30℃ 除此以外，對於與上述第一實施方式之玻尿酸衍生物相同之構成等，省略其說明。
本發明之第三實施方式之玻尿酸衍生物係一種導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)為11萬以上且未達50萬，較佳為13萬以上且未達30萬，更佳為14萬以上且未達25萬。於玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)滿足上述範圍之情形時，可相對較多地含有粒子尺寸較大之玻尿酸衍生物，於與藥效成分製劑化時，能夠與藥效成分形成穩定之締合狀態。藉此，能夠將藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(較佳為DC，更佳為cDC1)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。 另一方面，於玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)超過上述上限值之情形時，存在黏性增大而難以用作製劑之情形。
上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(聚丙烯酸換算)係根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，基於以各分子量為2 kDa、4 kDa、8 kDa、18 kDa、40 kDa、及150 kDa之聚丙烯酸作為標準物質所製作之校準曲線，依照下述式：At3＋Bt2＋Ct＋D而算出。 作為上述標準物質所使用之聚丙烯酸較佳為聚丙烯酸鈉，具體而言，更佳為Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa系列(聚丙烯酸鈉)。
藉由上述凝膠滲透層析法進行之測定可藉由上述第一或第二實施態樣所記載之方法進行。除此以外，對於與上述第一實施方式、及/或上述第二實施方式之玻尿酸衍生物相同之構成等，省略其說明。
≪醫藥組合物≫ 上述第一～第三實施方式之玻尿酸衍生物可與藥效成分製劑化而用作醫藥組合物。 即，本實施方式之醫藥組合物含有上述玻尿酸衍生物、及藥效成分。
於本實施方式之醫藥組合物中，上述玻尿酸衍生物與藥效成分形成複合體(以下有時稱為「藥效成分-玻尿酸衍生物複合體」)。具體而言，推定玻尿酸衍生物中之固醇基與藥效成分之疏水性部位藉由疏水性相互作用形成複合體，呈類核殼型之球狀結構，即藥效成分與固醇基等疏水性部位存在於中心部，另一方面，玻尿酸衍生物中之來自玻尿酸之部位等親水性部位存在於外緣部。即，推定呈將藥效成分封入或內包於玻尿酸衍生物中之結構。
於本實施方式之醫藥組合物中，包含藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之球狀結構體之平均粒徑可設為20 nm以上100 nm以下，可設為20 nm以上95 nm以下，可設為20 nm以上90 nm以下。此處提及之平均粒徑係以z平均表示之值。藉由平均粒徑為上述數值範圍，於生物體內可以穩定之結構存在，且能夠更容易地通過淋巴結。平均粒徑例如可藉由DLS(Dynamic Light Scattering，動態光散射儀)或奈米追蹤粒子測定裝置、尺寸排除層析法、高效液相層析法、及電子顯微鏡法等進行測定。更具體而言，例如藉由DLS裝置以玻尿酸衍生物濃度成為1 mg/mL之方式利用含有10 w/v%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液加以稀釋並測定。
於本實施方式之醫藥組合物中，玻尿酸衍生物、或藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之重量平均分子量Mw(聚丙烯酸換算)較佳為11萬以上。重量平均分子量Mw(聚丙烯酸換算)可藉由使用具有不同之分子量之複數種聚丙烯酸樣品製作校準曲線而算出。所使用之聚丙烯酸樣品較佳為聚丙烯酸鈉，具體而言，更佳為Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa系列(聚丙烯酸鈉)。 認為藉由Mw為上述數值範圍，共同刺激分子之活化優異之締合體尺寸更多地存在，藉由使用本實施方式之醫藥組合物，能夠將肽等藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時能夠提高、促進、維持或增強免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。 Mw例如可藉由DLS(Dynamic Light Scattering)、尺寸排除層析法、及電子顯微鏡法等進行測定。更具體而言，例如藉由尺寸排除層析裝置以玻尿酸衍生物濃度成為1 mg/mL之方式加以稀釋並測定。
於本實施方式之醫藥組合物中，玻尿酸衍生物、或藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之藉由尺寸排除層析法之粒徑分佈中之峰頂時間較佳為小於標準物質聚丙烯酸(50 kDa)之峰頂時間。認為藉由峰頂時間為上述範圍，共同刺激分子之活化優異之締合體尺寸更多地存在，藉由使用本實施方式之醫藥組合物，能夠將肽等藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時能夠提高、促進、維持或增強免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。峰頂時間例如可藉由尺寸排除層析法進行測定。更具體而言，例如藉由尺寸排除層析裝置以玻尿酸衍生物濃度成為1 mg/mL之方式加以稀釋並測定。
於本實施方式之醫藥組合物中，玻尿酸衍生物之含量並無特別限定，例如相對於醫藥組合物之100質量份，較佳為0.01質量份以上50.00質量份以下，更佳為0.10質量份以上25.00質量份以下，進而較佳為0.20質量份以上10.00質量份以下。
繼而，以下對本實施方式之構成成分進行詳細說明。
＜藥效成分＞ 作為藥效成分，並無特別限定，可例舉：抗原(癌抗原、源自感染症之抗原、免疫疾病中之自體抗原等)、醫藥活性肽或蛋白質、核酸、低分子化合物、中分子化合物等。其中，較佳為抗原，更佳為選自由癌抗原、源自感染症之抗原、及免疫疾病中之自體抗原所組成之群中之至少一者，更佳為癌抗原或源自感染症之抗原。
即，本實施方式之醫藥組合物較佳為選自由癌症、感染症、及免疫疾病所組成之群中之1種以上疾病之預防或治療用醫藥組合物，進而更佳為癌症或感染症之預防或治療用醫藥組合物。本實施方式之醫藥組合物於適用疾病為癌症、感染症或免疫疾病之情形時，亦可稱為疫苗組合物。
[抗原] (癌抗原) 所謂癌抗原係於癌細胞中大量表現之抗原，於若干情形時，僅藉由癌細胞而表現。癌抗原可於癌細胞內、或癌細胞之表面上表現。
本實施方式之醫藥組合物中可使用之抗原蛋白並無限定，可例舉：ERK1、ERK2、WT1、MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脫胺酶結合蛋白(ADAbp)、FAP、親環素b、結腸直腸相關抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、攝護腺特異性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、攝護腺特異性膜抗原(PSMA)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、CD20、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪胺酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-鈣黏素、α-連環蛋白、β-連環蛋白、γ-連環蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺瘤性息肉症蛋白(APC)、胞襯蛋白、連接蛋白37、Ig遺傳型、p15、gp75、GM2神經節苷脂、GD2神經節苷脂、人類乳突病毒蛋白、腫瘤抗原之Smad家族、lmp-1、P1A、EBV所編碼之核抗原(EBNA)-1、腦肝糖磷解酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、CT-7、CD20、c-erbB-2等。
作為上述抗原蛋白，可使用其全部序列之，亦可使用缺失一部分之序列。
本實施方式之醫藥組合物中可使用之抗原肽係抗原蛋白之序列中包含選自由CD8陽性細胞毒殺性T細胞識別表位及CD4陽性輔助T細胞識別表位所組成之群中之1種以上表位之抗原肽。於一實施方式中，就經由抗原呈現細胞中之分解而搭載於第一型MHC分子或第二型MHC分子之觀點而言，上述抗原肽較佳為包含2個以上表位之抗原肽。具體而言，作為上述抗原肽，可例舉包含腫瘤細胞之抗原蛋白之表位之抗原肽。
於一實施方式中，上述抗原肽例如具有8～120個胺基酸、較佳為8～80個胺基酸、更佳為15～80個胺基酸、進而更佳為16～80個胺基酸、進而較佳為23～80個胺基酸、進而更佳為23～60個胺基酸、尤佳為23～50個胺基酸。
於一實施方式中，就利用輔助T細胞之細胞毒殺性T細胞(CTL)之活化誘導之觀點而言，上述抗原肽係分別包含1個以上CD8陽性細胞毒殺性T細胞識別表位及CD4陽性輔助T細胞識別表位之抗原肽。
於一實施方式中，於包含2個以上表位之情形時，可於表位間配置胺基酸連接子。該連接子例如具有2～10個胺基酸、較佳為4～10個胺基酸、更佳為4～8個胺基酸。 作為該連接子所使用之胺基酸，可例舉：甘胺酸(G)、酪胺酸(Y)、白胺酸(L)、色胺酸(W)等。較佳為酪胺酸(Y)、白胺酸(L)、色胺酸(W)。作為胺基酸連接子之具體例，可例舉：包含連續之4個酪胺酸(Y)之連接子(4Y)、包含連續之4個白胺酸(L)之連接子(4L)、包含連續之4個色胺酸(W)之連接子(4W)、包含連續之6個甘胺酸(G)之連接子(6G)、包含連續之6個酪胺酸(Y)之連接子(6Y)、包含連續之6個白胺酸(L)之連接子(6L)、包含連續之6個色胺酸(W)之連接子(6W)、包含連續之8個酪胺酸(Y)之連接子(8Y)、包含連續之6個白胺酸(L)之連接子(8L)、包含連續之8個色胺酸(W)之連接子(8W)，較佳為6Y、6L或6W。
癌抗原可為腫瘤相關抗原，亦可為癌-睾丸抗原，亦可為病毒抗原，亦可為腫瘤特異性抗原(包括新抗原)。癌抗原可使用一種，亦可組合兩種以上使用。
(源自感染症之抗原) 作為源自感染症之抗原，只要為感染性病原體及源自感染性病原體之抗原，則無特別限定。作為感染性病原體，可例舉：病毒、細菌、真菌、線蟲等。源自感染症病原體之抗原可為抗原蛋白，亦可為抗原肽。
作為由上述感染性病原體所罹患之疾病，並無特別限定，例如可例舉：由腺病毒、疱疹病毒(例如HSV(Herpes Simplex virus，單純疱疹病毒)-I、HSV-II、CMV(Cytomegalovirus，巨細胞病毒)、VZV(Varicella-zoster virus，水痘帶狀疱疹病毒))、痘病毒(例如天花或牛痘、傳染性軟疣等正痘病毒)、小核糖核酸病毒(例如鼻病毒、腸病毒)、正黏液病毒(例如流行性感冒病毒)、副黏液病毒(例如副流行性感冒病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒(RSV))、冠狀病毒(例如SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome，嚴重急性呼吸道症候群)冠狀病毒(SARS-CoV)、MERS(Middle East Respiratory Syndrome，中東呼吸症候群)冠狀病毒(MERS-CoV)、SARS-CoV-2)、乳突狀多瘤空泡病毒(papovavirus)(例如引起生殖器疣、尋常性膀胱疣、足底疣者等乳頭狀瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如，B型肝炎病毒)、黃病毒(例如C型肝炎病毒、登革熱病毒)、反轉錄病毒(例如HIV(human immunodeficiency virus，人類免疫缺乏病毒)等慢病毒)等病毒感染所罹患之疾病等病毒疾病；由埃希氏菌屬、腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌、志賀氏菌、李斯特菌、嗜氣菌、螺桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、假單胞菌、鏈球菌、披衣菌、黴漿菌、肺炎雙球菌、奈瑟菌、梭菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌、分枝桿菌、曲狀桿菌、弧菌、沙雷氏菌、普羅威登斯菌、紫色桿菌、裂欖、耶爾辛氏菌、嗜血桿菌、博多特拉菌等細菌感染所罹患之疾病等細菌疾病；披衣菌病、念珠菌感染症、麴菌病、組織胞漿菌病、隱球菌腦膜炎等真菌疾病；瘧疾、肺囊蟲肺炎、利什曼原蟲症、隱孢子蟲症、弓形蟲病、椎體蟲感染等。
作為本實施方式之醫藥組合物中可使用之抗原之結構，只要為構成病原體之各種成分之至少一部分，則無特別限定，例如可例舉：活菌疫苗、去活化全粒子、該等之一部分、蛋白次單元、蛋白質、肽等。其中，就與玻尿酸衍生物之複合化之觀點而言，較佳為蛋白次單元、蛋白質、或肽。
上述流行性感冒病毒係屬於正黏液病毒科之具有直徑約100 nm之粒子尺寸的RNA包膜病毒，基於內部蛋白質之抗原性，分為A、B及C型。上述流行性感冒病毒包含與由具有脂質雙層結構之病毒包膜所包圍之內部核衣殼或核蛋白締合之核糖核酸(RNA)之核、及外部糖蛋白。上述病毒包膜之內層主要包含基質蛋白，外層之大部分包含來自宿主之脂質物質。又，上述流行性感冒病毒之RNA取分節結構。再者，於全世界大流行之流行性感冒係由A型流行性感冒病毒引起，該A型流行性感冒病毒具有血球凝集素及神經胺酸酶之2種包膜糖蛋白，根據抗原性之差異，血球凝集素中區分為16種亞型，神經胺酸酶中區分為9種亞型。
作為上述源自感染症之抗原，可適宜地使用源自A型及B型流行性感冒病毒之抗原。再者，作為上述A型及B型流行性感冒病毒之亞型，並無特別限定，可為目前經單離之亞型，亦可為將來經單離之亞型。
作為源自流行性感冒病毒之抗原，只要為構成上述流行性感冒病毒之各種成分之至少一部分，則無特別限定，例如可例舉純化病毒粒子經有機溶劑/界面活性劑或其他試劑不活化而成之全病毒粒子、或自該全病毒粒子中去除雜質並將血球凝集素及/或神經胺酸酶純化而製作之病毒次單元等。就免疫原性之觀點而言，較佳為血球凝集素次單元或全病毒粒子。上述全病毒粒子更佳為藉由福馬林等不活化而成者。又，對於雜質較少、必需免疫活化劑等佐劑之血球凝集素次單元(裂解)而言尤其有效。
上述流行性感冒病毒抗原之製備方法並無特別限定，可無限定地使用公知之方法。例如可例舉如下方法：使自流行性感冒感染動物或流行性感冒之患者單離之病毒株感染雞蛋等，藉由常規方法進行培養、純化，由所得之病毒原液製備抗原。又，亦可使用源自以基因工程方式於培養細胞中製備之病毒之抗原。
(免疫疾病中之抗原) 作為免疫疾病中之抗原，只要包含免疫疾病之靶蛋白之表位，則無特別限定。作為免疫疾病，並無特別限定，例如可例舉：尋常性牛皮癬、僵直性脊椎炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、中軸型脊椎關節炎、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、支氣管哮喘、慢性蕁麻疹、花粉病、異位性皮膚炎等。 作為靶蛋白，並無特別限定，可例舉：IL-17A、DPP4、S100A9、PCSK9、IL-23、IgE、TNFα、IL-12/23p40、IL-6、α4β7整合素、IL-4/13、IL-5、BLyS、IL-13等。參考文獻2(國際公開第2017/164409號)中記載有來自IL-17A之肽。 肽可不僅具有靶蛋白之表位，而且具有靶蛋白以外之表位。可為B細胞表位，亦可為T細胞表位。 肽係具有表位之序列，可具有環狀結構。上述肽可於分子內具有複數個環狀結構。 進而，上述肽可複合於蛋白質。 藉由在體內產生針對所投予之蛋白質或肽之抗體，而可期待治療效果。
[醫藥活性肽或蛋白質] 作為醫藥活性肽或蛋白質，意指於向對象投予治療有效量之情形時，對於對象之狀態或症狀具有正面效果、或有利之效果者。作為較佳之醫藥活性肽或蛋白質，為具有根治性或對症性性質且可為了改善疾病或障害之1種或複數種症狀、使其好轉、減輕、復原，延遲症狀之發病、或減小症狀之重症度而投予者。醫藥活性肽或蛋白質亦存在具有預防性性質之情況，可用於延遲疾病之發病、或減小此種疾病或病情之重症度。用語「醫藥活性肽或蛋白質」包含全長蛋白質或多肽，又，亦存在指其具有醫藥活性之片段之情況。該用語亦包含肽或蛋白質之具有醫藥活性之類似物。
作為醫藥活性蛋白質之例，並不限定於以下，但可例舉：免疫活性化合物等細胞激素及免疫系統蛋白質(例如介白素、菌落刺激因子(CSF)、粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)、紅血球生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、整合素、地址素、選擇素(seletin)、歸巢受體、T細胞受體、免疫球蛋白、抗體、激素(胰島素、甲狀腺激素、兒茶酚胺、激性腺素、刺激激素、泌乳素、催產素、多巴胺、牛生長素、瘦體素等)、生長激素(例如人類生長激素)、生長因子(例如上皮生長因子、神經生長因子、類胰島素生長因子等)、生長因子受體、酶(組織漿素原活化物、鏈激酶、膽固醇生物合成(biosynthestic)酶或分解酶、類固醇產生(steriodogenic)酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基酶、去氫酶、纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、細胞色素、腺苷酸環化酶或鳥嘌呤核苷酸(guanylaste)環化酶、神經胺酸酶(neuraminidase)等)、受體(類固醇激素受體、肽受體)、結合蛋白(生長激素結合蛋白或生長因子結合蛋白等)、轉錄因子及轉譯因子、腫瘤增生抑制蛋白(例如阻礙血管新生之蛋白質)、結構蛋白(膠原蛋白、絲蛋白、血纖維蛋白原、彈力蛋白、微管蛋白、肌動蛋白及肌球蛋白等)、血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、第VII因子、第VIII因子、胰島素、第IX因子、第X因子、組織漿素原活化物、蛋白C、類血友病因子、抗凝血酶III、葡糖腦苷脂酶、紅血球生成素、改型第VIII因子、抗凝固因子)等。
於一實施方式中，醫藥活性蛋白質係與淋巴細胞之穩態之控制相關之細胞激素，較佳為與選自由T細胞之產生、初次刺激、擴增、分化及生存所組成之群中之1種以上相關且誘導或增強該等之細胞激素。 於一實施方式中，細胞激素為介白素。 於一實施方式中，醫藥活性蛋白質係選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15及IL-21所組成之群中之1種以上介白素。 於一實施方式中，醫藥活性肽可具有環狀結構。上述肽可於分子內具有複數個環狀結構。
[核酸] 作為核酸，例如可例舉：DNA、RNA、反義核酸、誘餌核酸、核糖核酸酶、低分子干擾RNA、核酸適體等。又，於上述抗原為肽或蛋白質之情形時，亦可較佳地使用編碼該等抗原肽或蛋白質之核酸(DNA或mRNA等)。
[低分子化合物] 作為低分子化合物，例如可例舉：抑癌劑(例如烷化劑、抗代謝劑、生物鹼等)、免疫抑制劑、抗炎劑(類固醇劑、非類固醇劑系抗炎劑等)、抗風濕劑、抗菌劑(β-內醯胺系抗生素、胺基糖苷系抗生素、大環內酯系抗生素、四環素系抗生素、新喹啉酮系抗生素、磺胺劑等)等。
又，作為藥效成分，就能夠充分地發揮與上述玻尿酸衍生物之固醇基之相互作用之方面而言，亦可較佳地使用疏水性較高、即水難溶性者。再者，「水難溶性」係指日本藥典第十七修訂版中溶解溶質1 g所需之水量必須為30 mL以上。
作為水難溶性且固體狀之藥效成分，例如可例舉：乙醯胺酚、布洛芬、苯甲酸、乙水楊胺、咖啡因、樟腦、奎寧、葡萄糖酸鈣、二巰丙醇、磺胺、茶鹼、可可鹼、核黃素、美芬新、苯巴比妥、胺茶鹼、氨硫脲、槲皮素、芸香苷、水楊酸、茶鹼鈉鹽、匹拉比特魯、鹽酸奎寧、伊格比林、洋地黃毒苷、灰黃黴素、非那西汀等退熱鎮痛藥、神經系統醫藥、鎮靜安眠劑、肌肉鬆弛劑、降壓劑、抗組織胺劑等；乙醯螺旋黴素、安比西林、紅黴素、吉他黴素、氯黴素、三乙醯竹桃黴素、制黴素、硫酸黏桿菌素等抗生素；甲基睾固酮、甲基雄甾二醇、黃體素、苯甲酸雌二醇、乙炔雌甾二醇、醋酸去氧皮質固酮、醋酸可體松、氫化可體松、醋酸氫化可體松、潑尼松龍等類固醇激素劑；雙烯雌酚、己雌酚、己烯雌酚、二丙酸己烯雌酚、氯烯雌醚等非類固醇系蛋黃激素劑；其他脂溶性維生素類等「日本藥典」、「日本藥典外醫藥品規格」、「USP(美國藥典)」、「NF(國民醫藥品集)」、「EP(歐洲藥典)」中所記載之醫藥品藥效成分等。可使用選自該等藥效成分中之1種，亦可併用2種以上。
藥效成分亦可為水難溶性之油狀或液狀者。作為水難溶性之油狀或液狀之藥效成分，例如可例舉：替普瑞酮、吲哚美辛法尼酯、維生素K2、維生素K1、維生素A油、苯戊醇、維生素D、維生素E等維生素類；DHA(二十二碳六烯酸)、EPA(二十碳五烯酸)、肝油等高級不飽和脂肪酸類；輔酶Q類、橙油、檸檬油、胡椒薄荷油等油溶性香味料等「日本藥典」、「日本藥典外醫藥品規格」、「USP」、「NF」、「EP」中所記載之醫藥品藥效成分等。維生素E存在各種同系物、衍生物，但只要常溫下為液狀，則無特別限定，例如可例舉：dl-α-生育酚、醋酸dl-α-生育酚酯、d-α-生育酚、醋酸d-α-生育酚酯等。可使用選自該等藥效成分中之1種，亦可併用2種以上。
藥效成分亦可為水難溶性之半固形狀之物質。作為水難溶性之半固形狀之藥效成分，例如可例舉：地龍、甘草、桂皮、牡丹根、牡丹皮、纈草、山椒、生薑、陳皮、麻黃、天竺子、黃砷、遠志、桔梗、車前子、車前草、石蒜、美遠志、貝母、茴香、黃柏、黃連、莪術、洋甘菊、龍膽、牛黃、獸膽、珊瑚菜、生薑、蒼術、丁香、陳皮、白術、竹節人參、人參、葛根湯、桂枝湯、香蘇散、柴胡桂枝湯、小柴胡湯、小青龍湯、麥門冬湯、半夏厚朴湯、麻黃湯等中藥或生藥萃取物類；牡蠣肉萃取物、蜂膠及蜂膠萃取物、輔酶Q類等。可使用選自該等藥效成分中之1種，亦可併用2種以上。
於本實施方式之醫藥組合物中，藥效成分之含量取決於藥效成分之結構，相對於玻尿酸衍生物之質量，可設為0.001質量%以上10,000質量%以下，較佳為0.1質量%以上1000質量%以下，更佳為1.0質量%以上100.0質量%以下，進而較佳為1.5質量%以上50.0質量%以下，尤佳為3.0質量%以上30.0質量%以下，最佳為5.0質量%以上20.0質量%以下。 或於本實施方式之醫藥組合物中，藥效成分之含量相對於玻尿酸衍生物之質量，更佳為0.1質量%以上100.0質量%以下，進而較佳為0.1質量%以上50.0質量%以下，進而較佳為0.1質量%以上30.0質量%以下，進而較佳為0.5質量%以上30.0質量%以下，進而較佳為1.0質量%以上30.0質量%以下，進而較佳為1.0質量%以上25.0質量%以下，進而較佳為1.0質量%以上20.0質量%以下，進而更佳為1.0質量%以上15.0質量%以下，尤佳為1.0質量%以上10.0質量%以下。
或於本實施方式之醫藥組合物中，藥效成分之含量相對於醫藥組合物100質量份，較佳為0.0001質量份以上1.00質量份以下，更佳為0.001質量份以上0.100質量份以下，進而較佳為0.002質量份以上0.500質量份以下。
或於本實施方式之醫藥組合物中，藥效成分之含量相對於醫藥組合物100質量份，較佳為0.001質量份以上1.00質量份以下，更佳為0.001質量份以上0.500質量份以下，更佳為0.001質量份以上0.200質量份以下，進而較佳為0.005質量份以上0.100質量份以下。
藉由藥效成分之含量為上述下限值以上，能夠更有效地使免疫細胞活化，另一方面，藉由為上述上限值以下，能夠將藥效成分封入玻尿酸衍生物成分中，而製成更穩定之結構。
＜佐劑＞ 於本實施方式之醫藥組合物為疫苗組合物之情形時，除了上述藥效成分及上述玻尿酸衍生物以外，可進而含有佐劑。藉此，能夠更有效地誘導免疫。此處，所誘導之免疫可為液性免疫，亦可為細胞性免疫。即，本實施方式之醫藥組合物較佳為含有上述玻尿酸衍生物、及作為上述藥效成分之抗原(較佳為癌抗原或源自感染症之抗原)且進而含有佐劑之醫藥組合物。
再者，通常液性免疫係指B細胞與抗體成為中心之免疫機制。藉由輔助T細胞(Th2細胞)所產生之細胞激素刺激B細胞，藉此，B細胞分化為漿細胞，產生大量之抗體，抗體於體液中循環而擴散至全身。又，經刺激之B細胞之一部分成為記憶有抗原之資訊之記憶型B細胞，於再次感染時，可較最初之反應更迅速地產生大量對抗原親和性更高之抗體。 另一方面，細胞性免疫係指於病原體本身或病毒感染細胞、癌細胞等異物之排除中細胞成為主要之效應物之免疫機制。為利用巨噬細胞、細胞毒殺性T細胞(CTL、殺手T細胞)、自然殺手細胞(NK細胞)等免疫活性細胞自身之排除機制。
作為佐劑，只要為通常用於疫苗者，則無特別限定，例如可例舉：鋁鹽、角鯊烯、針對自然免疫受體之配體等。
此處提及之「配體」意指特異性地結合於受體之物質，尤其可使用特異性地結合於受體並表現出各種生理作用之物質。亦將此種物質稱為「促效劑」。
作為自然免疫受體，例如可例舉：類鐸受體(toll-like receptor，TLR)、類RIG-I受體(RIG-I-like receptor，RLR)、類NOD受體(NOD-like receptor，NLR)、C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)等。
作為TLR配體，例如適當選擇與選自由TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8及TLR-9所組成之群中之至少1種TLR相互作用者即可。
作為TLR-2配體，例如可例舉Pam3CSK4等。
作為TLR-3配體，例如可例舉：聚ICLC、聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)等。
作為TLR-4配體，例如可例舉：R型脂多糖、S型脂多糖、紫杉醇(Paclitaxel)、脂質A、單磷醯脂質A等。
作為TLR-5配體，例如可例舉：鞭毛蛋白(Flagellin)等。
作為TLR-2及TLR-6配體，例如可例舉：MALP-2等。
作為TLR-7及TLR-8配體，例如可例舉：雷西莫特(R848)、咪喹莫特(imiquimod、R837)、嘎德莫特(gardiquimod)、洛索立賓(loxoribine)等。
作為TLR-9配體，例如可例舉：CpG寡去氧核苷酸等。
其中，作為佐劑，就能夠進一步提高抗原呈現功能之方面而言，較佳為陰離子性化合物，更佳為CpG寡去氧核苷酸。
作為CpG寡去氧核苷酸，例如可例舉：CpG-ODN 1826、CpG-K3等。
＜其他添加劑＞ 本實施方式之醫藥組合物亦可單獨投予，或可與藥理學上可容許之載體一起依照常規方法投予。於與藥理學上可容許之載體併用之情形時，例如可將上述玻尿酸衍生物及上述藥效成分、以及視需要之佐劑、水或其以外之生理學上可容許之液(例如生理鹽水、含水乙醇、磷酸緩衝生理鹽水(PBS))等加以混合，亦可包含生理學上可容許之緩衝液、賦形劑、媒劑、防腐劑、穩定劑、結合劑、冷凍乾燥助劑等。
作為緩衝液，例如可例舉：Tris、磷酸鈉、磷酸鉀、組胺酸、或檸檬酸等。
作為防腐劑，例如可例舉：氯化苄烷銨、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯丁醇、山梨酸、烷基聚胺基乙基甘胺酸等。
作為穩定劑，例如可例舉：乙二胺四乙酸鈉水合物、聚乙烯基吡咯啶酮(povidone)、聚山梨醇酯80等。
作為本實施方式之醫藥組合物，亦可使用製劑化而成者。作為製劑之形態，可製成固體、半固體或液體之形態。 於固體之情形時，可例舉：粉末、顆粒、丸劑、顆粒(pellet)、錠劑、膠囊等形態。其中，作為固體，較佳為冷凍乾燥粉末。 於半固體之情形時，可例舉凝膠等形態。 於液體之情形時，可例舉藉由水或磷酸緩衝生理鹽水(PBS)等緩衝液將粉末稀釋或懸浮而成之懸濁液等形態。
＜醫藥組合物之製造方法＞ 本實施方式之醫藥組合物可藉由將上述玻尿酸衍生物與上述藥效成分適當混合而製造，較佳為藉由以下所示之方法製造。
本實施方式之醫藥組合物之製造方法係含有玻尿酸衍生物、及藥效成分之醫藥組合物之製造方法，且包括以下步驟。 製備步驟，將上述藥效成分溶解於有機溶劑或含有有機溶劑之水中，製備含有上述藥效成分之油相；及 混合步驟，以上述油相與含有上述玻尿酸衍生物之水相之混合比以體積比計成為20：100～0.01：100之方式進行混合。
先前，根據上述油相與水相之比率，玻尿酸衍生物因油相而固醇基彼此之相互作用受到阻礙，粒子散開或一部分凝集等，難以維持玻尿酸衍生物之粒子尺寸。因此，醫藥組合物中僅包含粒子散開之尺寸相對較小之玻尿酸衍生物、或包含一部分凝集而成之粒子之玻尿酸衍生物與藥效成分之複合體。又，由於使用透析法製造醫藥組合物，故而結果為難以控制玻尿酸衍生物與藥效成分之重量比。進而，為了製成目標之藥效成分濃度，亦需要濃縮之步驟。
與此相對，本實施方式之醫藥組合物之製造方法不使用透析法，藉由上述構成、尤其是以油相與水相之混合比成為上述數值範圍內之方式進行混合，能夠保持製造醫藥組合物之前之玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈，並且形成與藥效成分之複合體，亦能夠將玻尿酸衍生物與藥效成分之重量比控制為一定。藉此，可以穩定之結構獲得藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。其結果為，可獲得向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力更優異之醫藥組合物。
繼而，以下對本實施方式之醫藥組合物之製造方法之各步驟進行詳細說明。
[製備步驟] 於製備步驟中，將藥效成分溶解於有機溶劑或含有有機溶劑之水中，製備含有藥效成分之油相。
由於溶解於有機溶劑或含有有機溶劑之水中，故而作為藥效成分，可較佳地使用水難溶性者。作為藥效成分，具體而言，可使用上述「藥效成分」中所例示者。
作為溶解藥效成分之有機溶劑，可例舉通常用於醫藥組合物之製造之公知者，具體而言，例如可例舉：二甲基亞碸(DMSO)、甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、甲基乙基酮、庚烷、乙酸異丁酯、乙酸異丙酯、乙酸甲酯、甲基異丁基酮、二甲基甲醯胺等。
[混合步驟] 於混合步驟中，以藉由製備步驟所獲得之油相與含有上述玻尿酸衍生物之水相之混合比以體積比計成為20：100～0.01：100之方式進行混合。
玻尿酸衍生物係預先以成為所需之濃度之方式溶解或分散於水等中而使用。此時，含有玻尿酸衍生物之水相之pH值較佳為6.00以上，較佳為6.00以上11.00以下。藉由pH值為上述下限值以上，能夠更有效地抑制玻尿酸衍生物之凝集，並且形成與藥效成分之複合體，藉此，可以更穩定之結構獲得藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。藉由pH值為上述上限值以下，能夠維持玻尿酸衍生物之分散穩定性，並且將藥物複合化。又，藥物之電荷偏向為負，因此亦有玻尿酸衍生物之疏水部與藥物更容易相互作用之方面。另一方面，藉由為上述上限值以下，能夠進一步抑制玻尿酸衍生物之主鏈分解。
於混合步驟中，形成包含如下結構之藥效成分-玻尿酸衍生物複合體：藉由玻尿酸衍生物之固醇基與藥效成分之疏水性相互作用，固醇基及藥效成分存在於內部，另一方面，來自玻尿酸之親水性部位存在於外緣部。藉由藥效成分之結構，不僅可藉由上述疏水性相互作用，而且可藉由靜電相互作用、氫鍵等之相互作用形成複合體。
於混合步驟中，油相與水相之混合比以體積比計為20：100～0.01：100，較佳為10：100～0.05：100，更佳為5：100～0.1：100，進而較佳為2.5：100～0.5：100。藉由油相與水相之混合比為上述範圍內，可將充分量之藥效成分內包於玻尿酸衍生物中，而形成藥效成分-玻尿酸衍生物複合體，且玻尿酸衍生物之粒子因油相而固醇基彼此之疏水性相互作用受到阻礙，能夠有效地抑制締合消解。但並不僅限於疏水性相互作用，亦能夠有效地抑制靜電相互作用、氫鍵等可有助於結構穩定之相互作用之崩解。
於混合步驟中，溶解於油相中之藥效成分之濃度並無特別限定，相對於油相100質量份，較佳為0.1質量份以上50質量份以下，更佳為0.2質量份以上25質量份以下，進而較佳為0.5質量份以上10質量份以下。
於混合步驟中，溶解於水相中之玻尿酸衍生物之濃度並無特別限定，相對於水相100質量份，玻尿酸衍生物之濃度較佳為0.01質量份以上10質量份以下，更佳為0.1質量份以上10質量份以下，進而較佳為0.5質量份以上5質量份以下。
於混合步驟中，就稍微露出藥效成分之疏水部而容易與玻尿酸衍生物相互作用之觀點而言，較佳為將溫度設為20℃以上65℃以下，更佳為設為23℃以上55℃以下，進而較佳為設為25℃以上40℃以下。或可根據藥效成分之結構及特性而適當設定最佳之溫度。
於混合步驟中，方法並無特別限定，例如將含有藥效成分之油相以任意之比添加至上述含有玻尿酸衍生物之水相中，或將上述含有玻尿酸衍生物之水相以任意之比添加至含有藥效成分之油相中，使最終之油相與水相之混合比以體積比計成為20：100～0.01：100，藉由經由上述混合步驟，可維持玻尿酸衍生物之粒子尺寸。
混合步驟並不限定於分批方式(批次式)，亦可藉由流動法(連續式)將油相及水相混合。藉由將此時之油相與水相之混合比以體積比計設為20：100～0.01：100，能夠維持玻尿酸衍生物之粒子尺寸。
關於流動法中之反應器之材質或形狀，選擇可應用於本發明之製造方法之材質或形狀即可，並無特別限定，例如油相與水相各自所通過之配管之內徑可不同。
關於流動法中之管之材質或形狀，選擇可應用於本實施方式之醫藥組合物之製造方法之材質或形狀即可，並無特別限定，例如可例舉：鐵氟龍(註冊商標)製之管、不鏽鋼管、玻璃管、塑膠管等。
於混合步驟中，時間並無特別限定，例如可設為30分鐘以上90小時以下，可設為1小時以上80小時以下。
於混合步驟中，於將藥效成分複合化於玻尿酸衍生物後，可存在如下步驟：藉由切向流過濾(TFF)、或離心過濾、超過濾/滲濾(UFDF)膜中之複數個TFF等去除溶解有藥效成分之有機溶劑。
[殺菌步驟] 於混合步驟之後，可進行殺菌步驟，即對所獲得之包含藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之溶液進行殺菌，獲得殺菌製劑。作為製劑之殺菌方法，可例舉利用殺菌用過濾器之過濾殺菌、氣體殺菌、γ射線殺菌或電子束殺菌等。最佳為利用殺菌用過濾器之過濾殺菌。
[乾燥步驟] 於混合步驟之後，可進行乾燥步驟，即將所獲得之包含藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之溶液加以乾燥，獲得乾燥體。作為乾燥方法，可例舉與上述「玻尿酸衍生物之製造方法」中所例示之方法同樣之方法。
＜投予方法＞ 投予本實施方式之醫藥組合物之對象可例舉包括人類在內之分類為哺乳類之動物(猴、狨猿、小鼠、大鼠、牛、馬、貓、犬、豬、綿羊、山羊、兔等)。
投予路徑例如除了脊椎內注射、動脈內注射、靜脈內注射、皮下注射等以外，可藉由從業者所公知之方法以鼻腔內、經支氣管、經肺、肌內、經皮、或經口方式進行。其中，於本實施方式之醫藥組合物為疫苗組合物之情形時，較佳為皮下注射或肌內注射。
於本實施方式之醫藥組合物中，於以非經口方式投予之情形時，其投予量可考慮投予對象之種類(亦包括年齡或性別等)等而適當選擇，通常例如於人類(以體重60 kg計)中以藥效成分(較佳為抗原)之量計可設為每次0.01 μg以上5 mg以下，可設為0.1 μg以上500 μg以下，可設為1 μg以上100 μg以下。
投予次數可為上述投予量之單次投予，亦可為將上述投予量每隔1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、或半年投予1次等、2次以上之複數次投予。或可於1次投予中投予2處以上。
≪其他實施方式≫ 於一實施方式中，本發明提供一種選自由癌症、感染症及免疫疾病所組成之群中之1種以上疾病之預防或治療方法，其包括將上述醫藥組合物之有效量投予至患者或患畜。 再者，作為感染症，可例舉上述「抗原」之「源自感染症之抗原」中所例示者。 又，此處提及之「有效量」包含對於預防或治療而言有效之量、即適合於上述疾病之發病預防或治療之量。
於一實施方式中，本發明提供一種組合物，其係用於選自由癌症、感染症及免疫疾病所組成之群中之1種以上疾病之預防或治療者，且包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。
於一實施方式中，本發明提供一種用以製造醫藥組合物之上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之用途。 上述醫藥組合物較佳為感染症疫苗、癌疫苗、或免疫疾病用醫藥組合物。
於一實施方式中，進而，本發明提供一種醫藥組合物，其特徵在於包含含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物、及表現針對上述抗原之免疫受體之淋巴細胞。藉由組合使用含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物與抗原特異性淋巴細胞，能夠更強、更高效、更持續地、及/或於更大範圍內發揮抗腫瘤效果。
本發明提供一種醫藥組合物，其含有表現針對抗原之免疫受體之淋巴細胞，且用於與上述含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物之併用投予。
特徵在於包含含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物與抗原特異性淋巴細胞之組合之醫藥組合物亦可為套組之形態。該醫藥組合物例如可為包含含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物與抗原特異性淋巴細胞之癌治療套組。
於本發明之較佳之一態樣中，含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物較佳為於投予抗原特異性淋巴細胞之前投予。於本發明之較佳之一態樣中，較佳為於以投予1次含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物後輸注1次抗原特異性淋巴細胞作為投予次數之單位時，於進行1單位或2單位之投予後至少投予1次含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物。
於本發明之較佳之一態樣中，含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物之第1次投予與第2次投予之間隔例如可為1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、或14天以上。又，該間隔例如可為28天以下、24天以下、21天以下、17天以下、14天以下、13天以下、12天以下、11天以下、10天以下、9天以下、8天以下、7天以下、6天以下、5天以下、4天以下、3天以下、或2天以下。
於一實施方式中，本發明之含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物可與癌治療所使用之1種以上抗體組合投予。 抗體例如為阻礙腫瘤產生之免疫抑制訊號之抗體、或將免疫細胞之共同刺激訊號活化之1種以上抗體，較佳為阻礙腫瘤產生之免疫抑制訊號之抗體或將免疫細胞之共同刺激訊號活化之抗體。具體而言，為選自由抗CTLA4抗體、抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗OX40、及抗4-1BB抗體所組成之群中之1種以上抗體。
組合投予之情形時之含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物的投予量例如為0.01～100 mg/次，較佳為0.1～50 mg/次，更佳為0.1～20 mg/次，抗體之投予量例如為0.01～200 mg/kg體重，較佳為0.1～100 mg/kg體重，更佳為1～40 mg/kg體重。
抗體可與含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物於相同之時點(包括製劑中包含抗體之情形)投予，亦可於不同之時點投予。於在不同之時點投予之情形時，較佳為於投予其中一者後於例如1分鐘～24小時、較佳為1分鐘～5小時以內投予另一者。
含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物可與上述佐劑及抗體之兩者組合投予。該情形時之含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物之投予量例如為0.01～100 mg/次，較佳為0.1～50 mg/次，更佳為例如0.1～20 mg/次，佐劑之投予量例如為0.01～100 mg/kg體重，較佳為0.1～50 mg/kg體重，更佳為0.1～10 mg/kg體重，抗體之投予量例如為0.01～200 mg/kg體重，較佳為0.1～100 mg/kg體重，更佳為1～40 mg/kg體重。佐劑及抗體可與含有玻尿酸衍生物及抗原之組合物於相同之時點(包括製劑中包含佐劑之情形)投予，亦可於不同之時點投予。於在不同之時點投予之情形時，較佳為將疫苗製劑、佐劑、及抗體全部於例如1分鐘～24小時、較佳為1分鐘～5小時以內投予。
於一實施方式中，本發明提供一種組合物，其係用以提高、促進、或增強藥效成分之向免疫細胞之吸收者，且包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。
於一實施方式中，本發明提供一種組合物，其係用以提高、促進、或增強免疫細胞之活性者，且包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。
於一實施方式中，本發明提供一種組合物，其係用以提高、促進、維持或增強DC(尤其是cDC1)之共同刺激分子(尤其是CD80及CD86)之表現者，且包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體。
於一實施方式中，本發明提供一種方法，其係於活體內或活體外提高、促進、或增強藥效成分之向免疫細胞之吸收者，且包括投予包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
於一實施方式中，本發明提供一種方法，其係於活體內或活體外提高、促進、或增強免疫細胞之活性者，且包括投予包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
於一實施方式中，本發明提供一種方法，其係於活體內或活體外提高、促進、維持或增強DC(尤其是cDC1)之共同刺激分子(尤其是CD80及CD86)之表現者，且包括投予包含上述藥效成分-玻尿酸衍生物複合體之組合物。 [實施例]
以下，藉由實施例詳細地說明本發明，但本發明之範圍並不受該等實施例限制。
＜玻尿酸衍生物之合成＞ [合成例1-1] 依照以下步驟1～步驟3製備玻尿酸衍生物。
1.步驟1 (6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之合成) 依照以下所示之步驟1-1、繼而依照步驟1-2合成6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)。
(1)步驟1-1 於氬氣環境下向氯甲酸膽固醇酯(3.37 g、7.5 mmol)之無水二氯甲烷(20 mL)溶液中添加三乙基胺(TEA，1.05 mL)並攪拌。於冰浴冷卻下滴加6-(第三丁氧基羰基)胺基-1-胺基己烷(1.12 mL、5 mmol)，直接於冰浴冷卻下攪拌30分鐘後，升溫至室溫(25℃左右)，將該混合物攪拌一晚。利用超純水及飽和食鹽水洗淨反應混合物，利用無水硫酸鎂加以乾燥後，於減壓下將溶劑蒸餾去除。藉由矽膠管柱層析法(溶離液：乙酸乙酯：正己烷＝1：4)將所獲得之殘渣純化，將目標物之組分合併，於減壓下蒸餾去除溶劑。
(2)步驟1-2 將所獲得之殘渣溶解於乙酸乙酯(40 mL)中，添加4 N鹽酸/乙酸乙酯溶液(40 mL)，於室溫(25℃左右)下攪拌一晚。藉由離心分離回收所生成之沈澱物。利用乙酸乙酯將所獲得之固體洗淨4次後，於減壓下加以乾燥，獲得6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)1.2 g。
2.步驟2 (玻尿酸之四丁基銨(TBA)鹽之製備) 依照以下所示之步驟2-1、繼而依照步驟2-2製備玻尿酸(HA)之TBA鹽(HA-TBA)。
(1)步驟2-1 使DOWEX(註冊商標)50WX-8-400(Aldrich公司製造)懸浮於超純水中，藉由傾析利用超純水將樹脂洗淨3次左右。添加相對於樹脂之陽離子交換能力約1.5倍莫耳當量之40 wt%四丁基氫氧化銨水溶液(TBA-OH)(Aldrich公司製造)，於室溫(25℃左右)下攪拌30分鐘。藉由傾析去除剩餘之TBA-OH溶液後，進一步利用過量之超純水進行洗淨，藉此獲得經TBA鹽化之陽離子交換樹脂。
(2)步驟2-2 將重量平均分子量(絕對分子量)10,000(10 kDa)之原料玻尿酸鈉鹽(HA-Na)以15 mg/mL之濃度溶解於超純水中。添加以樹脂之離子交換能力換算計，相對於HA單元(單元分子量401.3)之莫耳數為5倍莫耳當量之「(1)步驟2-1」中經TBA鹽化之陽離子交換樹脂之懸濁液。於室溫(25℃左右)下攪拌15分鐘後，使用0.45 μm之過濾器進行過濾，將濾液冷凍乾燥，而獲得白色固體之玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。
3.步驟3 製備「2.(2)步驟2-2」中所製備之HA-TBA之無水DMSO溶液(10 mg/mL)。其後，以相對於「1.步驟1」中所合成之HA-TBA中所存在之二糖重複單元(HA單元)的Chol鹽酸鹽之添加量以莫耳比計成為44/100之方式進行添加。繼而，以相對於HA單元之4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鎓鹽酸鹽(DMT-MM)之添加量以莫耳比計成為48/100之方式進行添加，於室溫(25℃左右)下攪拌一晚。反應溶液依次為0.3 M之乙酸氨/DMSO溶液、0.15 M之NaCl水溶液、超純水，使用Spectra/Por7透析膜(Spectrum Laboratories公司製造，區分分子量(MWCO)：3,500)進行透析。將所獲得之透析液進行冷凍乾燥，而獲得白色固體之目標物(HA-C 6-Chol)。
藉由以下方法算出所獲得之白色固體中之膽固醇導入率。 使用0.02 N之DCl DMSO-d 6/D 2O混液(2 N之DCl D 2O：DMSO-d 6＝1：99)作為測定溶劑，使用JNM-ECS400(日本電子股份有限公司製造)作為NMR裝置，於85℃進行測定，獲得白色個體之 1H-NMR圖譜。於所獲得之 1H-NMR圖譜中，確認到來自N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基之峰(COCH 3、1.6 ppm以上2.0 ppm以下、3H)、來自膽固醇基中之甲基之峰(CH 3、0.7 ppm、3H)，膽固醇導入率為44%。
將作為冷凍乾燥品之玻尿酸衍生物(10k HA-C 6-Chol-44%)以1 mg/mL溶解於注射用水中，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖3A係所獲得之層析圖。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 溫度：30℃
[合成例1-2] 藉由與合成例1-1同樣之程序，合成玻尿酸衍生物。 於產物之 1H-NMR圖譜中，確認到來自N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基之峰(COCH 3、1.6 ppm以上2.0 ppm以下、3H)、來自膽固醇基中之甲基之峰(CH 3、0.7 ppm、3H)，膽固醇導入率為44%。於上述合成例1-1所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，將所獲得之層析圖示於圖3B。
[合成例1-3] 藉由與合成例1-1同樣之程序，合成玻尿酸衍生物。 於產物之 1H-NMR圖譜中，確認到來自N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基之峰(COCH 3、1.6 ppm以上2.0 ppm以下、3H)、來自膽固醇基中之甲基之峰(CH 3、0.7 ppm、3H)，膽固醇導入率為44%。於上述合成例1-1所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，將所獲得之層析圖示於圖3C。
[實施例1-1] 以如下方式進行合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。將冷凍乾燥品之玻尿酸衍生物(10k HA-C 6-Chol-44%)以5 mg/mL溶解於注射用水中，轉移至透析盒(FLOAT-A-LYZER G2，MWCO：300,000，家田貿易股份有限公司)中，相對於10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4)進行9次透析。對於所獲得之透析內液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖4A係所獲得之層析圖。圖21及圖22係為了對下文所述之面積比A1/A2及距離之比Da/Db之算出方法進行說明而重疊顯示實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物及作為標準物質之聚丙烯酸之層析圖的圖。 利用超濃縮器(Vivaspin20，MWCO：10,000，賽多利斯)將濾液濃縮至所需之濃度。
[實施例1-2] 藉由與實施例1-1同樣之程序，進行合成例1-2中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。對於所獲得之透析內液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖4B係所獲得之層析圖。
[實施例1-3] 藉由與實施例1-1同樣之程序，進行合成例1-3中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。對於所獲得之透析內液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖4C係所獲得之層析圖。
[比較例1-1] 以如下方式進行合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。將冷凍乾燥品之玻尿酸衍生物(10k HA-C 6-Chol-44%)以10 mg/mL溶解於注射用水中，藉由100 mM磷酸緩衝液以成為10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)之方式進行稀釋。其後，利用超過濾器(Vivaspin(註冊商標)20，MWCO：300,000，賽多利斯)進行過濾，對於所獲得之濾液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖5A係所獲得之層析圖。利用超濃縮器(Vivaspin20，MWCO：10,000，賽多利斯)將濾液濃縮至所需之濃度。
[比較例1-2] 藉由與比較例1-1同樣之程序，進行合成例1-2中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。對於所獲得之濾液之玻尿酸衍生物，利用超濃縮器(Vivaspin20，MWCO：10,000，賽多利斯)濃縮至所需之濃度。其後，以成為1 mg/mL之方式利用注射用水進行稀釋，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖5B係所獲得之層析圖。
[比較例1-3] 藉由與比較例1-2同樣之程序，進行合成例1-3中所獲得之玻尿酸衍生物之分取。對於所獲得之濾液之玻尿酸衍生物，利用超濃縮器(Vivaspin20，MWCO：10,000，賽多利斯)濃縮至所需之濃度。其後，以成為1 mg/mL之方式利用注射用水進行稀釋，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖5C係所獲得之層析圖。
[比較例1-4] 將膽固醇基修飾聚三葡萄糖(CHP：日油公司製造，製品編號CHP-80T)之冷凍乾燥體以成為1 mg/mL之方式溶解於注射用水中，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖5D係所獲得之層析圖。
[玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈之評估：面積比A1/A2及距離之比Da/Db] 根據實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物及作為標準物質之聚丙烯酸之凝膠滲透層析圖，算出面積比A1/A2及距離之比Da/Db。 作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa)係使用Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa50k(聚丙烯酸鈉)。 作為標準物質之聚丙烯酸(150 kDa)係使用Polymer Standards Service-USA公司製造之ORDER No.PSS-Paa150k(聚丙烯酸鈉)。 標準物質聚丙烯酸之粉末以成為2 mg/mL之濃度之方式利用注射用水進行溶解。此後所記載之作為標準物質之聚丙烯酸全部使用Polymer Standards Service-USA公司製造(聚丙烯酸鈉)者。
藉由以下所示之方法，根據圖21所示之凝膠滲透層析圖算出面積A1及A2，並計算面積比A1/A2。
(i)首先，將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點設為Ub，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線之交點設為Bb。此處，折射率強度極大點Kb下之溶出時間為7.41分鐘。 (ii)繼而，將玻尿酸衍生物之層析圖中由Ub至終點之曲線、自折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A2，將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由起點至上述Ub之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A1。
藉由以下所示之方法，根據圖22所示之凝膠滲透層析圖算出距離Da及Db，並計算距離之比Da/Db。
(i)首先，自作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之層析圖上的折射率強度極大點Ka向基準線B作垂線，將與基準線之交點設為Ba，將上述折射率強度極大點Ka與上述Ba之間之長度設為La。此處，折射率強度極大點Ka下之溶出時間為6.46分鐘。 (ii)繼而，將折射率強度成為La/20之層析圖上之2點中溶出時間較早者設為點R1，將溶出時間較晚者設為點S1。此處，點R1下之溶出時間為5.74分鐘，點S1下之溶出時間為7.68分鐘。 (iii)繼而，將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與基準線之交點設為Bb。此處，折射率強度極大點Kb下之溶出時間如上所述。 (iv)繼而，將連結上述點R1與上述點S1之直線D1與自上述折射率強度極大點Ka向基準線B所作之垂線之交點設為Ta，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述直線D1之交點設為Tb。 (v)最後，將上述點R1與上述Ta之距離設為Da，將上述Ta與上述Tb之距離設為Db。
藉由與實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物同樣之方法，根據合成例1-1～1-3、實施例1-2～1-3及比較例1-1～1-4中所獲得之各玻尿酸衍生物與作為標準物質之聚丙烯酸之凝膠滲透層析圖，算出面積比A1/A2及距離之比Da/Db。
將所算出之面積比A1/A2及距離之比Da/Db示於以下之表1。再者，於表1中，比較例3之膽固醇基修飾聚三葡萄糖(CHP)之距離之比Da/Db的RI之值較小而無法算出。
[表1]
   A1/A2 Da/Db
合成例1-1 0.51 0.68
合成例1-2 0.89 0.69
合成例1-3 0.60 0.71
實施例1-1 1.79 0.76
實施例1-2 4.24 0.91
實施例1-3 3.87 0.92
比較例1-1 0.31 0.22
比較例1-2 0.245 0.021
比較例1-3 0.350 0.28
比較例1-4 0.343 -
如表1所示，相較於純化前之合成例1-1～1-3之玻尿酸衍生物，可獲得面積比A1/A2較高之實施例1-1～1-3之玻尿酸衍生物。
＜醫藥組合物之製造＞ [實施例2-1] 以成為5 mg/mL之濃度之方式，利用10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)稀釋實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物而進行製備。 另一方面，於其他容器中，以螢光標記肽之濃度成為50 mg/mL之方式，溶解於二甲基亞碸(DMSO)中。螢光標記肽使用Biologica公司製造之具有於N末端結合有螢光素之如下胺基酸序列之螢光標記肽。
NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列編號1)
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與螢光標記肽之DMSO溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
其後，以相對於包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式，添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為約0.3 mg/mL之方式進行稀釋，使用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0317質量份。
藉由合成例1-1所記載之方法，以玻尿酸衍生物成為1 mg/mL之方式進行稀釋，藉由凝膠滲透層析法進行測定，結果為於肽封入前後玻尿酸衍生物之層析圖未見較大變化(圖6A)。此時，肽濃度成為0.1 mg/mL，亦確認可將加入之肽100%封入。
[實施例2-2] 使用實施例1-2中所獲得之玻尿酸衍生物，藉由與實施例2-1同樣之程序，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0478質量份。 藉由合成例1-1所記載之方法，利用凝膠滲透層析法進行測定，結果為於肽封入前後玻尿酸衍生物之層析圖未見較大變化(圖6B)。
[實施例2-3] 使用實施例1-3中所獲得之玻尿酸衍生物，藉由與實施例2-1同樣之程序，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0303質量份。 藉由合成例1-1所記載之方法，利用凝膠滲透層析法進行測定，結果為於肽封入前後玻尿酸衍生物之層析圖未見較大變化(圖6-C)。
[比較例2-1] 以成為5 mg/mL之濃度之方式，利用10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)稀釋比較例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物而製備。 另一方面，於其他容器中，以螢光標記肽之濃度成為50 mg/mL之方式，溶解於DMSO中。
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與螢光標記肽之二甲基亞碸溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
其後，以相對於包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式，添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為0.3 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0308質量份。
[比較例2-2] 使用比較例1-2中所獲得之玻尿酸衍生物，藉由與比較例2-1同樣之程序，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0332質量份。
[比較例2-3] 使用比較例1-3中所獲得之玻尿酸衍生物，藉由與比較例2-1同樣之程序，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0348質量份。
[比較例3] 將CHP(日油公司製造，製品編號CHP-80T)之冷凍乾燥體以成為10 mg/mL之濃度之方式溶解於含有6 M脲之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為7.4)中。 另一方面，於其他容器中，以螢光標記肽之濃度成為50 mg/mL之方式，溶解於二甲基亞碸中。
於室溫(25℃左右)下將上述含有6 M脲之CHP水溶液與螢光標記肽之二甲基亞碸溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含螢光標記肽-CHP複合體之組合物。
其後，轉移至透析盒(Thermo公司製造，Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes，3.5K MWCO，15 mL，No.87724)中，利用含有0.6 M脲之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為7.4)進行透析。繼而，依序以含有0.06 M脲之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為7.4)、磷酸緩衝生理鹽水(pH值為7.4)進行透析。進而利用超濃縮器(Vivaspin20，MWCO：10,000，賽多利斯)濃縮至所需之濃度。
最後，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含螢光標記肽-CHP複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0420質量份。
[比較例4-1] 稱量合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之冷凍乾燥體，以成為5 mg/mL之濃度之方式添加注射用水，攪拌一晚使其充分溶解。 另一方面，於其他容器中，以螢光標記肽之濃度成為50 mg/mL之方式，溶解於DMSO中。
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與螢光標記肽之二甲基亞碸溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
其後，以相對於包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式，添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之25 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為0.3 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0316質量份。
[比較例4-2] 使用合成例1-2中所獲得之玻尿酸衍生物之冷凍乾燥體，藉由與比較例4-1同樣之程序，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
其後，以相對於包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式，添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之30 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為0.33 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。相對於醫藥組合物100質量份之螢光標記肽之含量為0.0358質量份。
[螢光標記肽濃度之確認] 藉由以下條件之高效液相層析法測定，於實施例2-1～2-3及比較例2-1～2-3、3、4-1、4-2之包含螢光標記肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物中，確認螢光標記肽複合化於玻尿酸衍生物中並可溶化，又，提供各醫藥組合物中之螢光標記肽之濃度。
(測定條件) HPLC裝置：日本分光HPLC-EXTREMA 管柱：PLRP-S 1000A 8 μm 長度50 mm×內徑4.6 mm(Agilent Technologies股份有限公司製造，製品編號：PL1512-1802) 管柱溫度：40℃ 流動相：(A)0.1 v/v%三氟乙酸/乙腈 (B)0.1 v/v%三氟乙酸/水 流速：2 mL/分鐘 注入量：30 μL 檢測器：UV(215 nm) 梯度程式：示於以下之表2中。表2中，「%」意指「v/v%」。
[表2]
時間(min) 流動相A(%) 流動相B(%)
0→0.5 5 95
0.5→3.4 5→100 95→0
3.4→3.45 100→5 0→95
3.45→13.0 100→5 0→95
[試驗例1-1] (肽向淋巴結內骨髓細胞之吸收及活化解析) 1.材料 佐劑：CpG寡DNA1668(自Ajinomoto Bio-Pharma Services, GeneDesign購入) 所投予之組合物：實施例2-1、比較例2-1，比較例3、及比較例4-1之醫藥組合物。
評估所使用之螢光標記抗體如以下所述。全部自Biolegend購入。 亮紫421標記抗小鼠F4/80抗體(純系BM8)； 亮紫510標記抗小鼠CD11c抗體(純系N418)； APC-Cy7標記抗小鼠XCR1抗體(純系ZET)； APC標記抗小鼠CD80抗體(純系16-10A1)； APC標記抗小鼠CD86抗體(純系GL-1)； 純化CD16/32抗體(純系93)。
再者，下文所述之FACS解析所使用之抗體之組合如以下所述。
[表3]
細胞種類 第一抗體 第二抗體 第三抗體
巨噬細胞 (Mph) V421標記抗小鼠F4/80抗體 APC標記抗小鼠CD80抗體 -
V421標記抗小鼠F4/80抗體 APC標記抗小鼠CD86抗體 -
樹狀細胞(DC) V510標記抗小鼠CD11c抗體 APC標記抗小鼠CD80抗體 -
V510標記抗小鼠CD11c抗體 APC標記抗小鼠CD86抗體 -
標準型1型樹狀細胞(cDC1) V510標記抗小鼠CD11c抗體 APC標記抗小鼠CD80抗體 APC-Cy7標記抗小鼠XCR1抗體
V510標記抗小鼠CD11c抗體 APC標記抗小鼠CD86抗體 APC-Cy7標記抗小鼠XCR1抗體
2.解析方法 以螢光(螢光素)標記肽濃度成為0.3 mg/mL左右之方式，利用10質量%蔗糖10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)稀釋實施例2-1、比較例2-1及比較例4-1之醫藥組合物，並利用磷酸緩衝生理鹽水(pH值為7.4)稀釋比較例3之醫藥組合物，其後將各醫藥組合物之稀釋液以肽計分別成為60 μg之方式皮下投予至BALB/c小鼠之右側後背部。同時，作為佐劑而投予溶解於PBS中之50 μg之CpG寡DNA1668(Ajinomoto Bio-Pharma Services, GeneDesign)。
於自投予起20小時後採集投予部位之所屬淋巴結(右鼠蹊部淋巴結)，使用載玻片將淋巴結磨碎後，將細胞懸浮於RPMI1640培養基中。此時，收集相當於1組2隻之細胞。於離心分離(400×g、5分鐘、4℃)後去除上清液，使用RPMI1640培養基洗淨2次後，懸浮於含有10 v/v%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之RPMI1640培養基中。使用細胞血球計測定細胞數，以細胞濃度成為1.2×10 7個/mL之方式進行製備。
以每孔成為6×10 5個之方式將細胞懸濁液50 μL添加至96孔V底微盤(Nunc、Thermo Fisher Scientific)中。將細胞懸濁液進行離心分離(2000 rpm、2分鐘、4℃)，去除上清液後，使用200 μL之染色用緩衝液(含有0.5 v/v%FBS之PBS)洗淨2次後懸浮。進行離心分離而去除上清液後，添加稀釋50倍之含有抗小鼠CD16/CD32抗體之溶液50 μL，於4℃之避光處靜置10分鐘。添加150 μL之染色用緩衝液，進行離心分離而去除上清液後，進一步利用200 μL之染色用緩衝液將細胞洗淨2次。依照各抗體之製造商所推薦之使用濃度，以成為上述表3所記載之組合之方式，添加含有第一、第二、及第三抗體之溶液50 μL並混合後，於4℃之避光處靜置15分鐘。添加150 μL之染色用緩衝液，進行離心分離而去除上清液後，進一步利用200 μL之染色用緩衝液將細胞洗淨2次。進行離心分離而去除上清液後，於200 μL之染色用緩衝液中進行再懸浮，轉移至圓底聚苯乙烯管(BD生物科學)。細胞係使用流式細胞儀FACS Canto II(BD生物科學)及隨附之解析軟體(FACSDiva)進行解析。
樹狀細胞(DC)係作為CD11c陽性之集群檢測出，巨噬細胞(Mph)係作為F4/80陽性之集群檢測出，標準型1型DC(cDC1)係作為CD11c陽性且XCR1陽性之集群檢測出。 對於各細胞種類，檢測出FITC(螢光素)陽性細胞作為吸收肽之細胞。 作為共同刺激分子之CD80及CD86之表現係針對各細胞種類中之FITC陽性細胞進行解析。 將FACS解析方法示於圖7A～圖7F。 又，將解析結果示於表4-1～表4-3。例如，於表4-1中，「肽＋CD80＋DC」意指「表現CD80之吸收肽之樹狀細胞(DC)」，「肽＋CD86＋DC」意指「表現CD86之吸收肽之樹狀細胞(DC)」，「肽＋DC」意指「吸收肽之樹狀細胞(DC)」。
[表4-1]
DC (單位：%) 肽＋CD80＋DC/肽＋DC 肽＋CD86＋DC/肽＋DC
實施例2-1 51.1 50.9
比較例2-1 44.1 31.7
比較例4-1 50.2 46.3
比較例3 27.4 23.9
[表4-2]
cDC1 (單位：%) 肽＋CD80＋cDC1/肽＋cDC1 肽＋CD86＋cDC1/肽＋cDC1
實施例2-1 65.8 63.2
比較例2-1 44.7 45.3
比較例4-1 53.7 37.1
比較例3 23.7 17.0
[表4-3]
Mph (單位：%) 肽＋CD80＋Mph/肽＋Mph 肽＋CD86＋Mph/肽＋Mph
實施例2-1 52.0 39.1
比較例2-1 40.5 19.5
比較例4-1 43.8 30.1
比較例3 57.8 37.0
如表4-1～表4-3所示，於投予實施例2-1之醫藥組合物之小鼠組中，相較於投予比較例2-1及比較例4-1(區分前玻尿酸衍生物)之醫藥組合物之小鼠組，確認到巨噬細胞及DC(尤其是cDC1)中之共同刺激分子(CD80及CD86)之高表現。又，於DC(尤其是cDC1)中，於投予實施例2-1之醫藥組合物之小鼠組中，相較於投予作為其他多糖(聚三葡萄糖)之衍生物之比較例3之醫藥組合物的小鼠組，確認到巨噬細胞及DC(尤其是cDC1)中之共同刺激分子(CD80及CD86)之高表現。
[試驗例1-2] 使用實施例2-2、比較例2-2、比較例4-2之醫藥組合物，以螢光(螢光素)標記肽濃度成為0.2 mg/mL左右之方式利用10質量%蔗糖10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)進行稀釋，以肽計分別成為40 μg之方式進行皮下投予，除此以外，藉由與試驗例1-1同樣之方法實施。將解析結果示於表5-1～表5-3。
[表5-1]
DC (單位：%) 肽＋CD80＋DC/肽＋DC 肽＋CD86＋DC/肽＋DC
實施例2-2 46.3 37.0
比較例2-2 30.7 25.4
比較例4-2 39.6 33.7
[表5-2]
cDC1 (單位：%) 肽＋CD80＋cDC1/肽＋cDC1 肽＋CD86＋cDC1/肽＋cDC1
實施例2-2 82.1 75.9
比較例2-2 59.0 55.7
比較例4-2 73.7 66.3
[表5-3]
Mph (單位：%) 肽＋CD80＋Mph/肽＋Mph 肽＋CD86＋Mph/肽＋Mph
實施例2-2 46.9 36.5
比較例2-2 34.7 13.4
比較例4-2 31.3 20.9
與試驗例1-1同樣地，於投予實施例2-2之醫藥組合物之小鼠組中，相較於投予比較例2-2及比較例4-2(區分前玻尿酸衍生物)之醫藥組合物之小鼠組，確認到巨噬細胞及DC(尤其是cDC1)中之共同刺激分子(CD80及CD86)之高表現。比較例4-2中相對於cDC1之CD80及CD86之表現相對較高，但巨噬細胞中之CD80及CD86之表現較低，差於實施例2-2之醫藥組合物。
[試驗例1-3] 使用實施例2-3之醫藥組合物，以肽計分別成為40 μg之方式進行皮下投予，除此以外，藉由與試驗例1-1同樣之方法實施。將解析結果示於表6-1～表6-3。
[表6-1]
DC (單位：%) 肽＋CD80＋DC/肽＋DC 肽＋CD86＋DC/肽＋DC
實施例2-3 79.4 67.7
[表6-2]
cDC1 (單位：%) 肽＋CD80＋cDC1/肽＋cDC1 肽＋CD86＋cDC1/肽＋cDC1
實施例2-3 85.4 86.3
[表6-3]
Mph (單位：%) 肽＋CD80＋Mph/肽＋Mph 肽＋CD86＋Mph/肽＋Mph
實施例2-3 66.7 51.2
與試驗例1-1及試驗例1-2同樣地，於投予實施例2-3之醫藥組合物之小鼠組中，確認到巨噬細胞及DC(尤其是cDC1)中之共同刺激分子(CD80及CD86)之高表現。
此處，報告有若相對於巨噬細胞之CD86之表現降低，則將作用於或正作用於免疫抑制(參考文獻3：Taams LS et al., “Modulation of monocyte/macrophage function by human CD4+CD25+ regulatory T cells.”, Hum Immunol., Vol. 66, Issue 3, pp. 222-230, 2005.；參考文獻4：Sansom DM et al., “What's the difference between CD80 and CD86?”, Trends in Immunology., Vol. 24, Issue 6, pp. 313-318, 2003.)。根據上述參考文獻3之報告內容及上述試驗例1-1～試驗例1-3之結果，可期待CD86不僅於DC、而且於巨噬細胞中亦強烈表現之實施例2-1、實施例2-2及實施例2-3之醫藥組合物誘導更強之免疫。
根據該等結果推測，藉由使用本實施方式之醫藥組合物，能夠將肽等藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時提高、促進、維持或增強了免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。
＜醫藥組合物之製造條件之研究＞ [參考例1] 使用合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物，進行包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物之製備。
作為肽，使用Biologica公司製造之具有如下胺基酸序列之gp100RP2RP1_6Y肽。
SVYDFFVWLYYYYYYTWHRYHLLYYYYYYEGSRNQDWL(序列編號2)
具體而言，首先，稱量合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之冷凍乾燥體，以成為以下之表7之濃度之方式添加注射用水，攪拌一晚使其充分溶解。 另一方面，於其他容器中，以肽之濃度成為50 mg/mL之方式溶解於DMSO中。 於確認溶解後，依照以下之表7對上述玻尿酸衍生物水溶液添加1 moL/L之氫氧化鈉水溶液(FUJIFILM Wako公司製造)。
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與肽之二甲基亞碸溶液按照以下之表7所記載之體積比進行混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。亦測定此時之溶液之pH值。
(肽-玻尿酸衍生物複合體之穩定性：水溶液之外觀) 以目視判斷24小時後之包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物(水溶液)之情況，驗證是否發生白濁。結果示於以下之表7中。
[表7]
參考例 玻尿酸衍生物水溶液之濃度 (mg/mL) 玻尿酸衍生物水溶液 (體積比) 1 moL/L之氫氧化鈉水溶液 (體積比) 肽之DMSO溶液 (體積比) pH值 肽-玻尿酸衍生物複合體之情況 醫藥組合物中之肽濃度 (mg/mL) 平均粒徑 (nm)
1 5 100 2 1 8.90 透明 0.302 86.7
其後，以相對於包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。繼而，利用含有10質量%蔗糖之25 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之理論濃度成為0.3 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。藉由與上述實施例2-1同樣之方法對此時之包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物中之肽濃度進行定量，將結果示於上述表7中。
(平均粒徑) 對於藉由以下所示之方法所製造之包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物，於以下條件下藉由動態光散射法(DLS)進行測定，獲得z平均粒徑。將結果示於上述表7中。
(測定條件) DLS裝置：大塚電子製造，ELSZ2000 樣品池：微量粒徑樣品池 溫度：25℃ 肽-玻尿酸衍生物複合體之濃度：4.95 mg/mL
如上述表7所示可知，於醫藥組合物之製造中，藉由將混合溶液之pH值調整為特定之範圍內，能夠將肽等藥效成分與玻尿酸衍生物之複合體之粒徑保持為一定之範圍內，使該複合體之溶液中之穩定性變得良好。
[參考例2-1～2-3] 使用合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物、及與參考例1不同之肽，進行包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物之製備。
作為肽，使用Biologica公司製造之具有如下胺基酸序列之肽。
GSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP(序列編號3)
具體而言，首先，稱量合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之冷凍乾燥體，以成為以下之表8之濃度之方式添加注射用水，攪拌一晚使其充分溶解。 另一方面，於其他容器中，以肽之濃度成為50 mg/mL之方式溶解於DMSO中。 於確認溶解後，依照以下之表8對上述玻尿酸衍生物水溶液添加1 moL/L之氫氧化鈉水溶液(FUJIFILM Wako公司製造)。
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與肽之DMSO溶液以依照以下表8之體積比之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此獲得包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物。亦測定此時之溶液之pH值。 其後，以相對於包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。繼而，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。藉由與上述實施例2-1同樣之方法對此時之包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物中之肽濃度進行定量，藉由與上述參考例1同樣之方法測定包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物之平均粒徑。將其結果示於以下之表8中。
[表8]
參考例 玻尿酸衍生物水溶液之濃度 (mg/mL) 玻尿酸衍生物水溶液 (體積比) 1 moL/L之氫氧化鈉水溶液 (體積比) 肽之DMS0溶液 (體積比) pH值 醫藥組合物中之肽濃度 (mg/mL) 平均粒徑 (nm)
2-1 5 100 0 1 6.23 0.188 85.7
2-2 5 100 0.5 1 7.24 0.256 64.3
2-3 5 100 2 1 9.10 0.256 -
如上述表8所示可知，於使用與參考例1不同之肽之醫藥組合物之製造中，亦藉由將混合溶液之pH值調整為特定之範圍內，能夠將肽等藥效成分與玻尿酸衍生物之複合體之粒徑保持為一定之範圍內，使該複合體之溶液中之穩定性變得良好，而可提高醫藥組合物中之肽濃度。
＜維持合適之粒子尺寸分佈之製造條件＞ [試驗例2-1～2-8] 對於藉由與實施例1-1同樣之方法所分取之玻尿酸衍生物，準備濃度5 mg/mL之水溶液，對含有玻尿酸衍生物之水相與油相之混合比進行詳細研究。 相對於5 mg/mL之玻尿酸衍生物400 μL，依照下述表9混合作為油相之DMSO。充分混合後，以最終之玻尿酸衍生物濃度成為一定之方式依照下述表9添加注射用水。進而，於室溫(25℃)下保溫24小時後，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，藉由與實施例1-1同樣之方法算出面積比A1/A2(表9)。將所獲得之凝膠滲透層析圖示於圖8。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 溫度：30℃
[表9]
試驗例 油相DMSO混合量 (μL) 注射用水混合量 (μL) 相對於水相(100體積%)之油相含量 (體積%) A1/A2
2-1 4 396 1 1.469
2-2 20 380 5 1.367
2-3 40 360 10 1.239
2-4 80 320 20 0.927
2-5 160 240 40 0.655
2-6 240 160 60 0.457
2-7 320 80 80 0.303
2-8 400 0 100 0.205
[試驗例3-1～3-6] 使用乙醇而非DMSO作為油相，除此以外，藉由與上述試驗例2-1～2-8相同之方法進行維持合適之粒子尺寸分佈之混合比率之驗證。藉由凝膠滲透層析法進行測定，藉由與實施例1-1同樣之方法算出面積比A1/A2，將結果示於下述表10。將所獲得之凝膠滲透層析圖示於圖9。
[表10]
試驗例 油相乙醇混合量 (μL) 注射用水混合量 (μL) 相對於水相(100體積%)之油相含量 (體積%) A1/A2
3-1 4 396 1 1.438
3-2 20 380 5 1.334
3-3 40 360 10 1.170
3-4 160 240 40 0.345
3-5 240 160 60 0.075
3-6 400 0 100 0.062
根據試驗例2-1～2-8及3-1～3-6之結果可知，藉由經由將油相與含有玻尿酸衍生物之水相之混合比設為體積比20：100～0.01：100之混合步驟，能夠維持藥效優異之玻尿酸衍生物之粒子尺寸。
[比較例5-1] 將重量平均分子量Mw(絕對分子量)為980 kDa之玻尿酸(KIKKOMAN公司製造)之粉末以成為1 mg/mL之方式溶解於注射用水中，於合成例1-1所示之同樣之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，將所獲得之層析圖示於圖10。
進而，將重量平均分子量Mw(絕對分子量)為980 kDa之玻尿酸之粉末以成為10 mg/mL之方式溶解於注射用水中，其後，以成為5 mg/mL之方式利用注射用水進行稀釋，而獲得玻尿酸水溶液。 另一方面，於其他容器中，以抗原肽之濃度成為50 mg/mL之方式溶解於二甲基亞碸(DMSO)中，獲得抗原肽之DMSO溶液。抗原肽使用Biologica公司製造之具有如下胺基酸序列之肽。
NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列編號1)
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸水溶液與抗原肽之DMSO溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此嘗試抗原肽-玻尿酸複合體之製備。所獲得之混合液如圖11中由記載為「玻尿酸(980 kDa)」之照片所確認般，觀察到白濁，提示抗原肽未溶解，未將大量肽封入。
其後，以相對於包含肽-玻尿酸複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為約0.30 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含肽-玻尿酸複合體之醫藥組合物。醫藥組合物中之肽含量係藉由與實施例2-1同樣之方法，利用高效液相層析法測定進行定量。其結果為，醫藥組合物中之肽含量未達檢測極限。
[比較例5-2] 將重量平均分子量Mw(絕對分子量)為650 kDa之玻尿酸之粉末(Kewpie公司製造)以成為1 mg/mL之方式溶解於注射用水中，於合成例1-1所示之同樣之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，將所獲得之凝膠滲透層析圖示於圖12。
將重量平均分子量Mw(絕對分子量)為650 kDa之玻尿酸之粉末以成為10 mg/mL之方式溶解於注射用水中，以成為5 mg/mL之方式利用注射用水進行稀釋，獲得玻尿酸水溶液。 另一方面，於其他容器中，以抗原肽之濃度成為50 mg/mL之方式溶解於二甲基亞碸(DMSO)中，獲得抗原肽之DMSO溶液。抗原肽使用Biologica公司製造之具有如下胺基酸序列之肽。
NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列編號1)
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸水溶液與抗原肽之DMSO溶液以體積比100：1之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌24小時，藉此嘗試抗原肽-玻尿酸複合體之製備。所獲得之混合液如圖11中由記載為「玻尿酸(640 kDa)」之照片所確認般，觀察到白濁，提示抗原肽未溶解，而未將肽封入。
其後，以相對於包含肽-玻尿酸複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為約0.30 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含肽-玻尿酸複合體之醫藥組合物。醫藥組合物中之肽之含量係藉由與實施例2-1同樣之方法，利用高效液相層析法測定進行定量。其結果為，醫藥組合物中之肽含量未達檢測極限。
根據比較例5-1、5-2之結果，於面積比A1/A2成為0.9以上之高分子量玻尿酸中，肽之封入較為困難，難以將肽等藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，並進而提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收。
＜作為感染症疫苗之功能評估(針對外來性抗原之抗體產生評估)及免疫疾病治療用抗體體內產生功能評估＞ [試驗例4]
[比較例6-1] 藉由與合成例1-1同樣之方法，合成玻尿酸衍生物。不進行區分而直接使用。稱量所獲得之玻尿酸衍生物之冷凍乾燥體，以成為5 mg/mL之濃度之方式添加注射用水，於室溫下攪拌一晚使其充分溶解。對於上述玻尿酸衍生物水溶液，以成為1 mg/mL之方式利用注射用水稀釋5倍，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖13係所獲得之凝膠滲透層析圖。又，藉由與實施例1-1等同樣之方法實施玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈之評估，將結果示於下述表11。
[實施例6-1] 藉由與實施例1-1同樣之方法區分藉由與合成例1-1同樣之方法所合成之玻尿酸衍生物，而獲得玻尿酸衍生物。對於所獲得之透析內液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖14係所獲得之凝膠滲透層析圖。又，藉由與實施例1-1等同樣之方法實施玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈之評估，將結果示於下述表11。
[表11]
   A1/A2 Da/Db
比較例6-1 0.81 0.62
實施例6-1 2.03 0.79
＜醫藥組合物之製造＞ [實施例6-1-1] 根據濃度已知之玻尿酸衍生物之面積值算出實施例6-1中所獲得之玻尿酸衍生物水溶液中之玻尿酸衍生物之濃度，為4.28 mg/mL。 於其他容器中，以卵白蛋白(OVA，FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司製造之低內毒素品)之濃度成為5 mg/mL之方式溶解於PBS(pH值為7.4)(FUJIFILM Wako Pure Chemical股份有限公司製造，製品編號：166-23555)中，獲得OVA/PBS溶液。 按照注射用水、玻尿酸衍生物水溶液、OVA/PBS溶液之程序加以混合後，以成為10%蔗糖等張液之方式固體添加蔗糖，於室溫下充分攪拌直至成為澄清之溶液為止。製成製劑中之OVA濃度為0.15 mg/mL、玻尿酸衍生物濃度為3.0 mg/mL且含有10 mM PB(pH值為7.4)之10%蔗糖溶液。於75℃、1小時之加熱條件下保溫，獲得包含OVA-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
[比較例6-1-1] 使用比較例6-1中所獲得之玻尿酸衍生物水溶液，藉由與實施例6-1-1同樣之方法將OVA封入玻尿酸衍生物中，獲得包含OVA-玻尿酸衍生物複合體之組合物。
[抗體產生試驗] 將實施例6-1-1、比較例6-1-1中所製備之包含OVA-玻尿酸衍生物複合體之組合物以OVA成為20 μg之方式於第0天、第7天對BALB/c小鼠進行皮下投予，於第10天採集血清。再者，於投予OVA-玻尿酸衍生物複合體時，皮下投予作為佐劑之CpG1826(製造商：INVIVOGEN，製品編碼：tlrl-1826-1)50 μg。使用ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)套組(Chondrex公司製造，小鼠抗-OVA IgG抗體分析套組、小鼠抗-OVA IgG1抗體分析套組、小鼠抗-OVA IgG2a抗體分析套組)，依照隨附之協定測定針對OVA之抗體效價。血清之稀釋倍率設為10、50、250、1250、6250、31250。
將使用小鼠抗-OVA IgG抗體分析套組所算出之IgG抗體效價(OD)示於圖15，將使用小鼠抗-OVA IgG1抗體分析套組所算出之IgG1抗體效價(OD)示於圖16，將使用小鼠抗-OVA IgG2a抗體分析套組所算出之IgG2a抗體效價(OD)示於圖17。將稀釋倍率10下之各抗體效價示於圖18A(IgG抗體效價)、圖18B(IgG1抗體效價)及圖18C(IgG2a抗體效價)。
確認到於血清稀釋為1250倍以上之情形時，抗體效價無差異，但於稀釋倍率較其更低之情形時，實施例6-1-1之包含OVA-玻尿酸衍生物複合體之組合物相較於比較例6-1-1之包含OVA-玻尿酸衍生物複合體之組合物可獲得較高之抗體效價。藉此可知，實施例6-1之玻尿酸衍生物(A1/A2＝2.03)相較於比較例6-1之玻尿酸衍生物(A1/A2＝0.81)而具有針對外來抗原之較高之抗體產生能力，亦表明治療用抗體之體內產生功能較高。
報告有添加抗原之成熟樹狀細胞經由IFN-γ產生I型輔助T細胞之誘導而使抗原特異性IgG2a產生亢進(參考文獻5：Shigeharu Fujita et al., “Regulatory dendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murine asthmatic model.”, J Allergy Clin Immunol 2008;121:95-104.)。根據上述參考文獻5之報告內容與上述試驗例4之結果推測，實施例6-1-1之包含OVA-玻尿酸衍生物之醫藥組合物將DC之共同刺激分子活化，CD80及CD86強烈表現，提高其後之抗原特異性之T細胞之誘導與IFN-γ產生能力，藉此，其結果為，使抗原特異性IgG2a產生亢進。藉此，可期待實施例6-1-1之醫藥組合物不僅誘導液性免疫，而且亦誘導細胞性免疫，作為感染症疫苗誘導更強之免疫應答。
推測藉由使用本實施方式之醫藥組合物，不僅肽，而且蛋白抗原之藥效成分於加熱條件下亦受到保護，能夠於維持合適之立體結構之狀態下穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時提高、促進、維持或增強了免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。 推測藉由促進輔助T細胞之活化，進而促進B細胞之活化、增大，而產生針對表位之抗原。
認為藉由使用上述第一～第三實施方式之玻尿酸衍生物，相較於使用先前之玻尿酸衍生物，可提供優異之針對外來抗原之疫苗(主要是感染症疫苗)。同時認為可提供優異之含有治療用抗體誘導抗原之醫藥品。
＜作為癌疫苗之功能評估(使用包含玻尿酸衍生物及抗原之投予組合物之癌疫苗抗腫瘤試驗)＞ [試驗例5] 為了明確面積比A1/A2不同之玻尿酸衍生物之癌疫苗之抗腫瘤效果，使用免疫檢查點抑制劑(ICI)抵抗性纖維肉瘤細胞株CMS5a荷癌小鼠，製作將包含於CMS5a中表現之突變型ERK2抗原(mERK2)之CD8表位的長鏈肽抗原與各種玻尿酸衍生物複合化而成之搭載長鏈肽抗原之玻尿酸衍生物癌疫苗，並研究治療效果。
將材料及方法示於以下。 (1)細胞 RPMI1640培養基(添加有2-巰基乙醇)係自細胞科學研究所購入。 胎牛血清(FBS)係自Gibco購入。 小鼠纖維肉瘤CMS5a細胞株係使用自Memorial Sloan-Kettering癌症研究所購得，並於三重大學繼代而得者。小鼠纖維肉瘤CMS5a細胞株表現突變型ERK2蛋白。包含突變型ERK2蛋白之突變部分之肽(QYIHSANVL(序列編號4))係由BALB/c小鼠之CD8陽性細胞毒殺性T細胞所識別。將識別該肽之T細胞受體(TCR)單離，製作基因轉殖有TCR之基因轉殖小鼠(DUC18小鼠)。
(2)試驗動物 雌性BALB/c小鼠(CD90.2陽性)係自日本SLC購入6週齡～8週齡者。 將兩小鼠於三重大學尖端科學研究支援中心動物實驗設施中飼養。動物實驗之協定獲得三重大學醫學部之倫理委員會之核准。
(3)長鏈肽抗原 合成長鏈肽抗原係自Sigma Genosys購入。序列如下所述。 NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列編號1)。 該序列包含第16位之Q至第24位之L之9個胺基酸序列(QYIHSANVL(序列編號4))作為上述突變型ERK2之CD8陽性細胞損傷性T細胞識別表位序列，包含第13位之R至第29位之K之17個胺基酸序列(RGLQYIHSANVLHRDLK(序列編號5))作為CD4陽性輔助T細胞識別表位序列。 亦存在將使該長鏈肽抗原與各種玻尿酸衍生物複合化而成之搭載長鏈肽抗原之玻尿酸衍生物表示為「搭載長鏈肽抗原之HA奈米凝膠癌疫苗」或「HA奈米凝膠癌疫苗」之情況。
[實施例7-1] 以如下方式將比較例6-1中所獲得之玻尿酸衍生物進行區分。將冷凍乾燥品之玻尿酸衍生物(10k HA-C 6-Chol-41.3%)以5 mg/mL溶解於注射用水中，轉移至透析盒(FLOAT-A-LYZER G2，MWCO：300,000，家田貿易股份有限公司)，於10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)中進行透析，對於所獲得之透析內液之玻尿酸衍生物，藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖19係所獲得之凝膠滲透層析圖。藉由與實施例1-1等同樣之方法，實施玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈之評估。將結果示於表12。
[表12]
   A1/A2 Da/Db
實施例7-1 6.62 0.80
＜醫藥組合物之製造＞ [實施例7-1-1] 根據濃度已知之玻尿酸衍生物之面積值算出實施例7-1中所獲得之玻尿酸衍生物水溶液中之玻尿酸衍生物之濃度，為3.8 mg/mL。 另一方面，於其他容器中，以抗原肽之濃度成為50 mg/mL之方式溶解於二甲基亞碸(DMSO)中，獲得抗原肽之DMSO溶液。抗原肽使用Biologica公司製造之具有如下胺基酸序列之肽。
NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT(序列編號1)
於室溫(25℃左右)下將上述玻尿酸衍生物水溶液與抗原肽之DMSO溶液以相對於玻尿酸衍生物100質量份而成為肽10質量份之比率混合，於室溫(25℃左右)下攪拌2小時，藉此嘗試抗原肽-玻尿酸衍生物複合體之製備。目視確認此時之溶液之情況，結果由如圖11中記載為「玻尿酸衍生物」之照片所確認般，成功獲得澄清之溶液。由此確認確實可將肽封入。
其後，以相對於包含肽-玻尿酸衍生物複合體之組合物與蔗糖之合計質量成為10質量%蔗糖之方式添加固體之精製蔗糖(FUJIFILM Wako公司製造，製造專用，製品編號198-18385)，於室溫(25℃左右)下攪拌1小時以上。確認蔗糖充分溶解，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為約0.30 mg/mL之方式進行稀釋，利用0.2 μm之PES(聚醚碸)(Pall公司製造，Acrodisc針筒過濾器，25 mm )進行殺菌過濾，獲得包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物。醫藥組合物中之肽含量係藉由與實施例2-1同樣之方法，利用高效液相層析法測定進行定量。其結果，相對於醫藥組合物100質量份，肽之含量為0.383質量份。進而，以上述包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物成為250 μg/mL之肽濃度之方式，利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)進行稀釋，獲得投予液之醫藥組合物。對於上述包含肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物，藉由實施例1-1所記載之方法，於以下所示之測定條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定。圖20係所獲得之凝膠滲透層析圖。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 溫度：30℃
[比較例7-1-1] 將實施例7-1-1所使用之肽以成為50 mg/mL之方式溶解於二甲基亞碸(DMSO)中。利用含有10質量%蔗糖之10 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4)以肽之濃度成為0.25 mg/mL之方式進行稀釋。
[試驗例6] 腫瘤增生試驗 使用T75培養燒瓶(Corning)，於含有10%FBS之RPMI1640培養基中培養小鼠纖維肉瘤CMS5a細胞株。使用含有0.5%胰蛋白酶之PBS將經培養之細胞剝離，懸浮於含有10%FBS之RPMI1640培養基中。將懸濁液進行離心分離(400×g、5分鐘、4℃)後去除上清液。其後，使用RPMI1640培養基洗淨2次，以1×10 6個/100 μL之濃度懸浮於RPMI1640培養基中。以100 μL/個體之用量皮下移植於BALB/c小鼠之右側前背部(每組5隻)。
於投予搭載長鏈肽抗原之HA奈米凝膠癌疫苗時，於腫瘤移植7天後、10天後、13天後、及16天後，將搭載長鏈肽抗原之HA奈米凝膠癌疫苗50 μg與溶解於PBS中之50 μg之CpG寡DNA(Ajinomoto Bio-Pharma Services, GeneDesign)一起皮下投予至小鼠之右側後背部。其後，經時性地測定腫瘤面積。 於投予比較例7-1-1之長鏈肽抗原時，亦於腫瘤移植7天後、10天後、13天後、及16天後將長鏈肽50 μg與溶解於PBS中之50 μg之CpG寡DNA(Ajinomoto Bio-Pharma Services, GeneDesign)一起皮下投予至小鼠之右側後背部。其後，經時性地測定腫瘤面積。
將經時性之腫瘤面積值(平均值)示於圖23。 可知將使實施例7-1之玻尿酸衍生物(A1/A2＝6.62)與上述長鏈肽抗原複合化所獲得之搭載長鏈肽抗原之HA奈米凝膠癌疫苗與CpG寡DNA組合而成之醫藥組合物相較於將比較例7-1之上述長鏈肽抗原與CpG寡DNA組合而成之醫藥組合物，會抑制CMS5a腫瘤之增生。由此認為，藉由使用A1/A2＝6.62之玻尿酸衍生物，可提供優異之癌疫苗。
＜利用尺寸排除層析法(SEC)之峰頂(折射率強度極大點)之保持時間對免疫細胞活化及疫苗功能之影響)＞ [試驗例7] [玻尿酸衍生物之粒子尺寸分佈中之峰頂之保持時間比] 對於合成例1-1～1-3、實施例1-1～1-3、6-1、7-1、及比較例1-1～1-3、6-1、7-1、7-2中所獲得之玻尿酸衍生物及作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa)，藉由實施例1-1所記載之方法製備樣品，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 溫度：30℃
將合成例1-1～1-3、實施例1-1～1-3、6-1、7-1、及比較例1-1～1-3、6-1、7-1、7-2中所獲得之玻尿酸衍生物之峰頂保持時間Pt、及作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa)之峰頂保持時間Pr示於下述表13。又，算出玻尿酸衍生物之峰頂保持時間Pt與作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa)之峰頂保持時間Pr之比即Pt/Pr，記載於下述表13中。
[表13]
   峰頂保持時間 Pt/Pr
Pt[min] Pr[min]
合成例1-1 8.61 - 1.14
合成例1-2 8.33 - 1.11
合成例1-3 8.64 - 1.15
實施例1-1 5.99 - 0.80
實施例1-2 6.02 - 0.80
實施例1-3 5.97 - 0.79
比較例1-1 8.64 - 1.15
比較例1-2 8.42 - 1.12
比較例1-3 8.67 - 1.15
實施例6-1 6.86 - 0.91
比較例6-1 8.01 - 1.06
實施例7-1 5.97 - 0.79
比較例7-1 8.01 - 1.06
比較例7-2 8.08 - 1.07
聚丙烯酸 (50 kDa) - 7.53 -
推測於玻尿酸衍生物之峰頂保持時間Pt短於作為標準物質之聚丙烯酸(50 kDa)中之峰頂保持時間Pr的締合粒子尺寸之情形時，共同刺激分子之活化優異之締合體尺寸更多地存在，藉由使用本實施方式之醫藥組合物，能夠將肽或蛋白質之藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時提高、促進、維持或增強了免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。
＜利用GPC-SEC之平均分子量(聚丙烯酸換算)對免疫細胞活化及疫苗功能之影響＞ [試驗例8] 於以下條件下對合成例1-1～1-3、實施例1-1～1-3、6-1、7-1、及比較例1-1～1-3、6-1中所獲得之玻尿酸衍生物之重量平均分子量(Mw)及數量平均分子量(Mn)(聚丙烯酸換算)進行測定。以聚丙烯酸作為標準物質，製作校準曲線，算出以合成例1-1～1-3、實施例1-1～1-3、6-1、7-1、及比較例1-1～1-3、6-1中所獲得之玻尿酸衍生物之聚丙烯酸作為基準之各分子量。作為上述聚丙烯酸標準物質，使用PSS-Paa2k(2 kDa)、4k(4 kDa)、8k(8 kDa)、18k(18 kDa)、40k(40 kDa)、150k(150 kDa)(PSS Polymer Standard service GmbH公司製造(聚丙烯酸鈉))。將結果示於表14。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 樣品濃度：合成例、實施例、比較例中所獲得之玻尿酸衍生物為1 mg/ml，聚丙烯酸標準物質為2 mg/ml 校準曲線條件：使用3次：At3＋Bt2＋Ct＋D作為近似式
[表14]
   Mw Mw/Mn
合成例1-1 69201 2.784
合成例1-2 86393 2.293
實施例1-1 133892 2.565
實施例1-2 152674 2.073
比較例1-1 45799 2.209
比較例1-2 43722 1.826
實施例6-1 137659 2.201
比較例6-1 74840 1.825
實施例7-1 204104 2.056
推測於以聚丙烯酸作為標準物質所算出之玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw(聚丙烯酸換算)滿足11萬以上之情形時，共同刺激分子之活化優異之締合體尺寸更多地存在，藉由使用本實施方式之醫藥組合物，能夠將肽等藥效成分穩定且效率良好地傳遞至免疫細胞(尤其是cDC1、巨噬細胞)，進而，能夠提高、促進、或增強免疫細胞對該藥效成分之吸收，同時提高、促進、維持或增強了免疫細胞之活性(尤其是cDC1中之共同刺激分子CD80及CD86之表現)。
＜利用SEC(尺寸排除層析法)之分取方法)＞ [實施例8]
分取方法並不僅限於使用透析膜之區分方法。 將合成例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物以20 mg/mL溶解於注射用水中，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行分取。例如以0.1分鐘為間隔進行分取。
(測定條件) 裝置：HITACHI，CHROMASTER 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 mm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 保護管柱：TSKGEL GUARDCOLUMN SWXL (6.0 mm I.D.X 4CM) 溶離液：10 mm 磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：100 mL 檢測器：RI
分取後，藉由合成例1-1所記載之方法進行GPC分析，確認為面積比A1/A2為0.90以上之組分，而獲得目的之玻尿酸衍生物。
＜維持合適之粒子尺寸分佈之醫藥組合物之製造條件＞ [實施例9-1～9-4、比較例9-1～9-4] 對於藉由與實施例1-1同樣之方法所分取之玻尿酸衍生物，準備濃度5 mg/mL之水溶液，對含有玻尿酸衍生物之水相與油相之混合比進行詳細研究。 稱量作為肽藥物之環孢素(東京化成工業公司製造，製品編號：C2408)於6 mL之潔淨小瓶中，以肽成為50 mg/mL之濃度之方式溶解於DMSO(FUJIFILM Wako公司製造，製品編號：045-24511)中。 繼而，相對於5 mg/mL之玻尿酸衍生物400 μL，添加作為含有藥物之油相之50 mg/mL之環孢素4 μL。其後，依照下述表15使油相DMSO混合。充分混合後，以最終之玻尿酸衍生物濃度成為一定之方式，依照下述表15添加注射用水。進而，於在室溫(25℃)下保溫24小時後，於以下所示之條件下藉由凝膠滲透層析法進行測定，藉由與實施例1-1同樣之方法算出面積比A1/A2(表15)。
(測定條件) 裝置：HLC8420-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G4000SWXL(Tosoh公司製造，粒徑8 μm、內徑7.8 mm、長度30 cm，商品號：8542) 溶離液：10 mM之磷酸緩衝液(pH值為7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI 溫度：30℃
[表15]
實施例/比較例 油相DMSO混合量 (μL) 注射用水混合量 (μL) A1/A2
實施例9-1 0 396 1.46
實施例9-2 16 380 1.37
實施例9-3 36 360 1.25
實施例9-4 76 320 1.03
比較例9-1 156 240 0.69
比較例9-2 236 160 0.43
比較例9-3 316 80 0.30
比較例9-4 396 0 0.17
根據實施例9-1～9-4及比較例9-1～9-4之結果可知，藉由經由將油相與含有玻尿酸衍生物之水相之混合比設為體積比20：100～0.01：100之混合步驟，能夠維持藥效優異之玻尿酸衍生物之粒子尺寸。 [產業上之可利用性]
根據本實施方式之玻尿酸衍生物，可提供一種與藥效成分製劑化時向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異之玻尿酸衍生物。本實施方式之醫藥組合物包含上述玻尿酸衍生物，向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異。本實施方式之醫藥組合物之製造方法使用上述玻尿酸衍生物，可獲得向淋巴結內之免疫細胞之傳遞性及該免疫細胞之活化能力優異之醫藥組合物。
圖1係本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖之一例。 圖2係本實施方式之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖之一例。 圖3A係合成例1-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖3B係合成例1-2中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖3C係合成例1-3中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖4A係實施例1-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖4B係實施例1-2中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖4C係實施例1-3中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖5A係比較例1-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖5B係比較例1-2中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖5C係比較例1-3中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖5D係比較例1-4中之膽固醇基修飾聚三葡萄糖(CHP)之凝膠滲透層析圖。 圖6A係實施例1-1中之玻尿酸衍生物及實施例2-1中之醫藥組合物中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖6B係實施例1-2中之玻尿酸衍生物及實施例2-2中之醫藥組合物中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖6C係實施例1-3中之玻尿酸衍生物及實施例2-3中之醫藥組合物中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖7A係表示算出試驗例1-1中之表現CD80之吸收肽之樹狀細胞(DC)相對於吸收肽之DC之比率(%)時的FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting，螢光流式細胞分選)解析之一例之曲線圖。 圖7B係表示算出試驗例1-1中之表現CD86之吸收肽之DC相對於吸收肽之DC之比率(%)時的FACS解析之一例之曲線圖。 圖7C係表示算出試驗例1-1中之表現CD80之吸收肽之標準型1型樹狀細胞(cDC1)相對於吸收肽之cDC1之比率(%)時的FACS解析之一例之曲線圖。 圖7D係表示算出試驗例1-1中之表現CD86之吸收肽之cDC1相對於吸收肽之cDC1之比率(%)時的FACS解析之一例之曲線圖。 圖7E係表示算出試驗例1-1中之表現CD80之吸收肽之巨噬細胞(Mph)相對於吸收肽之Mph之比率(%)時的FACS解析之一例之曲線圖。 圖7F係表示算出試驗例1-1中之表現CD86之吸收肽之Mph相對於吸收肽之Mph之比率(%)時的FACS解析之一例之曲線圖。 圖8係試驗例2-1～2-8中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖9係試驗例3-1～3-6中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖10係比較例5-1中之玻尿酸之凝膠滲透層析圖。 圖11係比較例5-1及5-2中嘗試製備抗原肽-玻尿酸複合體時之混合液之照片、以及實施例7-1-1中製備抗原肽-玻尿酸衍生物複合體時之溶液之照片。 圖12係比較例5-2中之玻尿酸之凝膠滲透層析圖。 圖13係比較例6-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖14係實施例6-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖15係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之IgG抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖16係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之IgG1抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖17係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之IgG2a抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖18A係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之稀釋倍率為10(效價10 -1)時之IgG抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖18B係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之稀釋倍率為10(效價10 -1)時之IgG1抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖18C係表示實施例6-1-1及比較例6-1-1中之稀釋倍率為10(效價10 -1)時之IgG2a抗體效價(OD值)之曲線圖。 圖19係實施例7-1中之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖20係實施例7-1-1中之包含抗原肽-玻尿酸衍生物複合體之醫藥組合物之凝膠滲透層析圖。 圖21係實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖22係實施例1-1中所獲得之玻尿酸衍生物之凝膠滲透層析圖。 圖23係表示試驗例6中之經時性之腫瘤面積值(平均值)之曲線圖。
TW202402308A_112120351_SEQL.xml

Claims (16)

  1. 一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之面積A1與A2之比A1/A2為0.90以上： (i)將自作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的層析圖上之折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線、與上述玻尿酸衍生物之層析圖之交點設為Ub； (ii)將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由上述Ub至終點之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A2，將上述玻尿酸衍生物之層析圖中由起點至上述Ub之曲線、自上述折射率強度極大點Kb向上述基準線B所作之垂線、及基準線所包圍之面積值設為A1。
  2. 如請求項1之玻尿酸衍生物，其中根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，藉由以下所示之方法所算出之距離Da與Db之比Da/Db超過0.00且為1.20以下： (i)自作為標準物質之150 kDa之聚丙烯酸之層析圖上的折射率強度極大點Ka向基準線B作垂線，將與基準線之交點設為Ba，將上述折射率強度極大點Ka與上述Ba之間之長度設為La； (ii)將折射率強度成為La/20之層析圖上之2點中溶出時間較早者設為點R1，將溶出時間較晚者設為點S1； (iv)將連結上述點R1與上述點S1之直線D1與自上述折射率強度極大點Ka向基準線B所作之垂線之交點設為Ta，將自上述折射率強度極大點Kb向基準線B所作之垂線與上述直線D1之交點設為Tb； (v)將上述點R1與上述Ta之距離設為Da，將上述Ta與上述Tb之距離設為Db。
  3. 如請求項1或2之玻尿酸衍生物，其中上述面積A1與A2之比A1/A2為1.70以上。
  4. 一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖所算出之玻尿酸衍生物之折射率強度極大點下之保持時間Pt相對於作為標準物質之50 kDa之聚丙烯酸的折射率強度極大點下之保持時間Pr之比Pt/Pr為0.5以上且未達1.0。
  5. 一種玻尿酸衍生物，其係導入有固醇基之玻尿酸衍生物，且 根據藉由凝膠滲透層析法測定所求出之層析圖，基於以各分子量為2 kDa、4 kDa、8 kDa、18 kDa、40 kDa、及150 kDa之聚丙烯酸作為標準物質所製作之校準曲線所算出之玻尿酸衍生物之重量平均分子量為11萬以上且未達50萬。
  6. 如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物具有1個以上下述通式(I)所表示之重複單元： [化1] (式中，R 1、R 2、R 3、及R 4分別獨立地選自由氫原子、C 1-6烷基、甲醯基及C 1-6烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意胺基酸殘基之肽連接子； X 1為選自由以下之式所表示之基所組成之群中之基： -NR b-R、 -NR b-COO-R、 -NR b-CO-R、 -NR b-CO-NR c-R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Y a-S-R、 -O-CO-Y b-S-R、 -NR b-CO-Y b-S-R、及 -S-S-R； R a、R b及R c分別獨立地選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，此處該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NR f-所組成之群中之基； R f選自由氫原子、C 1-12烷基、胺基C 2-12烷基及羥基C 2-12烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為固醇基； Y為C 2-30伸烷基、或-(CH 2CH 2O) m-CH 2CH 2-，此處，該伸烷基可插入選自由-O-、-NR g-及-S-S-所組成之群中之基； R g選自由氫原子、C 1-20烷基、胺基C 2-20烷基及羥基C 2-20烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Y a為C 1-5伸烷基； Y b為C 2-8伸烷基或C 2-8伸烯基； m為1以上100以下之整數)。
  7. 如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述固醇基為膽固醇基。
  8. 如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物，其中相對於構成上述玻尿酸衍生物之二糖之重複單元，固醇基之導入率為30%以上60%以下。
  9. 如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為4,000以上1,000,000以下。
  10. 如請求項9之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量(絕對分子量)為5,000以上25,000以下。
  11. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物、及藥效成分。
  12. 如請求項11之醫藥組合物，其係用於預防或治療選自由癌症、感染症、及免疫疾病所組成之群中之1種以上疾病。
  13. 如請求項11之醫藥組合物，其含有選自由癌抗原、源自感染症之抗原、及免疫疾病中之自體抗原所組成之群中之至少一者作為上述藥效成分，且進而含有佐劑。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其含有癌抗原或源自感染症之抗原作為上述藥效成分。
  15. 一種醫藥組合物之製造方法，其中該醫藥組合物含有如請求項1、4或5中任一項之玻尿酸衍生物、及藥效成分， 該醫藥組合物之製造方法包括： 製備步驟，將上述藥效成分溶解於有機溶劑或含有有機溶劑之水中，而製備含有上述藥效成分之油相；及 混合步驟，以上述油相與含有上述玻尿酸衍生物之水相之混合比以體積比計成為20：100～0.01：100之方式進行混合。
  16. 如請求項15之醫藥組合物之製造方法，其中含有上述玻尿酸衍生物之水相之pH值為6.00以上11.00以下。
TW112120351A 2022-05-31 2023-05-31 玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法 TW202402308A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022088995 2022-05-31
JP2022-088995 2022-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202402308A true TW202402308A (zh) 2024-01-16

Family

ID=89024934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112120351A TW202402308A (zh) 2022-05-31 2023-05-31 玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2023234376A1 (zh)
TW (1) TW202402308A (zh)
WO (1) WO2023234376A1 (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3919072A4 (en) * 2019-01-29 2023-05-03 Mie University PREPARATION OF A CANCER VACCINE
WO2021157665A1 (ja) * 2020-02-07 2021-08-12 旭化成株式会社 ヒアルロン酸誘導体、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023234376A1 (ja) 2023-12-07
JPWO2023234376A1 (zh) 2023-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6041314B2 (ja) がん治療用ワクチン製剤
US11207418B2 (en) Synthetic nanoparticles for delivery of immunomodulatory compounds
KR20190020098A (ko) 펩타이드 백신의 제형
WO2021077770A1 (zh) 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用
EP2416801A1 (en) Immunogenic composition and uses thereof
WO2020158771A1 (ja) がんワクチン製剤
JP6400687B2 (ja) タンパク質−細胞コンジュゲート、その調製法および使用
CN118715021A (zh) 一种疫苗佐剂、其制备方法及应用
CA3075027A1 (en) Reversible linkers and use thereof
JP2014169275A (ja) 粘膜投与用ワクチン組成物
AU2002259107B2 (en) Colloidal metal compositions and methods
Shen et al. A novel liposomal recombinant lipoimmunogen enhances anti-tumor immunity
US20020110538A1 (en) Methods and products for tumor immunotherapy using cytokines
KR20090112590A (ko) 백신을 위한 인간 조직 적합성 항원(ｈｌａ) 종류 ｉ 또는 ｉｉ 분자에 결합하는 종양 관련 펩티드의 새로운 제형
US20220257752A1 (en) New use of cyclic dinucleotides
JP2021501792A (ja) ワクチンアジュバントとしての、ｇｍ３ガングリオシドの合成バリアントを含有するナノ粒子
WO2018162450A1 (en) New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells
TW202402308A (zh) 玻尿酸衍生物、醫藥組合物、及醫藥組合物之製造方法
Chen et al. Antigen-caged-adjuvant nanovaccines elicit potent humoral and cellular immune responses
WO2022025093A1 (ja) がんペプチドワクチンおよびその製造方法
Yu et al. Conjugation with loxoribine and mannan improves the immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis CFP10-TB10. 4 fusion protein
CN115581766A (zh) 一种结合PD-L1/TGFβ双功能抗体融合蛋白液体制剂
WO2024019127A1 (ja) ヒアルロン酸誘導体医薬組成物及び医薬組成物の製造方法
JP2023089973A (ja) ワクチン組成物
EP3504224A1 (en) Novel immunostimulating peptides