CN118027246A - 透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体 - Google Patents

透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体 Download PDF

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宫本佳季
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胜又彻
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Abstract

本发明提供一种透明质酸衍生物，其是引入有甾基的透明质酸衍生物，所述透明质酸衍生物的重均分子量Mw相对于数均分子量Mn之比Mw/Mn为1.11以上且10.0以下。

Description

透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体
本申请是基于以下中国专利申请的分案申请：
原案申请日：2021年02月04日
原案申请号：202180009356.X(PCT/JP2021/004158)
原案申请名称：透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体
技术领域
本发明涉及一种透明质酸衍生物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体。
本申请基于2020年2月7日在日本申请的日本特愿2020-019963号和2020年6月29日在日本申请的日本特愿2020-111674号主张优先权，将其内容援用于此。
背景技术
近年来，作为以蛋白质、肽、核酸为活性成分药品的生物药品已实用化，其数量逐年持续增加。生物药品可以满足以往的低分子药物不能满足的不充分医疗需求。然而，存在如下问题：不仅难以从消化道或粘膜等被吸收，而且在体内不稳定，血中半衰期短。因此，生物药品需要通过注射来频繁给药，给患者和医务人员均带来很大的负担。因此，需要一种药物基材(缓释性药物递送系统基材)，其能够不会损害药理活性地将生物药物胶囊化而在生物体内缓慢释放有效成分。
从这样的背景出发，在专利文献1和专利文献2中，提出了一种安全性优异的由透明质酸衍生物组成的缓释性药物释放系统基材。该透明质酸衍生物在水溶液中自发地缔合，可以在保持其生物活性的状态下高效地封入药物、特别是生物药品，在生理盐水浓度下凝聚(或者在生理盐水浓度下也分散)，并且血中滞留性良好。该透明质酸衍生物特别是在使用生物药品作为有效成分时，可以作为在保持药理活性的状态下能够高效地封入大量药物的载体和血中滞留性优异的血中缓释载体和靶向载体来使用，也可以成为能够持续缓释药物的局部(例如皮下等)缓释载体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公布第2010/053140号
专利文献2：日本特开2007-297542号公报
发明内容
发明所要解决的问题
然而，专利文献1和专利文献2中记载的透明质酸衍生物中的问题是粘度高，注射时的通针性(syringe ability)不充分。
本发明是鉴于上述情况而完成的，提供一种通针性优异的透明质酸衍生物，以及使用所述透明质酸衍生物的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体。
解决问题的技术方案
即，本发明包括以下方式：
(1)一种透明质酸衍生物，其是引入有甾基的透明质酸衍生物，
所述透明质酸衍生物的重均分子量Mw相对于数均分子量Mn之比Mw/Mn为1.11以上且10.0以下。
(2)根据(1)所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量为3000以上且160000以下。
(3)根据(1)或(2)所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的Mw/Mn为1.2以上且小于3.0。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的透明质酸衍生物，其中，相对于所述透明质酸衍生物的所述甾基的引入率为6％以上且小于60％。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物具有由下述通式(I)表示的重复单元：
[化1]
式中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
Z表示直接键合或由2个以上且30个以下的任意氨基酸残基组成的肽接头；
X1选自由下式表示的基团：
-NRb-R、
-NRb-COO-R、
-NRb-CO-R、
-NRb-CO-NRc-R、
-COO-R、
-O-COO-R、
-S-R、
-CO-Ya-S-R、
-O-CO-Yb-S-R、
-NRb-CO-Yb-S-R，以及，
-S-S-R；
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，此处该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NRf-的基团；
Rf选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基和羟基C2-12烷基，该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团；
R是甾基；
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，此处，该亚烷基任选插入选自-O-、-NRg-和-S-S-的基团；
Rg选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团；
Ya是C1-5亚烷基；
Yb是C2-8亚烷基或C2-8亚烯基；
m是1以上且100以下的整数。
(6)根据(5)所述的透明质酸衍生物，其中，所述R是胆甾基。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量Mw相对于数均分子量Mn之比Mw/Mn为1.2以上且2.9以下。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量为7000以上且120000以下。
(9)一种药物组合物，其含有所述(1)～(8)中任一项所述的透明质酸衍生物作为载体。
(10)根据(9)所述的药物组合物，其中，药物与所述透明质酸衍生物形成复合体。
(11)根据(9)或(10)所述的药物组合物，其中，药物是具有药理活性的蛋白质、肽或核酸。
(12)一种透明质酸衍生物-药物结合体，其是所述(1)～(8)中任一项所述的透明质酸衍生物结合有一个以上的药物而成。
发明效果
根据上述方式的透明质酸衍生物，可以提供一种通针性优异的透明质酸衍生物。
附图说明
图1是实施例1中的胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的1H-NMR谱图。
图2是实施例1中的透明质酸(HA)的四丁基铵(TBA)盐的1H-NMR谱图。
图3是实施例1中的引入有6-氨基己基氨基甲酸酯的HA衍生物(HA-C6-Chol)的1H-NMR谱图。
具体实施方式
下面，详细说明本发明的实施方式(以下称为“本实施方式”)，但本发明并不限定于此，可以在不脱离其主旨的范围内进行各种变形。
以下，对本说明书中使用的术语进行说明。
本说明书中使用的“C1-20烷基”术语是指碳原子数为1以上且20以下的直链状或支链状烷基，例如包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等“C1-4烷基”，进一步包括正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、n-己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、2-乙基丁基等。C1-20烷基中也包括碳原子数为1以上且12以下的C1-12烷基、碳原子数为1以上且6以下的C1-6烷基。
本说明书中使用的“C1-6烷基羰基”术语是指烷基部分已经是提及的C1-6烷基的烷基羰基，例如包括乙酰基、丙酰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、仲丁基羰基、异丁基羰基、叔丁基羰基等“C1-4烷基羰基”。
本说明书中使用的“氨基C2-20烷基”术语是指具有氨基作为取代基的碳原子数为2以上且20以下的直链状或支链状烷基，例如，氨基也可以位于烷基末端的碳原子上。氨基C2-20烷基中也包括碳原子数为2以上且12以下的氨基C2-12烷基。
本说明书中使用的“羟基C2-20烷基”术语是指具有羟基作为取代基的碳原子数为2以上且20以下的直链状或支链状烷基，例如，羟基也可以位于烷基末端的碳原子上。羟基C2-20烷基中也包括碳原子数为2以上且12以下的羟基C2-12烷基。
本说明书中使用的“C2-30亚烷基”术语是指碳原子数为2以上且30以下的直链状或支链状二价饱和烃基，例如包括亚乙基、亚丙基等，包括碳原子数为2以上且20以下的C2-20亚烷基、碳原子数为2以上且8以下的C2-8亚烷基、基团“-(CH2)n-”(此处，n为2以上且30以下，优选为2以上且20以下，更优选为2以上且15以下)。
本说明书中使用的“C1-5亚烷基”术语是指碳原子数为1以上且5以下的直链状或支链状二价饱和烃基，例如包括亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
本说明书中提及的术语“C2-8亚烯基”是指碳原子数为2以上且8以下的直链状或支链状的包含1个以上双键的二价饱和烃基，例如包括-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基、辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。在存在几何异构体的情况下，也包括各个异构体和它们的混合物。
《透明质酸衍生物》
本实施方式的透明质酸衍生物是引入有甾基的透明质酸衍生物。本实施方式的透明质酸衍生物的重均分子量Mw相对于数均分子量Mn之比Mw/Mn(以下有时称为“多分散指数”)为1.11以上且10.0以下。
通过使本实施方式的透明质酸衍生物多分散指数在上述范围内，具有响应于注射时剪切(shear)的优异的低粘度化能力，实现良好的通针性(syringe ability)。特别是通过使透明质酸衍生物的多分散指数为上述下限值以上，产生施加剪切(shear)时的分子间缠结缓和，通针性提高。
[Mw/Mn(多分散指数)]
Mw/Mn(多分散指数)为1.11以上且10.0以下，优选为1.2以上且小于3.0，优选为1.2以上且2.9以下，优选为1.3以上且2.9以下，更优选为1.3以上且2.4以下，更优选为1.3以上且2.1以下，进一步优选为1.5以上且2.1以下。
通过使Mw/Mn为上述下限值以上，可以诱发透明质酸衍生物的剪切稀释性，通过响应于注射时剪切(shear)而低粘度化，从而能够提高通针性。在Mw/Mn为上述下限值以上的情况下，低分子量透明质酸的比例变高，但透明质酸每分子所结合的修饰基团数在低分子量透明质酸中减少，因此分子间的疏水性相互作用变弱。因此，可推定为施加剪切力时的粘度的降低变大，剪切力弱时与强时的差变大。通过使Mw/Mn小于上述上限值(或以下)，能够抑制生物体内的透明质酸衍生物局部滞留性的降低。予以说明，此处的“剪切稀释性”是指随着剪切速度(shear rate)的增加而粘度降低的性质。
Mw/Mn(多分散指数)例如可以根据利用体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)确定的重均分子量Mw和数均分子量Mn来计算。Mw/Mn(多分散指数)具体地可以按照后述的实施例中记载的方法进行测定。
[重均分子量Mw]
透明质酸衍生物的重均分子量Mw没有特别限定，但从期待局部给予中的源于扩散延迟的缓释功能的角度出发，优选分子量相对较大的透明质酸衍生物，最终剂型为溶液制剂的情况下，从通针性的角度出发，优选分子量相对较小的透明质酸衍生物。因而，透明质酸衍生物的重均分子量Mw优选为3000(3kDa)以上且160000(160kDa)以下，更优选为7000(7kDa)以上且160000(160kDa)以下，更优选为7000(7kDa)以上且120000(120kDa)以下，进一步优选为7kDa以上且60kDa以下，最优选为10kDa以上且50kDa以下。
透明质酸衍生物的重均分子量Mw和数均分子量Mn可以通过使用通常具有对应的各分子量的原料进行调节。而且，也可以利用交联剂的添加和分子间交联来控制分子量。
透明质酸衍生物的重均分子量Mw和数均分子量Mn例如可以利用体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)进行测定。透明质酸衍生物的重均分子量Mw和数均分子量Mn具体地可以按照后述的实施例中记载的方法进行测定。
[甾基]
透明质酸衍生物中，甾基可以与透明质酸直接键合，也可以通过接头结合。
此处的“接头”是指可以使用能通过基因工程引入的任意肽接头，或者合成化合物接头，但在透明质酸衍生物中，优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，可以根据目的由本领域技术人员进行适当选择，优选的长度为2个氨基酸以上(上限没有特别限定，但通常为30个氨基酸以下，优选为20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。透明质酸衍生物中所含的肽接头可以使用全部相同长度的肽接头，也可以使用不同长度的肽接头。
本说明书中使用的“甾基”术语是指只要具有类固醇骨架的基团就没有特别限制。此处作为类固醇，具体地，可举出：胆固醇、胆甾烷醇、菜油甾烷醇、麦角甾醇、豆甾烷醇、粪甾烷醇、豆甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、麦角固醇、西米杜鹃醇、胆汁酸、睾丸酮、雌二醇、孕酮、皮质醇、可的松、醛甾酮、皮质酮、脱氧皮质酮等。作为甾基，可举出：胆甾基、豆甾基、羊毛甾基、麦角甾基等，其中，优选为胆甾基(特别是胆甾-5-烯-3β-基)。
[甾基引入率]
相对于透明质酸衍生物的甾基的引入率(以下有时简称为“甾基引入率”)优选为6％以上且小于60％，更优选为6％以上且50％以下，进一步优选为6％以上且40％以下，特别优选为6％以上且35％以下，最优选为8％以上且22％以下。
通过使甾基引入率在上述范围内，使透明质酸衍生物具有在纯水中或低盐浓度下良好地溶解，同时具有剪切稀释的性质，被赋予通针性能。此外，通过使甾基引入率在上述范围内的透明质酸衍生物与药物复合化并向体内给予(例如，皮下给予)，可以成为滞留在给予部位的长时间缓释制剂。
另外，从上述在给予部位的局部滞留性的提高的角度出发，甾基引入率优选为6％以上且小于35％，更优选为8％以上且33％以下，进一步优选为12％以上且22％以下。另一方面，基于因药物的凝聚抑制带来的稳定分散的角度，优选为35％以上且小于60％，更优选为35％以上且50％以下。
甾基引入率可以通过1H-NMR测定进行测定。即，可以使用1H-NMR谱图中来自透明质酸衍生物甾基的峰的积分值和来自透明质酸衍生物中所含的N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)的积分值，并根据下式来计算。予以说明。式中，nH表示峰对应的氢原子数。具体地，例如可以按照后述的实施例中记载的方法进行测定。
[甾基引入率](％)
＝[(来自甾基的峰积分值×3/nH)/(来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰积分值)]×100
作为优选的透明质酸衍生物，具体地，例如可举出：具有1个以上的由下述通式(I)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(I)”)的透明质酸衍生物等。
[化2]
(式中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
Z表示直接键合或由2个以上且30个以下的任意氨基酸残基组成的肽接头；
X1选自由下式表示的基团：
-NRb-R、
-NRb-COO-R、
-NRb-CO-R、
-NRb-CO-NRc-R、
-COO-R、
-O-COO-R、
-S-R、
-CO-Ya-S-R、
-O-CO-Yb-S-R、
-NRb-CO-Yb-S-R，以及，
-S-S-R；
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，此处该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NRf-的基团；
Rf选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基和羟基C2-12烷基，该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团；
R是甾基；
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，此处，该亚烷基任选插入选自-O-、-NRg-和-S-S-的基团；
Rg选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基，该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团；
Ya是C1-5亚烷基；
Yb是C2-8亚烷基或C2-8亚烯基；
m是1以上且100以下的整数。)
透明质酸衍生物优选包含具有1个以上的由下述通式(Ia)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(Ia)”)的透明质酸衍生物。
[化3]
(式中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
X是由-NRa-Y-NRb-COO-R表示的疏水性基团；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子和C1-6烷基；
R是甾基；
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，
m是1以上且100以下的整数。)
此处，透明质酸衍生物中分别包含2个以上的重复单元(I)或重复单元(Ia)的情况下，该重复单元可以相同，也可以不同。
透明质酸衍生物可以在重复单元(I)或重复单元(Ia)以外的位置被修饰，例如，羟基可以转化为-O(C1-6烷基)、-O(甲酰基)、-O(C1-6烷基羰基)等，羧基可以转化为酰胺或酯，也可以形成盐。
[重复单元(I)]
通式(I)中的基团“-Z-N(Ra)Y-X1”包括选自由下式表示的基团：
-NH-(CH2)mz-NH-R；
-NH-(CH2)mz-NH-COO-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R；
-NH-(CH2)mz-COO-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-COO-R、
-NH-(CH2)mz-O-COO-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-COO-R、
-NH-(CH2)mz-S-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-S-R；
-NH-(CH2)mz-O-CO-CH(R8)-CH2-S-R；
-NH-(CH2)mz-NHCO-CH(R8)-CH2-S-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NHCO-CH(R8)-CH2-S-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-CO-CH(R8)-CH2-S-R；
-NH-(CH2)mz-S-S-R；以及，
-Z-NRa-Y-NRb-COO-R
(此处，mz为2以上且30以下的整数，R8为氢原子或甲基，R和m如本说明书中所定义)。
作为该基团，优选为选自
-NH-(CH2)mz-NH-COO-R；
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R；以及，
-NH-(CH2)mz-S-S-R
(此处，mz、R和m如本说明书中所定义)的基团。
(Z)
通式(I)中，Z优选为直接键合。此外，在其它实施方式中，Z为肽接头的情况下，X1优选为-NRb-COO-R。而且，在其它实施方式中，Z可以是由-NH-[CH(-Za)-CONH]n-1-CH(-Za)-CO-表示的肽接头，此处，n为2以上且30以下的整数，Za各自独立地表示H2N-CH(-Za)-COOH所表示的α-氨基酸中的取代基。该肽接头在N末端与葡糖醛酸部分的羧基结合，在C末端与基团-N(-Ra)-Y-X1结合。作为可用作该肽接头的氨基酸残基的氨基酸例，可以使用α-氨基酸，例如可举出称为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸(Gly)、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的天然型(L型)的氨基酸、它们的D型等，包括合成的氨基酸在内的所有α-氨基酸。即，作为Za，例如可举出：-CH3、H2NC(NH)NH(CH2)3-、H2NCOCH2-等。此外，n个Z可以相同也可以不同。n为2以上且30以下的整数，优选为2以上且10以下，更优选为2以上且4以下。作为肽接头的优选例，例如可举出：-Gly-Phe-Leu-Gly-、-Asn-Phe-Phe-、-Phe-Phe-、Phe-Gly-等。
(Y)
通式(I)中，Y优选为选自-(CH2)n1-和-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-(此处，n1为2以上且20以下的整数，优选为2以上且15以下的整数，更优选为2以上且12以下的整数，进一步优选为2以上且6以下的整数。m1为1以上且4以下的整数)的基团。具体地，优选为-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)8-、-(CH2)12-或-(CH2CH2O)2-CH2CH2-。此外，从实现在纯水中以及低盐浓度下高溶解性，同时在生理盐水浓度下表现出高沉淀形成能力的角度出发，Y优选为选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)8-和-(CH2)12-的基团，更优选为-(CH2)6-。
Y例如也可以是-CH2CH2O-CH2CH2-S-S-CH2CH2O-CH2CH2-、-(CH2CH2O)2-CH2CH2-S-S-CH2CH2O-CH2CH2-、-CH2CH2O-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2-、-(CH2CH2O)2-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2-等。
(Ya)
作为Ya，优选为-CH2-或-CH2-CH2-。
(Yb)
作为Yb，优选为-CH2-CH2-、-CH(CH3)CH2-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基或辛-2,4,6-三烯-1,8-二基，更优选为-CH2-CH2-或-CH(CH3)CH2-。
作为基“-Z-N(Ra)Y-X1”的具体例，可举出：-NH-(CH2)2-NH-CO-胆甾基、-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-CO-NH-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-CO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-胆甾基等。作为优选的基团“-Z-N(Ra)Y-X1”，Ra、Rb和Rc为氢原子，Y为直链状的C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，Ya为直链状的C1-5亚烷基，或者Yb为直链状的C2-8亚烷基或直链状的C2-8亚烯基。
[重复单元(Ia)]
通式(Ia)中，X优选为-NH-(CH2)2-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)6-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)12-NH-COO-胆甾基或-NH-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-COO-胆甾基，更优选为-NH-(CH2)2-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)6-NH-COO-胆甾基或-NH-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-COO-胆甾基。
透明质酸衍生物除了重复单元(I)之外，还可以进一步包含由通式(II)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(II)”)。
[化4]
(式中，R1a、R2a、R3a和R4a各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
Xa选自羟基和-O-Q+；此处，Q+是抗衡阳离子。)
此处，在透明质酸衍生物包含2个以上重复单元(II)的情况下，该重复单元可以相同，也可以不同。
在其它实施方式中，透明质酸衍生物也可以是实质上由重复单元(I)、重复单元(Ia)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物。
[重复单元(II)]
通式(II)中，Q+只要是在水中与羧基形成盐的抗衡阳离子，就没有特别限定，在二价以上的情况下，根据价数与多个羧基形成盐。作为抗衡阳离子的例子，可举出：锂离子、钠离子、铷离子、铯离子、镁离子、钙离子等金属离子；由式：N+RjRkRlRm(式中，Rj、Rk、Rl和Rm各自独立地选自氢原子和C1-6烷基)表示的铵离子等。其中，Q+优选为钠离子、钾离子或四烷基铵离子(例如，四正丁基铵离子等)。Rj、Rk、Rl和Rm优选为选自C1-6烷基的相同基团，优选为正丁基。
R1、R2、R3和R4，以及R1a、R2a、R3a和R4a全部优选为氢原子。此外，Ra和Rb均优选为氢原子。
其中，透明质酸衍生物优选为实质上由重复单元(I)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物。透明质酸衍生物在由该衍生物中所含的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺构成的二糖重复单元中，例如80％以上，优选90％以上，更优选95％以上为重复单元(I)和重复单元(II)。透明质酸衍生物可以仅由重复单元(I)和重复单元(II)构成。
<透明质酸衍生物的制造方法>
本实施方式的透明质酸衍生物例如通过将葡糖醛酸的羧基转化为酰胺，并引入甾基，从而得到透明质酸衍生物。此外，通过调整与之反应的具有甾基的化合物相对于原料透明质酸或其衍生物的配入量，可以使甾基引入率为6％以上且小于60％。
作为将葡糖醛酸的羧基转化为酰胺，并引入甾基的方法，具体地，例如可举出：将原料透明质酸或其衍生物，优选为仅由重复单元(II)构成的透明质酸或其衍生物进行离子交换为四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，并在适当的缩合剂存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与引入有由式：“HNRa-Y-NRb-R、NHRa-Y-NRb-COO-R、HNRa-Y-NRb-COO-R、HNRa-Y-NRb-CO-R、HNRa-Y-NRb-CO-NRc-R、HNRa-Y-COO-R、HNRa-Y-O-COO-R、HNRa-Y-S-R、HNRa-Y-CO-Ya-S-R、HNRa-Y-O-CO-Yb-S-R、HNRa-Y-NRb-CO-Yb-S-R、HNRa-Y-S-S-R或-Z-NRa-Y-NRb-COO-R(式中，Ra、Rb、Rc、Y、Ya、Yb、Z和R如本说明书中所定义)”表示的甾基(特别是胆甾基)的胺反应的方法。
可以在上述反应中使用的缩合剂没有特别限定，例如可举出：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉(DMT-MM)、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。
特别是，虽然没有限定，但DMT-MM基于在水与有机溶剂的混合溶剂中也高效率进行反应的角度而优选。此外，通过使用DMT-MM作为缩合剂，可以在大量羟基共存的体系中，在抑制酯键形成的同时，高选择性地进行氨基与羧基形成酰胺键。通过使用该缩合剂，例如可以防止作为溶剂的醇与透明质酸部分的羧基进行反应或透明质酸部分中同时存在的羧基和羟基在分子内或分子间键合，导致形成不需要的交联。
作为甾基引入反应中使用的溶剂，可举出：水、DMSO、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、多元醇、乙腈、DMF、THF、二氯甲烷、氯仿、己烷、二乙醚、乙酸乙酯，以及它们的混合溶剂等。作为多元醇，可举出与上述“(B)醇”中例示的相同的多元醇，其中，优选为乙二醇。
或者，也可以将原料透明质酸或其衍生物离子交换为四烷基铵盐(例如，四丁基铵(TBA)盐)，并在适当的缩合剂存在下，在溶剂中使该透明质酸盐与间隔基团部分反应(此时，也可以根据需要进行保护和去保护反应)，将原料透明质酸或其衍生物的羧基(-COOH)转化，然后与适当的试剂进行反应。衍生自羧基的基团与反应试剂的组合例子如下所示。
-CONRa-Y-NRbH+Hal-R；
-CONRa-Y-NRbH+Hal-COOR；
-CONRa-Y-NRbH+HOCO-R；
-CONRa-Y-NRbH+Hal-CO-R；
-CONRa-Y-NRb-COOH+HNRc-R；
-CONRa-Y-NRb-CO-NRCH+Hal-R；
-CONRa-Y-NRbH+HOCO-NRc-R；
-CONRa-Y-NRbH+Hal-CO-NRc-R；
-CONRa-Y-COOH+HO-R；
-CONRa-Y-OH+Hal-COO-R；
-CONRa-Y-OCOOH+HO-R；
-CONRa-Y-OCOOH+Hal-R；
-CONRa-Y-OCO-Hal+HO-R；
-CONRa-Y-SH+Hal-R；
-CONRa-Y-Hal+HS-R；
-CONRa-Y-CO-Ya-Hal+HS-R；
-CONRa-Y-CO-Ya-SH+Hal-R；
-CONRa-Y-O-CO-CH＝CH2+HS-R；
-CONRa-Y-NRb-CO-CH(CH3)＝CH2+HS-R；
-CONRa-Y-SH+HS-R；
-COZ-OH+HNRa-Y-NRb-COO-R；
-COZ-NRa-Y-NRbH+Hal-COO-R
(式中，Ra、Rb、Rc、Y、Ya、Yb和Z如本说明书中所定义，Hal表示选自氟原子、氯原子、溴原子和碘的卤素原子)。
作为反应方式，可举出：脱卤化氢反应、缩合反应、脱水反应、迈克尔加成等亲核加成反应、氧化的二硫化物形成反应等，这些是公知的反应，本领域技术人员可以适当选择，发现优选的反应条件来进行。转化体或反应物具有羧基时，也可以制成N-羟基琥珀酰亚胺(以下称为也称为“NHS”)酯进行反应。
另外，可举出如下方法：使2-氨基乙基2-吡啶基二硫化物与原料透明质酸或其衍生物的羧基反应，制备引入有末端具有被离去基团修饰的巯基的间隔基团的透明质酸衍生物，使巯基胆固醇与其进行亲核取代反应而形成二硫键。
而且，也可举出如下方法：制备透明质酸或其衍生物的羧基上引入一部分间隔基团的所得物和甾基上引入一部分间隔基团的所得物，使它们反应。具体例中的一部分如上所述，进一步，在Y中插入-S-S-的情况下，也可举出如下方法：分别制备在透明质酸的羧基上引入末端具有巯基的间隔基团的透明质酸衍生物和引入末端具有巯基的间隔基团的甾基，使它们发生氧化反应形成二硫键。这时，也可以使其中一个巯基与2-巯基吡啶反应形成二硫化物后，再与另一个巯基进行取代。
另外，在制备本发明的透明质酸衍生物之后，还可以进一步引入其它取代基。可以通过将例如，实质上由重复单元(I)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物中的羧基的0.1％以上且99.5％以下、优选10％以上且40％以下转化为-CO-Xz、[此处，Xz选自以下基团：
-NH-(CH2)p1-O-CO-C(R17)＝CH2；
-NH-(CH2)p1-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-C(R17)＝CH2；
-NH-(CH2)p1-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-(CH2)r-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH；
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH；
-NH-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-O-CO-C(R17)＝CH2；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-C(R17)＝CH2；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-C(＝NH)-(CH2)3-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)r-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH；
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH；
-NH-CH(CO2H)-(CH2)-SH；
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-SH；以及，
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-CONH-CH(CONH-CH2-CO2H)-CH2-SH
(此处，R17表示氢原子或C1-6烷基，p1表示2以上且10以下的整数，q表示1以上且200以下的整数，r表示1以上且3以下的整数)]，使在分子内或包含其他分子的分子间交联而凝胶化。
通过化学交联使透明质酸衍生物凝胶化的步骤可以适当选择其条件。交联的条件有交联方法、聚合物浓度、交联剂浓度、溶剂、溶剂pH、盐浓度、温度、时间等。
在使透明质酸衍生物凝胶化的步骤中，形成交联的反应条件中，例如通过提高化学交联时的聚合物浓度和可形成交联的基团的引入率，可以提高所生成凝胶的交联密度。
对于使透明质酸衍生物凝胶化的步骤中的交联剂浓度，在使用两端具有可形成交联的基团的交联剂时，优选该基团以没有过量或不足而能够迅速参与交联反应的浓度添加。例如，在使用DTT通过迈克尔加成反应使引入有甲基丙烯酰基(MA基)的聚合物交联的情况下，优选MA基：SH基＝3:1～1:3，特别优选为2:1～1:2。
在使透明质酸衍生物凝胶化的步骤中的溶剂优选可以充分溶解聚合物和交联剂的溶剂，虽然没有特别限定，但优选使用水、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和选自这些中的混合溶剂。此外，也可以混合使用与这些溶剂混合的有机溶剂。虽然没有特别限定，但作为混合的有机溶剂，例如可举出：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、多元醇、丙酮、乙腈等。作为多元醇，可举出与上述“(B)醇”中例示的相同的多元醇，其中，优选为乙二醇。
透明质酸衍生物由于在水溶液中形成纳米微粒，因此通过在稀薄条件下交联，能够形成纳米尺寸的微粒凝胶，可以用作血中缓释载体、靶向载体。稀薄条件是指10mg/mL以下，优选为5mg/mL以下，进一步优选为1mg/mL以下。另一方面，通过在高浓度条件下进行交联，能够形成微粒彼此交联而成的本体凝胶(Bulk Gel)。这作为皮下缓释型载体是有用的。高浓度条件是指5mg/mL以上，优选为20mg/mL以上，进一步优选为40mg/mL。
使透明质酸衍生物凝胶化的步骤可以以本体进行，也可以在乳液中或喷雾液滴中等非连续相中进行。例如，在W/O乳液中进行的情况下，只要将溶解有聚合物、交联剂等的水相在不与水混合的溶剂中乳化，进行凝胶化反应即可。不与水混合的溶剂虽然没有特别限定，但例如可举出：己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、中链脂肪酸甘油三酯(MCT)、液体石蜡、大豆油等。还可以添加用于使乳化稳定化的表面活性剂。此外，例如可以在超临界二氧化碳中或PEG中等可去溶剂化的溶剂中进行。这种情况下，通过使溶解有聚合物和交联剂等的水相或有机溶剂相在前例的溶剂中乳化并分散，从而在去溶剂化(溶剂扩散)的同时聚合物浓缩得以完成，因此能够得到更高交联密度的凝胶。
使透明质酸衍生物凝胶化的步骤及其后，也可以进行停止交联反应的操作和使残留的交联性官能团失活或进行冲洗的操作。从安全性的角度、保存中稳定性的角度、与被封入的药物发生副反应等角度出发，优选除去未参与反应的交联性官能团、仅结合交联剂一端的基团、残留的交联剂等。虽然没有特别限定，但例如，在残留未反应的交联剂的情况下，可以通过用过量的水等冲洗来除去。此外，例如在聚合物中所取代的甲基丙烯酰基残留的情况下，也可以在添加过量的巯基乙醇等，使甲基丙烯酰基失活，然后用过量的水等冲洗剩余的巯基乙醇。进一步，例如在残留巯基的情况下，可以添加过量的3-马来酰亚胺基丙酸、碘乙酸等，使巯基失活，然后用过量的水等冲洗剩余的3-马来酰亚胺基丙酸、碘乙酸而除去。
在使透明质酸衍生物凝胶化的步骤之后，也可以进行粉碎步骤。作为粉碎方法，可举出：使用研棒和研钵的粉碎或使用研磨机的粉碎，优选使用研磨机的粉碎。作为研磨机粉碎装置，可举出：离心式粉碎机(日本精机制作所)和冲击研磨机(道尔顿公司)等旋转圆盘式粉碎装置、喷雾器(东京喷雾器制造公司)、样品研磨机(东京喷雾器制造公司)、Bantam研磨机(东京喷雾器制造公司)和SK研磨机(Tokken公司)等筛网研磨机的粉碎装置、超微少量实验室喷射研磨机(A-O喷射研磨机、Seishin企业)等喷射粉碎装置，以及可在超低温下粉碎的linrex研磨机(Liquid Gas公司)等，优选为SK研磨机和linrex研磨机。
在使透明质酸衍生物凝胶化的步骤之后，也可以进行干燥步骤。作为干燥方法，例如可举出：通风干燥、在恒温槽中的干燥、减压干燥、热风循环式干燥等。风速、干燥时间、温度、压力等可在透明质酸衍生物的凝胶不产生分解和变质的范围内适当选择。
《药物组合物》
本实施方式的药物组合物含有上述透明质酸衍生物作为载体。本实施方式的药物组合物中，优选载体与药物直接或间接键合，形成复合体，处于相互不游离的状态。在将该药物组合物给予到生物体内时，药物从载体中缓慢游离，能够期待良好的缓释性。载体与药物间的结合虽然不论共价键、非共价键均可，但基于保持药物活性的角度，优选为非共价键。
本实施方式的药物组合物中，优选药物与载体透明质酸衍生物形成复合体。认为在溶剂中，通过透明质酸衍生物的甾基与存在于体系中的药物间的疏水性相互作用而自发性缔合，从而形成药物与透明质酸衍生物的复合体。通过形成该复合体，可期待该药物的保存稳定性提高、生物活性的保持、缓释性的提高、与水的溶解性提高、对热和光等刺激的抵抗力的提高、抑制凝聚与沉淀等。
<药物>
本实施方式的药物组合物中所含的药物只要可以作为人、动物用药品使用的药物，就没有特别限定。例如可举出：蛋白质、肽、多糖类、核酸、低分子化合物等。本实施方式的药物组合物优选含有具有药理活性的蛋白质、肽、核酸等生物药品或低分子化合物与透明质酸衍生物形成复合体。通过形成该复合体，可期待药品的化学稳定性的提高、凝聚抑制，酶的分解抑制效果等。
[低分子化合物]
作为低分子化合物，例如可举出：抗癌剂(例如，烷基化剂、抗代谢物、生物碱等)、免疫抑制剂、抗炎剂(类固醇剂、非类固醇剂类抗炎剂等)、抗风湿剂、抗菌剂(β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、新喹诺酮类抗生素、磺胺剂等)等。
[蛋白质和肽]
作为蛋白质和肽，例如可举出：促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α、β、γ、(INF-α、β、γ)、促血小板生成素(TPO)、睫状神经营养因子(CNTF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNFbp)、白细胞介素-10(IL-10)、FMS类似酪氨酸激酶(Flt-3)、生长激素(GH)、胰岛素、胰岛素类似生长因子-1(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源性神经营养因子(BDNF)、角质化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、骨保护素(OPG)、瘦素、甲状旁腺激素(PTH)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、骨形成蛋白(BMP)、心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、C型钠尿肽(CNP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、疫苗用抗原、抗体、双抗体、微抗体、碎片抗体、PEG化蛋白(例如，PEG化干扰素-α-2a、PEG化干扰素-α-2b、PEG化GCSF、PEG化hG11拮抗剂B2036等)等。
[核酸]
作为核酸，例如可举出：DNA、RNA、反义核酸、诱饵(decoy)核酸、核酶、低分子干扰RNA、核酸适体等。
<形态>
本实施方式的药物组合物可以是分散性微粒溶液，可以是沉淀性悬浮液，也可以是冷冻干燥物。此外，在是冷冻干燥物的情况下，医生在给予前加入生理盐水等等渗液而可成为事先制备给予液类型的沉淀型缓释制剂。这种情况下，认为适用于以溶液状态包含不稳定活性成分的药物组合物。
在本实施方式的药物组合物为分散性微粒溶液或沉淀性悬浮液的情况下，药物组合物中的透明质酸衍生物的浓度优选为1mg/mL以上且200mg/mL以下，更优选为4mg/mL以上且100mg/mL以下，进一步优选为4mg/mL以上且50mg/mL以下，特别优选为4mg/mL以上且12mg/mL以下。通过使药物组合物中的透明质酸衍生物的浓度在上述范围内，在制成注射剂时可以使粘度更良好。此外，也可以使使用本实施方式的透明质酸衍生物的注射剂的通针性更良好。
《透明质酸衍生物-药物结合体》
本实施方式的透明质酸衍生物-药物结合体的上述透明质酸衍生物结合有一个以上的药物。
适于形成本实施方式的透明质酸衍生物-药物结合体组合物的药物是蛋白质、肽、核酸等生物药品或低分子化合物。
本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物并不限定于已说明的形态，也可以是纳米微粒、微粒、溶液、乳液、悬浮液、凝胶、胶束、植入物、粉末或膜的形态。粉末可以将通过冷冻干燥或喷雾干燥而得到的固体进行粉碎来制造，也可以由将沉淀物干燥后所得物来制造。
本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物可以经由口服、肠道外、鼻腔内、阴道内、眼内、皮下、静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内、脑内或口腔内的途径进行给予。此外，本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物并不限定于注射剂，也可以是贴剂或微针制剂、涂敷药、滴眼药、喷雾药、吸入药、皮肤填充剂等。
另外，本实施方式的透明质酸衍生物不仅可以用作药物组合物，还可以用作化妆品组合物、检测试剂组合物、医疗器械的保存剂和表面涂层剂。
作为化妆品组合物，可以含有生理活性成分。作为生理活性成分的种类，虽然没有特别限定，但例如可举出：抗老化剂、紧致剂、抗炎剂、美白剂、保湿剂、血液循环促进剂、维生素类、氨基酸、肽、神经酰胺类、创伤治愈促进剂、紫外线防护剂、刺激缓解剂、细胞活化剂、酶成分等。
作为检测试剂组合物，可以含有用于检测的成分和其他成分。作为用于检测的成分，可以使用负载有抗体的聚合物粒子、无机粒子、平膜等。作为其他成分，可以含有载体、生理盐水、防腐剂(叠氮化钠、苯扎氯铵、氯丁醇等)、稳定剂(丙二醇、抗坏血酸等)、赋形剂(乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇等)、缓冲剂(月桂基硫酸钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝等)、保存剂(苯扎氯铵、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯等)等。
作为医疗器械的保存剂和表面涂层剂，可以含有增稠剂、维生素类、氨基酸、肽、稳定剂、杀菌剂等。作为医疗器械，可举出：内窥镜、人工关节、假牙、支架、隐形眼镜、导管、导丝、手指结构体、人工心脏、人工肌肉纤维等。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行详细说明，但这些并不意在将本发明的范围限制于实施例。
实施例和比较例中制造的透明质酸衍生物的各物理性质的测定方法和评价方法如下所述。
[物理性质1]
(透明质酸衍生物的重均分子量Mw和重均分子量相对于数均分子量之比Mw/Mn)
透明质酸衍生物的重均分子量Mw和数均分子量Mn利用体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)测定。将透明质酸衍生物(20mg)溶于超纯水(10mL)中并在室温下搅拌12小时以上，得到透明质酸衍生物水溶液(2mg/mL)。向该透明质酸衍生物水溶液(750μL)中加入300mM羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)水溶液(750μL)并使用震荡机混合10秒，在37℃孵育1小时。然后，将得到的试样供于SEC-MALS测定来确定重均分子量Mw和数均分子量Mn。SEC-MALS测定的条件如下所示。此外，重均分子量相对于数均分子量之比Mw/Mn通过由SEC-MALS的测定结果将重均分子量Mw除以数均分子量Mn来计算。
(测定条件)
色谱柱：TSKgel GMPWXL(东曹公司制)2根
柱温度：30℃
洗脱液：加入10mM HP-β-CD的磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)
流速：1mL/分
注入量：200μL
[物理性质2]
(甾基引入率)
透明质酸衍生物甾基引入率由1H-NMR测定来确定。首先，以质量比99：1混合二甲基亚砜-d6(99.9v/v％，含有0.05v/v％的三甲基甲硅烷基(TMS)，富士膜和光制)和20％氯化氘(99.5v/v％、富士膜和光制)，制备成测定溶剂。接着，向该测定溶剂(0.6mL)中添加透明质酸衍生物(2mg)，用超声波浴处理30分钟使其完全溶解，供于1H-NMR测定。1H-NMR测定使用傅立叶变换核磁共振装置(FT-NMR装置)(ECS400，日本电子公司制)在样品温度85℃下进行。甾基引入率根据来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)的积分值和来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)的积分值，并使用如下所示的式计算出相对于透明质酸单元的胆甾基的引入率。予以说明，由于在来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰与来自胆甾基的峰(5H)重叠，因此将由1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰的积分值减去来自胆甾基甲基的峰(0.7ppm)的积分值乘以5/3倍后的值而计算出的值(即，积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3)作为来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰的积分值，用于甾基引入率的计算。
[甾基引入率(％)]
＝[(来自胆甾基中甲基的峰积分值)/(来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰积分值)]×100
＝[积分值(0.7ppm)/{积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3}]×100
[评价1]
<应变速率依赖性试验>
响应于透明质酸衍生物剪切的低粘度化能力、即剪切稀释性通过以下所示的操作步骤确定。
首先，向透明质酸衍生物中加入超纯水，搅拌12小时以上使其溶解，以4mg/mL的浓度得到透明质酸衍生物水溶液。该水溶液供于应变速率依赖性试验。应变速率依赖性试验的条件如下所示。
(测定条件)
测定装置：TA仪器制ARES
测定温度：25℃
几何形状：50mmΦ锥板
剪切速度：0.25s-1以上且1000s-1以下
测定时间：每个点60s
透明质酸衍生物的剪切稀释性基于如下所示的式计算。
〔剪切稀释性〕
＝(剪切速度1s-1时的粘度[mPa·s])/(剪切速度1000s-1时的粘度[mPa·s])
<透明质酸衍生物的制造>
[实施例1]
(透明质酸衍生物HA-a1的制造)
透明质酸衍生物按照如下步骤1～步骤3进行制备。
1.步骤1
(胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的合成)
胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐(Chol盐酸盐)按照如下所示的步骤1-1，接着按照步骤1-2进行合成。
(步骤1-1)
在氩气气氛下，向胆固醇氯甲酸酯(3.37g、7.5mmol)的无水二氯甲烷(20mL)溶液中加入三乙胺(TEA、1.05mL)并进行搅拌。在冰冷却下，滴加6-(叔丁氧基羰基)氨基-1-氨基己烷(1.12mL，5mmol)，直接在冰冷却下搅拌30分钟，然后升温至室温，搅拌该混合物过夜。将反应混合物用超纯水和饱和盐水进行冲洗，用无水硫酸镁干燥，然后减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣用硅胶柱色谱(洗脱液：乙酸乙酯：正己烷＝1：4)进行纯化，合并目标物馏分，减压蒸馏除去溶剂。
(步骤1-2)
将得到的残渣溶于乙酸乙酯(40mL)中，加入4N盐酸/乙酸乙酯溶液(40mL)在室温搅拌过夜。产生的沉淀物通过离心分离回收。将得到的固体用乙酸乙酯冲洗4次，然后减压下进行干燥，得到胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐(Chol盐酸盐)1.2g。生成物的1H-NMR谱图(ECS400日本电子公司制，EtOH-d6)示于图1中。
2.步骤2
(透明质酸的四丁基铵(TBA)盐的制备)
透明质酸的TBA盐(HA-TBA)按照如下所示的步骤2-1，接着按照步骤2-2进行制备。
(1)步骤2-1
使DOWEX(注册商标)50WX-8-400(Aldrich公司制)悬浮于超纯水中，通过倾析用超纯水冲洗树脂3次左右。相对于树脂的阳离子交换能力加入约1.5倍摩尔等量的40wt％四丁基氢氧化铵水溶液(TBA-OH)(Aldrich公司制)，搅拌30分钟。剩余的TBA-OH溶液通过倾析除去后，进一步用过量的超纯水进行冲洗，由此得到TBA氯化后的阳离子交换树脂。
(2)步骤2-2
将重均分子量50,000(50kDa)的原料透明质酸钠盐(HA-Na)以15mg/mL的浓度溶于超纯水中。相对于HA单元(单元分子量401.3)的摩尔数以树脂的离子交换能力计添加5倍摩尔等量的“(1)步骤2-1”中TBA氯化后的阳离子交换树脂的悬浮液。搅拌15分钟后，用0.45μm的滤器进行过滤，将滤液冷冻干燥，得到透明质酸的TBA盐(HA-TBA)，为白色固体。生成物的1H-NMR谱图(ECS400日本电子公司制，EtOH-d6)示于图2中。
3.步骤3
制备“2.(2)步骤2-2”中制备的HA-TBA的无水DMSO溶液(10mg/mL)。然后，相对于“1.步骤1”中合成的存在于HA-TBA中的二糖重复单元(HA单元)，Chol盐酸盐的添加量以摩尔比为15/100进行添加。接着，相对于HA单元的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)的添加量以摩尔比为21.6/100进行添加，在室温搅拌过夜。反应溶液依次用0.3M乙酸铵/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超纯水进行透析(Spectra 4，截留分子量(MWCO)：12,000以上且14,000以下)。将得到的透析液冷冻干燥而得到目标物(HA-C6-Chol)，为白色固体。生成物的1H-NMR谱图示于图3中。确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)，来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)。
[实施例2～31]
(透明质酸衍生物HA-a2～HA-a31的制造)
“2.(2)步骤2-2”中，使用的原料透明质酸钠盐(HA-Na)的分子量是如表1至表7所示的值，“3.步骤3”中，相对于HA单元的Chol盐酸盐的添加量，以及相对于HA单元的DMT-MM的添加量以摩尔比为如表1和表2所示的比率，除此之外，使用与实施例1相同的方法，得到各透明质酸衍生物。对得到的透明质酸衍生物进行1H-NMR测定，各透明质酸衍生物中均确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)，来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)。
[实施例32]
(透明质酸衍生物HA-a32)
“2.(2)步骤2-2”中，使用的原料透明质酸钠盐(HA-Na)的分子量是如表8所示的值，“3.步骤3”中，相对于HA单元的Chol盐酸盐的添加量，以及相对于HA单元的DMT-MM的添加量以摩尔比如表1和表2所示的比率，进一步添加1,6-二氨基己烷，除此之外，使用与实施例1相同的方法，得到各透明质酸衍生物。对得到的透明质酸衍生物进行1H-NMR测定，各透明质酸衍生物中均确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)，来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)。
[比较例1]
(透明质酸衍生物HA-b1的制造)
透明质酸衍生物按照如下步骤1～步骤3进行制备。
1.步骤1
(胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的合成)
使用与实施例1相同的方法，合成Chol盐酸盐。
2.步骤2
(透明质酸的四丁基铵(TBA)盐的制备)
透明质酸的TBA盐(HA-TBA)按照如下所示的步骤2-1、步骤2-2，接着按照步骤2-3进行制备。
(1)步骤2-1
将透明质酸钠盐(HA-Na、50kDa、Mw/Mn1.2)溶于超纯水中至10mg/mL的浓度。对该溶液用超纯水进行透析(Spectra 6，截留分子量(MWCO)：50,000)。将得到的透析液冷冻干燥而得到目标物(HA-Na)，为白色固体。
当生成物利用体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)测定重均分子量和数均分子量时，确认到重均分子量Mw为50000，Mw/Mn(多分散指数)为1.1。
(2)步骤2-2
使用与实施例1中的“2.(1)步骤2-1”相同的方法，制作TBA氯化后的阳离子交换树脂。
(3)步骤2-3
使用上述“(1)步骤2-1”中得到的重均分子量Mw为50,000(50k)的透明质酸钠盐(HA-Na)，除此之外，使用与实施例1中的“2.(2)步骤2-2”相同的方法，得到透明质酸的TBA盐(HA-TBA)，为白色固体。
3.步骤3
使用上述“2.(3)步骤2-3”中得到的HA-TBA，除此之外，使用与实施例1中的“3.步骤3”相同的方法，得到目标物(HA-C6-Chol)，为白色固体。对得到的HA-C6-Chol进行1H-NMR测定，确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)，来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)。
[比较例2～7]
(透明质酸衍生物HA-b2～HA-b7)
在比较例1中的“2.(1)步骤2-1”中，使用的透明质酸钠的重均分子量和Mw/Mn(多分散指数)是如表2所示的值，在比较例1中的“3.步骤3”中，相对于HA单元的Chol盐酸盐的添加量，以及相对于HA单元的DMT-MM的添加量以摩尔比如表2至表7所示的比率，除此之外，使用与比较例1相同的方法，得到各透明质酸衍生物。对得到的透明质酸衍生物进行1H-NMR测定，各透明质酸衍生物中均确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3，1.6ppm以上且2.0ppm以下，3H)，来自胆甾基中甲基的峰(CH3，0.7ppm，3H)。
对于在实施例和比较例中得到的透明质酸衍生物，使用上述方法测定各物理性质，进行各种评价。结果示于表1至表8中。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
由表1可知，重均分子量Mw为50kDa且Mw/Mn(多分散指数)为1.11以上范围的透明质酸衍生物HA-a1～HA-a5(实施例1～5)中，剪切稀释性良好，为1.8以上且6.0以下。此外，如果施加较大剪切(速度1000s-1)时的粘度为2.9mPa·s以上且6.0mPa·s以下，则粘度低，有助于通针性提高。另一方面，在重均分子量Mw为50kDa且多分散指数为1.1的透明质酸衍生物HA-b1(比较例1)中，剪切稀释性为1.5，在施加较大剪切(速度1000s-1)时的粘度不佳，为7.9mPa·s。此外，与多分散指数为1.2(实施例1)相比，多分散指数为1.3(实施例2)的剪切稀释性更良好。
另外，根据表2，在重均分子量Mw为120kDa且多分散指数为1.11以上范围的透明质酸衍生物HA-a6至HA-a10(实施例5和6)中，与多分散指数为1.1的比较例2相比，剪切稀释性也为良好。
另外，在多分散指数为相同程度但重均分子量不同的透明质酸衍生物HA-a3、HA-a9和HA-a10(实施例3、9和10)中，观察到重均分子量越大，则剪切稀释性更趋于良好。
根据表4，即使在使甾基的引入率变更为19％的情况下，与同样多分散指数为1.1的比较例4相比，在多分散指数大于1.11时，剪切速度1000S-1时的粘度也低，剪切稀释性也为良好。
由表5可知，在重均分子量Mw为10kDa且多分散指数为1.5以上且1.7以下范围的透明质酸衍生物HA-a19和HA-a20(实施例19和20)中，剪切稀释性为1.3以上且2.1以下，在施加较大剪切(1000s-1)时的粘度良好，为1.4mPa·s以上且1.5mPa·s以下。另一方面，在多分散指数为1.1的透明质酸衍生物HA-b5(比较例5)中，剪切稀释性为1.0，在施加较大剪切(1000s-1)时的粘度不佳，为1.9mPa·s。
另外，由表6可知，在重均分子量Mw为10kDa、甾基引入率设为33％且多分散指数为1.7的透明质酸衍生物HA-a25(实施例25)中，剪切稀释性为1.9，在施加较大剪切(1000s-1)时的粘度良好，为2.3mPa·s。另一方面，在多分散指数为1.1的透明质酸衍生物HA-b6(比较例6)中，剪切稀释性为1.0，在施加较大剪切(1000s-1)时的粘度不佳，为2.6mPa·s。
另外，由表7可知，在重均分子量Mw为10kDa且甾基引入率设为8％的情况下，与多分散指数为1.1时相比，在为1.11以上时，也显示出良好的剪切稀释性。
另外，在多分散指数为相同程度且甾基引入率不同的透明质酸衍生物HA-a20、HA-a25和HA-a30(实施例20、25和30)中，观察到如果甾基引入率变小，则剪切稀释性更趋于良好。
根据表8，在通过使重均分子量10kDa的原料HA-Na交联而得到35k的透明质酸衍生物HA-a32的情况下，与为相同的重均分子量且多分散指数低为1.1的HA-b4(比较例4)相比，显示出良好的剪切稀释性。由此可知，重要的是最终的分子量和分子量分布，而不是原料。
[实施例33]
(透明质酸衍生物与蛋白质的复合化)
将实施例25中得到的透明质酸衍生物HA-a25以45.0mg/mL的浓度溶于纯水中，将得到的透明质酸衍生物HA-a25水溶液1.0mL与另外溶解而成的hGH(人生长激素)水溶液(9mg/mL)0.5mL混合，通过在37℃孵育24小时，得到30mg/mL的透明质酸衍生物HA-a25和3mg/mL的hGH的复合液。然后，通过加入2×PBS1.5mL，生成透明质酸衍生物HA-a10与hGH复合体的沉淀。在相当于9000G的条件下，离心分离10分钟，当对上清液进行凝胶渗透色谱(GPC)测定(测定条件如下所示)时，未观察到来自hGH的峰，确认到被完全复合化。
(GPC条件)
装置：HLC8320-GPC(东曹公司制)
色谱柱：G2000SWXL
洗脱液：10mM PBS(pH7.4)
流速：1mL/min
注入量：50μL
检测器：RI或UV280nm
温度：30℃
[实施例34]
(透明质酸衍生物与PEG化蛋白质的复合化)
除了使用PEG化G-CSF代替hGH之外，使用与实施例33相同的方法，得到透明质酸衍生物HA-a25与PEG化G-CSF的复合体。此外，在与实施例33相同条件的GPC测定中，上清液中未观察到来自PEG化G-CSF的峰，确认到被完全复合化。
[实施例35]
(透明质酸衍生物与难溶性药物的复合化)
将实施例25中得到的透明质酸衍生物HA-a25以31.6mg/mL的浓度溶于纯水中，将得到的透明质酸衍生物HA-a25水溶液0.95mL与另外溶解而成的环孢素A的甲醇溶液(30mg/mL)0.05mL混合，通过在4℃孵育16小时，得到30mg/mL的透明质酸衍生物HA-a25和3mg/mL的环孢素A的复合液。然后，通过加入2×PBS1.5mL，生成透明质酸衍生物HA-a25与环孢素A复合体的沉淀。在相当于9000G的条件下，离心分离10分钟，当对上清液进行高效液相色谱(HPLC)测定时，未观察到来自环孢素A的峰，确认到被完全复合化。
(HPLC条件)
装置：HPLC系统Extrema(日本分光公司制)
色谱柱：Inertsil ODS 5μm
流动相：0.1v/v％TFA：90v/v％乙腈：10v/v％水
流速：1mL/分
注入量：30μL
检测器：UV(210nm)
温度：40℃
工业上的可利用性
根据本实施方式的透明质酸衍生物，可以提供一种通针性优异的透明质酸衍生物。

Claims (15)

1.一种透明质酸衍生物，其是引入有甾基的透明质酸衍生物，且实质上由下述重复单元(Ia)和重复单元(II)构成，
其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量Mw相对于数均分子量Mn之比Mw/Mn为1.2以上且2.9以下，
所述透明质酸衍生物的重均分子量为7000以上且134000以下，
所述甾基相对于所述透明质酸衍生物的引入率为8％以上且小于60％；
式中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
X是由-NRa-Y-NRb-COO-R表示的疏水性基团；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子和C1-6烷基；
R是甾基；
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-，
m是1以上且100以下的整数；
式中，R1a、R2a、R3a和R4a各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基；
Xa选自羟基和-O-Q+；此处，Q+是抗衡阳离子。
2.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量为7000以上且120000以下。
3.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量为7000以上且60000以下。
4.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的重均分子量为10000以上且50000以下。
5.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述透明质酸衍生物的Mw/Mn为1.3以上且2.1以下。
6.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述甾基相对于所述透明质酸衍生物的引入率为8％以上且33％以下。
7.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述甾基相对于所述透明质酸衍生物的引入率为8％以上且22％以下。
8.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述甾基相对于所述透明质酸衍生物的引入率为12％以上且22％以下。
9.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述甾基相对于所述透明质酸衍生物的引入率为35％以上且50％以下。
10.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物，其中，所述R选自胆甾基、豆甾基、羊毛甾基、麦角甾基。
11.一种药物组合物，其含有权利要求1～10中任一项所述的透明质酸衍生物作为载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中，药物与所述透明质酸衍生物形成复合体。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其中，药物是具有药理活性的蛋白质、肽或核酸。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述具有药理活性的蛋白质、肽是抗体。
15.一种透明质酸衍生物-药物结合体，其是权利要求1～10中任一项所述的透明质酸衍生物结合有一个以上的药物而成。
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