WO2021157677A1 - ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物 - Google Patents

ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物 Download PDF

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慶之 中川
昂平 藪内
圭介 福本
徹 勝又
昭淵 梁
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旭化成株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to hyaluronic acid derivative compositions, pharmaceutical compositions and hyaluronic acid derivative-drug conjugate compositions.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-018312 filed in Japan on February 5, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • biopharmacy which is a drug containing proteins, peptides, and nucleic acids as active ingredients, has been put into practical use, and the number is increasing year by year. Biopharmacy can meet unmet medical needs that conventional small molecule drugs could not meet. However, there are problems that it is difficult to be absorbed from the digestive tract or mucous membrane, and that it is unstable in the body and has a short half-life in blood. Therefore, biopharmacy needs to be administered frequently by injection, which imposes a heavy burden on both patients and medical personnel. Therefore, there is a demand for a drug base material (sustained release drug delivery system base material) capable of encapsulating a biopharmacy and gradually releasing an active ingredient in vivo without impairing its pharmacological activity.
  • drug base material sustained release drug delivery system base material
  • Patent Document 1 proposes a sustained release drug delivery system substrate made of a hyaluronic acid derivative having excellent safety.
  • This hyaluronic acid derivative spontaneously associates in an aqueous solution to efficiently encapsulate drugs, especially biopharmacy, while maintaining its biological activity, and aggregates under physiological salt concentration (or physiological salt concentration). It also disperses underneath) and has good blood retention.
  • This hyaluronic acid derivative is a carrier capable of efficiently encapsulating many drugs while maintaining pharmacological activity, especially when a biopharmacy is used as an active ingredient, and a sustained-release carrier and a targeting carrier having excellent blood retention. It is said that it can also be used as a local (for example, subcutaneous) sustained-release carrier capable of continuously releasing the drug.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a hyaluronic acid derivative composition having an excellent ability to form a precipitate under physiological salt concentration, and a pharmaceutical composition and hyaluronic acid using the hyaluronic acid derivative composition.
  • Derivative-drug conjugate compositions are provided.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the content of the (B) polar group-containing compound is 0.001 mass ppm or more and less than 1000 mass ppm with respect to the mass of the (A) hyaluronic acid derivative.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkyl carbonyl;
  • Z represents a peptide linker that is directly linked or consists of 2 to 30 amino acid residues;
  • R f is selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-12 alkyl, amino C 2-12 alkyl and hydroxy C 2-12 alkyl, and the alkyl moiety of the group is from the group consisting of -O- and -NH-.
  • the group of choice may be inserted;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene, or-(CH 2 CH 2 O) m- CH 2 CH 2- , where the alkylene is from -O-, -NR g- and -SS-.
  • a group selected from the group may be inserted;
  • R g is selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl, and the alkyl moiety of the group is from the group consisting of -O- and -NH-.
  • the group of choice may be inserted;
  • Y a is an C 1-5 alkylene;
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene;
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the drug forms a complex with the (A) hyaluronic acid derivative.
  • the pharmaceutical composition according to (12) or (13) above, wherein the drug is a protein, peptide or nucleic acid having pharmacological activity.
  • hyaluronic acid derivative composition of the above aspect it is possible to provide a hyaluronic acid derivative composition having an excellent ability to form a precipitate under physiological salt concentration, a pharmaceutical composition containing the same, and a hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition. can.
  • Example 1 1 1 H-NMR spectrum of cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride in Example 1.
  • TSA tetrabutylammonium
  • HA hyaluronic acid
  • 6 is a 1 H-NMR spectrum of a HA derivative (HA-C 6- Chol) introduced with 6-aminohexyl carbamate in Example 1.
  • the present embodiment will be described in detail, but the present invention is not limited thereto, and various modifications can be made without departing from the gist thereof. be.
  • C 1-20 alkyl means a linear or branched alkyl group with 1 to 20 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, iso.
  • C 1-4 alkyl such as -propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, tert-butyl, and further n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1 -Ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like are included.
  • the C 1-20 alkyl also includes a C 1-12 alkyl having 1 or more and 12 or less carbon atoms and a C 1-6 alkyl group having 1 or more and 6 or less carbon atoms.
  • C 1-6 alkylcarbonyl means an alkylcarbonyl group whose alkyl moiety is C 1-6 alkyl already mentioned, eg, acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, etc.
  • C 1-4 alkylcarbonyl such as iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl and the like are included.
  • amino C 2-20 alkyl means a linear or branched alkyl having an amino group as a substituent and having 2 to 20 carbon atoms, for example, an amino group. May be located on the carbon atom at the end of the alkyl group. Amino C 2-20 alkyl also includes amino C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • hydroxy C 2-20 alkyl means a linear or branched alkyl group having a hydroxy group as a substituent and having 2 to 20 carbon atoms, for example, hydroxy. The group may be located on the terminal carbon atom of the alkyl group. Hydroxy C 2-20 alkyl also includes hydroxy C 2-12 alkyl having 2 or more and 12 or less carbon atoms.
  • C 2-30 alkylene means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, such as ethylene, propylene and the like.
  • C 1-5 alkylene means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, such as methylene, ethylene, and the like. Contains propylene and the like.
  • C 2-8 alkenylene refers to a divalent saturated hydrocarbon group containing one or more double bonds in a linear or branched chain with 2 to 8 carbon atoms.
  • the hyaluronic acid derivative composition of the present embodiment includes (A) a steryl group-introduced hyaluronic acid derivative (hereinafter, may be referred to as "(A) hyaluronic acid derivative"), (B) (B) hydroxy group, and the like. Includes a polar group-containing compound having at least one functional group selected from the group consisting of a carboxy group, an amino group, an amide group, a carbamate group, a urea group and a thiol group. (A) The introduction rate of the steryl group to the hyaluronic acid derivative is 0.1% or more and less than 35%.
  • the hyaluronic acid derivative composition of the present embodiment can adjust the precipitation forming ability in a salt concentration-dependent manner, and while it dissolves well at a low salt concentration, the introduction rate of the steryl group is as described above under a physiological salt concentration.
  • (A) hyaluronic acid derivative within the range it has at least one functional group selected from the group consisting of (B) hydroxy group, carboxy group, amino group, amide group, carbamate group, urea group and thiol group.
  • the polar group-containing compound functions as an aggregation accelerator and improves the ability to form a precipitate under physiological salt concentration.
  • the "physiological salt concentration” as used herein means the salt concentration at the administration site of the animal to be administered.
  • the physiological salt concentration in humans is a concentration of sodium chloride having a concentration of about 150 mM.
  • the "low salt concentration” means a concentration sufficiently lower than the physiological salt concentration.
  • the steryl group may be directly bonded to hyaluronic acid, or may be bonded by breaking the linker.
  • the linker here, any peptide linker or synthetic compound linker that can be introduced by genetic engineering can be used, but in the (A) hyaluronic acid derivative of the present embodiment, the peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the intended purpose, but the preferred length is 2 amino acids or more (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 amino acids or less is preferable.
  • peptide linkers contained in the (A) hyaluronic acid derivative peptide linkers having the same length may be used, or peptide linkers having different lengths may be used.
  • steryl group is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • steroids specifically, cholesterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmastanol, coprostanol, stigmasterol, citosterol, lanosterol, ergosterol, simialenol, bile acid, testosterone, estradiol, pro. Examples thereof include gesterone, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, and deoxycortisterone.
  • steryl group examples include a cholesteryl group, a stigmasteryl group, a lanosteryl group, an ergosteryl group and the like, and among them, a cholesteryl group (particularly, a cholester-5-ene-3 ⁇ -yl group) is preferable.
  • Stepryl group introduction rate The introduction rate of steryl groups to the hyaluronic acid derivative (hereinafter, may be simply referred to as "steryl group introduction rate") is 0.1% or more and less than 35%, preferably 5% or more and 33% or less, 6 % Or more and 22% or less are more preferable, and 6% or more and 20% or less are further preferable.
  • steryl group introduction rate is within the above range, the hyaluronic acid derivative has the property of dissolving well in pure water or under low salt concentration and agglomerating under physiological salt concentration to form a precipitate. Become.
  • the hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition in which the (A) hyaluronic acid derivative in the hyaluronic acid derivative composition is complexed with the drug is administered into the body (for example).
  • the body for example.
  • Subcutaneous administration it can be a precipitation-type sustained-release preparation that takes advantage of the feature of aggregation after administration.
  • the steryl group introduction rate can be measured by 1 H-NMR measurement according to the method described in Examples described later. That is, the integrated value of peak derived from steryl group (A) hyaluronic acid derivative in 1 H-NMR spectrum of hyaluronic acid derivative composition, the N- acetyl -D- glucosamine contained in (A) hyaluronic acid derivative acetyl It can be calculated based on the following formula using the integrated value of the peak derived from the group (COCH 3, 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, 3H).
  • Stepryl group introduction rate (%) [((A) Integral value of peak derived from steryl group of hyaluronic acid derivative) / (Integral value of peak derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine)] ⁇ 100
  • the steryl group introduction rate is specifically the integral of the peak (COCH 3 , 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, 3H) derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine. It is calculated from the value and the integrated value of the peak (CH 3 , 0.7 ppm, 3H) derived from the methyl group in the cholesteryl group.
  • the peak derived from the cholesteryl group (5H) overlaps the peak near 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less including the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine, 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less.
  • the integrated value (0.7 ppm) x 5/3) is used as the integrated value of the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine.
  • Stepryl group introduction rate (%) [(Peak integral value derived from methyl group in cholesteryl group) / (Peak integral value derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine)]
  • ⁇ 100 [Integral value (integral value ( 0.7ppm) / ⁇ Integral value (1.6ppm or more and 2.0ppm or less) -Integral value (0.7ppm) x 5/3 ⁇ ] x 100
  • the molecular weight of the (A) hyaluronic acid derivative is not particularly limited, but the molecular weight is relatively large from the viewpoint of expecting a sustained release function derived from the delayed diffusion in local administration and the above-mentioned ability to form a precipitate under physiological saline concentration.
  • the (A) hyaluronic acid derivative is preferable, and when the final dosage form is a solution preparation, the (A) hyaluronic acid derivative having a relatively small molecular weight is preferable from the viewpoint of syringe ability.
  • the molecular weight of the (A) hyaluronic acid derivative is preferably 1,000 (1 kDa) or more and less than 1,000,000 (1,000 kDa), more preferably 3 kDa or more and 500 kDa or less, and more preferably 5 kDa or more and 300 kDa or less. It is more preferably 5 kDa or more and 120 kDa or less, and particularly preferably 10 kDa or more and 100 kDa or less.
  • the molecular weight of the (A) hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using a raw material having the corresponding molecular weight.
  • the "molecular weight of (A) hyaluronic acid derivative" referred to here is a weight average molecular weight determined by a size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector (SEC-MALS). Specifically, the measurement can be performed according to the method described in Examples described later.
  • SEC-MALS size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector
  • hyaluronic acid derivative for example, a hyaluronic acid derivative having one or more repeating units represented by the following general formula (I) (hereinafter, may be referred to as “repeating unit (I)”). And so on.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkyl carbonyl;
  • Z represents a peptide linker that is directly linked or consists of 2 to 30 amino acid residues;
  • R f is selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-12 alkyl, amino C 2-12 alkyl and hydroxy C 2-12 alkyl, and the alkyl moiety of the group is from the group consisting of -O- and -NH-.
  • the group of choice may be inserted;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene, or-(CH 2 CH 2 O) m- CH 2 CH 2- , where the alkylene is from -O-, -NR g- and -SS-.
  • a group selected from the group may be inserted;
  • R g is selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl, and the alkyl moiety of the group is from the group consisting of -O- and -NH-.
  • the group of choice may be inserted;
  • Y a is an C 1-5 alkylene;
  • Y b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene;
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • the (A) hyaluronic acid derivative preferably contains a hyaluronic acid derivative having one or more repeating units represented by the following general formula (Ia) (hereinafter, may be referred to as "repeating unit (Ia)").
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkyl carbonyl;
  • X is a hydrophobic group represented by -NR a- Y-NR b-COO-R;
  • R a and R b are independently selected from the group consisting of hydrogen atom and C 1-6 alkyl;
  • R is a steryl group;
  • Y is C 2-30 alkylene or-(CH 2 CH 2 O) m- CH 2 CH 2- .
  • m is an integer of 1 or more and 100 or less.
  • repeating units may be the same or different.
  • the hyaluronic acid derivative (A) may be modified at a position other than the repeating unit (I) or the repeating unit (Ia), for example, the hydroxy group is —O (C 1-6 alkyl), —O (formyl). ), —O (C 1-6 alkylcarbonyl), etc., and the carboxy group may be converted to an amide or ester, or may form a salt.
  • the group "-ZN ( Ra ) YX 1 " in the general formula (I) has the following formula: -NH- (CH 2 ) mz- NH-R; -NH- (CH 2 ) mz- COO-R; -NH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2- COO-R, -NH- (CH 2 ) mz- O-COO-R; -NH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2- O-COO-R, -NH- (CH 2 ) mz -SR; -NH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2- SR; -NH- (CH 2 ) mz- O-CO-CH (R 8 ) -CH 2- SR; -NH- (CH 2 ) mz- NHCO-CH (R 8 ) -CH 2 -SR; -NH- (CH 2 CH 2 O) m
  • the group is selected from the group consisting of the groups represented by.
  • the group: -Z-NR a- Y-NR b- COO-R has the following formula: -NH- (CH 2 ) mz- NH-COO-R; -NH- (CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2- NH-COO-R; (In the formula, R, mz and m are as already defined herein.) It is preferably a group represented by selected from the group consisting of.
  • Z is preferably a direct bond.
  • X 1 is preferably -NR b- COO-R.
  • Z may be a peptide linker represented by -NH- [CH (-Z a ) -CONH] n-1- CH (-Z a) -CO-, where , n is 2 to 30 integer, Z a are each independently represent a H 2 n-CH (-Z a ) substituents in ⁇ - amino acid expressed as -COOH.
  • the peptide linker is bonded to the carboxyl group of glucuronic acid moiety at the N-terminus and linked to a group -N (-R a) -Y-X 1 at the C-terminus.
  • amino acids that can be used as amino acid residues of the peptide linker include ⁇ -amino acids such as alanine, arginine, asparagine (Asn), aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine (Gly), histidine, isoleucine, and leucine (Leu).
  • -Amino acids can be used. That is, the Z a, for example, -CH 3, H 2 NC ( NH) NH (CH 2) 3 -, H 2 NCOCH 2 - and the like.
  • the n Zs may be the same or different. n is an integer of 2 or more and 30 or less, preferably 2 or more and 10 or less, and more preferably 2 or more and 4 or less.
  • Preferred examples of the peptide linker include -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, Phe-Gly- and the like.
  • Y is-(CH 2 ) n1- and- (CH 2 CH 2 O) m1- CH 2 CH 2- (where n1 is an integer of 2 or more and 20 or less, and is 2 or more. An integer of 15 or less is preferable, an integer of 2 or more and 12 or less is more preferable, and an integer of 2 or more and 6 or less is further preferable. A group selected from the group consisting of (m1 is an integer of 1 or more and 4 or less) is preferable.
  • Y is-(CH 2 ) 2 -,-(CH 2).
  • a group selected from the group consisting of 6 ⁇ , ⁇ (CH 2 ) 8 ⁇ and ⁇ (CH 2 ) 12 ⁇ is preferred, and ⁇ (CH 2 ) 6 ⁇ is more preferred.
  • Y is, for example, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2- S-S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -,-(CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2 -S- S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2- , -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2- S-S- (CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2 -,-(CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2 -SS- (CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2 -etc.
  • Y b The Y b, -CH 2 -CH 2 - , - CH (CH 3) CH 2 -, 2- butene-1,4-diyl, hepta-2,4-diene-1,6-diyl or octa -2 , 4,6-Triene-1,8-diene is preferable, and -CH 2- CH 2- or -CH (CH 3 ) CH 2 -is more preferable.
  • Ra , R b and R c are hydrogen atoms
  • Y is a linear C 2-30 alkylene or-(CH). 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 - and is, Y a is either a straight chain C 1-5 alkylene, or Y b is straight-chain C 2-8 alkylene or linear C 2-8 alkenylene.
  • X is -NH- (CH 2 ) 2- NH-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 6- NH-COO-cholesteryl, -NH- (CH 2 ) 12- NH.
  • -COO-cholesteryl or -NH- (CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2- NH-COO-cholesteryl is preferred, -NH- (CH 2 ) 2- NH-COO-cholesteryl, -NH- (CH) 2 ) 6- NH-COO-cholesteryl or -NH- (CH 2 CH 2 O) 2- CH 2 CH 2- NH-COO-cholesteryl is more preferable.
  • the hyaluronic acid derivative (A) can further contain a repeating unit represented by the general formula (II) (hereinafter, may be referred to as “repeating unit (II)”) in addition to the repeating unit (I). ..
  • R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are independently selected from the group consisting of hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl and C 1-6 alkyl carbonyl;
  • X a is selected from the group consisting of hydroxy and —OQ + ; where Q + is a counter cation.
  • the repeating units may be the same or different.
  • the (A) hyaluronic acid derivative may be a hyaluronic acid derivative substantially consisting of a repeating unit (I), a repeating unit (Ia) and a repeating unit (II).
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with a carboxy group in water, and if it is divalent or higher, it forms a salt with a plurality of carboxy groups according to the valence.
  • counter cations are metal ions such as lithium ion, sodium ion, rubidium ion, cesium ion, magnesium ion, calcium ion; formula: N + R j R k R l R m (in the formula, R j , R k).
  • R l and R m are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom and a C 1-6 alkyl), and examples thereof include ammonium ions.
  • Q + is preferably sodium ion, potassium ion, or tetraalkylammonium ion (for example, tetra n-butylammonium ion).
  • R j , R k , R l and R m are preferably the same group selected from the group consisting of C 1-6 alkyl, preferably n-butyl groups.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 , and R 1a , R 2a , R 3a , and R 4a are all hydrogen atoms. Further, it is preferable that both Ra and R b are hydrogen atoms.
  • the (A) hyaluronic acid derivative is preferably a hyaluronic acid derivative substantially composed of the repeating unit (I) and the repeating unit (II).
  • the hyaluronic acid derivative (A) is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, among the repeating units of the disaccharide composed of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine contained in the derivative. More preferably, 95% or more are the repeating unit (I) and the repeating unit (II).
  • the hyaluronic acid derivative (A) may be composed of only the repeating unit (I) and the repeating unit (II).
  • the polar group-containing compound has at least one functional group selected from the group consisting of a hydroxy group, a carboxy group, an amino group, an amide group, a carbamate group, a urea group and a thiol group.
  • the content of the polar group-containing compound (B) is preferably 0.001 mass ppm or more and less than 1000 mass ppm, and more preferably 0.001 mass ppm or more and 900 mass ppm or less with respect to the mass of the (A) hyaluronic acid derivative. , 0.005 mass ppm or more and 800 mass ppm or less is more preferable, and 0.006 mass ppm or more and 700 mass ppm or less is particularly preferable. (B) When the content of the polar group-containing compound is at least the above lower limit value, the precipitation forming ability of the hyaluronic acid derivative composition under the physiological saline concentration can be further increased, while at the above upper limit value or less.
  • the content of the polar group-containing compound can be measured by a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method, and specifically, can be measured according to the method described in Examples described later. ..
  • the (B) polar group-containing compound preferably contains a compound having at least one hydroxy group, and preferably contains alcohol.
  • the alcohol functions as an aggregation promoter of the (A) hyaluronic acid derivative under the physiological salt concentration, and improves the precipitation forming ability of the (A) hyaluronic acid derivative under the physiological salt concentration.
  • Alcohol has many water-soluble compounds, is compatible with the steryl skeleton, and has relatively high solubility of the sterol compound. Therefore, when the (A) hyaluronic acid derivative is dispersed in water, nano-order gels are spontaneously formed, but the inclusion of alcohol increases the fluidity of the cholesterol domain, and the physical properties of the nano-order gels are increased. It is thought that cross-linking is likely to be promoted. Therefore, it is considered that the inclusion of a small amount of alcohol facilitates aggregation between nanogels and improves the ability to form a precipitate when the concentration of physiological salt is increased.
  • the alcohol may be a monoalcohol or a polyhydric alcohol.
  • monoalcohols include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol (isopropanol), 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, 1-pentanol, 2-pentanol, isoamyl alcohol, 1-hexanol, and the like.
  • the polyhydric alcohol may be a divalent alcohol or a trihydric alcohol.
  • Examples of the divalent alcohol include ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, neopentyl glycol, 1,4-butanediol, 1,6-hexanediol and the like.
  • Examples of the trihydric alcohol include glycerin and trimethylolpropane.
  • the alcohol one or more alcohols selected from the group consisting of ethanol, isopropanol, and polyhydric alcohol are preferable, polyhydric alcohol is more preferable, and ethylene glycol is further preferable.
  • the polar group-containing compound is preferably a polyfunctional compound having a plurality of polar groups.
  • hydrogen bonds between hyaluronic acids here, hydrogen bonds between nano-order gels are promoted, the state tends to be easily aggregated, and the precipitation forming ability at physiological salt salt concentration tends to be improved.
  • Examples of the (B) polar group-containing compound containing a carboxy group include fragrances such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, hexaneic acid and other C 1-12 may be branched hydrocarbon acids and benzoic acid. Examples thereof include carboxylic acid compounds having a group group. Examples of the polyfunctional carboxylic acid compound include oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, phthalic acid, isophthalic acid, and terephthalic acid. The polyfunctional carboxylic acid compound is preferably contained from the viewpoint of promoting the aggregated state. Compounds having a carboxy group and a hydroxy group, such as salicylic acid, are also preferable because they have a plurality of hydrogen-bondable functional groups.
  • a primary, secondary or tertiary amine compound can be used from the viewpoint of interacting with the carboxy of the (A) hyaluronic acid derivative, and salt exchange can be used. Therefore, a quaternary ammonium salt can also be used.
  • the amine compound C 1-12 may be branched such as methylamine, ethylamine, n-propylamine, butylamine, dimethylamine, diethylamine, din-propylamine, trimethylamine, triethylamine and tri-n-propylamine.
  • the (B) polar group-containing compound containing an amide group is a primary or 2 compound having a C 1-12 branched hydrocarbon acid and a C 1-12 branched hydrocarbon group.
  • Examples thereof include a condensed compound with a secondary amine compound.
  • N, N-dimethylformamide and N, N-dimethylacetamide can be mentioned.
  • cyclic amide compounds such as ⁇ -lactam, ⁇ -lactam, and ⁇ -lactam may be used.
  • Examples of the thiol-containing (B) polar group-containing compound include compounds having a C 1-12 branched hydrocarbon group, such as methanethiol, ethanethiol, and n-propurthiol.
  • (B) polar group-containing compound a compound containing a urea group such as urea or a compound containing a carbamate group may be used.
  • the (A) hyaluronic acid derivative after producing (A) a hyaluronic acid derivative, the (A) hyaluronic acid derivative has (B) a hydroxy group, a carboxy group, an amino group, an amide group, a carbamate group, and a urea group. It can be produced by adding a polar group-containing compound having at least one functional group selected from the group consisting of a thiol group and the like.
  • the (A) hyaluronic acid derivative can be obtained by converting the carboxy group of glucuronic acid into an amide and introducing a steryl group. Further, the steryl group introduction rate can be set to 0.1% or more and less than 35% by adjusting the blending amount of the compound having a steryl group to be reacted with hyaluronic acid as a raw material or a derivative thereof.
  • a steryl group for example, hyaluronic acid as a raw material or a derivative thereof, preferably hyaluronic acid composed of only the repeating unit (II) or
  • the derivative is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (eg, a tetrabutylammonium (TBA) salt) and, in the presence of a suitable condensing agent, with the hyaluronate in a solvent, formula: "HNR a- Y-NR b".
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited, and for example, 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium (DMT-MM), N. , N'-carbonyldiimidazole (CDI), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 2-benzotriazole-1,1, 3,3-Tetramethyluronium tetrafluorinated borate (TBTU), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HOdhbt), benzotriazole-1-oxy -Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorinated phosphate (PyBOP), benzotriazole-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent. Further, by using DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond by an amino group and a carboxy group while suppressing the formation of an ester bond in a system in which a large number of hydroxys coexist.
  • this condensing agent for example, the alcohol as a solvent reacts with the carboxy group of the hyaluronic acid moiety, and the carboxy group and the hydroxy that are simultaneously present in the hyaluronic acid moiety are bonded intramolecularly or intermolecularly. It is possible to prevent the formation of unwanted crosslinks.
  • Solvents used in the steryl group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, isopropanol, polyhydric alcohol, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and a mixture thereof. Examples include a solvent. Examples of the polyhydric alcohol include those similar to those exemplified in the above alcohols.
  • the raw material hyaluronic acid or a derivative thereof is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (for example, a tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronate and the spacer moiety are reacted in a solvent in the presence of a suitable condensing agent.
  • a protection and deprotection reaction may be carried out if necessary
  • the carboxy group (-COOH) of the raw material hyaluronic acid or a derivative thereof may be converted, and then reacted with an appropriate reagent. ..
  • reaction mode examples include dehydrohalogenation reaction, condensation reaction, dehydration reaction, nucleophilic addition reaction such as Michael addition, oxidative disulfide formation reaction, etc., which are well-known reactions and are appropriately selected by those skilled in the art. However, favorable reaction conditions can be found and carried out.
  • N-hydroxysuccinimide hereinafter, also referred to as “NHS”
  • a 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide is reacted with the carboxy group of the raw material hyaluronic acid or its derivative to prepare a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group modified with a leaving group is introduced at the terminal. Then, a method of forming a disulfide bond by subjecting thiocholester to a nucleophilic substitution reaction can be mentioned.
  • a method of preparing a hyaluronic acid or a derivative thereof in which a part of the spacer is introduced into the carboxy group and a steryl group in which a part of the spacer is introduced and reacting them Some specific examples have been described above, but when —SS— is inserted in Y, a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group at the end is introduced into the carboxy group of hyaluronic acid, and Another method is to prepare a steryl group into which a spacer having a mercapto group at the terminal is introduced and react them oxidatively to form a disulfide bond. At this time, one mercapto group may be reacted with 2-mercaptopyridine to form a disulfide, and then the other mercapto group may be substituted.
  • another substituent may be introduced.
  • the conditions for gelling the hyaluronic acid derivative by chemical cross-linking may be appropriately selected.
  • the cross-linking conditions include a cross-linking method, a polymer concentration, a cross-linking agent concentration, a solvent, a solvent pH, a salt concentration, a temperature, a time and the like.
  • the concentration of the cross-linking agent in the step of gelling the hyaluronic acid derivative is such that when a group having a group capable of forming a cross-linking at both ends is used, the group can quickly participate in the cross-linking reaction without excess or deficiency. It is preferable to add it.
  • MA group: SH group 3: 1 to 1: 3 is preferable, and 2: 1 to 1: 2 Is particularly preferable.
  • the solvent in the step of gelling the hyaluronic acid derivative (A) is preferably one capable of sufficiently dissolving the polymer and the cross-linking agent, and is not particularly limited, but is limited to water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMAc), and the like. It is preferable to use dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) and a mixed solvent selected from these. It is also possible to mix and use an organic solvent miscible with these solvents.
  • examples of the organic solvent to be mixed include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, polyhydric alcohol, acetone, acetonitrile and the like.
  • examples of the polyhydric alcohol include those similar to those exemplified in the above-mentioned "alcohol", and among them, ethylene glycol is preferable.
  • nano-sized fine particle gels can be formed by cross-linking under dilute conditions, and the hyaluronic acid derivative is used as a sustained-release carrier in blood and a targeting carrier.
  • the dilute condition is 10 mg / mL or less, preferably 5 mg / mL or less, and more preferably 1 mg / mL or less.
  • the high concentration condition is 5 mg / mL or more, preferably 20 mg / mL or more, and more preferably 40 mg / mL.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative may be performed in bulk or in a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • an aqueous phase in which a polymer, a cross-linking agent or the like is dissolved may be emulsified in a solvent immiscible with water, and a gelation reaction may be carried out.
  • the solvent immiscible with water is not particularly limited, and examples thereof include hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, medium chain fatty acid triglyceride (MCT), liquid paraffin, soybean oil and the like.
  • Surfactants may be added to stabilize the emulsification. Further, for example, it may be carried out in a solvent capable of desolving, such as in supercritical carbon dioxide or PEG.
  • a solvent capable of desolving such as in supercritical carbon dioxide or PEG.
  • the aqueous phase or organic solvent phase in which the polymer or cross-linking agent is dissolved is emulsified and dispersed in the solvent of the previous example to concentrate the polymer due to desolvation (solvent diffusion). , It is possible to obtain a gel with a higher crosslink density.
  • a step of gelling the hyaluronic acid derivative, and thereafter, an operation of stopping the cross-linking reaction and an operation of deactivating or washing the remaining cross-linking functional group may be performed.
  • Crosslinkable functional groups that did not participate in the reaction, groups to which only one end of the crosslinking agent was bonded, remaining crosslinking agents, etc. were used from the viewpoint of safety, stability during storage, side reactions with the encapsulated drug, etc. It is preferable to remove it from the viewpoint. Although not particularly limited, for example, if an unreacted cross-linking agent remains, it may be removed by washing with excess water or the like.
  • the methacryloyl group substituted with the polymer when it remains, it is removed by adding excess mercaptoethanol or the like to inactivate the methacryloyl group and then washing the excess mercaptoethanol with excess water or the like. May be good.
  • excess 3-maleimide propionic acid, iodoacetic acid, etc. are added to inactivate the mercapto group, and then excess 3-maleimide propionic acid, iodo, etc. are added with excess water or the like. It may be removed by washing the acetic acid.
  • a pulverization step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative.
  • the crushing method include crushing using a pestle and a mortar and crushing using a mill, and crushing using a mill is preferable.
  • Mill crushers include rotary disk-type crushers such as centrifugal crushers (Nippon Seiki Seisakusho) and impact mills (Dalton Co., Ltd.), atomizers (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.), and sample mills (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.).
  • a drying step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative.
  • the drying method include ventilation drying, drying in a constant temperature bath, vacuum drying, hot air circulation type drying and the like.
  • the wind speed, drying time, temperature, pressure, etc. are appropriately selected within the range in which the gel of the (A) hyaluronic acid derivative does not decompose or deteriorate.
  • the hyaluronic acid derivative composition is prepared by adding the (B) polar group-containing compound after the production of the (A) hyaluronic acid derivative so that the content of the (B) polar group-containing compound becomes a desired amount. Can be obtained.
  • the polar group-containing compound (B) it is preferable to add it before the drying step.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment contains a drug and a carrier, and contains the above hyaluronic acid derivative composition as a carrier.
  • the carrier and the drug are directly or indirectly bonded by hydrogen bond, ionic bond, non-covalent bond such as van der Worth force, etc. to form a complex, and form a complex with each other. It is desirable that it is not free.
  • the pharmaceutical composition is administered in vivo, the drug is gradually released from the carrier, and good sustained release can be expected.
  • the drug forms a complex with the (A) hyaluronic acid derivative in the hyaluronic acid derivative composition as a carrier.
  • the steryl group of the (A) hyaluronic acid derivative and the drug present in the system spontaneously associate with each other to form a complex of the drug and the (A) hyaluronic acid derivative. It is thought to be formed.
  • the drug contained in the pharmaceutical composition of the present embodiment is not particularly limited, and examples thereof include proteins, peptides, polysaccharides, nucleic acids, and small molecule compounds.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment contains a biopharmacy or a small molecule compound such as a protein, peptide, or nucleic acid having pharmacological activity in a complex with the (A) hyaluronic acid derivative in the hyaluronic acid derivative composition. Is preferable.
  • Examples of low molecular weight compounds include anticancer agents (eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.), immunosuppressants, anti-inflammatory agents (steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents, etc.), anti-rheumatic agents, antibacterial agents. Examples thereof include agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa agents, etc.).
  • anticancer agents eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids, etc.
  • immunosuppressants e.g., anti-inflammatory agents, etc.
  • anti-inflammatory agents steroids, non-steroidal anti-inflammatory agents, etc.
  • anti-rheumatic agents antibacterial agents. Examples thereof include agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulf
  • proteins and peptides examples include erythropoetin (EPO), granulocytoculture stimulating factor (G-CSF), interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ , (INF- ⁇ , ⁇ , ⁇ ), thrombopoetin (TPO), and serialy.
  • EPO erythropoetin
  • G-CSF granulocytoculture stimulating factor
  • INF- ⁇ , ⁇ , ⁇ thrombopoetin
  • serialy serialy.
  • CNTF Neutropic Factor
  • TNF Tumane Closis Factor
  • TNFbp Tuman Necrosis Factor Binding Protein
  • IL-10 Interleukin-10
  • FMS-like Tyrosine Kinase Flt-3
  • Growth Hormone GH
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • IL-1ra interleukin-1 receptor antagonist
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • KGF keratinocyte growth factor
  • SCF stem cell factor
  • MDF keratinocyte growth factor
  • SCF stem cell factor
  • MDF keratinocyte growth factor
  • SCF stem cell factor
  • MDF megacariosite growth factor
  • OPG osteoprotegerin
  • leptin parathyroid hormone
  • PTH basic fibroblast growth factor
  • BMP Atrial Natriuretic Peptide
  • BNP Brain Natriuretic Peptide
  • CNP C-Type Natriuretic Peptide
  • nucleic acid examples include DNA, RNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, ribozyme, small interfering RNA, nucleic acid aptamer and the like.
  • polysaccharide examples include lentinan, schizophyllan, pahimalan, pustulan, yeast glucan, yeast mannan, marinactane, curdlan, dextran sulfate, heparin, carrageenan, inulin, chondroitin, chondroitin sulfate and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may be a dispersible fine particle solution, a precipitating suspension, or a lyophilized product.
  • a dispersible fine particle solution it is a precipitation-type sustained-release preparation that has the characteristic of aggregating on the spot in the body after administration by administering it into the body (for example, subcutaneous administration) while being in a solution state before administration into the body.
  • a precipitating suspension it can be a precipitation-type sustained-release preparation characterized in that the active ingredient is less likely to be burst-released.
  • the size of the precipitate is preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or less, and even more preferably 20 ⁇ m or less.
  • a freeze-dried product it can be a precipitation-type sustained-release preparation of a type in which a doctor adds an isotonic solution such as physiological saline to prepare the administration solution.
  • an isotonic solution such as physiological saline to prepare the administration solution.
  • it is considered suitable for a pharmaceutical composition containing an active ingredient that is unstable in a solution state.
  • the concentration of the (A) hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition is preferably 1 mg / mL or more and 200 mg / mL or less, and 4 mg / mL /. It is more preferably mL or more and 100 mg / mL or less, further preferably 4 mg / mL or more and 50 mg / mL or less, and particularly preferably 4 mg / mL or more and 12 mg / mL or less.
  • the concentration of the (A) hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition is at least the above lower limit value, the precipitation forming ability under the physiological salt concentration can be made more excellent, and the dose of the drug is also larger. I tend to be able to do it.
  • the concentration of the (A) hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition is not more than the above upper limit value, the injectorability when administered into the living body using an injection needle is further improved, and the sterilization filterability is further improved. It tends to improve.
  • the hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition of the present embodiment contains the hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition and one or more drugs, and the (A) hyaluronic acid derivative contained in the hyaluronic acid derivative composition One or more of the above drugs are bound.
  • Drugs suitable for forming the hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition of the present embodiment are biopharmacy or small molecule compounds such as proteins, peptides and nucleic acids.
  • the pharmaceutical composition and hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition of the present embodiment are not limited to the forms already described, and are not limited to the forms described above, and are nanoparticulates, microparticulates, solutions, emulsions, suspensions, gels, micelles, and implants.
  • Powder or in the form of a film.
  • the powder may be produced by pulverizing a solid obtained by freeze-drying or spray-drying, or may be produced from a dried precipitate.
  • the pharmaceutical composition and hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition of the present embodiment can be used orally, extraintestinally, intranasally, intravaginally, intraocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intrathecally or intracerebrally. It may be administered via the intraoral route.
  • the pharmaceutical composition and the hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition of the present embodiment are not limited to injections, and may be a patch formulation, a microneedle formulation, an ointment, an eye drop, a spray, an inhalant, or the like. There may be.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative is the weight average molecular weight determined by size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector (SEC-MALS).
  • SEC-MALS size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector
  • a 300 mM hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) aqueous solution (750 ⁇ L) is added to this hyaluronic acid derivative composition aqueous solution (750 ⁇ L), mixed for 10 seconds using a shaker, and mixed at 37 ° C. for 1 Incubated for hours. Then, the obtained sample was subjected to SEC-MALS measurement to determine the weight average molecular weight. The conditions for SEC-MALS measurement are shown below.
  • Stepryl group introduction rate The steryl group introduction rate of the hyaluronic acid derivative was determined by 1 1 H-NMR measurement. First, dimethyl sulfoxide-d 6 (99.9 v / v%, 0.05 v / v% containing trimethylsilyl (TMS), manufactured by Fujifilm Wako) and 20% dihydrochloric acid (99.5 v / v%, manufactured by Fujifilm Wako). ) was mixed at a mass ratio of 99: 1 to prepare a measurement solvent.
  • TMS trimethylsilyl
  • the hyaluronic acid derivative composition (2 mg) was added to this measurement solvent (0.6 mL), treated with an ultrasonic bath for 30 minutes to completely dissolve it, and subjected to 1 1 H-NMR measurement.
  • 1 1 H-NMR measurement was carried out at a sample temperature of 85 ° C. using a Fourier transform nuclear magnetic resonance apparatus (FT-NMR apparatus) (ECS400, manufactured by JEOL Ltd.).
  • the steryl group introduction rate is the integral value of the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine (COCH 3 , 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, 3H) and the peak derived from the methyl group in the cholesteryl group (CH).
  • the introduction rate of the cholesteryl group to the hyaluronic acid unit was calculated using the formula shown below. Since the peak derived from the cholesteryl group (5H) overlaps the peak near 1.6 ppm or more and 2.0 ppm or less, which includes the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine, 1.6 ppm or more 2 The value calculated by subtracting the integral value of the peak derived from cholesteryl group methyl (0.7 ppm) by 5/3 from the integral value of the peak near 0.0 ppm (that is, the integral value (1.6 ppm or more and 2.0 ppm)).
  • Stepryl group introduction rate (%) [(Integrated peak value derived from methyl group in cholesteryl group) / (Integrated peak value derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine)]
  • ⁇ 100 [Integral value (0.7ppm) / ⁇ Integral value (1.6ppm or more and 2.0ppm or less) -Integral value (0.7ppm) x 5/3 ⁇ ] x 100
  • the mass ratio of the (B) polar group-containing compound in the measurement sample to the amount of the added hyaluronic acid derivative was calculated as the content of the (B) polar group-containing compound with respect to the hyaluronic acid derivative.
  • the calibration curve required for the quantitative analysis was prepared using a commercially available standard. The conditions for GC-MS measurement are shown below.
  • the mass ratio of ethylene glycol in the sample to the mass of the (A) hyaluronic acid derivative used was calculated as the content of the (B) polar functional group-containing compound with respect to the (A) hyaluronic acid derivative.
  • Heat desorption device GESTEL TDU, CIS4 Desorption temperature: 200 ° C Desorption time: 10 minutes
  • Split Splitless cryo Focusing temperature: -130 ° C
  • CIS Liner Tenax (GL Science)
  • GC device Agilent Technologies 7890
  • Column GL Science DB-WAX (30m x 0.25mm ⁇ , film thickness 0.25mm) Temperature conditions: 40 ° C (5 minutes) ⁇ 20 ° C / min ⁇ 250 ° C (hold for 5 minutes)
  • MS device Agilent Technologies 7000
  • Ionization EI 70eV Ion source temperature 250 ° C Scan range: SIM (m / z33)
  • the measurement was carried out in the same manner as ethylene glycol except that the temperature conditions were 50 ° C. (5 minutes) ⁇ 10 ° C./min ⁇ 240 ° C. (holding for 6 minutes).
  • the precipitation rate of the hyaluronic acid derivative composition was determined by the procedure shown below. First, a 40 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 600 mM sodium chloride was prepared (referred to as a concentrated buffer solution). Next, ultrapure water was added to the hyaluronic acid derivative composition, and the mixture was stirred and dissolved for 12 hours or more to obtain an aqueous solution of the hyaluronic acid derivative composition. This aqueous solution was placed in a filtration tube (pore size: 5.0 ⁇ m; UFC40SV25; manufactured by Merck & Co., Inc.), centrifuged, and filtered.
  • a filtration tube pore size: 5.0 ⁇ m; UFC40SV25; manufactured by Merck & Co., Inc.
  • a precipitate-forming sample obtained by mixing a filtered hyaluronic acid derivative aqueous solution (600 ⁇ L) and a concentrated buffer solution (200 ⁇ L), and a filtered hyaluronic acid derivative aqueous solution (600 ⁇ L) and ultrapure water (200 ⁇ L).
  • a reference sample (N number: 2) was prepared. Then, the precipitate-forming sample and the reference sample were incubated at 37 ° C. for 20 minutes, and then centrifuged (2,000 ⁇ g, 10 minutes).
  • each sample was diluted 2-fold by adding a 300 mM hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin (HP- ⁇ -CD) aqueous solution (200 ⁇ L), and then at 37 ° C. for 2 hours. Incubated. Further, all the samples were diluted by adding 10 mM HP- ⁇ -CD aqueous solution (1000 ⁇ L) and treated with a syringe filter (pore size: 0.45 ⁇ m). Then, the obtained precipitate-forming sample and reference sample were subjected to size exclusion chromatography (SEC) measurement.
  • SEC size exclusion chromatography
  • the precipitation rate of the hyaluronic acid derivative composition was calculated based on the formula shown below using the area value of the peak (around 7 minutes) derived from the hyaluronic acid derivative in the SEC chromatogram of the precipitate-forming sample and the reference sample.
  • the conditions for SEC measurement are shown below.
  • the volume of the filtered aqueous solution of the hyaluronic acid derivative composition was measured, and the volume of the filtered aqueous solution of the hyaluronic acid derivative composition per effective filtration area was calculated to obtain the maximum filtration amount.
  • Step 1-2 The obtained residue was dissolved in ethyl acetate (40 mL), 4N hydrochloric acid / ethyl acetate solution (40 mL) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting precipitate was collected by centrifugation. The obtained solid was washed 4 times with ethyl acetate and dried under reduced pressure to obtain 1.2 g of cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride (Chol hydrochloride).
  • the 1 H-NMR spectrum of the product (CS400 manufactured by JEOL Ltd., EtOH-d 6 ) is shown in FIG.
  • Step 2 Preparation of tetrabutylammonium (TBA) salt of hyaluronic acid
  • TBA salt of hyaluronic acid HA-TBA
  • Step 2-1 DOWNEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Aldrich) was suspended in ultrapure water, and the resin was washed with ultrapure water about 3 times by decantation.
  • a 40 mass% tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution (TBA-OH) (manufactured by Aldrich) was added in an equivalent amount of about 1.5 times the cation exchange capacity of the resin, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • TBA-OH tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution
  • the excess TBA-OH solution was removed by decantation and then washed with excess ultrapure water to obtain a TBA-chlorinated cation exchange resin.
  • Step 2-2 A raw material sodium hyaluronate salt (HA-Na) having a molecular weight of 50,000 (50 kDa) was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg / mL.
  • the suspension of the cation exchange resin TBA-chlorinated in "(1) Step 2-1" was added in an equal amount of 5 times the molar number of HA units (unit molecular weight 401.3) in terms of the ion exchange capacity of the resin. ..
  • filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was lyophilized to obtain the TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • the 1 H-NMR spectrum of the product (ECS400 manufactured by JEOL Ltd., EtOH-d 6 ) is shown in FIG.
  • Examples 2 to 25 and Comparative Examples 1 to 2 (Production of Hyaluronic Acid Derivative Compositions HA-a2-HA-a25 and HA-b1-HA-b2) In “3. Step 3", the amount of Chol hydrochloride added to the HA unit and the amount of DMT-MM added to the HA unit are set to the ratio shown in the table below in terms of molar ratio, and the type of alcohol and (A). Each hyaluronic acid derivative composition was obtained by using the same method as in Example 1 except that the content of the (B) polar group-containing compound with respect to the hyaluronic acid derivative was as shown in the table below.
  • hyaluronic acid derivative compositions HA-a19 and HA-a23 having different alcohol contents
  • the maximum amount of filtration tended to increase as the alcohol content decreased.
  • HA-a23 to HA-a25 in which the types of alcohols are different, when ethylene glycol is used, precipitation with a concentrated buffer solution containing 1.2 mg / mL NaCl is used. The rate was good.
  • hyaluronic acid derivative composition of the present embodiment a hyaluronic acid derivative composition having an excellent ability to form a precipitate under physiological salt concentration, a pharmaceutical composition containing the same, and a hyaluronic acid derivative-drug conjugate composition are provided. Can be done.

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Abstract

（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物と、を含み、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が、０．１％以上３５％未満であるヒアルロン酸誘導体組成物、当該ヒアルロン酸誘導体組成物を担体として含む医薬組成物、および、当該ヒアルロン酸誘導体組成物における（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に１以上の薬物が結合したヒアルロン酸誘導体－薬物結合組成物が提供される。

Description

ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物
　本発明は、ヒアルロン酸誘導体組成物、医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物に関する。
　本願は、２０２０年２月５日に、日本に出願された特願２０２０－０１８３１２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、タンパク質やペプチド、核酸を活性成分とする医薬品であるバイオ医薬品が実用化されており、その数は年々増え続けている。バイオ医薬品は、従来の低分子医薬では満たすことができなかった未充足医療ニーズを満たすことができる。しかしながら、消化管乃至粘膜等からは吸収されにくい上、体内では不安定で血中半減期が短いという課題がある。そのため、バイオ医薬品は注射による頻回投与が必要であり、患者と医療関係者いずれにとっても負担が大きい。そこで、薬理活性を損なうことなくバイオ医薬品をカプセル化して生体内で徐々に有効成分を放出することができる薬物基材（徐放性ドラッグデリバリーシステム基材）が求められている。
　このような背景から、特許文献１では、安全性に優れたヒアルロン酸誘導体からなる徐放性ドラッグデリバリーシステム基材が提案されている。このヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特にバイオ医薬品を、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができ、生理食塩濃度下で凝集し（或いは、生理食塩濃度下でも分散し）、なおかつ血中滞留性が良好である。このヒアルロン酸誘導体は、特にバイオ医薬品を有効成分として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、及び血中滞留性に優れた血中徐放キャリア並びにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（例えば、皮下等）徐放キャリアにもなり得るとされている。
国際公開第２０１０／０５３１４０号
　しかしながら、特許文献１に記載されたヒアルロン酸誘導体では、塩濃度依存的に沈殿形成能を調整することが難しく、また、生理食塩濃度下における沈殿形成能が十分でないため、ヒアルロン酸誘導体を含む薬物組成物の生体内での局所滞留性が損なわれるリスクがある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生理食塩濃度下での沈殿形成能に優れるヒアルロン酸誘導体組成物、並びに、前記ヒアルロン酸誘導体組成物を用いた医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）　（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、
　（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物と、
を含むヒアルロン酸誘導体組成物であって、
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が０．１％以上３５％未満である、ヒアルロン酸誘導体組成物。
（２）　前記（Ｂ）極性基含有化合物が、ヒドロキシ基を少なくとも一つ有する極性基含有化合物である、前記（１）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（３）　前記（Ｂ）極性基含有化合物の含有量が、前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の質量に対して０．００１質量ｐｐｍ以上１０００質量ｐｐｍ未満である、前記（１）又は（２）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（４）　前記（Ｂ）極性基含有化合物が複数の極性基を有している化合物である、前記（１）～（３）いずれかに記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（５）前記（Ｂ）極性基含有化合物が、アルコールである前記（１）～（４）いずれかに記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（６）　前記アルコールが、エタノール、イソプロパノール、及び、多価アルコールからなる群より選択される、前記（５）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（７）　前記アルコールが、多価アルコールである、前記（６）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（８）　前記アルコールが、エチレングリコールである、前記（７）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（９）　前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有する、（１）～（８）のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。
(１０)　前記Ｒがコレステリル基である、前記（９）に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
(１１)　前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量が１,０００以上１,０００,０００未満である、前記（１）～（１０）のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
（１２）　薬物と、担体を含み、前記担体が前記（１）～（１１）のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物である、医薬組成物。
（１３）　前記薬物が（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、前記（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）　薬物が、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド又は核酸である、前記（１２）又は（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）　前記（１）～（１１）のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物および１以上の薬物を含み、前記ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、前記１以上の薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物。
　上記態様のヒアルロン酸誘導体組成物によれば、生理食塩濃度下での沈殿形成能に優れるヒアルロン酸誘導体組成物、これを含む医薬組成物およびヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物を提供することができる。
実施例１におけるコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 実施例１におけるヒアルロン酸（ＨＡ）のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 実施例１における６－アミノヘキシルカーバメートを導入したＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。
　以下、本発明の実施形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
　以下、本明細書において使用される用語を説明する。
　本明細書において使用される「Ｃ１－２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、２－エチルブチル等が含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ１－１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ１－６アルキル基も含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ１－６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル等の「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書において使用される「アミノＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ２－３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ２－２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ２－８アルキレン、基「－（ＣＨ２）ｎ－」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。
　本明細書において使用される「Ｃ１－５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル、オクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。
≪ヒアルロン酸誘導体組成物≫
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体（以下、「（Ａ）ヒアルロン酸誘導体」と称する場合がある）と、（Ｂ）（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物と、を含む。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対するステリル基の導入率が０．１％以上３５％未満である。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、塩濃度依存的に沈殿形成能を調整することができ、低塩濃度では良好に溶解しつつ、生理食塩濃度下では、ステリル基の導入率が上記の範囲内の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対して、（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物が凝集促進剤として機能し、生理食塩濃度下での沈殿形成能が向上するものである。ここでいう「生理食塩濃度」とは、投与対象である動物の投与部位における塩濃度を意味する。例えば、ヒトにおける生理食塩濃度とは、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ程度の濃度である。また、「低塩濃度」とは、生理食塩濃度よりも十分に低い濃度を意味する。
＜（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体＞
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体において、ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを解して結合されていてもよい。
　ここでいう「リンカー」とは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができるが、本実施形態の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体においては、ペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは２アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるペプチドリンカーは、全て同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよく、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。
［ステリル基］
　本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
［ステリル基導入率］
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対するステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）は０．１％以上３５％未満であり、５％以上３３％以下が好ましく、６％以上２２％以下がより好ましく、６％以上２０％以下がさらに好ましい。
　ステリル基導入率が上記範囲内であることで、ヒアルロン酸誘導体が純水中又は低塩濃度下では良好に溶解しつつ、生理食塩濃度下で凝集して沈殿を形成するという性質を有するようになる。ステリル基導入率が上記範囲内であることで、ヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を薬物と複合化させた、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物は、体内に投与（例えば、皮下投与）する際に、投与後に凝集する特長を生かした沈殿型の徐放製剤となり得る。
　ステリル基導入率は、後述する実施例に記載した方法に従って１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、ヒアルロン酸誘導体組成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおける（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。
　［ステリル基導入率（％）］＝［（（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク積分値）］×１００
　ステリル基がコレステリル基である場合、ステリル基導入率は、具体的には、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）の積分値より算出される。なお、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピークが含まれる１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークにコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なるため、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３倍したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピークの積分値として使用する。
　［ステリル基導入率（％）］＝［（コレステリル基中のメチル基由来のピーク積分値）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク積分値）］×１００＝［積分値（０．７ｐｐｍ）／｛積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３｝］×１００
［（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量］
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を期待する観点や前述した生理食塩濃度下における沈殿形成能という観点からは、分子量の比較的大きい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましく、最終剤形が溶液製剤の場合はシリンジアビリティの観点から分子量の比較的小さい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が好ましい。このような（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量としては、１，０００（１ｋＤａ）以上１，０００，０００（１，０００ｋＤａ）未満が好ましく、３ｋＤａ以上５００ｋＤａ以下がより好ましく、５ｋＤａ以上３００ｋＤａ以下がより好ましく、５ｋＤａ以上１２０ｋＤａ以下がさらに好ましく、１０ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下が特に好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ここでいう、「（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量」は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。具体的には、後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。
　好ましい（Ａ）ヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、下記一般式（Ｉａ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉａ）」と称する場合がある）を、１以上有するヒアルロン酸誘導体を含むことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｘは、－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒで表される疎水性基であり；
　Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択され；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、
　ｍは、１以上１００以下の整数である。
　ここで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）がそれぞれ２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）又は繰り返し単位（Ｉａ）以外の位置において、修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は－Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｏ（ホルミル）、－Ｏ（Ｃ１－６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシ基は、アミド又はエステルに変換されていてもよく、塩を形成していてもよい。
［繰り返し単位（Ｉ）］
　一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
　－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｚ、Ｒａ、Ｙ、Ｒｂ、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基であることが好ましい。
　前記基：－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒとしては、下記式：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
（式中、Ｒ、ｍｚ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択されるで表される基であることが好ましい。
　これらの中でも、一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」として、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択される基であることがより好ましい。
（Ｚ）
　一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。
　また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。
　さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
（Ｙ）
　一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
　Ｙは、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－等であってもよい。
（Ｙａ）
　Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
（Ｙｂ）
　Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
（Ｒ）
　Ｒとしては、コレステリル基が好ましい。
　基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリル等が挙げられる。好ましい基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」としては、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、又はＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレン若しくは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
［繰り返し単位（Ｉａ）］
　一般式（Ｉａ）において、Ｘは、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが好ましく、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル又は－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルがより好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）に加えて、一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を更に含むことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｘａは、ヒドロキシ及び－Ｏ－Ｑ＋からなる群より選択され；ここで、Ｑ＋は、カウンターカチオンである。
　ここで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に繰り返し単位（ＩＩ）が２以上含まれる場合に、当該繰り返し単位は同一であってもよく、異なっていてもよい。
　別の態様において、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）、繰り返し単位（Ｉａ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であってもよい。
［繰り返し単位（ＩＩ）］
　一般式（ＩＩ）において、Ｑ＋はカルボキシ基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシ基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、それぞれ独立に、水素原子及びＣ１－６アルキルからなる群より選択される）で表されるアンモニウムイオン等が挙げられる。中でも、Ｑ＋は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、又はテトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン等）が好ましい。Ｒｊ、Ｒｋ、Ｒｌ及びＲｍは、Ｃ１－６アルキルからなる群より選択される同一の基であることが好ましく、ｎ－ブチル基が好ましい。
　Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４、並びにＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、及びＲ４ａは、全て水素原子であることが好ましい。また、Ｒａ及びＲｂは、いずれも水素原子であることが好ましい。
　中でも、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体であることが好ましい。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）である。（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されていてもよい。
［（Ｂ）極性基含有化合物］
　（Ｂ）極性基含有化合物は、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する。
　（Ｂ）極性基含有化合物の含有量は、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の質量に対して、０．００１質量ｐｐｍ以上１０００質量ｐｐｍ未満が好ましく、０．００１質量ｐｐｍ以上９００質量ｐｐｍ以下がより好ましく、０．００５質量ｐｐｍ以上８００質量ｐｐｍ以下がさらに好ましく、０．００６質量ｐｐｍ以上７００質量ｐｐｍ以下が特に好ましい。
　（Ｂ）極性基含有化合物の含有量が上記下限値以上であることで、ヒアルロン酸誘導体組成物の生理食塩濃度下での沈殿形成能をより高くすることができ、一方、上記上限値以下であることで、純水中乃至低塩濃度下における（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の凝集をより効果的に抑制することができ、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液の０．２２μｍフィルターを用いた滅菌ろ過のろ過性をさらに向上させることができる。
　（Ｂ）極性基含有化合物の含有量は、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）法により測定することができ、具体的には後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。
　前記（Ｂ）極性基含有化合物として、ヒドロキシ基を少なくも一つ有する化合物が含まれることが好ましく、アルコールが含まれることが好ましい。アルコールは、生理食塩濃度下で（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の凝集促進剤として機能し、生理食塩濃度下における（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の沈殿形成能を向上させる。アルコールは、水溶性の化合物が多く、また、ステリル骨格と相性が良く、ステロール化合物の溶解性が比較的高い。そのため、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を水中に分散させると、自発的にナノオーダーのゲルを形成するが、アルコールを含むことにより、コレステロールドメインの流動性が高くなり、ナノオーダーのゲル同士の物理的架橋が促進されやすくなると考えられる。よって、アルコールが微量含まれることで、ナノゲル間の凝集が進みやすくなり、生理食塩濃度化での沈殿形成能が向上すると考えられる。
　前記アルコールとしては、モノアルコールであってもよく、多価アルコールであってもよい。モノアルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール（イソプロパノール）、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、イソアミルアルコール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、１－ヘプタノール、１－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、３，３，５－トリメチル－１－ヘキサノール、トリデカノール、ペンタデカノール、パルミチルアルコール、ステアリルアルコール、シクロペンタノール、シクロヘキサノール、メチルシクロヘキサノール、トリメチルシクロヘキサノール等が挙げられる。多価アルコールとしては、２価のアルコールであってもよく、３価のアルコールであってもよい。２価のアルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等が挙げられる。３価のアルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等が挙げられる。
　中でも、アルコールとして、エタノール、イソプロパノール、及び、多価アルコールからなる群より選択される１種以上のアルコールが好ましく、多価アルコールがより好ましく、エチレングリコールがさらに好ましい。
　（Ｂ）極性基含有化合物は、極性基を複数有する多官能化合物であることが好ましい。この場合、ヒアルロン酸同士の水素結合、ここではナノオーダーのゲル間の水素結合を促進させるため、凝集しやすい状態となり、生理塩食塩濃度化での沈殿形成能が向上する傾向がある。
　カルボキシ基を含有する（Ｂ）極性基含有化合物としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘキサン酸などのＣ１－１２の分岐してもよい炭化水素酸、安息香酸などの芳香族基を有するカルボン酸化合物が挙げられる。また、多官能カルボン酸化合物としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などが挙げられる。多官能カルボン酸化合物は、凝集状態を促進する観点から好ましく含まれる。カルボキシ基とヒドロキシ基を有する化合物、例えば、サリチル酸なども複数の水素結合可能な官能基を有することから好ましい。
　アミノ基を含有する（Ｂ）極性基含有化合物としては、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のカルボキシとの相互作用をする観点で、１級、２級、３級アミン化合物を用いることができ、塩交換により、４級アンモニウム塩も使用できる。
　アミン化合物としては、メチルアミン、エチルアミン、n-プロピルアミン、ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジn-プロピルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリn-プロピルアミンなどのＣ１－１２の分岐してもよい炭化水素基を有する１級から３級アミン化合物、テトラメチルアンモニウムフルオリド、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムブロミド、テトラメチルアンモニウムヨージド、テトラエチルアンモニウムフルオリド、テトラエチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムブロミド、テトラエチルアンモニウムヨージド、テトラn-プロピルフルオリド、テトラn-プロピルクロリド、テトラn-プロピルブロミド、テトラn-プロピルヨージド、テトラｎ－ブチルフルオリド、テトラｎ－ブチルクロリド、テトラｎ－ブチルブロミド、テトラｎ－ブチルヨージドなどのＣ１－１２の分岐してもよい炭化水素基を有する４級アンモニウム塩が挙げられる。
　アミド基を含有する（Ｂ）極性基含有化合物としては、Ｃ１－１２の分岐していてもよい炭化水素酸とＣ１－１２の分岐していてもよい炭化水素基を有する１級または２級アミン化合物との縮合化合物が挙げられる。例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミドが挙げられる。そのほか、β―ラクタム、γ―ラクタム、δ-ラクタムなどの環状アミド化合物を用いてもよい。
　チオールを含有する（Ｂ）極性基含有化合物としては、Ｃ１－１２の分岐していてもよい炭化水素基を有する化合物、例えば、メタンチオール、エタンチオール、ｎ－プロプルチオールなどが挙げられる。
　その他、（Ｂ）極性基含有化合物として、尿素などのウレア基を含有する化合物や、カルバメート基を含有する化合物を用いてもよい。
＜ヒアルロン酸誘導体組成物の製造方法＞
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物は、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を製造した後に、当該（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物を添加することなどで、製造することができる。
　まず、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造方法としては、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、ステリル基を導入することで、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が得られる。また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を０．１％以上３５％未満とすることができる。
　グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基を導入する方法として具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体、好ましくは、繰り返し単位（ＩＩ）のみから構成されるヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、式：「ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－Ｒ、ＮＨＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、ＨＮＲａ－Ｙ－Ｓ－Ｓ－Ｒ、又は－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、Ｚ及びＲは本明細書で既に定義したとおりである）」で表されるステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシとが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。多価アルコールとしては、上記アルコールにおいて例示されたものと同様のものが挙げられる。
　或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　 ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ　＋　ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。
　さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、繰り返し単位（Ｉ）、及び繰り返し単位（ＩＩ）から実質的になるヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１％以上９９．５％以下、好ましくは１０％以上４０％以下を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で架橋させてゲル化することもできる。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体を、化学架橋によりゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、架橋方法、ポリマー濃度、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間等がある。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度及び架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における架橋剤濃度は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような濃度で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル基（ＭＡ基）を導入したポリマーを、ＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１～１：３が好ましく、２：１～１：２が特に好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ポリマー及び架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）及びこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、多価アルコール、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。多価アルコールとしては、上記「アルコール」において例示されたものと同様のものが挙げられ、中でも、エチレングリコールが好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中徐放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中等の不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤等を溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油等が挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中等の脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤等を溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、及びその後に、架橋反応を停止する操作及び残存した架橋性官能基を失活若しくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤等は、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応等の観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水等で洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイル基が残存する場合は、過剰のメルカプトエタノール等を添加し、メタクリロイル基を失活させた後、過剰の水等で余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプト基が残存する場合は、過剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸等を添加し、メルカプト基を失活させた後、過剰の水等で余剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸を洗浄することで除去してもよい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）及びインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、及びＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ－Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミル及びリンレックスミルが好ましい。
　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥等が挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力等は（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
　上記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造において、製造時に使用した溶媒由来の（Ｂ）極性基含有化合物が残存している場合には、（Ｂ）極性基含有化合物を添加せずにヒアルロン酸誘導体組成物を得ることができる。或いは、（Ｂ）極性基含有化合物の含有量が所望の量となるように、上記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の製造後に、（Ｂ）極性基含有化合物を添加することで、ヒアルロン酸誘導体組成物を得ることができる。（Ｂ）極性基含有化合物を添加する場合には、上記乾燥工程の前に添加することが好ましい。
≪医薬組成物≫
　本実施形態の医薬組成物は、薬物と担体を含み、上記ヒアルロン酸誘導体組成物を担体として含む。本実施形態の医薬組成物において、担体と薬物は、水素結合、イオン結合、ファンデルワース力等の非共有結合等により直接的又は間接的に結合して、複合体を形成しており、互いに遊離していない状態であることが望ましい。当該医薬組成物を生体内に投与した際には、担体から薬物が徐々に遊離し、良好な徐放性を期待できる。
　本実施形態の医薬組成物において、薬物は、担体であるヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成していることが好ましい。溶媒中において、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体のステリル基と、系中に存在する薬物との疎水性相互作用により、自発的に会合することで、薬物と（Ａ）ヒアルロン酸誘導体との複合体が形成されると考えられる。当該複合体を形成することにより、当該薬物の保存安定性向上や生物活性の維持、徐放性の向上等が期待される。
＜薬物＞
　本実施形態の医薬組成物に含まれる薬物としては、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、核酸、低分子化合物等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物は、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド、核酸等のバイオ医薬品又は低分子化合物が、ヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と、複合体を形成して含まれることが好ましい。
［低分子化合物］
　低分子化合物としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤等）等が挙げられる。
［タンパク質及びペプチド］
　タンパク質及びペプチドとしては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α、β、γ、（ＩＮＦ－α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ－３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ－ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等が挙げられる。
［核酸］
　核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、核酸アプタマー等が挙げられる。
［多糖類］
　多糖類としては、例えば、レンチナン、シゾフィラン、パヒマラン、プスチュラン、イーストグルカン、イーストマンナン、マリナクタン、カードラン、デキストラン硫酸、ヘパリン、カラゲナン、イヌリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。
＜形態＞
　本実施形態の医薬組成物は、分散性微粒子溶液であってもよく、沈殿性懸濁液であってもよく、凍結乾燥体であってもよい。分散性微粒子溶液である場合は、体内に投与する前は溶液状態でありながら体内に投与（例えば、皮下投与）することにより投与後に体内のその場で凝集する特長を有する沈殿型の徐放製剤となりうる。沈殿性懸濁液である場合は、活性成分がバーストリリースされにくいことを特長とする沈殿型の徐放製剤となりうる。この場合、シリンジアビリティも付与することが可能であることから、沈殿物の大きさは２００μｍ以下が好ましく、１００μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましい。また、凍結乾燥体の場合は、医師が投与前に生理食塩水等の等張液を加えて投与液を用事調製するタイプの沈殿型の徐放製剤となりうる。この場合、溶液状態では不安定な活性成分を含む医薬組成物に適していると考えられる。
　本実施形態の医薬組成物が分散性微粒子溶液又は沈殿物懸濁液である場合、医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以上２００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上１２ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度が上記下限値以上であることで、生理食塩濃度下での沈殿形成能をより優れたものとすることができ、薬物の投与量もより多くできる傾向にある。一方、医薬組成物中の（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の濃度が上記上限値以下であることで、注射針を用いて生体内に投与する際のインジェクタビリティがより向上するとともに、滅菌ろ過性がより向上する傾向にある。
≪ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物≫
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物は、上記ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物と１以上の薬物を含み、上記ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、上記１以上の薬物が結合している。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物を形成させるのに適した薬物は、タンパク質、ペプチド、核酸等のバイオ医薬品又は低分子化合物である。
　本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物は、既に述べた形態に限定されることはなく、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、又はフィルムの形態にあってもよい。粉末は、凍結乾燥又は噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
　本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物は、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内又は口腔内の経路を経て投与されてよい。また、本実施形態の医薬組成物及びヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物は、注射剤に限定されることはなく、貼付製剤やマイクロニードル製剤、塗り薬、点眼薬、噴霧薬、吸入薬等であってもよい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。
　実施例及び比較例で製造したヒアルロン酸誘導体組成物の各物性の測定方法及び評価方法は以下のとおりである。
［物性１］
（ヒアルロン酸誘導体の分子量）
　ヒアルロン酸誘導体の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により決定された重量平均分子量である。ヒアルロン酸誘導体組成物（２０ｍｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解して室温で１２時間以上撹拌し、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を得た。このヒアルロン酸誘導体組成物水溶液（７５０μＬ）に対して３００ｍＭ　ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）水溶液（７５０μＬ）加えて振とう機を用いて１０秒間混合し、３７℃にて１時間インキュベートした。そして、得られた試料をＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定に供して重量平均分子量を決定した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ測定の条件を以下に示す。
（測定条件）
　カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＧＭＰＷＸＬ（東ソー株式会社製）２本
　カラム温度：３０℃
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ入りリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：２００μＬ
［物性２］
（ステリル基導入率）
　ヒアルロン酸誘導体のステリル基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により決定した。まず、ジメチルスルホキシド－ｄ６（９９．９ｖ／ｖ％、０．０５ｖ／ｖ％のトリメチルシリル（ＴＭＳ）含有、富士フイルム和光製）と２０％重塩酸（９９．５ｖ／ｖ％、富士フイルム和光製）とを質量比９９：１にて混合し、測定溶媒を調製した。続いて、この測定溶媒（０．６ｍＬ）にヒアルロン酸誘導体組成物（２ｍｇ）を添加し、超音波バスにて３０分間処理して完全に溶解させて１Ｈ－ＮＭＲ測定に供した。１Ｈ－ＮＭＲ測定は、フーリエ変換核磁気共鳴装置（ＦＴ－ＮＭＲ装置）（ＥＣＳ４００、日本電子製）を用いてサンプル温度８５℃にて実施した。ステリル基導入率は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）の積分値より、以下に示す式を用いてヒアルロン酸ユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した。なお、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピークが含まれる１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３倍したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピークの積分値として、ステリル基導入率の計算に使用した。
　［ステリル基導入率（％）］
＝［（コレステリル基中のメチル基由来のピーク積分値）／（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク積分値）］×１００
＝［積分値（０．７ｐｐｍ）／｛積分値（１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３｝］×１００
［物性３］
（極性基含有化合物の含有量）
　ヒアルロン酸誘導体組成物中の（Ｂ）極性基含有化合物の含有量は、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）法により測定した。
　まず、ヒアルロン酸誘導体組成物（１６．０ｍｇ）を超純水（２．０ｍＬ）に添加し、１２時間以上撹拌して溶解させて８．０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸誘導体組成物水溶液を得た。その後、得られた水溶液をＧＣ－ＭＳ測定に供し、外部標準法によって測定試料中の（Ｂ）極性基含有化合物の含有量を求めた。そののち、添加したヒアルロン酸誘導体の量に対する測定試料中の（Ｂ）極性基含有化合物の質量比を、ヒアルロン酸誘導体に対する（Ｂ）極性基含有化合物の含有量として算出した。定量分析に必要な検量線は、市販標品を用いて作成した。ＧＣ－ＭＳ測定の条件を以下に示す。
（測定条件）
ＧＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，７８９０Ａ
カラム：ＤＢ－６２４（６０ｍ×０．２５ｍｍΦ）、膜厚１．４０μｍ
カラム温度：５０℃（５分間)→２０℃／分の速度で昇温→１５８℃（２分間)→３℃／分の速度で昇温→１８０℃（０分間）→２０℃／分の速度で昇温→２５０℃（５．８分間)
流速：１ｍＬ／分
注入口温度：２５０℃
スプリット比：１／５０
　定量する化合物にもよるが５０質量ｐｐｍ以下の場合は、以下の手法が用いられた。
（測定条件：エチレングリコールの場合）
　ヒアルロン酸誘導体を０．１ｇをガラスチューブに入れ、２００℃で１０分間加熱脱着を行い、揮発成分を－１３０℃にてトラップした。その後、冷却されていたトラップを２５０℃で急速加熱し、ＧＣ－ＭＳ測定を行った。
　濃度既知のエチレングリコール標準品を同様の条件で測定し、検出ピーク面積値から検量線を作成した。検量線からサンプル中のエチレングリコールの質量を算出した。その後、使用した（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の質量に対するサンプル中のエチレングリコールの質量比を、（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する（Ｂ）極性官能基含有化合物の含有量として算出した。
加熱脱着装置：ＧＥＲＳＴＥＬ　ＴＤＵ，ＣＩＳ４
脱着温度：２００℃
脱着時間：１０分
スプリット：スプリットレス
クライオフォーカシング温度：－１３０℃
注入温度：２５０℃
ＣＩＳライナー：Ｔｅｎａｘ（ＧＬサイエンス）
ＧＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　７８９０
カラム：ＧＬサイエンス　ＤＢ－ＷＡＸ　（３０ｍ×０．２５ｍｍΦ、膜厚０．２５ｍｍ）
温度条件：４０℃（５分）→２０℃／分→２５０℃（５分保持）
ＭＳ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７０００
イオン化：ＥＩ　７０ｅＶ
イオン源温度２５０℃
スキャン範囲：ＳＩＭ（ｍ／ｚ３３）
　イソプロパノールおよびエタノールの場合は、温度条件を５０℃（５分）→１０℃／分→２４０℃（６分保持）とした以外は、エチレングリコールと同様に測定した。
［評価１］
（沈殿率）
　ヒアルロン酸誘導体組成物の沈殿率は、以下に示す手順により決定した。まず、６００ｍＭ塩化ナトリウム入りの４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７．４）を調製した（濃縮緩衝液と呼ぶ）。次に、ヒアルロン酸誘導体組成物に超純水を加え、１２時間以上撹拌して溶解させてヒアルロン酸誘導体組成物水溶液を得た。この水溶液を、ろ過チューブ（ポアサイズ：５．０μｍ；ＵＦＣ４０ＳＶ２５；メルク社製）に入れて遠心分離機にかけ、ろ過処理した。続いて、ろ過済みヒアルロン酸誘導体水溶液（６００μＬ）と濃縮緩衝液（２００μＬ）を混合した沈殿形成サンプル（Ｎ数：３）、及び、ろ過済みヒアルロン酸誘導体水溶液（６００μＬ）と超純水（２００μＬ）を混合したリファレンスサンプル（Ｎ数：２）を調製した。その後、沈殿形成サンプル及びリファレンスサンプルを３７℃にて２０分間インキュベートし、そののちに遠心分離機（２，０００×ｇ、１０分間）にかけた。遠心分離後のサンプルそれぞれの上澄みを２００μＬ採取し、いずれも３００ｍＭヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）水溶液（２００μＬ）を加えて２倍希釈したうえで、３７℃にて２時間インキュベートした。さらに、全てのサンプルに対して１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ水溶液（１０００μＬ）を加えて希釈し、シリンジフィルター（ポアサイズ：０．４５μｍ）により処理した。そして、得られた沈殿形成サンプル及びリファレンスサンプルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）測定に供した。ヒアルロン酸誘導体組成物の沈殿率は、沈殿形成サンプル及びリファレンスサンプルのＳＥＣクロマトグラムのヒアルロン酸誘導体由来のピーク（７分付近）の面積値を用いて、以下に示す式に基づいて算出した。
　［沈殿率］（％）
＝　［１－（沈殿形成サンプルにおけるヒアルロン酸誘導体由来のピークの面積値）／（リファレンスサンプルにおけるヒアルロン酸誘導体由来のピークの面積値）］×１００
　ここで、沈殿形成サンプルにおけるヒアルロン酸誘導体由来のピークの面積値はＮ＝３で調製した沈殿形成サンプルそれぞれにおける面積値の平均値を使用し、リファレンスサンプルにおけるヒアルロン酸誘導体由来のピークの面積値はＮ＝２で調製したリファレンスサンプルそれぞれにおける面積値の平均値を使用した。なお、ＳＥＣ測定の条件を以下に示す。
（測定条件）
　カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ４０００ＳＷＸＬ（東ソー株式会社製）
　カラム温度：３５℃
　溶離液：１０ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ入りリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
　流速：１ｍＬ／分
　注入量：９０μＬ
　検出：示差屈折率検出器（ＲＩ検出器）又は紫外検出器（ＵＶ検出器）
［評価２］
（滅菌ろ過性）
　滅菌ろ過性は、ヒアルロン酸誘導体組成物水溶液を０．２２μｍフィルターで処理した際のろ過最大量により評価した。すなわち、ヒアルロン酸誘導体組成物を超純水に溶解して０．９ｍｇ／ｍＬとし、得られたヒアルロン酸誘導体組成物水溶液を０．２２μｍフィルター（ステリカップ-ＧＰ　Ｓ２ＧＰＵ０５ＲＥ、有効ろ過面積４０ｃｍ２、メルク社製）により膜が目詰まりして水溶液が透過しなくなるまでろ過しつづけた。そして、ろ過済みのヒアルロン酸誘導体組成物水溶液の体積を測定し、有効ろ過面積あたりのろ過済みのヒアルロン酸誘導体組成物水溶液の体積を計算してろ過最大量とした。
＜ヒアルロン酸誘導体組成物の製造＞
［実施例１］
（ヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ１の製造）
　ヒアルロン酸誘導体組成物を次の工程１～工程３に従って調製した。
１．工程１
（コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の合成）
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）を次に示す工程１－１、続いて工程１－２に従って合成した。
（１）工程１－１
　コレステリルクロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。
（２）工程１－２
　得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ塩酸塩）１．２ｇを得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＣＳ４００　日本電子製、ＥｔＯＨ－ｄ６）を図１に示す。
２．工程２
（ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩の調製）
　ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を次に示す工程２－１、続いて工程２－２に従って調製した。
（１）工程２－１
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０質量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５倍モル等量加え、３０分間撹拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄することで、ＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（２）工程２－２
　分子量５０，０００（５０ｋＤａ）の原料ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。「（１）工程２－１」でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液を、ＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５倍モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＥＣＳ４００　日本電子製、ＥｔＯＨ－ｄ６）を図２に示す。
３．工程３
　「２．（２）工程２－２」で調製したＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡ－ＴＢＡ中に存在する二糖繰り返し単位（ＨＡユニット）に対する、「１．工程１」で合成したＣｈｏｌ塩酸塩の添加量がモル比（Ｃｈｏｌ塩酸塩／ＨＡユニット）で１５／１００となるように添加した。次に、ＨＡユニットに対する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）の添加量がモル比（ＤＭＴ－ＭＭ／ＨＡユニット）で２１．６／１００となるように加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４（スペクトラム社製）、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２，０００以上１４，０００以下）した。得られた透析液に対し、エチレングリコール（ＥＧ）を、組成物中の含有量が０．００６２質量ｐｐｍとなるように加え、その後凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ）を白色固体として得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３に示す。Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認された。
［実施例２～２５及び比較例１～２］
（ヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ２～ＨＡ－ａ２５及びＨＡ－ｂ１～ＨＡ－ｂ２の製造）
　「３．工程３」において、ＨＡユニットに対するＣｈｏｌ塩酸塩の添加量、及び、ＨＡユニットに対するＤＭＴ－ＭＭの添加量がモル比で下記表に示す比率となるようにし、アルコールの種類及び（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する（Ｂ）極性基含有化合物の含有量が下記表に示すようにした以外は、実施例１と同様の方法を用いて、各ヒアルロン酸誘導体組成物を得た。得られたヒアルロン酸誘導体組成物の１Ｈ－ＮＭＲ測定を行い、各ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれるヒアルロン酸誘導体においていずれも、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ、３Ｈ）が確認された。
　なお、下記表において、アルコールの種類及び略称は以下のとおりである。
（アルコールの種類及び略称）
　イソプロパノール：ＩＰＡ
　エタノール：ＥｔＯＨ
　実施例及び比較例で得られたヒアルロン酸誘導体組成物について、上述の方法を用いて、各物性を測定し、各種評価を行なった。結果を下記表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　前記表１～４から、ヒアルロン酸の分子量が５０ｋＤａである場合に、アルコールを含有するヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ１～ＨＡ－ａ１２、ＨＡ－ａ１７及びＨＡ－ａ１８（実施例１～１２、１７及び１８）では、６ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率が７４．５％以上９１．３％以下と良好であった。一方、アルコールを含まないヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ｂ１（比較例１）では、６ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率が４６．０％と不良であった。
　また、ステリル基導入率が異なるヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ１、ＨＡ－ａ１７及びＨＡ－ａ１８（実施例１、１７及び１８）において、ステリル基導入率が低くなるほど、６ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率がより良好になる傾向がみられた。
　表５～６から、ヒアルロン酸の分子量が１００ｋＤａである場合に、アルコールを含有するヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ１９～ＨＡ－ａ２５（実施例１９～２５）では、低濃度である１．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率が２３．９％以上５０．９％以下と良好であった。一方、アルコールを含まないヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ｂ２（比較例２）では、１．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率が１２．４％と不良であった。
　また、アルコールの含有量が異なるヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ１９及びＨＡ－ａ２３（実施例１９及び２３）において、アルコールの含有量が少なくなるほど、ろ過最大量が増加する傾向がみられた。
　また、アルコールの種類が異なるヒアルロン酸誘導体組成物ＨＡ－ａ２３～ＨＡ－ａ２５（実施例２３～２５）において、エチレングリコールを使用した場合に、１．２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ含有濃縮緩衝液での沈殿率が良好であった。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体組成物によれば、生理食塩濃度下での沈殿形成能に優れるヒアルロン酸誘導体組成物、これを含む医薬組成物およびヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物を提供することができる。

Claims (15)

  1. 　（Ａ）ステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体と、
    　（Ｂ）ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ウレア基およびチオール基からなる群から選ばれる少なくとも一種類の官能基を有する極性基含有化合物と、
    を含むヒアルロン酸誘導体組成物であって、
    　（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が０．１％以上３５％未満である、ヒアルロン酸誘導体組成物。
  2. 　前記（Ｂ）極性基含有化合物が、ヒドロキシ基を少なくとも一つ有する極性基含有化合物である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  3. 　前記（Ｂ）極性基含有化合物の含有量が、前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の質量に対して０．００１質量ｐｐｍ以上１０００質量ｐｐｍ未満である、請求項１又は２に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  4. 　前記（Ｂ）極性基含有化合物が複数の極性基を有している化合物である、請求項１～３いずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  5. 　前記（Ｂ）極性基含有化合物が、アルコールである請求項１～４いずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  6. 　前記アルコールが、エタノール、イソプロパノール、及び、多価アルコールからなる群より選択される、請求項５に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  7. 　前記アルコールが、多価アルコールである、請求項６に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  8. 　前記アルコールが、エチレングリコールである、請求項７に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  9. 　前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体が、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
    　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
    　Ｘ１は、以下の式：
    　－ＮＲｂ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
    　－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
    　－Ｓ－Ｒ、
    　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
    　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
    　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
    で表される基からなる群より選択される基であり；
    　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒは、ステリル基であり；
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。
  10. 　前記Ｒがコレステリル基である、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  11. 　前記（Ａ）ヒアルロン酸誘導体の分子量が１,０００以上１,０００,０００未満である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物。
  12. 　薬物と、担体を含み、前記担体が、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物である、医薬組成物。
  13. 　前記薬物が（Ａ）ヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　前記薬物が、薬理活性を有するタンパク質、ペプチド又は核酸である、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
  15. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体組成物および薬物を含み、前記ヒアルロン酸誘導体組成物に含まれる（Ａ）ヒアルロン酸誘導体に、前記薬物が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体組成物。
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