TW202140073A - 玻尿酸衍生物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體 - Google Patents

玻尿酸衍生物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體 Download PDF

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福本圭介
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Abstract

本發明提供一種玻尿酸衍生物，其係導入有甾基者，且上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn為1.11以上10.0以下。

Description

玻尿酸衍生物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體
本發明係關於一種玻尿酸衍生物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體。 本申請案係基於2020年2月7日於日本提出申請之特願2020-019963號及2020年6月29日於日本提出申請之特願2020-111674號而主張優先權，將其等之內容援用至此。
近年來，採用蛋白質或肽、核酸作為活性成分之醫藥品即生物醫藥品得以實用化，其數量逐年遞增。生物醫藥品能夠滿足先前之低分子醫藥所未能滿足之未滿足醫療需求(unmet health needs)。然而，存在不易被消化管或黏膜等吸收，以及於體內不穩定、血中半衰期較短之課題。因此，生物醫藥品需要進行高頻次之注射投予，無論對於患者或相關醫療人員而言均為較重負擔。於是，尋求能夠於無損藥理活性之情況下將生物醫藥品膠囊化，使之於生物體內緩慢釋出有效成分之藥物基材(緩釋性藥物遞送系統基材)。
於此種背景下，專利文獻1及專利文獻2中提出有包含安全性優異之玻尿酸衍生物之緩釋性藥物遞送系統基材。該玻尿酸衍生物會於水溶液中自發地締合，能夠將藥物、尤其是生物醫藥品於維持其生物活性之狀態下效率良好地封入，於生理食鹽濃度下凝集(或於生理食鹽濃度下分散)，並且血中滯留性良好。認為該玻尿酸衍生物尤其於使用生物醫藥品作為有效成分之情形時，可用作能夠於維持藥理活性之狀態下效率良好地封入較多藥物之載體、及血中滯留性優異之血中緩釋載體以及標靶載體，亦可成為能夠持續緩釋藥物之局部(例如皮下等)緩釋載體。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2010/053140號 [專利文獻2]日本專利特開2007-297542號公報
[發明所欲解決之問題]
然而，專利文獻1及專利文獻2中記載之玻尿酸衍生物存在黏度較高、注射時之通針性不充分之問題。
本發明鑒於上述情況而成，提供一種通針性優異之玻尿酸衍生物、以及使用上述玻尿酸衍生物之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體。 [解決問題之技術手段]
即，本發明包含以下之形態。 (1)一種玻尿酸衍生物，其係導入有甾基者，且 上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn為1.11以上10.0以下。 (2)如上述(1)記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量為3000以上160000以下。 (3)如上述(1)或(2)記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之Mw/Mn為1.2以上且未達3.0。 (4)如上述(1)至(3)中任一項記載之玻尿酸衍生物，其中上述甾基相對於上述玻尿酸衍生物之導入率為6%以上且未達60%。 (5)如上述(1)至(4)之中任一項記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物具有下述通式(I)所表示之重複單元， [化1]
Figure 02_image001
(式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之胺基酸殘基之肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數)。 (6)如上述(5)記載之玻尿酸衍生物，其中上述R為膽固醇基。 (7)如上述(1)至(6)之中任一項記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn為1.2以上2.9以下。 (8)如上述(1)至(7)中任一項記載之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量為7000以上120000以下。 (9)一種醫藥組合物，其包含如上述(1)至(8)之中任一項記載之玻尿酸衍生物作為載體。 (10)如上述(9)記載之醫藥組合物，其中藥物與上述玻尿酸衍生物形成複合體。 (11)如上述(9)或(10)記載之醫藥組合物，其中藥物為具有藥理活性之蛋白質、肽或核酸。 (12)一種玻尿酸衍生物-藥物結合體，其係於如上述(1)至(8)之中任一項記載之玻尿酸衍生物上結合有1種以上之藥物。 [發明之效果]
根據上述形態之玻尿酸衍生物，可提供一種通針性優異之玻尿酸衍生物。
以下，對本發明之實施方式(以下稱為「本實施方式」)進行詳細說明，但本發明並不限定於此，可於不脫離其主旨之範圍內進行各種變化。
以下，對本說明書中使用之用語進行說明。
本說明書中使用之「C1-20 烷基」用語意指碳數1以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基等「C1-4 烷基」，進而包括正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、2-乙基丁基等。C1-20 烷基亦包括碳數1以上12以下之C1-12 烷基、碳數1以上6以下之C1-6 烷基。
本說明書中使用之「C1-6 烷基羰基」用語意指烷基部分為已提及之C1-6 烷基之烷基羰基，例如，包括乙醯基、丙醯基、正丙基羰基、異丙基羰基、正丁基羰基、第二丁基羰基、異丁基羰基、第三丁基羰基等「C1-4 烷基羰基」。
本說明書中使用之「胺基C2-20 烷基」用語意指具有胺基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，胺基可位於烷基末端之碳原子上。胺基C2-20 烷基亦包括碳數2以上12以下之胺基C2-12 烷基。
本說明書中使用之「羥基C2-20 烷基」用語意指具有羥基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，羥基可位於烷基末端之碳原子上。羥基C2-20 烷基亦包括碳數2以上12以下之羥基C2-12 烷基。
本說明書中使用之「C2-30 伸烷基」用語意指碳數2以上30以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如，包括伸乙基、伸丙基等，亦包括碳數2以上20以下之C2-20 伸烷基、碳數2以上8以下之C2-8 伸烷基、基「-(CH2 )n -」(此處，n為2以上30以下，較佳為2以上20以下，更佳為2以上15以下)。
本說明書中使用之「C1-5 伸烷基」用語意指碳數1以上5以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如，包括亞甲基、伸乙基、伸丙基等。
本說明書中提及之「C2-8 伸烯基」用語意指碳數2以上8以下之直鏈狀或支鏈狀之包含1個以上之雙鍵之二價飽和烴基，例如，包括-CH=CH-、-C(CH3 )=CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基、辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。於存在幾何異構之情形時，亦包括各個異構物及該等之混合物。
《玻尿酸衍生物》 本實施方式之玻尿酸衍生物為導入有甾基之玻尿酸衍生物。本實施方式之玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn(以下有時稱為「多分散度」)為1.11以上10.0以下。
藉由使本實施方式之玻尿酸衍生物之多分散度為上述範圍內，而具有對注射時之剪切(shear)應答之優異之低黏度化能，實現良好之通針性。尤其藉由使玻尿酸衍生物之多分散度為上述下限值以上，而使施加剪切(shear)時分子間之交聯發生緩和，通針性提高。
[Mw/Mn(多分散度)] Mw/Mn(多分散度)為1.11以上10.0以下，較佳為1.2以上且未達3.0，較佳為1.2以上2.9以下，較佳為1.3以上2.9以下，更佳為1.3以上2.4以下，更佳為1.3以上2.1以下，進而較佳為1.5以上2.1以下。 藉由Mw/Mn為上述下限值以上，可誘發玻尿酸衍生物之剪切稀化性，對注射時之剪切(shear)應答而降低低黏度，藉此可提高通針性。於Mw/Mn為上述下限值以上之情形時，低分子量之玻尿酸之比率變高，但於低分子量玻尿酸中，玻尿酸1分子上結合之修飾基之數量減少，故而分子間之疏水性相互作用減弱。因此推測，施加剪力時黏度之降低幅度增大，剪力較弱時與較強時之差變大。藉由使Mw/Mn未達上述上限值(或以下)，可抑制生物體內之玻尿酸衍生物之局部滯留性之降低。再者，此處所謂「剪切稀化性」，意指隨著剪切速率(shear rate)之增大而黏度降低之性質。
Mw/Mn(多分散度)可由例如利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)所確定之重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn來算出。Mw/Mn(多分散度)具體而言可依據後述實施例中記載之方法測定。
[重量平均分子量Mw] 玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw並無特別限定，就期待於局部投予時由擴散延遲產生之緩釋功能之觀點而言，較佳為分子量相對較大之玻尿酸衍生物，就最終劑型為溶液製劑之情形時之通針性之觀點而言，較佳為分子量相對較小之玻尿酸衍生物。因此，玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw較佳為3000(3 kDa)以上160000(160 kDa)以下，更佳為7000(7 kDa)以上160000(160 kDa)以下，更佳為7000(7 kDa)以上120000(120 kDa)以下，進而較佳為7 kDa以上60 kDa以下，最佳為10 kDa以上50 kDa以下。 玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn通常可藉由使用具有相應之各分子量之原料來調節。進而，亦可藉由交聯劑之添加或分子間交聯來控制分子量。 玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn例如可利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)來測定。玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn具體而言可依據後述實施例中記載之方法進行測定。
[甾基] 於玻尿酸衍生物中，甾基可直接鍵結於玻尿酸，亦可經由連接基鍵結於玻尿酸。 此處之「連接基」，可使用能夠藉由基因工程導入之任意之肽連接基、或合成化合物連接基，於玻尿酸衍生物中，較佳為肽連接基。肽連接基之長度並無特別限定，業者可根據目的而適當選擇，較佳之長度為2個胺基酸以上(上限並無特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。玻尿酸衍生物中包含之肽連接基可使用全部為相同長度之肽連接基，亦可使用不同長度之肽連接基。
本說明書中使用之「甾基」用語，只要為具有類固醇骨架之基，則無特別限制。此處，作為類固醇，具體而言，可例舉：膽固醇、膽固烷醇、菜油固醇、麥角甾烷醇、豆固烷醇、腎固醇、豆固醇、穀固醇、羊毛固醇、麥角固醇、西米杜鵑醇、膽汁酸、睪固酮、雌二醇、孕酮、皮質醇、可體松、醛固酮、皮質酮、脫氧皮質酮等。作為甾基，可例舉：膽固醇基、豆固醇基、羊毛固醇基、麥角甾醇基等，其中，較佳為膽固醇基(尤其是膽甾烷-5-烯-3β-基)。
[甾基導入率] 甾基相對於玻尿酸衍生物之導入率(以下有時簡稱為「甾基導入率」)較佳為6%以上且未達60%，更佳為6%以上50%以下，進而較佳為6%以上40%以下，尤佳為6%以上35%以下，最佳為8%以上22%以下。 藉由使甾基導入率為上述範圍內，玻尿酸衍生物於純水中或低鹽濃度下良好地溶解，並且具有剪切稀化之性質，賦予通針性能。又，藉由使甾基導入率為上述範圍內之玻尿酸衍生物與藥物複合化後向體內投予(例如皮下投予)，可成為滯留於投予部位之長期緩釋製劑。 又，就提高上述投予部位處之局部滯留性之觀點而言，甾基導入率較佳為6%以上且未達35%，更佳為8%以上33%以下，進而較佳為12%以上22%以下。另一方面，就藉由抑制藥物凝集而使之穩定分散之觀點而言，較佳為35%以上且未達60%，更佳為35%以上50%以下。
甾基導入率可藉由1 H-NMR測定來進行測定。即，可使用1 H-NMR圖譜中之源於玻尿酸衍生物之甾基的波峰之積分值、及源於玻尿酸衍生物中包含之N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)之積分值，基於下式計算。再者，式中，nH 表示對應於波峰之氫原子之數量。具體而言，例如可依據後述實施例中記載之方法測定。
[甾基導入率](%) ＝[(源於甾基之波峰積分值×3/nH )/(源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基之波峰積分值)]×100
作為較佳之玻尿酸衍生物，具體而言，例如可例舉具有1個以上之下述通式(I)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(I)」)之玻尿酸衍生物等。
[化2]
Figure 02_image003
(式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意之胺基酸殘基的肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數)
玻尿酸衍生物較佳為包含具有1個以上之下述通式(Ia)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(Ia)」)之玻尿酸衍生物。
[化3]
Figure 02_image005
(式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； X為-NRa -Y-NRb -COO-R所表示之疏水性基； Ra 及Rb 分別獨立地選自由氫原子及C1-6 烷基所組成之群； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -， m為1以上100以下之整數)
此處，於玻尿酸衍生物中分別包含2個以上之重複單元(I)或重複單元(Ia)之情形時，該重複單元可相同亦可不同。
亦可對玻尿酸衍生物中重複單元(I)或重複單元(Ia)以外之位置進行修飾，例如，可將羥基轉化成-O(C1-6 烷基)、-O(甲醯基)、-O(C1-6 烷基羰基)等，可將羧基轉化成醯胺或酯，亦可形成鹽。
[重複單元(I)] 通式(I)中之基「-Z-N(Ra )Y-X1 」包含選自由下式所表示之基所組成之群中之基： -NH-(CH2 )mz -NH-R； -NH-(CH2 )mz -NH-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NH-COO-R； -NH-(CH2 )mz -COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -COO-R、 -NH-(CH2 )mz -O-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -O-COO-R、 -NH-(CH2 )mz -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -O-CO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -NHCO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NHCO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -O-CO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -S-S-R；及 -Z-NRa -Y-NRb -COO-R (此處，mz為2以上30以下之整數，R8 為氫原子或甲基，R及m如本說明書中已作定義)。 作為該基，較佳為選自由 -NH-(CH2 )mz -NH-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NH-COO-R；及 -NH-(CH2 )mz -S-S-R (此處，mz、R及m如本說明書中已作定義) 所組成之群中之基。
(Z) 通式(I)中，Z較佳為直接鍵。又，於另一形態中，Z為肽連接基之情形時，X1 較佳為-NRb -COO-R。進而，於另一形態中，Z亦可為-NH-[CH(-Za )-CONH]n － 1 -CH(-Za )-CO-所表示之肽連接基，此處，n為2以上30以下之整數，Za 分別獨立地表示以H2 N-CH(-Za )-COOH表示之α-胺基酸中之取代基。該肽連接基係以N末端鍵結於葡萄糖醛酸部分之羧基，以C末端鍵結於基-N(-Ra )-Y-X1 。作為可用作該肽連接基之胺基酸殘基的胺基酸之例，可例舉：例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸(Gly)、組胺酸、異白胺酸、白胺酸(Leu)、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸等天然型(L型)胺基酸、該等之D體等α-胺基酸，，可使用包含合成胺基酸在內之全部α-胺基酸。即，作為Za ，例如可例舉：-CH3 、H2 NC(NH)NH(CH2 )3 -、H2 NCOCH2 -等。又，n個Z可相同或不同。n為2以上30以下之整數，較佳為2以上10以下，更佳為2以上4以下。作為肽連接基之較佳例，例如可例舉：-Gly-Phe-Leu-Gly-、-Asn-Phe-Phe-、-Phe-Phe-、Phe-Gly-等。
(Y) 通式(I)中，Y較佳為選自由-(CH2 )n1 -及-(CH2 CH2 O)m1 -CH2 CH2 -(此處，n1為2以上20以下之整數，較佳為2以上15以下之整數，更佳為2以上12以下之整數，進而較佳為2以上6以下之整數。m1為1以上4以下之整數)所組成之群中之基。具體而言，較佳為-(CH2 )2 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )8 -、-(CH2 )12 -、或-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -。又，就實現於純水中或低鹽濃度下之高溶解性、並於生理食鹽濃度下表現出較高沈澱形成能力之觀點而言，Y較佳為選自由-(CH2 )2 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )8 -及-(CH2 )12 -所組成之群中之基，更佳為-(CH2 )6 -。
Y亦可為例如-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -S-S-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -、-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -S-S-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -、-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -S-S-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -、-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -S-S-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -等。
(Ya ) 作為Ya ，較佳為-CH2 -或-CH2 -CH2 -。
(Yb ) 作為Yb ，較佳為-CH2 -CH2 -、-CH(CH3 )CH2 -、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基或辛-2,4,6-三烯-1,8-二基，更佳為-CH2 -CH2 -或-CH(CH3 )CH2 -。
作為基「-Z-N(Ra )Y-X1 」之具體例，可例舉：-NH-(CH2 )2 -NH-CO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-CO-NH-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-CO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-膽固醇基等。作為較佳之基「-Z-N(Ra )Y-X1 」，Ra 、Rb 及Rc 為氫原子，Y為直鏈狀之C2-30 伸烷基或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，Ya 為直鏈狀之C1-5 伸烷基，或者Yb 為直鏈狀之C2-8 伸烷基或直鏈狀之C2-8 伸烯基。
[重複單元(Ia)] 通式(Ia)中，X較佳為-NH-(CH2 )2 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )6 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )12 -NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -NH-COO-膽固醇基，更佳為-NH-(CH2 )2 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )6 -NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -NH-COO-膽固醇基。
玻尿酸衍生物除包含重複單元(I)以外，亦可進而包含通式(II)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(II)」)。
[化4]
Figure 02_image007
(式中，R1a 、R2a 、R3a 及R4a 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Xa 選自由羥基及-O-Q＋ 所組成之群；此處，Q＋ 為抗衡陽離子)
此處，於玻尿酸衍生物包含2個以上之重複單元(II)之情形時，該重複單元可相同亦可不同。 於另一形態中，玻尿酸衍生物可為實質上由重複單元(I)、重複單元(Ia)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物。
[重複單元(II)] 通式(II)中，Q＋ 只要為與羧基於水中形成鹽之抗衡陽離子，則無特別限定，於2價以上之情形時，根據價數而與複數個羧基形成鹽。作為抗衡陽離子之例，可例舉：鋰離子、鈉離子、銣離子、銫離子、鎂離子、鈣離子等金屬離子；式：N＋ Rj Rk Rl Rm (式中，Rj 、Rk 、Rl 及Rm 分別獨立地選自由氫原子及C1-6 烷基所組成之群)所表示之銨離子等。其中，Q＋ 較佳為鈉離子、鉀離子或四烷基銨離子(例如四正丁基銨離子等)。Rj 、Rk 、Rl 及Rm 較佳為選自由C1-6 烷基所組成之群中之相同之基，較佳為正丁基。
R1 、R2 、R3 及R4 、以及R1a 、R2a 、R3a 及R4a 較佳為均為氫原子。又，Ra 及Rb 較佳為均為氫原子。
其中，玻尿酸衍生物較佳為實質上由重複單元(I)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物。玻尿酸衍生物中，包含該衍生物中所含之D-葡萄糖醛酸與N-乙醯基-D-葡糖胺之二糖之重複單元中之例如80%以上、較佳90%以上、更佳95%以上為重複單元(I)及重複單元(II)。玻尿酸衍生物可僅由重複單元(I)及重複單元(II)構成。
＜玻尿酸衍生物之製造方法＞ 本實施方式之玻尿酸衍生物例如藉由將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺，並導入甾基而獲得玻尿酸衍生物。又，藉由相對於原料之玻尿酸或其衍生物，調整與其反應之具有甾基之化合物之調配量，可使甾基導入率成為6%以上且未達60%。
作為將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺並導入甾基之方法，具體而言，例如可例舉如下方法：使原料之玻尿酸或其衍生物、較佳為僅由重複單元(II)構成之玻尿酸或其衍生物與四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)進行離子交換，於存在適宜之縮合劑之狀態下，於溶劑中，使該玻尿酸鹽與式：「HNRa -Y-NRb -R、NHRa -Y-NRb -COO-R、HNRa -Y-NRb -COO-R、HNRa -Y-NRb -CO-R、HNRa -Y-NRb -CO-NRc -R、HNRa -Y-COO-R、HNRa -Y-O-COO-R、HNRa -Y-S-R、HNRa -Y-CO-Ya -S-R、HNRa -Y-O-CO-Yb -S-R、HNRa -Y-NRb -CO-Yb -S-R、HNRa -Y-S-S-R或-Z-NRa -Y-NRb -COO-R(式中，Ra 、Rb 、Rc 、Y、Ya 、Yb 、Z及R如本說明書中已作定義)」所表示之導入有甾基(尤其是膽固醇基)之胺進行反應。
上述反應中可使用之縮合劑並無特別限定，例如可例舉：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤)-4-甲基嗎啉鎓(DMT-MM)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三𠯤(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺(EDC)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)等。
就於水及有機溶劑之混合溶劑中反應亦高效率地進行之方面而言，較佳為DMT-MM，但並無特別限定。又，藉由使用DMT-MM作為縮合劑，於多個羥基共存之系統中，可抑制酯鍵形成，且可高選擇性地由胺基與羧基形成醯胺鍵。藉由使用該縮合劑，可防止以下情況：例如作為溶劑之醇與玻尿酸部分之羧基反應，或玻尿酸部分同時存在之羧基與羥基於分子內或分子間鍵結而形成意外之交聯。
作為甾基導入反應中使用之溶劑，可例舉：水、DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇、多元醇、乙腈、DMF(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)、THF(Tetrahydrofuran，四氫呋喃)、二氯甲烷、氯仿、己烷、二乙醚、乙酸乙酯、及該等之混合溶劑等。作為多元醇，可例舉與上述「(B)醇」中之例示相同者，其中，較佳為乙二醇。
或者，亦可使原料之玻尿酸或其衍生物與四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)進行離子交換，於存在適宜之縮合劑之狀態下，於溶劑中，使該玻尿酸鹽與間隔基部分進行反應(此時可視需要進行保護及脫保護反應)，而使原料之玻尿酸或其衍生物之羧基(-COOH)發生轉化，其後與適宜之試劑反應。以下例示由羧基衍生之基與反應試劑之組合例。 -CONRa -Y-NRb H＋Hal-R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-COOR； -CONRa -Y-NRb H＋HOCO-R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-CO-R； -CONRa -Y-NRb -COOH＋HNRc -R； -CONRa -Y-NRb -CO-NRc H＋Hal-R； -CONRa -Y-NRb H＋HOCO-NRc -R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-CO-NRc -R； -CONRa -Y-COOH＋HO-R； -CONRa -Y-OH＋Hal-COO-R； -CONRa -Y-OCOOH＋HO-R； -CONRa -Y-OCOOH＋Hal-R； -CONRa -Y-OCO-Hal＋HO-R； -CONRa -Y-SH＋Hal-R； -CONRa -Y-Hal＋HS-R； -CONRa -Y-CO-Ya -Hal＋HS-R； -CONRa -Y-CO-Ya -SH＋Hal-R； -CONRa -Y-O-CO-CH=CH2 ＋HS-R； -CONRa -Y-NRb -CO-CH(CH3 )=CH2 ＋HS-R； -CONRa -Y-SH＋HS-R； -COZ-OH＋HNRa -Y-NRb -COO-R； -COZ-NRa -Y-NRb H＋Hal-COO-R (式中，Ra 、Rb 、Rc 、Y、Ya 、Yb 及Z如本說明書中已作定義，Hal表示選自由氟原子、氯原子、溴原子及碘原子所組成之群中之鹵素原子)。
作為反應樣式，可例舉：脫鹵化氫反應、縮合反應、脫水反應、麥可加成等親核加成反應、氧化形成二硫化物之反應等，該等為周知反應，業者可適當選擇以發現較佳之反應條件來進行反應。於轉化體或反應物具有羧基之情形時，亦可將其變為N-羥基琥珀醯亞胺(以下亦稱為「NHS」)酯後再進行反應。
又，可例舉如下方法：使原料之玻尿酸或其衍生物之羧基與2-胺基乙基2-吡啶二硫醚反應，製備導入有末端具有經脫離基修飾之巰基之間隔基的玻尿酸衍生物，使其與硫代膽固醇進行親核取代反應，而形成雙硫鍵。
進而，亦可例舉如下方法：製備於玻尿酸或其衍生物之羧基導入有間隔基之一部分者、及於甾基導入有間隔基之一部分者，使該等反應。一部分具體例如上所述，進而於Y中插入有-S-S-之情形時，亦可例舉如下方法：分別製備於玻尿酸之羧基導入有末端具有巰基之間隔基之玻尿酸衍生物、及導入有末端具有巰基之間隔基之甾基，使該等發生氧化反應，而形成雙硫鍵。此時，亦可於使一者之巰基與2-巰基吡啶反應而製成二硫化物後，與另一者之巰基進行取代。
又，製備本發明之玻尿酸衍生物後，亦可進而導入其他取代基。例如，亦可藉由將實質上由重複單元(I)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物中之羧基之0.1%以上99.5%以下、較佳為10%以上40%以下轉化成-CO-Xz ，而使分子內或包含其他分子之分子間交聯而凝膠化。 [此處，Xz 選自由下述基所組成之群： -NH-(CH2 )p1 -O-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 )p1 -O-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 )p1 -NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-(CH2 )r -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(NH2 )-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(NH2 )-(CH2 )2 -SH； -NH-NH-CO-(CH2 )4 -CO-NH-NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -O-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -O-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-(CH2 )r -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(NH2 )-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(NH2 )-(CH2 )2 -SH； -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )-SH； -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )2 -SH；及 -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )2 -CONH-CH(CONH-CH2 -CO2 H)-CH2 -SH (此處，R17 表示氫原子或C1-6 烷基，p1表示2以上10以下之整數，q表示1以上200以下之整數，r表示1以上3以下之整數)]
藉由化學交聯使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟可適當選擇其條件。所謂交聯之條件，包括交聯方法、聚合物濃度、交聯劑濃度、溶劑、溶劑pH值、鹽濃度、溫度、時間等。
於使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中，藉由增大形成交聯之反應條件中之例如化學交聯時之聚合物濃度及提昇可形成交聯之基之導入率，能夠提高所生成凝膠之交聯密度。
關於使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中之交聯劑濃度，於使用兩端具有可形成交聯之基者之情形時，較佳為以如該基不會過多或不足而可快速參與交聯反應之濃度添加。例如，於使用DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，藉由麥可加成反應使導入有甲基丙烯醯基(MA基)之聚合物交聯之情形時，較佳為MA基：SH基＝3：1～1：3，尤佳為2：1～1：2。
使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中之溶劑較佳為可使聚合物及交聯劑充分溶解者，並無特別限定，較佳為使用水、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺(DMAc)、二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)及選自該等中之混合溶劑。又，亦可於該等溶劑中混合使用可溶混之有機溶劑。作為可溶混之有機溶劑，例如可例舉：甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、多元醇、丙酮、乙腈等，但並無特別限定。作為多元醇，可例舉與上述「(B)醇」中之例示相同者，其中，較佳為乙二醇。
玻尿酸衍生物由於在水溶液中形成奈米微粒子，故藉由在稀薄條件下交聯，可形成奈米尺寸之微粒子凝膠，可用作血中緩釋載體、標靶載體。稀薄條件係指10 mg/mL以下，較佳為5 mg/mL以下，進而較佳為1 mg/mL以下。另一方面，藉由在高濃度條件下交聯，可形成微粒子彼此交聯之塊狀凝膠。其可用作皮下緩釋型載體。高濃度條件係指5 mg/mL以上，較佳為20 mg/mL以上，進而較佳為40 mg/mL。
使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟可於塊體狀態下進行，亦可於乳液中或噴霧液滴中等不連續相中進行。例如，於W/O乳液中進行之情形時，使溶解有聚合物或交聯劑等之水相於不可與水溶混之溶劑中乳化，進行凝膠化反應即可。不可與水溶混之溶劑並無特別限定，例如可例舉：己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、中長鏈三酸甘油酯(MCT)、液態石蠟、大豆油等。亦可添加用以使乳化保持穩定之界面活性劑。又，例如亦可於超臨界二氧化碳中或PEG中等能夠脫溶劑之溶劑中進行。於該情形時，藉由使溶解有聚合物或交聯劑等之水相或有機溶劑相於前例之溶劑中進行乳化、分散，實現了伴有脫溶劑(溶劑擴散)之聚合物濃縮，因此可獲得更高交聯密度之凝膠。
亦可進行如下步驟及操作，即，使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟，及其後中止交聯反應之操作以及使殘存之交聯性官能基失活或洗淨去除之操作。就安全性之觀點、保存中穩定性之觀點、與所封入藥物之副反應等觀點而言，較佳為將未參與反應之交聯性官能基、僅交聯劑之一端所鍵結之基、殘存之交聯劑等去除。例如於殘存未反應之交聯劑之情形時，可藉由利用過量之水等洗淨而去除，但並無特別限定。又，例如於殘存聚合物上取代之甲基丙烯醯基之情形時，可藉由添加過量之巰基乙醇等使甲基丙烯醯基失活後，利用過量之水等將剩餘之巰基乙醇洗淨而去除。進而，例如於巰基殘存之情形時，可藉由添加過量之3-順丁烯二醯亞胺基丙酸、碘乙酸等使巰基失活後，利用過量之水等將剩餘之3-順丁烯二醯亞胺基丙酸、碘乙酸洗淨而去除。
於使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟後，亦可進行粉碎步驟。作為粉碎方法，可例舉：使用研杵與研缽之粉碎、或使用研磨機之粉碎，較佳為使用研磨機之粉碎。作為研磨粉碎裝置，可例舉：離心式粉碎機(日本精機製作所)及衝擊式研磨機(DALTON股份有限公司)等旋轉圓板型粉碎裝置、霧化器(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、樣品研磨機(Sample Mill)(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、小型磨機(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、及SK Mill(TOKKEN公司)等篩磨機之粉碎裝置、超微少量實驗室噴氣磨機(Lab Jet Mill)(A-O噴射磨機，Seishin Enterprise Co., Ltd)等噴射粉碎裝置、以及能夠進行超低溫粉碎之Linlex Mill(Liquid Gas Co., Ltd.)等，較佳為SK Mill及Linlex Mill。
於使玻尿酸衍生物凝膠化之步驟後，亦可進行乾燥步驟。作為乾燥方法，例如可例舉：通風乾燥、於恆溫槽中之乾燥、減壓乾燥、熱風循環式乾燥等。風速、乾燥時間、溫度、壓力等可於不會使玻尿酸衍生物之凝膠發生分解或變質之範圍內適當選擇。
《醫藥組合物》 本實施方式之醫藥組合物包含上述玻尿酸衍生物作為載體。於本實施方式之醫藥組合物中，載體與藥物較理想為直接地結合或間接地結合而形成複合體，處於未相互游離之狀態。於向生物體內投予該醫藥組合物時，藥物緩慢地自載體釋出，可期待良好之緩釋性。載體與藥物之間的結合為共價鍵結、非共價鍵結均可，就維持藥物活性之觀點而言，較佳為非共價鍵結。
本實施方式之醫藥組合物中，較佳為藥物與作為載體之玻尿酸衍生物形成複合體。認為於溶劑中，藉由玻尿酸衍生物之甾基與系統中存在之藥物之疏水性相互作用而自發地締合，藉此形成藥物與玻尿酸衍生物之複合體。藉由形成該複合體，有望提高該藥物之保存穩定性、維持生物活性、改善緩釋性、提高於水中之溶解性、提高對熱或光等刺激之耐性、抑制凝集與沈澱等。
＜藥物＞ 本實施方式之醫藥組合物中包含之藥物只要為可用作人類、動物用醫藥品之藥物，則無特別限定，例如可例舉：蛋白質、肽、多糖類、核酸、低分子化合物等。本實施方式之醫藥組合物中，較佳為具有藥理活性之蛋白質、肽、核酸等生物醫藥品或低分子化合物以與玻尿酸衍生物形成複合體之形式包含。藉由形成該複合體，有望提高醫藥品之化學穩定性、抑制凝集、由酵素產生之分解抑制效果等。
[低分子化合物] 作為低分子化合物，例如可例舉：抗癌劑(例如烷基化劑、抗代謝劑、生物鹼等)、免疫抑制劑、抗炎症劑(類固醇劑、非類固醇劑系抗炎症劑等)、抗風濕劑、抗菌劑(β-內醯胺系抗生素、胺基糖苷系抗生素、大環內酯系抗生素、四環素系抗生素、新喹諾酮系抗生素、磺胺劑等)等。
[蛋白質及肽] 作為蛋白質及肽，例如可例舉：紅血球生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素-α、β、γ、(INF-α、β、γ)、血小板生成素(TPO)、睫狀神經營養因子(CNTF)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子結合蛋白(TNFbp)、介白素-10(IL-10)、FMS樣酪胺酸激酶(Flt-3)、生長激素(GH)、胰島素、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血小板衍生生長因子(PDGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、腦源性神經營養因子(BDNF)、角質形成細胞生長因子(KGF)、幹細胞因子(SCF)、巨核細胞生長發育因子(MGDF)、骨保護素(OPG)、瘦體素、甲狀旁腺激素(PTH)、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、骨塑型蛋白(BMP)、心房利鈉肽(ANP)、腦利鈉肽(BNP)、C型利鈉肽(CNP)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、疫苗用抗原、抗體、雙抗體、微型抗體、片段化抗體、PEG化蛋白(例如PEG化干擾素-α-2a、PEG化干擾素-α-2b、PEG化GCSF、PEG化hG11拮抗劑B2036等)等。
[核酸] 作為核酸，例如可例舉：DNA、RNA、反義核酸、誘餌核酸、核酶、低分子干擾RNA、核酸適體等。
＜形態＞ 本實施方式之醫藥組合物可為分散性微粒子溶液，亦可為沈澱性懸浮液，亦可為冷凍乾燥體。又，於冷凍乾燥體之情形時，可成為如下類型之沈澱型緩釋製劑：由醫生於投予前添加生理鹽水等等張液而即時製備投予液。認為該情形適合包含於溶液狀態下不穩定之活性成分之醫藥組合物。
於本實施方式之醫藥組合物為分散性微粒子溶液或沈澱性懸浮液之情形時，醫藥組合物中之玻尿酸衍生物之濃度較佳為1 mg/mL以上200 mg/mL以下，更佳為4 mg/mL以上100 mg/mL以下，進而較佳為4 mg/mL以上50 mg/mL以下，尤佳為4 mg/mL以上12 mg/mL以下。藉由使醫藥組合物中之玻尿酸衍生物之濃度為上述範圍內，於製成注射劑之情形時可具有更佳之黏度。又，亦可進一步優化使用本實施方式之玻尿酸衍生物之注射劑之通針性。
《玻尿酸衍生物-藥物結合體》 本實施方式之玻尿酸衍生物-藥物結合體係於上述玻尿酸衍生物上結合有1種以上之藥物。
適用於形成本實施方式之玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物之藥物為蛋白質、肽、核酸等生物醫藥品或低分子化合物。
本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物不限定於上述說明之形態，亦可為奈米微粒子、微米微粒子、溶液、乳液、懸浮液、凝膠、微胞、植入體、粉末、或膜之形態。關於粉末，可將藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥獲得之固體加以粉碎而製造，亦可由將沈澱物乾燥所得者而製造。
本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物可經由經口、腸道外、鼻腔內、陰道內、眼內、皮下、靜脈內、肌肉內、皮內、腹腔內、腦內或口腔內之路徑來投予。又，本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物不限定於注射劑，亦可為貼附製劑或微針製劑、塗抹藥、滴眼藥、噴霧藥、吸入藥、皮膚填充劑等。
又，本實施方式之玻尿酸衍生物不僅可用作醫藥組合物，亦可用作化妝品組合物或檢查藥組合物、醫學機器之保存劑或表面包覆劑。
作為化妝品組合物，可包含生理活性成分。作為生理活性成分之種類，並無特別限定，例如可例舉：抗老化劑、緊縮劑、抗炎症劑、美白劑、保濕劑、血液循環促進劑、維生素類、胺基酸、肽、腦醯胺類、創傷癒合促進劑、防紫外線劑、刺激緩和劑、細胞活化劑、酵素成分等。
作為檢查藥組合物，可包含用以檢查之成分或其他成分。作為用以檢查之成分，可使用擔載有抗體之聚合物粒子、無機粒子、平板膜等。作為其他成分，可包括載體、生理鹽水、防腐劑(疊氮化鈉、氯化苄烷銨、氯丁醇等)、穩定劑(丙二醇、抗壞血酸等)、賦形劑(乳糖、澱粉、山梨糖醇、D-甘露醇等)、緩衝劑(月桂基硫酸鈉、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁等)、保存劑(氯化苄烷銨、苄醇、對羥基苯甲酸甲酯等)等。
作為醫學機器之保存劑或表面包覆劑，可包括增黏劑、維生素類、胺基酸、肽、穩定劑、殺菌劑等。作為醫學機器，可例舉：內視鏡、人工關節、假牙、血管內支架、隱形眼鏡、導管、導絲、指構造體、人工心臟、人工肌纖維等。 [實施例]
以下，藉由實施例來詳細地說明本發明，但該等並非意在將本發明之範圍限於實施例。
實施例及比較例中所製造之玻尿酸衍生物之各物性之測定方法及評價方法如下所述。
[物性1] (玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw、及重量平均分子量相對於數量平均分子量之比Mw/Mn) 玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn係利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)進行測定。使玻尿酸衍生物(20 mg)溶解於超純水(10 mL)，於室溫下攪拌12小時以上，而獲得玻尿酸衍生物水溶液(2 mg/mL)。對於該玻尿酸衍生物水溶液(750 μL)添加300 mM羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)水溶液(750 μL)，使用振盪機進行10秒混合，於37℃下培養1小時。然後，將所獲得之試樣供於SEC-MALS測定來確定重量平均分子量Mw及數量平均分子量Mn。以下揭示SEC-MALS測定之條件。又，重量平均分子量相對於數量平均分子量之比Mw/Mn係根據SEC-MALS之測定結果，用重量平均分子量Mw除以數量平均分子量Mn，藉此算出該比Mw/Mn。
(測定條件) 管柱：TSKgel GMPWXL(Tosoh股份有限公司製造)2根 管柱溫度：30℃ 溶離液：添加有10 mM HP-β-CD之磷酸緩衝生理鹽水(pH值7.4) 流速：1 mL/min 注入量：200 μL
[物性2] (甾基導入率) 玻尿酸衍生物之甾基導入率係藉由1 H-NMR測定來確定。首先，將二甲基亞碸-d6 (99.9 v/v%，含有0.05 v/v%之三甲基矽烷(TMS)，FUJIFILM Wako公司製造)與20%氘代鹽酸(99.5 v/v%，FUJIFILM Wako公司製造)以質量比99：1進行混合，而製備測定溶劑。繼而，於該測定溶劑(0.6 mL)中添加玻尿酸衍生物(2 mg)，利用超音波浴進行30分鐘處理使之完全溶解後，供於1 H-NMR測定。1 H-NMR測定係使用傅立葉變換核磁共振裝置(FT-NMR裝置)(ECS400，日本電子製造)，於試樣溫度85℃下實施。甾基導入率係由源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)之積分值、與源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)之積分值，使用以下所示之式，算出膽固醇基相對於玻尿酸單元之導入率。再者，源於膽固醇基之波峰(5H)重疊在包含源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰在內之1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰上，因此，採用自1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰之積分值中減去將源於膽固醇基甲基之波峰(0.7 ppm)之積分值乘以5/3倍所得者而算出之值(即，積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)－積分值(0.7 ppm)×5/3)作為源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰之積分值，用於計算甾基導入率。
[甾基導入率(%)] ＝[(源於膽固醇基中之甲基的波峰積分值)/(源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰積分值)]×100 ＝[積分值(0.7 ppm)/｛積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)-積分值(0.7 ppm)×5/3｝]×100
[評價1] ＜應變速率相依性試驗＞ 玻尿酸衍生物之對剪切應答之低黏度化能、即剪切稀化性係藉由以下所示之順序來確定。 首先，於玻尿酸衍生物中添加超純水，攪拌12小時以上使之溶解，而獲得濃度為4 mg/mL之玻尿酸衍生物水溶液。將該水溶液供於應變速率依存性試驗。以下揭示應變速率依存性試驗之條件。
(測定條件) 測定裝置：TA Instruments製造之ARES 測定溫度：25℃ 幾何形狀：50 mmΦ圓錐＆平板 剪切速率：0.25 s-1 以上1000 s-1 以下 測定時間：每點60 s
基於下式算出玻尿酸衍生物之剪切稀化性。
〔剪切稀化性〕 ＝(剪切速率1 s-1 時之黏度[mPa・s])/(剪切速率1000 s-1 時之黏度[mPa・s])
＜玻尿酸衍生物之製造＞ [實施例1] (玻尿酸衍生物HA-a1之製造) 依據以下之步驟1～步驟3，製備玻尿酸衍生物。
1.步驟1 (6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之合成) 依序按照以下所示之步驟1-1、及步驟1-2，合成6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)。
(步驟1-1) 於氯甲酸膽固醇酯(3.37 g、7.5 mmol)之無水二氯甲烷(20 mL)之溶液中，於氬氣氛圍下，添加三乙胺(TEA，1.05 mL)進行攪拌。於冰浴冷卻下滴加6-(第三丁氧基羰基)胺基-1-胺基己烷(1.12 mL、5 mmol)，直接於冰浴冷卻下攪拌30分鐘後，升溫至室溫，將該混合物攪拌一夜。利用超純水及飽和鹽水將反應混合物洗淨，經無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸餾去除溶劑。藉由矽膠管柱層析(溶離液：乙酸乙酯：正己烷＝1：4)精製所獲得之殘渣，將目標物之溶出分進行合併，於減壓下蒸餾去除溶劑。
(步驟1-2) 使所獲得之殘渣溶解於乙酸乙酯(40 mL)，添加4N鹽酸/乙酸乙酯溶液(40 mL)，於室溫下攪拌一夜。藉由離心分離來回收所生成之沈澱物。利用乙酸乙酯將獲得之固體清洗4次後，於減壓下乾燥，而獲得6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)1.2 g。將生成物之1 H-NMR圖譜(ECS400 日本電子製造，EtOH-d6 )示於圖1。
2.步驟2 (玻尿酸之四丁基銨(TBA)鹽之製備) 依序按照以下所示之步驟2-1、及步驟2-2，製備玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。
(1)步驟2-1 使DOWEX(註冊商標)50WX-8-400(Aldrich公司製造)懸浮於超純水，藉由傾析法利用超純水將樹脂清洗3次左右。添加約為樹脂之陽離子交換能之1.5倍莫耳當量之40 wt%氫氧化四丁基銨水溶液(TBA-OH)(Aldrich公司製造)，攪拌30分鐘。藉由傾析法去除剩餘之TBA-OH溶液後，進而利用過量之超純水洗淨，藉此獲得經TBA鹽化之陽離子交換樹脂。
(2)步驟2-2 使重量平均分子量50,000(50 kDa)之原料玻尿酸鈉鹽(HA-Na)以濃度15 mg/mL溶解於超純水。添加相對於HA單元(單元分子量401.3)之莫耳數，以樹脂之離子交換能換算為5倍莫耳當量的「(1)步驟2-1」中經TBA鹽化之陽離子交換樹脂之懸浮液。攪拌15分鐘後，使用0.45 μm之過濾器進行過濾，將濾液冷凍乾燥，而獲得為白色固體之玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。將生成物之1 H-NMR圖譜(ECS400 日本電子製造，EtOH-d6 )示於圖2。
3.步驟3 製備「2.(2)步驟2-2」所製備之HA-TBA之無水DMSO溶液(10 mg/mL)。其後，以相對於「1.步驟1」中合成之HA-TBA中存在之二糖重複單元(HA單元)，按莫耳比計為15/100之方式添加Chol鹽酸鹽。其次，以相對於HA單元，按莫耳比計為21.6/100之方式添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)，於室溫下攪拌一夜。依序利用0.3 M乙酸氨/DMSO溶液、0.15 M NaCl水溶液、超純水，對反應溶液進行透析(Spectra/Por4，區分分子量(MWCO)：12,000以上14,000以下)。將所獲得之透析液進行冷凍乾燥，而獲得為白色固體之目標物(HA-C6 -Chol)。將生成物之1 H-NMR圖譜示於圖3。確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
[實施例2～31] (玻尿酸衍生物HA-a2～HA-a31之製造) 於「2.(2)步驟2-2」中，使用原料玻尿酸鈉鹽(HA-Na)之分子量為表1～表7所示之值者，於「3.步驟3」中，將Chol鹽酸鹽相對於HA單元之添加量、及DMT-MM相對於HA單元之添加量設為以莫耳比計成為表1及表2所示之比率，除此以外，藉由與實施例1相同之方法獲得各玻尿酸衍生物。對所獲得之玻尿酸衍生物進行1 H-NMR測定，於各玻尿酸衍生物中均確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
[實施例32] (玻尿酸衍生物HA-a32) 於「2.(2)步驟2-2」中，使用原料玻尿酸鈉鹽(HA-Na)之分子量為表8所示之值者，於「3.步驟3」中，將Chol鹽酸鹽相對於HA單元之添加量、及DMT-MM相對於HA單元之添加量設為以莫耳比計成為表1及表2所示之比率，進而添加1,6-二胺基己烷，除此以外，藉由與實施例1相同之方法獲得各玻尿酸衍生物。對所獲得之玻尿酸衍生物進行1 H-NMR測定，於各玻尿酸衍生物中均確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
[比較例1] (玻尿酸衍生物HA-b1之製造) 按照以下之步驟1～步驟3，製備玻尿酸衍生物。 1.步驟1 (6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之合成) 藉由與實施例1相同之方法合成Chol鹽酸鹽。
2.步驟2 (玻尿酸之四丁基銨(TBA)鹽之製備) 依序按照以下所示之步驟2-1、步驟2-2、及步驟2-3，製備玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。
(1)步驟2-1 使玻尿酸鈉鹽(HA-Na，50 kDa、Mw/Mn1.2)以濃度成為10 mg/mL之方式溶解於超純水。利用超純水對該溶液進行透析(Spectra/Por 6，區分分子量(MWCO)：50,000)。對所獲得之透析液進行冷凍乾燥而獲得為白色固體之目標物(HA-Na)。 利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)來測定生成物之重量平均分子量及數量平均分子量，結果確認到重量平均分子量Mw為50000、Mw/Mn(多分散度)為1.1。
(2)步驟2-2 藉由與實施例1之「2.(1)步驟2-1」相同之方法，製作經TBA鹽化之陽離子交換樹脂。
(3)步驟2-3 使用上述「(1)步驟2-1」中獲得之重量平均分子量Mw為50,000(50k)之玻尿酸鈉鹽(HA-Na)，除此以外，藉由與實施例1之「2.(2)步驟2-2」相同之方法，獲得為白色固體之玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。
3.步驟3 使用上述「2.(3)步驟2-3」中獲得之HA-TBA，除此以外，藉由與實施例1之「3.步驟3」相同之方法，獲得為白色固體之目標物(HA-C6-Chol)。對所獲得之HA-C6-Chol進行1 H-NMR測定，確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
[比較例2～7] (玻尿酸衍生物HA-b2～HA-b7) 於比較例1之「2.(1)步驟2-1」中，使用玻尿酸鈉之重量平均分子量及Mw/Mn(多分散度)為表2所示之值者，於比較例1之「3.步驟3」中，將Chol鹽酸鹽相對於HA單元之添加量、及DMT-MM相對於HA單元之添加量設為以莫耳比計成為表2～表7所示之比率，除此以外，藉由與比較例1相同之方法獲得各玻尿酸衍生物。對所獲得之玻尿酸衍生物進行1 H-NMR測定，於各玻尿酸衍生物中均確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
採用上述方法，測定實施例及比較例中獲得之玻尿酸衍生物之各物性，進行各種評價。將結果示於表1～表8。
[表1]
   實施例1 實験例2 實施例3 實施例4 實施例5 比較例1
玻尿酸衍生物 HA-a1 HA-a2 HA-a3 HA-a4 HA-a5 HA-b1
組成 HA-Na之分子量 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 15 15 15 15
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 53 kDa 52 kDa 52 kDa 51 kDa 51 kDa 53 kDa
Mw/Mn 1.2 1.3 1.8 2.1 2.9 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 10.8 10.8 11 18.9 5.9 11.9
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 6 5.2 3.1 3.2 2.9 7.9
剪切稀化性 1.8 2.1 3.5 6 2 1.5
[表2]
   實施例6 實施例7 實施例8 實施例9 實施例10 比較例2
玻尿酸衍生物 HA-a6 HA-a7 HA-a8 HA-a9 HA-a10 HA-b2
組成 HA-Na之分子量 120 kDa 120 kDa 120 kDa 120 kDa 120 kDa 120 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 15 15 15 15
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 132 kDa 131 kDa 131 kDa 130 kDa 129 kDa 134 kDa
Mw/Mn 1.2 1.3 1.5 1.7 2.4 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 872 756.3 732.1 925.5 557.4 881
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 34.7 24.5 20.5 15.1 14.7 59
剪切稀化性 25.1 30.9 35.7 61.3 37.9 14.9
[表3]
   實施例11 比較例3
玻尿酸衍生物 HA-a11 HA-b3
組成 HA-Na之分子量 35 kDa 35 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 35 kDa 35 kDa
Mw/Mn 1.7 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 5.4 6.6
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 2.7 5
剪切稀化性 2 1.3
[表4]
   實施例12 實施例13 實施例14 實施例15 實施例16 實施例17 比較例4
玻尿酸衍生物 HA-a12 HA-a13 HA-a14 HA-a15 HA-a16 HA-a17 HA-b4
組成 HA-Na之分子量 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6
甾基導入率(%) 19 19 19 19 19 19 19
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa
Mw/Mn 1.2 1.3 1.5 1．7 2.1 2.9 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 5.2 5.2 5.1 5 6.3 4.7 6
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 2.8 2.6 2.4 2.3 2.3 2.2 4.5
剪切稀化性 1.9 2 2.1 2.2 2.7 2.1 1.3
[表5]
   實施例18 實施例19 實施例20 實施例21 實施例22 比較例5
玻尿酸衍生物 HA-a18 HA-a19 HA-a20 HA-a21 HA-a22 HA-b5
組成 HA-Na之分子量 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/ 44/ 58 100/ 44/ 58 100/ 44/ 58 100/ 44/ 58 100/ 44/ 58 100/ 44/ 58
甾基導入率(%) 43 43 43 43 43 43
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
Mw/Mn 1.3 1.5 1.7 2.1 2.9 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 3 3.3 1.8 1.9 1.9 1.9
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 1.5 1.5 1.4 1.3 1.3 1.9
剪切稀化性 2 2.1 1.3 1.5 1.5 1
[表6]
   實施例23 實施例24 實施例25 實施例26 實施例27 比較例6
玻尿酸衍生物 HA-a23 HA-a24 HA-a25 HA-a26 HA-a27 HA-b6
組成 HA-Na之分子量 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/34/45 100/34/45 100/34/45 100/34/45 100/34/45 100/34/45
甾基導入率(%) 33 33 33 33 33 33
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
Mw/Mn 1.3 1.5 1.7 2.1 2.9 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 3.6 3.7 4.3 4.2 3.8 2.7
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 2.4 2.4 2.3 2.3 2.1 2.6
剪切稀化性 1.5 1.5 1.9 1.8 1.8 1
[表7]
   實施例28 實施例29 實施例30 實施例31 比較例7
玻尿酸衍生物 HA-a28 HA-a29 HA-a30 HA-a31 HA-b7
組成 HA-Na之分子量 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
HA單元/ Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/ 8/ 11.2 100/ 8/ 11.2 100/ 8/ 11.2 100/ 8/ 11.2 100/ 8/ 11.2
甾基導入率(%) 8 8 8 8 8
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa 10 kDa
Mw/Mn 1.3 1.5 2.1 2.9 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 3.3 3.4 3.7 3.5 2.5
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 2.1 2 2 1.9 2.4
剪切稀化性 1.6 1.7 1.9 1.8 1
[表8]
   實施例32 比較例4
玻尿酸衍生物 HA-a32 HA-b4
組成 HA-Na之分子量 10 kDa 35 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/1,6-二胺基己烷/DMT-MM之莫耳比 100/19/0.3/26.6 100/19/0/26.6
甾基導入率(%) 19 19
玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw 35 kDa 35 kDa
Mw/Mn 2.1 1.1
評價 剪切速率1 s-1 時之黏度(mPa・s) 5.5 6
剪切速率1000 s-1 時之黏度(mPa・s) 2.6 4.5
剪切稀化性 2.1 1.3
根據表1可知，於重量平均分子量Mw為50 kDa、Mw/Mn(多分散度)為1.11以上之範圍之玻尿酸衍生物HA-a1～HA-a5(實施例1～5)中，剪切稀化性良好，為1.8以上6.0以下。又，加大剪切(速度1000 s-1 )時之黏度較低，為2.9 mPa・s以上6.0 mPa・s以下，有助於提昇通針性。另一方面，於重量平均分子量Mw為50 kDa、多分散度為1.1之玻尿酸衍生物HA-b1(比較例1)中，剪切稀化性為1.5，加大剪切(速度1000 s-1 )時之黏度不良，為7.9 mPa・s。又，相較於多分散度為1.2(實施例1)，多分散度為1.3(實施例2)時剪切稀化性更佳。
又，根據表2可知，重量平均分子量Mw為120 kDa、多分散度為1.11以上範圍之玻尿酸衍生物HA-a6～HA-a10(實施例5及6)中，剪切稀化性亦優於多分散度為1.1之比較例2。 又，於多分散度程度相同、重量平均分子量不同之玻尿酸衍生物HA-a3、HA-a9及HA-a10(實施例3、9及10)中發現如下傾向：重量平均分子量越大，剪切稀化性越良好。
根據表4可知，即便於將甾基之導入率變為19%之情形時，亦同樣地相較於多分散度為1.1之比較例4，當多分散度大於1.11時，剪切速率1000 s-1 時之黏度較低、剪切稀化性亦良好。
根據表5可知，於重量平均分子量Mw為10 kDa、多分散度為1.5以上1.7以下範圍之玻尿酸衍生物HA-a19及HA-a20(實施例19及20)中，剪切稀化性為1.3以上2.1以下，加大剪切(1000 s-1 )時之黏度良好，為1.4 mPa・s以上1.5 mPa・s以下。另一方面，於多分散度1.1之玻尿酸衍生物HA-b5(比較例5)中，剪切稀化性為1.0，加大剪切(1000 s-1 )時之黏度不良，為1.9 mPa・s。 又，根據表6可知，於重量平均分子量Mw為10 kDa、甾基導入率設為33%、多分散度為1.7之玻尿酸衍生物HA-a25(實施例25)中，剪切稀化性為1.9，加大剪切(1000 s-1 )時之黏度良好，為2.3 mPa・s。另一方面，於多分散度1.1之玻尿酸衍生物HA-b6(比較例6)中，剪切稀化性為1.0，加大剪切(1000 s-1 )時之黏度不良，為2.6 mPa・s。 又，根據表7可知，於重量平均分子量Mw為10 kDa、甾基導入率設為8%之情形時，亦相較於多分散度為1.1之情形，多分散度為1.11以上之情形時表現出良好之剪切稀化性。 又，於多分散度程度相同、甾基導入率不同之玻尿酸衍生物HA-a20、HA-a25及HA-a30(實施例20、25及30)中發現如下傾向：甾基導入率越小，剪切稀化性越佳。
根據表8可知，即便藉由使重量平均分子量10 kDa之原料HA-Na交聯而獲得35k之玻尿酸衍生物HA-a32之情形，相較於重量平均分子量相同、多分散度低至1.1之HA-b4(比較例4)，表現出良好之剪切稀化性。由此可知，重要的是最終分子量及分子量分佈而非原料。
[實施例33] (玻尿酸衍生物與蛋白質之複合化) 使實施例25中獲得之玻尿酸衍生物HA-a25以濃度45.0 mg/mL溶解於純水，將獲得之玻尿酸衍生物HA-a25水溶液1.0 mL與另外溶解獲得之hGH(人類生長激素)水溶液(9 mg/mL)0.5 mL加以混合，於37℃下培養24小時，藉此獲得30 mg/mL之玻尿酸衍生物HA-a25及3 mg/mL之hGH之複合液。其後，添加2×PBS 1.5 mL，藉此生成玻尿酸衍生物HA-a10與hGH之複合體之沈澱。於相當於9000 G之條件下進行10分鐘離心分離，對上清液進行凝膠滲透層析(GPC)測定(測定條件示於以下)，結果未觀測到源於hGH之波峰，確認已完全複合化。
(GPC條件) 裝置：HLC8320-GPC(Tosoh公司製造) 管柱：G2000SWXL 溶離液：10 mM PBS(pH值7.4) 流速：1 mL/min 注入量：50 μL 檢測器：RI或UV 280 nm 溫度：30℃
[實施例34] (玻尿酸衍生物與PEG化蛋白之複合化) 使用PEG化G-CSF代替hGH，除此以外，藉由與實施例33相同之方法，獲得玻尿酸衍生物HA-a25與PEG化G-CSF之複合體。又，在與實施例33相同條件之GPC測定中，上清液中未觀察到源於PEG化G-CSF之波峰，確認已完全複合化。
[實施例35] (玻尿酸衍生物與難溶性藥物之複合化) 使實施例25中獲得之玻尿酸衍生物HA-a25以濃度31.6 mg/mL溶解於純水，於獲得之玻尿酸衍生物HA-a25水溶液0.95 mL中混合另外溶解獲得之環孢素A之甲醇溶液(30 mg/mL)0.05 mL，於4℃下培養16小時，藉此獲得30 mg/mL之玻尿酸衍生物HA-a25及3 mg/mL之環孢素A之複合液。其後，添加2×PBS 1.5 mL，藉此生成玻尿酸衍生物HA-a25與環孢素A之複合體之沈澱。於相當於9000 G之條件下進行10分鐘離心分離，對上清液進行高效液相層析(HPLC)測定，結果未觀測到源於環孢素A之波峰，確認已完全複合化。
(HPLC條件) 裝置：HPLC系統Extrema(日本分光公司製造) 管柱：Inertsil ODS 5 μm 流動相：0.1 v/v%TFA：90 v/v%乙腈：10 v/v%水 流速：1 mL/min 注入量：30 μL 檢測器：UV(210 nm) 溫度：40℃ [產業上之可利用性]
根據本實施方式之玻尿酸衍生物，可提供一種通針性優異之玻尿酸衍生物。
圖1係實施例1中之6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之1 H-NMR圖譜。 圖2係實施例1中之玻尿酸(HA)之四丁基銨(TBA)鹽之1 H-NMR圖譜。 圖3係實施例1中之導入有6-胺基己基胺基甲酸酯之HA衍生物(HA-C6 -Chol)之1 H-NMR圖譜。

Claims (12)

  1. 一種玻尿酸衍生物，其係導入有甾基者，且 上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn為1.11以上10.0以下。
  2. 如請求項1之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量為3000以上160000以下。
  3. 如請求項1或2之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之Mw/Mn為1.2以上且未達3.0。
  4. 如請求項1至3中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述甾基相對於上述玻尿酸衍生物之導入率為6%以上且未達60%。
  5. 如請求項1至4中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物具有下述通式(I)所表示之重複單元， [化1]
    Figure 03_image009
    (式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意之胺基酸殘基的肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數)。
  6. 如請求項5之玻尿酸衍生物，其中上述R為膽固醇基。
  7. 如請求項1至6中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量Mw相對於數量平均分子量Mn之比Mw/Mn為1.2以上2.9以下。
  8. 如請求項1至7中任一項之玻尿酸衍生物，其中上述玻尿酸衍生物之重量平均分子量為7000以上120000以下。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之玻尿酸衍生物作為載體。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中藥物與上述玻尿酸衍生物形成複合體。
  11. 如請求項9或10之醫藥組合物，其中藥物為具有藥理活性之蛋白質、肽或核酸。
  12. 一種玻尿酸衍生物-藥物結合體，其於如請求項1至8中任一項之玻尿酸衍生物上結合有1種以上之藥物。
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