JP2021123597A - ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】従来より粒径が小さく制御されたヒアルロン酸誘導体組成物を提供する。【解決手段】ヒアルロン酸誘導体組成物（Ａ）は、ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）コレステロール誘導体と、を含むヒアルロン酸誘導体組成物であって、前記（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量がヒアルロン酸誘導体組成物の総質量に対して０．０１質量％以上１．６質量％未満である。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物に関する。

近年、タンパク質やペプチド、核酸を活性成分とする医薬品であるバイオ医薬品が実用化されており、その数は年々増え続けている。バイオ医薬品は、従来の低分子医薬では満たすことができなかった未充足医療ニーズを満たすことができる。しかしながら、消化管乃至粘膜等からは吸収されにくい上、体内では不安定で血中半減期が短いという課題がある。そのため、バイオ医薬品は注射による頻回投与が必要であり、患者と医療関係者いずれにとっても負担が大きい。そこで、薬理活性を損なうことなくバイオ医薬品をカプセル化して生体内で徐々に有効成分を放出することができる薬物基材（徐放性ドラッグデリバリーシステム基材）が求められている。

このような背景から、特許文献１では、安全性に優れたヒアルロン酸誘導体からなる徐放性ドラッグデリバリーシステム基材が提案されている。このヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特にバイオ医薬品を、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができ、なおかつ血中滞留性が良好である。このヒアルロン酸誘導体は、特にバイオ医薬品を有効成分として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、及び血中滞留性に優れた血中徐放キャリア並びにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（例えば、皮下等）徐放キャリアにもなり得るとされている。

国際公開第２０１０／０５３１４０号

しかしながら、特許文献１に記載されたヒアルロン酸誘導体では、粒径を調整することが難しく、ヒアルロン酸誘導体を含む薬物組成物の滅菌ろ過性が悪化することがある。ヒアルロン酸誘導体の粒径を小さくすれば、滅菌ろ過性は向上するものの、分子構造を変化させて粒径を制御する場合、薬物基材としての性能まで変化する恐れがあるため、分子構造を維持したまま、簡便な方法で粒子径を小さくすることが望まれる。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、従来より粒径が小さく制御されたヒアルロン酸誘導体組成物、並びに、前記ヒアルロン酸誘導体組成物を用いた医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物を提供する。

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） （Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）コレステロール誘導体と、を含むヒアルロン酸誘導体組成物であって、前記（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量がヒアルロン酸誘導体組成物の総質量に対して０．０１質量％以上１．６質量％未満である、ヒアルロン酸誘導体組成物。
（２） （Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が３５％以上６０％未満である、（１）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（３） 前記（Ｂ）コレステロール誘導体が、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である、（１）又は（２）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。

（式中、Ｒ^１１は水素原子、−ＣＯ−Ｃｌ、−ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯＯＨ及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ^１１−Ｎ（Ｘ^１１）Ｘ^１２からなる群より選択され；
Ｘ^１１及びＸ^１２は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ１−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｆ１は、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙ^１１は、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ１−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｇ１は、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
ｍ１は、1以上１００以下の整数である。）

（４） 前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有する、（１）〜（３）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体組成物。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル、ホルミル及びＣ_１−６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ^１は、以下の式：
−ＮＲ^ｂ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ、
−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｓ−Ｒ、
−ＣＯ−Ｙ^ａ−Ｓ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、及び
−Ｓ−Ｓ−Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｆは、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｇは、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙ^ａは、Ｃ_１−５アルキレンであり；
Ｙ^ｂは、Ｃ_２−８アルキレン又はＣ_２−８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）

（５） 前記Ｒがコレステリル基である、（４）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（６） 前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量が１,０００以上１,０００,０００未満である、（１）〜（５）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（７） （１）〜（６）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体組成物を担体として含む、医薬組成物。
（８） 薬物が（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、（７）に記載の医薬組成物。
（９） 薬物が、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド又は核酸である、（７）又は（８）に記載の医薬組成物。
（１０） （１）〜（６）のいずれか一つに記載のヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物。

上記態様のヒアルロン酸誘導体組成物によれば従来より粒径が小さく制御されたヒアルロン酸誘導体組成物を提供することができる。

実施例１におけるコレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 実施例１におけるヒアルロン酸（ＨＡ）のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。 実施例１における６−アミノヘキシルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃ_６−Ｃｈｏｌ）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。

以下、本発明の実施形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。

以下、本明細書において使用される用語を説明する。

本明細書において使用される「Ｃ_１−２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等の「Ｃ_１−４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、２−エチルブチル等が含まれる。Ｃ_１−２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ_１−１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ_１−６アルキル基も含まれる。

本明細書において使用される「Ｃ_１−６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ_１−６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−プロピルカルボニル、ｉｓｏ−プロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、ｉｓｏ−ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル等の「Ｃ_１−４アルキルカルボニル」が含まれる。

本明細書において使用される「アミノＣ_２−２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ_２−２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ_２−１２アルキルも含まれる。

本明細書において使用される「ヒドロキシＣ_２−２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ_２−２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ_２−１２アルキルも含まれる。

本明細書において使用される「Ｃ_２−３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ_２−２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ_２−８アルキレン、基「−（ＣＨ_２）_ｎ−」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。

本明細書において使用される「Ｃ_１−５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。

本明細書で言及する用語「Ｃ_２−８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイル、オクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。

≪ヒアルロン酸誘導体組成物≫
本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体（以下、「（Ａ）ヒアルロン酸誘導体」と称する場合がある）と、（Ｂ）アルコールと、を含む。（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量がヒアルロン酸誘導体組成物の総質量に対して０．０１質量％以上１．６質量％未満である。

本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量が上記範囲内であることで、粒径を小さく調整することができる。これは、ヒアルロン酸誘導体のステリル基が、コレステロール誘導体を内側に取り込んでナノ粒子を形成し、分子内疎水相互作用が強くなるため、分子の広がり（粒径）を小さく抑えられることによるものであると考えられる。

本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物の粒径は、１００ｎｍ未満が好ましく、９０ｎｍ以下がより好ましく、８０ｎｍ以下がさらに好ましい。粒径が上記上限値未満又は上記上限値以下であることで、生体内で細網内皮系により取り込まれやすい。なお、本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物の粒径は、後述する実施例に記載した方法で測定することができる。

＜（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体＞
（Ａ）ヒアルロン酸誘導体において、ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを解して結合されていてもよい。
ここでいう「リンカー」とは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができるが、本実施形態の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体においては、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは２アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるペプチドリンカーは、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよく、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。

［ステリル基］
本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ−５−エン−３β−イル基）が好ましい。

［ステリル基導入率］
（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対するステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）は３５％以上６０％未満が好ましく、３６％以上５５％未満がより好ましく、３８％以上５０％以下がさらに好ましく、３８％以上４５％以下が特に好ましい。
ステリル基導入率が上記範囲内であることで、ヒアルロン酸誘導体が水中でより良好にナノ粒子を形成し分散するという性質を有するようになる。ステリル基導入率が上記範囲内であることで、ヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させた、ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物は、水中に溶解し、生体内で細網内皮系への取り込みが可能な徐放製剤となり得る。

ステリル基導入率は、^１Ｈ−ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、ヒアルロン酸誘導体組成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ_３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。なお、式中ｎ_Ｈはピークに対応する水素原子の数を表す。具体的には、例えば後述する実施例に記載した方法に従って測定することができる。

［ステリル基導入率］（％）
＝［（ステリル基に由来するピーク積分値×３／ｎ_Ｈ）／（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値）］×１００

［（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量］
（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を期待する観点からは、分子量の比較的大きい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましく、最終剤形が溶液製剤の場合はシリンジアビリティの観点から分子量の比較的小さい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましい。このような（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量としては、１，０００（１ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上３００ｋ以下がより好ましく、５ｋ以上１２０ｋ以下がさらに好ましく、１０ｋ以上１００ｋ以下が特に好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。

ここでいう、「（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量」は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。具体的には、後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。

好ましい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル、ホルミル及びＣ_１−６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ^１は、以下の式：
−ＮＲ^ｂ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ、
−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｓ−Ｒ、
−ＣＯ−Ｙ^ａ−Ｓ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、
−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、及び
−Ｓ−Ｓ−Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｆは、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｇは、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙ^ａは、Ｃ_１−５アルキレンであり；
Ｙ^ｂは、Ｃ_２−８アルキレン又はＣ_２−８アルケニレンであり；
ｍは、１以上１００以下の整数である。）

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉａ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉａ）」と称する場合がある）を、１以上有するヒアルロン酸誘導体を含むことが好ましい。

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル、ホルミル及びＣ_１−６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｘは、−ＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒで表される疎水性基であり；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ_１−６アルキルからなる群より選択され；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、
ｍは、１以上１００以下の整数である。）

ここで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）がそれぞれ２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）以外の位置において、修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は−Ｏ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｏ（ホルミル）、−Ｏ（Ｃ_１−６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド又はエステルに変換されていてもよく、塩を形成していてもよい。

［繰り返し単位（Ｉ）］
一般式（Ｉ）中の基「−Ｚ−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｙ−Ｘ^１」は、以下の式：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−ＮＨ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^８）−ＣＨ_２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−ＮＨＣＯ−ＣＨ（Ｒ^８）−ＣＨ_２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨＣＯ−ＣＨ（Ｒ^８）−ＣＨ_２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^８）−ＣＨ_２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−Ｓ−Ｓ−Ｒ；及び
−Ｚ−ＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ
（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ^８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基を含む。
当該基としては、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；及び
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍｚ−Ｓ−Ｓ−Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択される基が好ましい。

（Ｚ）
一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ^１は−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒであることが好ましい。さらに、別の態様において、Ｚは、−ＮＨ−［ＣＨ（−Ｚ^ａ）−ＣＯＮＨ］_ｎ−１−ＣＨ（−Ｚ^ａ）−ＣＯ−で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚ^ａは、それぞれ独立に、Ｈ_２Ｎ−ＣＨ（−Ｚ^ａ）−ＣＯＯＨとして表されるα−アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基−Ｎ（−Ｒ^ａ）−Ｙ−Ｘ^１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα−アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα−アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚ^ａとしては、例えば、−ＣＨ_３、Ｈ_２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、Ｈ_２ＮＣＯＣＨ_２−等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−等が挙げられる。

（Ｙ）
一般式（Ｉ）において、Ｙは−（ＣＨ_２）_ｎ１−及び−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_６−、−（ＣＨ_２）_８−、−（ＣＨ_２）_１２−、又は、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−が好ましい。また、純水中で高い溶解性を実現させるという観点からは、Ｙは−（ＣＨ_２）_２−、−（ＣＨ_２）_６−、−（ＣＨ_２）_８−及び−（ＣＨ_２）_１２−からなる群より選択される基が好ましく、−（ＣＨ_２）_６−がより好ましい。

Ｙは、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−等であってもよい。

（Ｙ^ａ）
Ｙ^ａとしては、−ＣＨ_２−又は−ＣＨ_２−ＣＨ_２−が好ましい。

（Ｙ^ｂ）
Ｙ^ｂとしては、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイル又はオクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイルが好ましく、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−又は−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２−がより好ましい。

基「−Ｚ−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｙ−Ｘ^１」の具体例としては、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−ＣＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−ＣＯ−ＮＨ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−ＣＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−Ｎ（−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２）−コレステリル等が挙げられる。好ましい基「−Ｚ−Ｎ（Ｒ^ａ）Ｙ−Ｘ^１」としては、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ_２−３０アルキレン又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｙ^ａが、直鎖状のＣ_１−５アルキレンであるか、又はＹ^ｂが、直鎖状のＣ_２−８アルキレン若しくは直鎖状のＣ_２−８アルケニレンである。

［繰り返し単位（Ｉａ）］
一般式（Ｉａ）において、Ｘは、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_１２−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル又は−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルが好ましく、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル又は−ＮＨ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_２−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルがより好ましい。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）に加えて、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を更に含むことができる。

（式中、Ｒ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル、ホルミル及びＣ_１−６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
Ｘ^ａは、ヒドロキシ及び−Ｏ−Ｑ^＋からなる群より選択され；ここで、Ｑ^＋は、カウンターカチオンである。）

ここで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（ＩＩ）が２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
別の態様において、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。

［繰り返し単位（ＩＩ）］
一般式（ＩＩ）において、Ｑ^＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ^＋Ｒ^ｊＲ^ｋＲ^ｌＲ^ｍ（式中、Ｒ^ｊ、Ｒ^ｋ、Ｒ^ｌ及びＲ^ｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ_１−６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。中でも、Ｑ^＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。Ｒ^ｊ、Ｒ^ｋ、Ｒ^ｌ及びＲ^ｍは、Ｃ_１−６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ−ブチル基が好ましい。

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４、並びにＲ^１ａ、Ｒ^２ａ、Ｒ^３ａ、及びＲ^４ａは、全て水素原子であることが好ましい。また、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは、いずれも水素原子であることが好ましい。

中でも、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であることが好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されていてもよい。

［（Ｂ）コレステロール誘導体］
（Ｂ）コレステロール誘導体は、ヒアルロン酸誘導体の小粒子形成促進剤として機能し、ヒアルロン酸誘導体を小粒化させる。

（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量は、ヒアルロン酸誘導体組成物の総質量に対して、０．０１質量％以上１．６質量％未満であり、０．０１質量％以上１．０質量％以下が好ましく、０．０１質量％以上０．５質量％以下がより好ましく、０．１質量％以上０．５質量％以下がさらに好ましい。
（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量が上記下限値以上であることで、ヒアルロン酸誘導体組成物の粒径をより小さくすることができ、一方、上記上限値以下であることで、純水中乃至低塩濃度下におけるヒアルロン酸誘導体の凝集をより効果的に抑制することができる。

（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。具体的には、後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。

（Ｂ）コレステロール誘導体としては、例えば、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（以下、「化合物（ＩＩＩ）」と称する場合がある）等が挙げられる。中でも、化合物（ＩＩＩ）が好ましい。

（式中、Ｒ^１１は水素原子、−ＣＯ−Ｃｌ、−ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯＯＨ及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ^１１−Ｎ（Ｘ^１１）Ｘ^１２からなる群より選択され；
Ｘ^１１及びＸ^１２は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ１−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｆ１は、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｙ^１１は、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ１−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
Ｒ^ｇ１は、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
ｍ１は、1以上１００以下の整数である。）

基「−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ^１１−Ｎ（Ｘ^１１）Ｘ^１２」は、以下の式：
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＮＨ_２；及び
−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２；
で表される基からなる群より選択される基を含む。

化合物（ＩＩＩ）は、塩を形成していてもよい。塩の形態としては、例えば、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、カルシウム、エデト酸カルシウム、カムシレート、炭酸塩、塩化物、塩酸塩、クラブラネート、クエン酸塩、塩化二水素酸塩、エデト酸塩、エジシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、ヒドロキシナプトエート、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムケート、ナプシレート、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロネート、カリウム、サリチル酸塩、ナトリウム、ステアリン酸塩、サバステート、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、吉草酸塩、及びそれらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい（Ｂ）コレステロール誘導体として具体的には、例えば、コレステロール、クロロギ酸コレステロール、コレステロール塩酸塩、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］カルバミド酸３β−コレステリル、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］カルバミド酸３β−コレステリル塩酸塩、コレステリル３β−Ｎ−（ジメチルアミノ−エチル）−カルバメート塩酸塩、ヘミコハク酸コレステリル等が挙げられる。
中でも、（Ｂ）コレステロール誘導体としては、コレステロール又はコレステロール塩酸塩が好ましい。

＜ヒアルロン酸誘導体組成物の製造方法＞
本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を製造した後に、当該（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に（Ｂ）コレステロール誘導体を添加することで、製造することができる。

まず、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造方法としては、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、ステリル基を導入することで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が得られる。また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を３５％以上６０％未満とすることができる。

グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基を導入する方法として具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されるヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、式：「ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−Ｒ、ＮＨＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＣＯＯ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−Ｓ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＣＯ−Ｙ^ａ−Ｓ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−Ｏ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、ＨＮＲ^ａ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｒ、又は−Ｚ−ＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ（式中、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｙ、Ｙ^ａ、Ｙ^ｂ、Ｚ及びＲは本明細書で既に定義したとおりである）」で表されるステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。

上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。

特に、限定はされないが、ＤＭＴ−ＭＭは水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ−ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシとが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。

ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。多価アルコールとしては、上記「（Ｂ）アルコール」において例示されたものと同様のものが挙げられ、中でも、エチレングリコールが好ましい。

或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ Ｈａｌ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯＲ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ ＨＯＣＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯＨ ＋ ＨＮＲ^ｃ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＮＲ^ｃＨ ＋ Ｈａｌ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ ＨＯＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＯＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＯＣＯＯＨ ＋ ＨＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＯＣＯＯＨ ＋ Ｈａｌ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＯＣＯ−Ｈａｌ ＋ ＨＯ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＣＯ−Ｙ^ａ−Ｈａｌ ＋ ＨＳ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＣＯ−Ｙ^ａ−ＳＨ ＋ Ｈａｌ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ_２ ＋ ＨＳ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ_３）＝ＣＨ_２ ＋ ＨＳ−Ｒ；
−ＣＯＮＲ^ａ−Ｙ−ＳＨ ＋ ＨＳ−Ｒ；
−ＣＯＺ−ＯＨ ＋ ＨＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＣＯＺ−ＮＲ^ａ−Ｙ−ＮＲ^ｂＨ ＋ Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｒ
（式中、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｙ、Ｙ^ａ、Ｙ^ｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。

反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。

また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２−アミノエチル ２−ピリジル ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。

さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに−Ｓ−Ｓ−が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２−メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。

また、本発明のヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、繰り返し単位（Ｉ）、及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１％以上９９．５％以下、好ましくは４０％以上６５％以下を、−ＣＯ−Ｘ^ｚ、［ここで、Ｘ^ｚは、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ^１７）＝ＣＨ_２；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^１７）−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ^１７）＝ＣＨ_２；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ_２）_３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｒ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^１７）−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ_２）_３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ^１７）＝ＣＨ_２；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^１７）−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ^１７）＝ＣＨ_２；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ_２）_３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｒ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ^１７）−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＨ_２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｑ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ_２Ｈ）−（ＣＨ_２）−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ_２Ｈ）−（ＣＨ_２）_２−ＳＨ；及び
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ_２Ｈ）−（ＣＨ_２）_２−ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−ＣＯ_２Ｈ）−ＣＨ_２−ＳＨ
（ここで、Ｒ^１７は、水素原子又はＣ_１−６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で架橋させてゲル化することもできる。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を、化学架橋によりゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、架橋方法、ポリマー濃度、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間等がある。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度及び架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における架橋剤濃度は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような濃度で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル基（ＭＡ基）を導入したポリマーを、ＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１〜１：３が好ましく、２：１〜１：２が特に好ましい。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ポリマー及び架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）及びこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、多価アルコール、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。多価アルコールとしては、上記「（Ｂ）アルコール」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中徐放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中等の不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤等を溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油等が挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中等の脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤等を溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、及びその後に、架橋反応を停止する操作及び残存した架橋性官能基を失活若しくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤等は、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応等の観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水等で洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイル基が残存する場合は、過剰のメルカプトエタノール等を添加し、メタクリロイル基を失活させた後、過剰の水等で余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプト基が残存する場合は、過剰の３−マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸等を添加し、メルカプト基を失活させた後、過剰の水等で余剰の３−マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸を洗浄することで除去してもよい。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）及びインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、及びＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ−Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミル及びリンレックスミルが好ましい。

（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥等が挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力等は（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。

上記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造において、製造時に使用した原料由来の（Ｂ）コレステロール誘導体が残存している場合には、（Ｂ）コレステロール誘導体を添加せずにヒアルロン酸誘導体組成物を得ることができる。或いは、（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量が所望の量となるように、上記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造後に、（Ｂ）コレステロール誘導体を添加することで、ヒアルロン酸誘導体組成物を得ることができる。（Ｂ）コレステロール誘導体を添加する場合には、上記乾燥工程の前に添加することが好ましい。

≪医薬組成物≫
本実施形態の医薬組成物は、上記ヒアルロン酸誘導体組成物を担体として含む。本実施形態の医薬組成物において、担体と薬物は、水素結合、イオン結合、ファンデルワース力等の非共有結合等により直接的又は間接的に結合して、複合体を形成しており、互いに遊離していない状態であることが望ましい。当該医薬組成物を生体内に投与した際には、担体から薬物が徐々に遊離し、良好な徐放性を期待できる。

本実施形態の医薬組成物において、薬物は、担体であるヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成していることが好ましい。溶媒中において、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基と、系中に存在する薬物との疎水性相互作用により、自発的に会合することで、薬物と（Ａ）ヒアルロン酸誘導体との複合体が形成されると考えられる。当該複合体を形成することにより、当該薬物の保存安定性向上や生物活性の維持、徐放性の向上等が期待される。

＜薬物＞
本実施形態の医薬組成物に含まれる薬物としては、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、核酸、低分子化合物等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物は、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド、核酸等のバイオ医薬品又は低分子化合物が、ヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と、複合体を形成して含まれることが好ましい。

［低分子化合物］
低分子化合物としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤等）等が挙げられる。

［タンパク質及びペプチド］
タンパク質及びペプチドとしては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等が挙げられる。

［核酸］
核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、核酸アプタマー等が挙げられる。

＜形態＞
本実施形態の医薬組成物は、分散性微粒子溶液であってもよく、沈殿性懸濁液であってもよく、凍結乾燥体であってもよい。また、凍結乾燥体の場合は、医師が投与前に生理食塩水等の等張液を加えて投与液を用事調製するタイプの沈殿型の徐放製剤となりうる。この場合、溶液状態では不安定な活性成分を含む医薬組成物に適していると考えられる。

本実施形態の医薬組成物が分散性微粒子溶液又は沈殿性懸濁液である場合、医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上５００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上２００ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度が上記下限値以上であることで、薬物の保存安定性向上や生物活性の維持徐放性の向上、当該薬物が難水溶性である場合には、薬物の水への可溶化等をより優れたものとすることができ、薬物の投与量もより多くできる傾向にある。一方、医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度が上記上限値以下であることで、注射針を用いて生体内に投与する際のインジェクタビリティがより向上するとともに、得られる医薬組成物がより小粒子化する傾向にある。

≪ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物≫
本実施形態のヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物は、上記ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合している。

本実施形態のヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物を形成させるのに適した薬物は、タンパク質、ペプチド、核酸等のバイオ医薬品又は低分子化合物である。

本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物は、既に述べた形態に限定されることはなく、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、又はフィルムの形態にあってもよい。粉末は、凍結乾燥又は噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。

本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物は、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内又は口腔内の経路を経て投与されてよい。また、本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物は、注射剤に限定されることはなく、貼付製剤やマイクロニードル製剤、塗り薬、点眼薬、噴霧薬、吸入薬等であってもよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。

実施例及び比較例で製造したヒアルロン酸誘導体組成物の各物性の測定方法及び評価方法は以下のとおりである。

［物性１］
（ヒアルロン酸誘導体の分子量）
ヒアルロン酸誘導体の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。ヒアルロン酸誘導体組成物（２０ｍｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解して室温で１２時間以上撹拌し、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。このヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（７５０μＬ）に対して３００ｍＭ ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）水溶液（７５０μＬ）加えて振とう機を用いて１０秒間混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。そして、得られた試料をＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定に供して重量平均分子量を決定した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定の条件を以下に示す。

（測定条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本
カラム温度：３０℃
溶離液：１０ｍＭ ＨＰ−β−ＣＤ入りリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
流速：１ｍＬ／分
注入量：２００μＬ

［物性２］
（ステリル基導入率）
ヒアルロン酸誘導体のステリル基導入率は、^１Ｈ−ＮＭＲ測定により決定した。まず、ジメチルスルホキシド−ｄ_６（９９．９ｖ／ｖ％、０．０５ｖ／ｖ％のトリメチルシリル（ＴＭＳ）含有、富士フィルム和光製）と２０％重塩酸（９９．５ｖ／ｖ％、富士フィルム和光製）とを質量比９９：１にて混合し、測定溶媒を調製した。続いて、この測定溶媒（０．６ｍＬ）にヒアルロン酸誘導体組成物（２ｍｇ）を添加し、超音波バスにて３０分間処理して完全に溶解させて^１Ｈ−ＮＭＲ測定に供した。^１Ｈ−ＮＭＲ測定は、フーリエ変換核磁気共鳴装置（ＦＴ−ＮＭＲ装置）（ＥＣＳ４００、日本電子製）を用いてサンプル温度８５℃にて実施した。ステリル基導入率は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ_３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ_３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）の積分値より、以下に示す式を用いてヒアルロン酸ユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した。なお、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピークが含まれる１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３倍したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピークの積分値として、ステリル基導入率の計算に使用した。

［ステリル基導入率（％）］
＝［（コレステリル基中のメチル基由来のピーク積分値）／（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピーク積分値）］×１００
＝［積分値（０．７ｐｐｍ）／｛積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３｝］×１００

［物性３］
（コレステロール誘導体の含有量）
ヒアルロン酸誘導体組成物中のコレステロール誘導体の含有量は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）で測定した。ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。

（測定条件）
ＨＰＬＣ装置：Ｓｉｍａｄｚｕ Ｎｅｘｅｒａ
カラム：Ｉｎｔａｋｔ Ｃａｄｅｎｚａ ＣＸ−Ｃ１８ ＨＴ（２ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍｍ）膜厚３μｍ
カラム温度：５０℃
流速：０．３ｍＬ／分
移動相：Ａ＝Ｗａｔｅｒ／ＨＣＯＯＨ＝１００／０．１
Ｂ＝ＭｅＯＨ／ＨＣＯＯＨ＝１００／０．１
グラジェント：０分 Ａ５０％／Ｂ５０％
〜１０分 Ａ０％／Ｂ１００％
〜１０．１分 Ａ５０％／Ｂ５０％
〜１８分 Ａ５０％／Ｂ５０％
注入量：１０μＬ
測定時間：１８分

［評価１］
（粒径）
ヒアルロン酸誘導体組成物の粒径は、以下に示す手順により決定した。まず、１／１５ｍｏｌ／Ｌ ＰＢ（りん酸緩衝材粉末、富士フィルム和光製）１包を３．３３Ｌの超純水に溶解し、０．２２μｍフィルターでろ過を行い、２０ｍＭ ＰＢ水溶液を調整した。次に、ヒアルロン酸誘導体組成物（１０ｍｇ）に超純水（５ｍＬ）を加え、１２時間以上撹拌して溶解させてヒアルロン酸誘導体組成物水溶液を得た。この水溶液（１ｍＬ）を２０ｍＭ ＰＢ水溶液（１ｍＬ）で希釈し、０．２２μｍフィルターでろ過を行い、ヒアルロン酸誘導体組成物ＰＢ水溶液を得た。そして、得られたヒアルロン酸誘導体組成物ＰＢ水溶液を動的光散乱（ＤＬＳ）測定に供し、ヒアルロン酸誘導体組成物の粒径を決定した。ＤＬＳの測定条件を以下に示す。なお、粒径は、散乱光強度基準による調和平均粒子径（直径）であり、単位はナノメートル（ｎｍ）であり、同一試料を２回測定した平均値である。

（測定条件）
ＤＬＳ装置：大塚電子製、ＥＬＳＺ２０００
セル：微量粒径セル
温度：３７℃
ヒアルロン酸誘導体組成物の濃度：１ｍｇ／ｍＬ
溶液：１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）

＜ヒアルロン酸誘導体組成物の製造＞
［実施例１］
（ヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ−ａ１の製造）
ヒアルロン酸誘導体組成物を次の工程１〜工程３に従って調製した。

１．工程１
（コレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
コレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１−１、続いて工程１−２に従って合成した。

（１）工程１−１
コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−１−アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：４)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。

（２）工程１−２
得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＳ４００ 日本電子製、ＥｔＯＨ−ｄ_６）を図１に示す。

２．工程２
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を次に示す工程２−１、続いて工程２−２に従って調製した。

（１）工程２−１
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ−８−４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０ｗｔ％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ−ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ−ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。

（２）工程２−２
分子量１０，０００（１０ｋ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２−１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＥＣＳ４００ 日本電子製、ＥｔＯＨ−ｄ_６）を図２に示す。

３．工程３
「２．（２）工程２−２」で調製したＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、「１．工程１」で合成したＨＡ−ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比で４４／１００となるように添加した。次に、ＨＡユニットに対する４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）の添加量がモル比で５２．８／１００となるように加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ 酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：２，０００）した。生成物の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３に示す。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ_３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ_３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認された。
次いで、得られた透析液を０．２２μｍのフィルターを用いて濾過を行い、凍結乾燥してヒアルロン酸誘導体を得た。得られたヒアルロン酸誘導体に超純水を加え、室温で一晩攪拌し、４ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体水溶液を得た。また、コレステロール塩酸塩にエタノールへ加え、１時間攪拌し、１ｍｇ／ｍＬのコレステロール塩酸塩エタノール溶液を得た。上記ヒアルロン酸誘導体水溶液に、コレステロール塩酸塩エタノール溶液を、組成物中にコレステロール塩酸塩の含有量が０．１質量％となるように加え、１時間撹拌した後、凍結乾燥し、目的物（ＨＡ−Ｃ_６−Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。

［実施例２〜６及び比較例１〜４］
（ヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ−ａ２〜ＨＡ−ａ６及びＨＡ−ｂ１〜ＨＡ−ｂ４の製造）
「３．工程３」において、ＨＡユニットに対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量、及び、ＨＡユニットに対するＤＭＴ−ＭＭの添加量がモル比で表１及び表２に示す比率となるようにし、コレステロール誘導体の種類及び添加量が表１及び表２に示すようにした以外は、実施例１と同様の方法を用いて、各ヒアルロン酸誘導体組成物を得た。得られたヒアルロン酸誘導体組成物の^１Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、各ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれるヒアルロン酸誘導体においていずれも、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ_３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ_３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認された。

なお、表１及び表２において、コレステロール誘導体の種類及び略称は以下のとおりである。

（コレステロール種類及び略称）
コレステロール塩酸塩：Ａ
コレステロール：Ｂ

実施例及び比較例で得られたヒアルロン酸誘導体組成物について、上述の方法を用いて、各物性を測定し、各種評価を行なった。結果を表１及び表２に示す。

表１及び表２から、コレステロール誘導体を組成物の総質量に対して０．１質量％以上１．１質量％以下含有するヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ−ａ１〜ＨＡ−ａ６（実施例１〜６）では、粒径が４５ｎｍ以上９８ｎｍ以下と良好であった。一方、コレステロール誘導体を組成物の総質量に対して０．００１質量％又は１．７質量％含有するヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ−ｂ１〜ＨＡ−ｂ４（比較例１〜４）では、粒径が１０３ｎｍ以上１１０ｎｍ以下と１００ｎｍ超であり、不良であった。

本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物によれば、従来より粒子径が小さく制御されたヒアルロン酸誘導体組成物を提供することができる。

Claims (10)

1. （Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、
   （Ｂ）コレステロール誘導体と、
   を含むヒアルロン酸誘導体組成物であって、
   前記（Ｂ）コレステロール誘導体の含有量がヒアルロン酸誘導体組成物の総質量に対して０．０１質量％以上１．６質量％未満である、ヒアルロン酸誘導体組成物。
2. （Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が３５％以上６０％未満である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
3. 前記（Ｂ）コレステロール誘導体が、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその塩である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
   

   

   （式中、Ｒ^１１は水素原子、−ＣＯ−Ｃｌ、−ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯＯＨ及び−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ^１１−Ｎ（Ｘ^１１）Ｘ^１２からなる群より選択され；
   Ｘ^１１及びＸ^１２は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ１−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｒ^ｆ１は、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｙ^１１は、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ１−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ１−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｒ^ｇ１は、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   ｍ１は、1以上１００以下の整数である。）
4. 前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
   

   

   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル、ホルミル及びＣ_１−６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
   Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
   Ｘ^１は、以下の式：
   −ＮＲ^ｂ−Ｒ、
   −ＮＲ^ｂ−ＣＯＯ−Ｒ、
   −ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｒ、
   −ＮＲ^ｂ−ＣＯ−ＮＲ^ｃ−Ｒ、
   −ＣＯＯ−Ｒ、
   −Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
   −Ｓ−Ｒ、
   −ＣＯ−Ｙ^ａ−Ｓ−Ｒ、
   −Ｏ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、
   −ＮＲ^ｂ−ＣＯ−Ｙ^ｂ−Ｓ−Ｒ、及び
   −Ｓ−Ｓ−Ｒ、
   で表される基からなる群より選択される基であり；
   Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−及び−ＮＲ^ｆ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｒ^ｆは、水素原子、Ｃ_１−１２アルキル、アミノＣ_２−１２アルキル及びヒドロキシＣ_２−１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｒは、ステリル基であり；
   Ｙは、Ｃ_２−３０アルキレン、又は−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲ^ｇ−及び−Ｓ−Ｓ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｒ^ｇは、水素原子、Ｃ_１−２０アルキル、アミノＣ_２−２０アルキル及びヒドロキシＣ_２−２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−及び−ＮＨ−からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
   Ｙ^ａは、Ｃ_１−５アルキレンであり；
   Ｙ^ｂは、Ｃ_２−８アルキレン又はＣ_２−８アルケニレンであり；
   ｍは、１以上１００以下の整数である。）
5. 前記Ｒがコレステリル基である、請求項４に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
6. 前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量が１,０００以上１,０００,０００未満である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物を担体として含む、医薬組成物。
8. 薬物が（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 薬物が、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド又は核酸である、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
10. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体組成物。

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