CN114981313A - 透明质酸衍生物组合物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种透明质酸衍生物组合物、含有该透明质酸衍生物组合物作为载体的药物组合物,以及该透明质酸衍生物组合物中的(A)透明质酸衍生物结合有一个以上的药物的透明质酸衍生物‑药物结合组合物;所述透明质酸衍生物组合物含有(A)引入有甾基的透明质酸衍生物和(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团的含极性基团化合物,且所述甾基相对于(A)透明质酸衍生物的引入率为0.1%以上且小于35%。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸衍生物组合物、药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物。
本申请基于2020年2月5日在日本申请的日本特愿2020-018312号主张优先权,将其内容援用于此。
背景技术
近年来,作为以蛋白质、肽、核酸为活性成分药品的生物药品已实用化,其数量逐年持续增加。生物药品可以满足以往的低分子药物不能满足的不充分医疗需求。然而,存在如下问题:不仅难以从消化道或粘膜等被吸收,而且在体内不稳定,血中半衰期短。因此,生物药品需要通过注射来频繁给药,给患者和医务人员均带来很大的负担。因此,需要一种药物基材(缓释性药物递送系统基材),其能够不会损害药理活性地将生物药物胶囊化而在生物体内缓慢释放有效成分。
从这样的背景出发,在专利文献1中,提出了一种安全性优异的由透明质酸衍生物组成的缓释性药物释放系统基材。该透明质酸衍生物在水溶液中自发地缔合,可以在保持其生物活性的状态下高效地封入药物、特别是生物药品,在生理盐水浓度下凝聚(或者在生理盐水浓度下也分散),并且血中滞留性良好。该透明质酸衍生物特别是在使用生物药品作为有效成分时,可以作为在保持药理活性的状态下能够高效地封入大量药物的载体和血中滞留性优异的血中缓释载体和靶向载体来使用,也可以成为能够持续缓释药物的局部(例如皮下等)缓释载体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公布第2010/053140号
发明内容
发明所要解决的问题
然而,在专利文献1中记载的透明质酸衍生物中,难以依赖于盐浓度来调整沉淀形成能力,此外,在生理盐水浓度下的沉淀形成能力不充分,因此含有透明质酸衍生物的药物组合物在生物体内的局部滞留性存在受损的风险。
本发明是鉴于上述情况而完成的,提供一种在生理盐水浓度下的沉淀形成能力优异的透明质酸衍生物组合物,以及使用所述透明质酸衍生物组合物的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物。
解决问题的技术方案
即,本发明包括以下方式:
(1)一种透明质酸衍生物组合物,其含有:
(A)引入有甾基的透明质酸衍生物;
(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团的含极性基团化合物,
其中,所述甾基相对于(A)透明质酸衍生物的引入率为0.1%以上且小于35%。
(2)根据(1)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是具有至少一个羟基的含极性基团化合物。
(3)根据(1)或(2)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,相对于所述(A)透明质酸衍生物的质量,所述(B)含极性基团化合物的含量为0.001质量ppm以上且小于1000质量ppm。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是具有多个极性基团的化合物。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是醇。
(6)根据(5)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇选自乙醇、异丙醇和多元醇。
(7)根据(6)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇是多元醇。
(8)根据(7)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇是乙二醇。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(A)透明质酸衍生物具有由下述通式(I)表示的重复单元:
[化1]
式中,R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基;
Z表示直接键合或由2个以上且30个以下的氨基酸残基组成的肽接头;
X1选自由下式表示的基团:
-NRb-R、
-NRb-COO-R、
-NRb-CO-R、
-NRb-CO-NRc-R、
-COO-R、
-O-COO-R、
-S-R、
-CO-Ya-S-R、
-O-CO-Yb-S-R、
-NRb-CO-Yb-S-R,以及,
-S-S-R;
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,此处该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NRf-的基团;
Rf选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基和羟基C2-12烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
R是甾基;
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,此处,该亚烷基任选插入选自-O-、-NRg-和-S-S-的基团;
Rg选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
Ya是C1-5亚烷基;
Yb是C2-8亚烷基或C2-8亚烯基;
m是1以上且100以下的整数。
(10)根据(9)所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述R是胆甾基。
(11)根据(1)~(10)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(A)透明质酸衍生物的分子量为1,000以上且小于1,000,000。
(12)一种药物组合物,其含有药物和载体,所述载体是所述(1)~(11)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物。
(13)根据(12)所述的药物组合物,其中,所述药物与(A)透明质酸衍生物形成复合体。
(14)根据(12)或(13)所述的药物组合物,其中,药物是具有药理活性的蛋白质、肽或核酸。
(15)一种透明质酸衍生物-药物结合体组合物,其含有所述(1)~(11)中任一项所述的透明质酸衍生物组合物和一个以上的药物,所述透明质酸衍生物组合物中所含的(A)透明质酸衍生物结合有所述一个以上的药物。
发明效果
根据上述方式的透明质酸衍生物组合物,可以提供一种在生理盐水浓度下的沉淀形成能力优异的透明质酸衍生物组合物、含有该透明质酸衍生物组合物的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物。
附图说明
图1是实施例1中的胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的1H-NMR谱图。
图2是实施例1中的透明质酸(HA)的四丁基铵(TBA)盐的1H-NMR谱图。
图3是实施例1中的引入有6-氨基己基氨基甲酸酯的HA衍生物(HA-C6-Chol)的1H-NMR谱图。
具体实施方式
下面,详细说明本发明的实施方式(以下称为“本实施方式”),但本发明并不限定于此,可以在不脱离其主旨的范围内进行各种变形。
以下,对本说明书中使用的术语进行说明。
本说明书中使用的“C1-20烷基”术语是指碳原子数为1以上且20以下的直链状或支链状烷基,例如包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等“C1-4烷基”,进一步包括正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、n-己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、2-乙基丁基等。C1-20烷基中也包括碳原子数为1以上且12以下的C1-12烷基、碳原子数为1以上且6以下的C1-6烷基。
本说明书中使用的“C1-6烷基羰基”术语是指烷基部分已经是提及的C1-6烷基的烷基羰基,例如包括乙酰基、丙酰基、正丙基羰基、异丙基羰基、正丁基羰基、仲丁基羰基、异丁基羰基、叔丁基羰基等“C1-4烷基羰基”。
本说明书中使用的“氨基C2-20烷基”术语是指具有氨基作为取代基的碳原子数为2以上且20以下的直链状或支链状烷基,例如,氨基也可以位于烷基末端的碳原子上。氨基C2-20烷基中也包括碳原子数为2以上且12以下的氨基C2-12烷基。
本说明书中使用的“羟基C2-20烷基”术语是指具有羟基作为取代基的碳原子数为2以上且20以下的直链状或支链状烷基,例如,羟基也可以位于烷基末端的碳原子上。羟基C2-20烷基中也包括碳原子数为2以上且12以下的羟基C2-12烷基。
本说明书中使用的“C2-30亚烷基”术语是指碳原子数为2以上且30以下的直链状或支链状二价饱和烃基,例如包括亚乙基、亚丙基等,包括碳原子数为2以上且20以下的C2-20亚烷基、碳原子数为2以上且8以下的C2-8亚烷基、基团“-(CH2)n-”(此处,n为2以上且30以下,优选为2以上且20以下,更优选为2以上且15以下)。
本说明书中使用的“C1-5亚烷基”术语是指碳原子数为1以上且5以下的直链状或支链状二价饱和烃基,例如包括亚甲基、亚乙基、亚丙基等。
本说明书中提及的术语“C2-8亚烯基”是指碳原子数为2以上且8以下的直链状或支链状的包含1个以上双键的二价饱和烃基,例如包括-CH=CH-、-C(CH3)=CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基、辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。在存在几何异构体的情况下,也包括各个异构体和它们的混合物。
《透明质酸衍生物组合物》
本实施方式的透明质酸衍生物组合物含有(A)引入有甾基的透明质酸衍生物(以下有时称为“(A)透明质酸衍生物”)和(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团的含极性基团化合物。甾基相对于(A)透明质酸衍生物的引入率为0.1%以上且小于35%。
本实施方式的透明质酸衍生物组合物可以依赖于盐浓度来调整沉淀形成能力,在低盐浓度下良好地溶解,并且在生理盐水浓度下,对于甾基的引入率在上述范围内的(A)透明质酸衍生物,(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团的含极性基团化合物作为凝聚促进剂起作用,在生理盐水浓度下的沉淀形成能力提高。此处的“生理盐水浓度”是指作为给予对象的动物的给予部位中的盐浓度。例如,人体中的生理盐水浓度是氯化钠浓度为150mM左右的浓度。此外,“低盐浓度”是指比生理盐水浓度低很多的浓度。
<(A)引入有甾基的透明质酸衍生物>
(A)透明质酸衍生物中,甾基可以与透明质酸直接键合,也可以通过接头结合。
此处的“接头”是指可以使用能通过基因工程引入的任意肽接头,或者合成化合物接头,但在本实施方式的(A)透明质酸衍生物中,优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定,可以根据目的由本领域技术人员进行适当选择,优选的长度为2个氨基酸以上(上限没有特别限定,但通常为30个氨基酸以下,优选为20个氨基酸以下),特别优选为15个氨基酸。(A)透明质酸衍生物中所含的肽接头可以使用全部相同长度的肽接头,也可以使用不同长度的肽接头。
[甾基]
本说明书中使用的“甾基”术语是指只要具有类固醇骨架的基团就没有特别限制。此处作为类固醇,具体地,可举出:胆甾基、胆甾烷醇、菜油甾烷醇、麦角甾醇、豆甾烷醇、粪甾烷醇、豆甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、麦角固醇、西米杜鹃醇、胆汁酸、睾丸酮、雌二醇、孕酮、皮质醇、可的松、醛甾酮、皮质酮、脱氧皮质酮等。作为甾基,可举出:胆甾基、豆甾基、羊毛甾基、麦角甾基等,其中,优选为胆甾基(特别是胆甾-5-烯-3β-基)。
[甾基引入率]
甾基相对于(A)透明质酸衍生物的引入率(以下有时简称为“甾基引入率”)是0.1%以上且小于35%,优选为5%以上且33%以下,更优选为6%以上且22%以下,进一步优选为6%以上且20%以下。
通过使甾基引入率在上述范围内,使透明质酸衍生物具有在纯水中或低盐浓度下良好地溶解,同时在生理盐水浓度下凝聚形成沉淀的性质。通过使甾基引入率在上述范围内,使透明质酸衍生物组合物中的(A)透明质酸衍生物与药物复合化而成的透明质酸衍生物-药物结合体组合物可成为在向体内给予(例如,皮下给予)时,发挥出给予后凝聚的独特优点的沉淀型缓释制剂。
甾基引入率可以按照后述的实施例中记载的方法并通过1H-NMR测定进行测定。即,可以使用透明质酸衍生物组合物的1H-NMR谱图中来自(A)透明质酸衍生物甾基的峰的积分值和来自(A)透明质酸衍生物中所含的N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3,1.6ppm以上且2.0ppm以下,3H)的积分值,并根据下式来计算。
[甾基引入率(%)]=[(来自(A)透明质酸衍生物甾基的峰的积分值)/(来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰积分值)]×100
甾基是胆甾基的情况下,甾基引入率具体地通过来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3,1.6ppm以上且2.0ppm以下,3H)的积分值和来自胆甾基中甲基的峰(CH3,0.7ppm,3H)的积分值计算出。予以说明,由于在来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰与来自胆甾基的峰(5H)重叠,因此使用由1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰的积分值减去来自胆甾基甲基的峰(0.7ppm)的积分值乘以5/3倍后的值而计算出的值(即,积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3),作为来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰的积分值。
[甾基引入率(%)]=[(来自胆甾基中甲基的峰积分值)/(来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰积分值)]×100=[积分值(0.7ppm)/{积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3}]×100
[(A)透明质酸衍生物的分子量]
(A)透明质酸衍生物的分子量没有特别限定,但从期待局部给予中的源于扩散延迟的缓释功能的角度或从前述的在生理盐水浓度下的沉淀形成能力的角度出发,优选分子量相对较大的(A)透明质酸衍生物,最终剂型为溶液制剂的情况下,从通针性(syringeability)的角度出发,优选分子量相对较小的(A)透明质酸衍生物。作为这样的(A)透明质酸衍生物的分子量,优选为1,000(1kDa)以上且小于1,000,000(1,000kDa),更优选为3kDa以上且500kDa以下,更优选为5kDa以上且300kDa以下,进一步优选为5kDa以上且120kDa以下,特别优选为10kDa以上且100kDa以下。(A)透明质酸衍生物的分子量通常可以通过使用具有对应分子量的原料进行调节。
此处的“(A)透明质酸衍生物的分子量”是由体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)确定的重均分子量。具体地,可以按照后述的实施例中记载的方法进行测定。
作为优选的(A)透明质酸衍生物,具体地,例如可举出具有1个以上的由下述通式(I)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(I)”)的透明质酸衍生物等。
[化2]
式中,R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基;
Z表示直接键合或由2个以上且30个以下的任意氨基酸残基组成的肽接头;
X1选自由下式表示的基团:
-NRb-R、
-NRb-COO-R、
-NRb-CO-R、
-NRb-CO-NRc-R、
-COO-R、
-O-COO-R、
-S-R、
-CO-Ya-S-R、
-O-CO-Yb-S-R、
-NRb-CO-Yb-S-R,以及,
-S-S-R;
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,此处该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NRf-的基团;
Rf选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基和羟基C2-12烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
R是甾基;
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,此处,该亚烷基任选插入选自-O-、-NRg-和-S-S-的基团;
Rg选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
Ya是C1-5亚烷基;
Yb是C2-8亚烷基或C2-8亚烯基;
m是1以上且100以下的整数。
(A)透明质酸衍生物优选包含具有1个以上的由下述通式(Ia)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(Ia)”)的透明质酸衍生物。
[化3]
式中,R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基;
X是由-NRa-Y-NRb-COO-R表示的疏水性基团;
Ra和Rb各自独立地选自氢原子和C1-6烷基;
R是甾基;
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,
m是1以上且100以下的整数。
此处,(A)透明质酸衍生物中分别包含2个以上的重复单元(I)或重复单元(Ia)的情况下,该重复单元可以相同,也可以不同。
(A)透明质酸衍生物可以在重复单元(I)或重复单元(Ia)以外的位置被修饰,例如,羟基可以转化为-O(C1-6烷基)、-O(甲酰基)、-O(C1-6烷基羰基)等,羧基可以转化为酰胺或酯,也可以形成盐。
[重复单元(I)]
通式(I)中的基团“-Z-N(Ra)Y-X1”优选为选自由下式表示的基团:
-NH-(CH2)mz-NH-R;
-NH-(CH2)mz-COO-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-COO-R、
-NH-(CH2)mz-O-COO-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-COO-R、
-NH-(CH2)mz-S-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-S-R;
-NH-(CH2)mz-O-CO-CH(R8)-CH2-S-R;
-NH-(CH2)mz-NHCO-CH(R8)-CH2-S-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NHCO-CH(R8)-CH2-S-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-O-CO-CH(R8)-CH2-S-R;
-NH-(CH2)mz-S-S-R;以及,
-Z-NRa-Y-NRb-COO-R
(式中,mz为2以上且30以下的整数,R8为氢原子或甲基,Z、Ra、Y、Rb、R和m如本说明书中所定义)。
作为上述基团:-Z-NRa-Y-NRb-COO-R,优选为选自由下式表示的基团:
-NH-(CH2)mz-NH-COO-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R;
(式中,R、mz和m如本说明书中所定义)。
这些之中,作为通式(I)中的基团“-Z-N(Ra)Y-X1”,更优选为选自由下式表示的基团:
-NH-(CH2)mz-NH-COO-R;
-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-NH-COO-R;以及,
-NH-(CH2)mz-S-S-R
(此处,mz、R和m如本说明书中所定义)。
(Z)
通式(I)中,Z优选为直接键合。
另外,在其它实施方式中,Z为肽接头的情况下,X1优选为-NRb-COO-R。
而且,在其它实施方式中,Z可以是由-NH-[CH(-Za)-CONH]n-1-CH(-Za)-CO-表示的肽接头,此处,n为2以上且30以下的整数,Za各自独立地表示H2N-CH(-Za)-COOH所表示的α-氨基酸中的取代基。该肽接头在N末端与葡糖醛酸部分的羧基结合,在C末端与基团-N(-Ra)-Y-X1结合。作为可用作该肽接头的氨基酸残基的氨基酸例,可以使用α-氨基酸,例如可举出称为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸(Gly)、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸的天然型(L型)的氨基酸、它们的D型等,包括合成的氨基酸在内的所有α-氨基酸。即,作为Za,例如可举出:-CH3、H2NC(NH)NH(CH2)3-、H2NCOCH2-等。此外,n个Z可以相同也可以不同。n为2以上且30以下的整数,优选为2以上且10以下,更优选为2以上且4以下。作为肽接头的优选例,例如可举出:-Gly-Phe-Leu-Gly-、-Asn-Phe-Phe-、-Phe-Phe-、Phe-Gly-等。
(Y)
通式(I)中,Y优选为选自-(CH2)n1-和-(CH2CH2O)m1-CH2CH2-(此处,n1为2以上且20以下的整数,优选为2以上且15以下的整数,更优选为2以上且12以下的整数,进一步优选为2以上且6以下的整数。m1为1以上且4以下的整数)的基团。具体地,优选为-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)8-、-(CH2)12-或-(CH2CH2O)2-CH2CH2-。此外,从实现在纯水中以及在低盐浓度下高溶解性,同时在生理盐水浓度下表现出高沉淀形成能力的角度出发,Y优选为选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)8-和-(CH2)12-的基团,更优选为-(CH2)6-。
Y例如也可以是-CH2CH2O-CH2CH2-S-S-CH2CH2O-CH2CH2-、-(CH2CH2O)2-CH2CH2-S-S-CH2CH2O-CH2CH2-、-CH2CH2O-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2-、-(CH2CH2O)2-CH2CH2-S-S-(CH2CH2O)2-CH2CH2-等。
(Ya)
作为Ya,优选为-CH2-或-CH2-CH2-。
(Yb)
作为Yb,优选为-CH2-CH2-、-CH(CH3)CH2-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基或辛-2,4,6-三烯-1,8-二基,更优选为-CH2-CH2-或-CH(CH3)CH2-。
(R)
作为R,优选为胆甾基。
作为基“-Z-N(Ra)Y-X1”的具体例,可举出:-NH-(CH2)2-NH-CO-胆甾基、-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2)-COO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-CO-NH-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-CO-胆甾基、-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-N(-(CH2)3-NH2)-胆甾基等。作为优选的基团“-Z-N(Ra)Y-X1”,Ra、Rb和Rc为氢原子,Y为直链状的C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,Ya为直链状的C1-5亚烷基,或者Yb为直链状的C2-8亚烷基或直链状的C2-8亚烯基。
[重复单元(Ia)]
通式(Ia)中,X优选为-NH-(CH2)2-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)6-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)12-NH-COO-胆甾基或-NH-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-COO-胆甾基,更优选为-NH-(CH2)2-NH-COO-胆甾基、-NH-(CH2)6-NH-COO-胆甾基或-NH-(CH2CH2O)2-CH2CH2-NH-COO-胆甾基。
(A)透明质酸衍生物除了重复单元(I)之外,还可以进一步包含由通式(II)表示的重复单元(以下有时称为“重复单元(II)”)。
[化4]
式中,R1a、R2a、R3a和R4a各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基;
Xa选自羟基和-O-Q+;此处,Q+是抗衡阳离子。
此处,在(A)透明质酸衍生物包含2个以上重复单元(II)的情况下,该重复单元可以相同,也可以不同。
在其它实施方式中,(A)透明质酸衍生物也可以是实质上由重复单元(I)、重复单元(Ia)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物。
[重复单元(II)]
通式(II)中,Q+只要是在水中与羧基形成盐的抗衡阳离子,就没有特别限定,在二价以上的情况下,根据价数与多个羧基形成盐。作为抗衡阳离子的例子,可举出:锂离子、钠离子、铷离子、铯离子、镁离子、钙离子等金属离子;由式:N+RjRkRlRm(式中,Rj、Rk、Rl和Rm各自独立地选自氢原子和C1-6烷基)表示的铵离子等。其中,Q+优选为钠离子、钾离子或四烷基铵离子(例如,四正丁基铵离子等)。Rj、Rk、Rl和Rm优选为选自C1-6烷基的相同基团,优选为正丁基。
R1、R2、R3和R4,以及R1a、R2a、R3a和R4a全部优选为氢原子。此外,Ra和Rb均优选为氢原子。
其中,(A)透明质酸衍生物优选为实质上由重复单元(I)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物。(A)透明质酸衍生物在由该衍生物中所含的D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺构成的二糖重复单元中,例如80%以上,优选90%以上,更优选95%以上为重复单元(I)和重复单元(II)。(A)透明质酸衍生物可以仅由重复单元(I)和重复单元(II)构成。
[(B)含极性基团化合物]
(B)含极性基团化合物具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团。
相对于(A)透明质酸衍生物的质量,(B)含极性基团化合物的含量优选为0.001质量ppm以上且小于1000质量ppm,更优选为0.001质量ppm以上且900质量ppm以下,进一步优选为0.005质量ppm以上且800质量ppm以下,特别优选为0.006质量ppm以上且700质量ppm以下。
通过使(B)含极性基团化合物的含量为上述下限值以上,可以进一步提高透明质酸衍生物组合物在生理盐水浓度下的沉淀形成能力,另一方面,通过使为上述上限值以下,可以更有效地抑制在纯水中以及低盐浓度下的(A)透明质酸衍生物的凝聚,可以进一步提高透明质酸衍生物组合物水溶液使用0.22μm滤器的灭菌过滤的过滤性。
(B)含极性基团化合物的含量可以通过气相色谱-质谱(GC-MS)法进行测定,具体地可以按照后述的实施例中记载的方法进行测定。
作为所述(B)含极性基团化合物,优选含有具有至少一个羟基的化合物,优选含有醇。醇在生理盐水浓度下作为(A)透明质酸衍生物的凝聚促进剂发挥作用,提高在生理盐水浓度下的(A)透明质酸衍生物的沉淀形成能力。醇中水溶性化合物较多,此外与甾醇骨架的相容性好,甾醇化合物的溶解性相对较高。因此,认为如果使(A)透明质酸衍生物分散于水中,则自发形成纳米级凝胶,但通过含有醇,胆甾基结构域的流动性变高,容易促进纳米级凝胶彼此的物理性交联。因而,认为通过含有微量的醇,容易促进纳米凝胶间的凝聚,在生理盐水浓度下的沉淀形成能力提高。
作为所述醇,可以是一元醇,也可以是多元醇。作为一元醇,例如可举出:甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇(异丙醇)、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1-戊醇、2-戊醇、异戊醇、1-己醇、2-己醇、1-庚醇、1-辛醇、2-乙基-1-己醇、3,3,5-三甲基-1-己醇、十三烷醇、十五烷醇、棕榈醇、硬脂醇、环戊醇、环己醇、甲基环己醇、三甲基环己醇等。作为多元醇,可以是二元醇,也可以是三元醇。作为二元醇,例如可举出:乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、新戊二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇等。作为三元醇,例如可举出:甘油、三羟甲基丙烷等。
其中,作为醇,优选为选自乙醇、异丙醇和多元醇中的1种以上的醇,更优选为多元醇,进一步优选为乙二醇。
(B)含极性基团化合物优选为具有多个极性基团的多官能化合物。这种情况下,由于促进透明质酸彼此的氢键、此处为纳米级凝胶间的氢键,因此成为易于凝聚的状态,在生理盐水浓度下的沉淀形成能力趋于提高。
作为含有羧基的(B)含极性基团化合物,可举出:甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等C1-12可支化的烃酸、苯甲酸等具有芳族基团的羧酸化合物。此外,作为多官能羧酸化合物,可举出:草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸等。从促进凝聚状态的角度出发,优选包含多官能羧酸化合物。具有羧基和羟基的化合物,例如水杨酸等也具有可形成多个氢键的官能团,因此优选。
作为含有氨基的(B)含极性基团化合物,基于与(A)透明质酸衍生物的羧基的相互作用的角度,可以使用伯、仲、叔胺化合物,通过盐交换,也可以使用季铵盐。
作为胺化合物,可举出:甲胺、乙胺、正丙胺、丁胺、二甲胺、二乙胺、二正丙胺、三甲胺、三乙胺、三正丙胺等具有C1-12可支化烃基的伯胺至叔胺化合物、四甲基氟化铵、四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四甲基碘化铵、四乙基氟化铵、四乙基氯化铵、四乙基溴化铵、四乙基碘化铵、四正丙基氟化物、四正丙基氯化物、四正丙基溴化物、四正丙基碘化物、四正丁基氟化物、四正丁基氯化物、四正丁基溴化物、四正丁基碘化物等具有C1-12可支化烃基的季铵盐。
作为含有酰胺基的(B)含极性基团化合物,可举出:C1-12可支化烃酸与具有C1-12可支化烃基的伯胺或仲胺化合物的缩合化合物。例如可举出:N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺。此外,也可以使用β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰胺等环状酰胺化合物。
作为含有硫醇的(B)含极性基团化合物,可举出具有C1-12可支化烃基的化合物,例如,甲硫醇、乙硫醇、正丙硫醇等。
其他,作为(B)含极性基团化合物,也可以使用尿素等含脲基的化合物、含氨基甲酸酯基的化合物。
<透明质酸衍生物组合物的制造方法>
本实施方式的透明质酸衍生物组合物可以通过以下方式等来制造:在制造(A)透明质酸衍生物后,向该(A)透明质酸衍生物中添加(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种官能团的含极性基团化合物。
首先,作为(A)透明质酸衍生物的制造方法,例如,将葡糖醛酸的羧基转化为酰胺,并引入甾基,从而得到(A)透明质酸衍生物。此外,通过调整与之反应的具有甾基的化合物相对于原料透明质酸或其衍生物的配入量,可以使甾基引入率为0.1%以上且小于35%。
作为将葡糖醛酸的羧基转化为酰胺,并引入甾基的方法,具体地,例如可举出:将原料透明质酸或其衍生物,优选为仅由重复单元(II)构成的透明质酸或其衍生物进行离子交换为四烷基铵盐(例如,四丁基铵(TBA)盐),并在适当的缩合剂存在下,在溶剂中使该透明质酸盐与引入有由式:“HNRa-Y-NRb-R、NHRa-Y-NRb-COO-R、HNRa-Y-NRb-COO-R、HNRa-Y-NRb-CO-R、HNRa-Y-NRb-CO-NRc-R、HNRa-Y-COO-R、HNRa-Y-O-COO-R、HNRa-Y-S-R、HNRa-Y-CO-Ya-S-R、HNRa-Y-O-CO-Yb-S-R、HNRa-Y-NRb-CO-Yb-S-R、HNRa-Y-S-S-R或-Z-NRa-Y-NRb-COO-R(式中,Ra、Rb、Rc、Y、Ya、Yb、Z和R如本说明书中所定义)”表示的甾基(特别是胆甾基)的胺反应的方法。
可以在上述反应中使用的缩合剂没有特别限定,例如可举出:4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪)-4-甲基吗啉(DMT-MM)、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。
特别是,虽然没有限定,但DMT-MM基于在水与有机溶剂的混合溶剂中也高效率进行反应的角度而优选。此外,通过使用DMT-MM作为缩合剂,可以在大量羟基共存的体系中,在抑制酯键形成的同时,高选择性地进行氨基与羧基形成酰胺键。通过使用该缩合剂,例如可以防止作为溶剂的醇与透明质酸部分的羧基进行反应或透明质酸部分中同时存在的羧基和羟基在分子内或分子间键合,导致形成不需要的交联。
作为甾基引入反应中使用的溶剂,可举出:水、DMSO、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、多元醇、乙腈、DMF、THF、二氯甲烷、氯仿、己烷、二乙醚、乙酸乙酯,以及它们的混合溶剂等。作为多元醇,可举出与上述醇中例示的多元醇相同的多元醇。
或者,也可以将原料透明质酸或其衍生物离子交换为四烷基铵盐(例如,四丁基铵(TBA)盐),并在适当的缩合剂存在下,在溶剂中使该透明质酸盐与间隔基团部分反应(此时,也可以根据需要进行保护和去保护反应),将原料透明质酸或其衍生物的羧基(-COOH)转化,然后与适当的试剂进行反应。衍生自羧基的基团与反应试剂的组合例子如下所示。
-CONRa-Y-NRbH+Hal-R;
-CONRa-Y-NRbH+Hal-COOR;
-CONRa-Y-NRbH+HOCO-R;
-CONRa-Y-NRbH+Hal-CO-R;
-CONRa-Y-NRb-COOH+HNRc-R;
-CONRa-Y-NRb-CO-NRcH+Hal-R;
-CONRa-Y-NRbH+HOCO-NRc-R;
-CONRa-Y-NRbH+Hal-CO-NRc-R;
-CONRa-Y-COOH+HO-R;
-CONRa-Y-OH+Hal-COO-R;
-CONRa-Y-OCOOH+HO-R;
-CONRa-Y-OCOOH+Hal-R;
-CONRa-Y-OCO-Hal+HO-R;
-CONRa-Y-SH+Hal-R;
-CONRa-Y-Hal+HS-R;
-CONRa-Y-CO-Ya-Hal+HS-R;
-CONRa-Y-CO-Ya-SH+Hal-R;
-CONRa-Y-O-CO-CH=CH2+HS-R;
-CONRa-Y-NRb-CO-CH(CH3)=CH2+HS-R;
-CONRa-Y-SH+HS-R;
-COZ-OH+HNRa-Y-NRb-COO-R;
-COZ-NRa-Y-NRbH+Hal-COO-R
(式中,Ra、Rb、Rc、Y、Ya、Yb和Z如本说明书中所定义,Hal表示选自氟原子、氯原子、溴原子和碘的卤素原子)。
作为反应方式,可举出:脱卤化氢反应、缩合反应、脱水反应、迈克尔加成等亲核加成反应、氧化的二硫化物形成反应等,这些是公知的反应,本领域技术人员可以适当选择,发现优选的反应条件来进行。转化体或反应物具有羧基时,也可以制成N-羟基琥珀酰亚胺(以下称为也称为“NHS”)酯进行反应。
另外,可举出如下方法:使2-氨基乙基2-吡啶基二硫化物与原料透明质酸或其衍生物的羧基反应,制备引入有末端具有被离去基团修饰的巯基的间隔基团的透明质酸衍生物,使巯基胆甾基与其进行亲核取代反应而形成二硫键。
而且,也可举出如下方法:制备透明质酸或其衍生物的羧基上引入一部分间隔基团的所得物和甾基上引入一部分间隔基团的所得物,使它们反应。具体例中的一部分如上所述,进一步,在Y中插入-S-S-的情况下,也可举出如下方法:分别制备在透明质酸的羧基上引入末端具有巯基的间隔基团的透明质酸衍生物和引入末端具有巯基的间隔基团的甾基,使它们发生氧化反应形成二硫键。这时,也可以使其中一个巯基与2-巯基吡啶反应形成二硫化物后,再与另一个巯基进行取代。
另外,在制备本发明的透明质酸衍生物之后,还可以进一步引入其它取代基。例如,可以通过将实质上由重复单元(I)和重复单元(II)构成的透明质酸衍生物中的羧基的0.1%以上且99.5%以下、优选10%以上且40%以下转化为-CO-Xz[此处,Xz选自以下基团:
-NH-(CH2)p1-O-CO-C(R17)=CH2;
-NH-(CH2)p1-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH;
-NH-(CH2)p1-SH;
-NH-(CH2)p1-NH-CO-C(R17)=CH2;
-NH-(CH2)p1-NH-C(=NH)-(CH2)3-SH;
-NH-(CH2)p1-NH-CO-(CH2)r-SH;
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH;
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH;
-NH-(CH2)p1-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH;
-NH-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-NH-C(=NH)-(CH2)3-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-O-CO-C(R17)=CH2;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-O-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-C(R17)=CH2;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-C(=NH)-(CH2)3-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)r-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(R17)-CH2-S-CH2-CH(OH)-CH(OH)-CH2-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-CH2-SH;
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-CH2-NH-CO-CH(NH2)-(CH2)2-SH;
-NH-CH(CO2H)-(CH2)-SH;
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-SH;以及,
-NH-CH(CO2H)-(CH2)2-CONH-CH(CONH-CH2-CO2H)-CH2-SH
(此处,R17表示氢原子或C1-6烷基,p1表示2以上且10以下的整数,q表示1以上且200以下的整数,r表示1以上且3以下的整数)],使在分子内或包含其他分子的分子间交联而凝胶化。
通过化学交联使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤可以适当选择其条件。交联的条件有交联方法、聚合物浓度、交联剂浓度、溶剂、溶剂pH、盐浓度、温度、时间等。
在使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤中,形成交联的反应条件中,例如通过提高化学交联时的聚合物浓度和可形成交联的基团的引入率,可以提高所生成凝胶的交联密度。
对于使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤中的交联剂浓度,在使用两端具有可形成交联的基团的交联剂时,优选以该基团不会过多或不足地能够迅速参与交联反应的浓度添加。例如,在使用DTT通过迈克尔加成反应使引入有甲基丙烯酰基(MA基)的聚合物交联的情况下,优选MA基:SH基=3:1~1:3,特别优选为2:1~1:2。
在使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤中的溶剂优选可以充分溶解聚合物和交联剂的溶剂,虽然没有特别限定,但优选使用水、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和选自这些中的混合溶剂。此外,也可以混合使用与这些溶剂混合的有机溶剂。虽然没有特别限定,但作为混合的有机溶剂,例如可举出:甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、多元醇、丙酮、乙腈等。作为多元醇,可举出与上述“醇”中例示的相同的多元醇,其中,优选为乙二醇。
(A)透明质酸衍生物由于在水溶液中形成纳米微粒,因此通过在稀薄条件下交联,能够形成纳米尺寸的微粒凝胶,可以用作血中缓释载体、靶向载体。稀薄条件是指10mg/mL以下,优选为5mg/mL以下,进一步优选为1mg/mL以下。另一方面,通过在高浓度条件下进行交联,能够形成微粒彼此交联而成的本体凝胶(Bulk Gel)。这作为皮下缓释型载体是有用的。高浓度条件是指5mg/mL以上,优选为20mg/mL以上,进一步优选为40mg/mL。
使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤可以以本体进行,也可以在乳液中或喷雾液滴中等非连续相中进行。例如,在W/O乳液中进行的情况下,只要将溶解有聚合物和交联剂等的水相在不与水混合的溶剂中乳化,进行凝胶化反应即可。不与水混合的溶剂虽然没有特别限定,但例如可举出:己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、中链脂肪酸甘油三酯(MCT)、液体石蜡、大豆油等。还可以添加用于使乳化稳定化的表面活性剂。此外,例如可以在超临界二氧化碳中或PEG中等可去溶剂化的溶剂中进行。这种情况下,通过使溶解有聚合物和交联剂等的水相或有机溶剂相在前例的溶剂中乳化并分散,从而在去溶剂化(溶剂扩散)的同时聚合物浓缩得以完成,因此能够得到更高交联密度的凝胶。
在使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤及其后,也可以进行停止交联反应的操作和使残留的交联性官能团失活或进行冲洗的操作。从安全性的角度、保存中稳定性的角度、与被封入的药物发生副反应等角度出发,优选除去未参与反应的交联性官能团、仅结合交联剂片端的基团、残留的交联剂等。虽然没有特别限定,但例如,在残留未反应的交联剂的情况下,可以通过用过量的水等冲洗来除去。此外,例如在聚合物中所取代的甲基丙烯酰基残留的情况下,也可以在添加过量的巯基乙醇等,使甲基丙烯酰基失活,然后用过量的水等冲洗剩余的巯基乙醇。进一步,例如在残留巯基的情况下,可以添加过量的3-马来酰亚胺基丙酸、碘乙酸等,使巯基失活,然后用过量的水等冲洗剩余的3-马来酰亚胺基丙酸、碘乙酸而除去。
在使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤之后,也可以进行粉碎步骤。作为粉碎方法,可举出:使用研棒和研钵的粉碎或使用研磨机的粉碎,优选使用研磨机的粉碎。作为研磨机粉碎装置,可举出:离心式粉碎机(日本精机制作所)和冲击研磨机(道尔顿公司)等旋转圆盘式粉碎装置、喷雾器(东京喷雾器制造公司)、样品研磨机(东京喷雾器制造公司)、Bantam研磨机(东京喷雾器制造公司)和SK研磨机(Tokken公司)等筛网研磨机的粉碎装置、超微少量实验室喷射研磨机(A-O喷射研磨机、Seishin企业)等喷射粉碎装置,以及可在超低温下粉碎的linrex研磨机(Liquid Gas公司)等,优选为SK研磨机和linrex研磨机。
在使(A)透明质酸衍生物凝胶化的步骤之后,也可以进行干燥步骤。作为干燥方法,例如可举出:通风干燥、在恒温槽中的干燥、减压干燥、热风循环式干燥等。风速、干燥时间、温度、压力等可在(A)透明质酸衍生物的凝胶不产生分解和变质的范围内适当选择。
上述(A)透明质酸衍生物的制造中,在残留有来自制造时使用的溶剂的(B)含极性基团化合物的情况下,可以不添加(B)含极性基团化合物而得到透明质酸衍生物组合物。或者,在制造上述(A)透明质酸衍生物之后,可以通过添加(B)含极性基团化合物使(B)含极性基团化合物的含量达到所期望的量,而得到透明质酸衍生物组合物。在添加(B)含极性基团化合物的情况下,优选在上述干燥步骤之前添加。
《药物组合物》
本实施方式的药物组合物含有药物和载体,含有上述透明质酸衍生物组合物作为载体。本实施方式的药物组合物中,优选载体和药物通过氢键、离子键、范德华力等非共价键等直接或间接键合,形成复合体,处于相互不游离的状态。在将该药物组合物给予到生物体内时,药物从载体中缓慢游离,能够期待良好的缓释性。
本实施方式的药物组合物中,优选药物与载体透明质酸衍生物组合物中的(A)透明质酸衍生物形成复合体。认为在溶剂中,通过(A)透明质酸衍生物的甾基与存在于体系中的药物间的疏水性相互作用而自发性缔合,形成药物与(A)透明质酸衍生物的复合体。通过形成该复合体,可期待该药物的保存稳定性提高和生物活性的保持、缓释性的提高等。
<药物>
作为本实施方式的药物组合物中所含的药物,没有特别限定,例如可举出:蛋白质、肽、多糖类、核酸、低分子化合物等。本实施方式的药物组合物优选含有具有药理活性的蛋白质、肽、核酸等生物药品或低分子化合物与透明质酸衍生物组合物中的(A)透明质酸衍生物形成复合体。
[低分子化合物]
作为低分子化合物,例如可举出:抗癌剂(例如,烷基化剂、抗代谢物、生物碱等)、免疫抑制剂、抗炎剂(类固醇剂、非类固醇剂类抗炎剂等)、抗风湿剂、抗菌剂(β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、新喹诺酮类抗生素、磺胺剂等)等。
[蛋白质和肽]
作为蛋白质和肽,例如可举出:促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α、β、γ、(INF-α、β、γ)、促血小板生成素(TPO)、睫状神经营养因子(CNTF)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子结合蛋白(TNFbp)、白细胞介素-10(IL-10)、FMS类似酪氨酸激酶(Flt-3)、生长激素(GH)、胰岛素、胰岛素类似生长因子-1(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、脑源性神经营养因子(BDNF)、角质化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、骨保护素(OPG)、瘦素、甲状旁腺激素(PTH)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、骨形成蛋白(BMP)、心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、C型钠尿肽(CNP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、抗体、双抗体、微抗体、碎片抗体等。
[核酸]
作为核酸,例如可举出:DNA、RNA、反义核酸、诱饵(decoy)核酸、核酶、低分子干扰RNA、核酸适体等。
[多糖类]
作为多糖类,例如可举出:香菇多糖、裂褶多糖、茯苓次聚糖、石耳葡聚糖、酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖、海拿登(marinactan)、凝胶多糖、硫酸葡聚糖、肝素、角叉莱胶、菊粉、软骨素、硫酸软骨素等。
<形态>
本实施方式的药物组合物可以是分散性微粒溶液,可以是沉淀性悬浮液,也可以是冷冻干燥物。在是分散性微粒溶液的情况下,可成为具有如下独特优点的沉淀型缓释制剂:在向体内给予之前虽然是溶液状态,但通过向体内给予(例如,皮下给予)而在给予后于体内给予部位发生凝聚。在是沉淀性悬浮液的情况下,可成为具有活性成分难以被突释的独特优点的沉淀型缓释制剂。这种情况下,由于也能够赋予通针性,因此优选沉淀物大小为200μm以下,更优选为100μm以下,进一步优选为20μm以下。此外,在是冷冻干燥物的情况下,医生在给予前加入生理盐水等等渗液而可成为事先制备给予液类型的沉淀型缓释制剂。这种情况下,认为适用于以溶液状态包含不稳定活性成分的药物组合物。
本实施方式的药物组合物是分散性微粒溶液或沉淀物悬浮液的情况下,药物组合物中的(A)透明质酸衍生物的浓度优选为1mg/mL以上且200mg/mL以下,更优选为4mg/mL以上且100mg/mL以下,进一步优选为4mg/mL以上且50mg/mL以下,特别优选为4mg/mL以上且12mg/mL以下。通过使药物组合物中的(A)透明质酸衍生物的浓度为上述下限值以上,趋于能够使其在生理盐水浓度下的沉淀形成能力更优异,药物的给予量也能够进一步增多。另一方面,通过使药物组合物中的(A)透明质酸衍生物的浓度为上述上限值以下,在使用注射针向生物体内给予时的注射能力趋于进一步提高,同时灭菌过滤性亦趋于进一步提高。
《透明质酸衍生物-药物结合体组合物》
本实施方式的透明质酸衍生物-药物结合体组合物含有上述透明质酸衍生物-药物结合体组合物和一个以上的药物,上述透明质酸衍生物组合物中所含的(A)透明质酸衍生物结合有上述一个以上的药物。
适于形成本实施方式的透明质酸衍生物-药物结合体组合物的药物是蛋白质、肽、核酸等生物药品或低分子化合物。
本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物并不限定于已说明的形态,也可以是纳米微粒、微粒、溶液、乳液、悬浮液、凝胶、胶束、植入物、粉末或膜的形态。粉末可以将通过冷冻干燥或喷雾干燥而得到的固体进行粉碎来制造,也可以由将沉淀物干燥后所得物来制造。
本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物可以经由口服、肠道外、鼻腔内、阴道内、眼内、皮下、静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内、脑内或口腔内的途径进行给予。此外,本实施方式的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物并不限定于注射剂,也可以是贴剂或微针制剂、涂敷药、滴眼药、喷雾药、吸入药等。
实施例
下面,通过实施例对本发明进行详细说明,但这些并不意在将本发明的范围限制于实施例。
实施例和比较例中制造的透明质酸衍生物组合物各物理性质的测定方法和评价方法如下所述。
[物理性质1]
(透明质酸衍生物的分子量)
透明质酸衍生物的分子量是由体积排阻色谱与多角度光散射检测器(SEC-MALS)确定的重均分子量。将透明质酸衍生物组合物(20mg)溶于超纯水(10mL)中并在室温下搅拌12小时以上,得到透明质酸衍生物组合物水溶液(2mg/mL)。向该透明质酸衍生物组合物水溶液(750μL)中加入300mM羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)水溶液(750μL)并使用震荡机混合10秒,在37℃孵育1小时。然后,将得到的试样供于SEC-MALS测定而确定重均分子量。SEC-MALS测定的条件如下所示。
(测定条件)
色谱柱:TSKgel GMPWXL(东曹公司制)2根
柱温度:30℃
洗脱液:加入10mM HP-β-CD的磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)
流速:1mL/分
注入量:200μL
[物理性质2]
(甾基引入率)
透明质酸衍生物甾基引入率由1H-NMR测定来确定。首先,以质量比99:1混合二甲基亚砜-d6(99.9v/v%,含有0.05v/v%的三甲基甲硅烷基(TMS),富士胶片和光纯药公司制)和20%氯化氘(99.5v/v%,富士胶片和光纯药公司制),制备成测定溶剂。接着,向该测定溶剂(0.6mL)中添加透明质酸衍生物组合物(2mg),用超声波浴处理30分钟使其完全溶解,供于1H-NMR测定。1H-NMR测定使用傅立叶变换核磁共振装置(FT-NMR装置)(ECS400,日本电子公司制)在样品温度85℃下进行。甾基引入率根据来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3,1.6ppm以上且2.0ppm以下,3H)的积分值和来自胆甾基中甲基的峰(CH3,0.7ppm,3H)的积分值,并使用如下所示的式计算出胆甾基相对于透明质酸单元的引入率。予以说明,由于在来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰所包含的1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰与来自胆甾基的峰(5H)重叠,因此将由1.6ppm以上且2.0ppm以下附近的峰的积分值减去来自胆甾基甲基的峰(0.7ppm)的积分值乘以5/3倍后的值而计算出的值(即,积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3)作为来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰的积分值,用于甾基引入率的计算。
[甾基引入率(%)]
=[(来自胆甾基中甲基的峰积分值)/(来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰积分值)]×100
=[积分值(0.7ppm)/{积分值(1.6ppm以上且2.0ppm以下)-积分值(0.7ppm)×5/3}]×100
[物理性质3]
(含极性基团化合物的含量)
透明质酸衍生物组合物中的(B)含极性基团化合物的含量通过气相色谱-质谱(GC-MS)法测定。
首先,将透明质酸衍生物组合物(16.0mg)添加到超纯水(2.0mL)中,搅拌12小时以上使其溶解,得到8.0mg/mL的透明质酸衍生物组合物水溶液。然后,将得到的水溶液供于GC-MS测定,通过外标法求出测定试样中的(B)含极性基团化合物的含量。然后,计算测定试样中的(B)含极性基团化合物相对于添加的透明质酸衍生物量的质量比作为(B)含极性基团化合物相对于透明质酸衍生物的含量。定量分析所需的校准曲线使用市售标准品而制作。GC-MS测定的条件如下所示。
(测定条件)
GC装置:Agilent Technologies,7890A
色谱柱:DB-624(60m×0.25mmΦ),膜厚1.40μm
柱温度:50℃(5分钟)→以20℃/分的速度升温→158℃(2分钟)→以3℃/分的速度升温→180℃(0分钟)→以20℃/分的速度升温→250℃(5.8分钟)
流速:1mL/分
注入口温度:250℃
分流比:1/50
虽也根据定量的化合物,但在50质量ppm以下的情况下,使用以下的方法。
(测定条件:乙二醇的情况下)
将透明质酸衍生物0.1g放入玻璃管中,在200℃下进行10分钟加热脱附,在-130℃捕集挥发成分。然后,冷却的捕集成分在250℃快速加热,进行GC-MS测定。
将已知浓度的乙二醇标准品在相同条件下测定,根据检测峰面积值制作校准曲线。由校准曲线计算出样品中的乙二醇的质量。然后,计算样品中的乙二醇相对于使用的(A)透明质酸衍生物质量的质量比作为(B)极性官能团含有化合物相对于(A)透明质酸衍生物的含量。
热脱附装置:GERSTEL TDU,CIS4
脱附温度:200℃
脱附时间:10分钟
分流:未分流
冷阱温度:-130℃
注入温度:250℃
CIS衬管:Tenax(GL科学)
GC装置:Agilent Technologies7890
色谱柱:GL科学DB-WAX(30m×0.25mmΦ,膜厚0.25mm)
温度条件:40℃(5分钟)→20℃/分钟→250℃(保持5分钟)
MS装置:Agilent Technology 7000
离子化:EI 70eV
离子源温度250℃
扫描范围:SIM(m/z33)
异丙醇和乙醇的情况下,除了将温度条件设为50℃(5分钟)→10℃/分钟→240℃(保持6分钟)之外,与乙二醇同样地进行测定。
[评价1]
(沉淀率)
透明质酸衍生物组合物的沉淀率通过以下所示的操作步骤确定。首先,制备加入600mM氯化钠的40mM磷酸缓冲液(pH7.4)(称为浓缩缓冲液)。接着,向透明质酸衍生物组合物中加入超纯水,搅拌12小时以上使其溶解,得到透明质酸衍生物组合物水溶液。将该水溶液放入过滤管(孔径:5.0μm;UFC40SV25;Merck公司制)中利用离心分离机进行过滤处理。接着,制备经过滤后的透明质酸衍生物水溶液(600μL)与浓缩缓冲液(200μL)混合而成的沉淀形成样品(N数:3),以及经过滤后的透明质酸衍生物水溶液(600μL)与超纯水(200μL)混合而成的参考样品(N数:2)。然后,将沉淀形成样品和参考样品在37℃孵育20分钟,然后装入离心分离机(2,000×g,10分钟)。分别采集200μL离心分离后的样品各自的上清液,均加入300mM羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)水溶液(200μL)并稀释2倍后,在37℃孵育2小时。而且,向全部样品中加入10mM HP-β-CD水溶液(1000μL)并稀释,通过针筒过滤器(孔径:0.45μm)进行处理。然后,将得到的沉淀形成样品和参考样品供于体积排阻色谱(SEC)测定。透明质酸衍生物组合物的沉淀率使用沉淀形成样品和参考样品的SEC色谱图的来自透明质酸衍生物的峰(7分钟附近)的面积值,根据如下所示的式进行计算。
[沉淀率](%)
=[1-(沉淀形成样品中来自透明质酸衍生物的峰的面积值)/(参考样品中来自透明质酸衍生物的峰的面积值)]×100
此处,沉淀形成样品中来自透明质酸衍生物的峰的面积值使用以N=3制备的各沉淀形成样品中的面积值平均值,参考样品中来自透明质酸衍生物的峰的面积值使用以N=2制备的各参考样品中的面积值平均值。予以说明,SEC测定的条件如下所示。
(测定条件)
色谱柱:TSKgel G4000SWXL(东曹公司制)
柱温度:35℃
洗脱液:加入10mM HP-β-CD的磷酸盐缓冲生理盐水(pH7.4)
流速:1mL/分钟
注入量:90μL
检测:示差折光检测器(RI检测器)或紫外检测器(UV检测器)
[评价2]
(灭菌过滤性)
灭菌过滤性通过透明质酸衍生物组合物水溶液在用0.22μm滤器处理时的最大过滤量进行评价。即,将透明质酸衍生物组合物溶于超纯水中制成为0.9mg/mL,将得到的透明质酸衍生物组合物水溶液通过0.22μm滤器(Stericup-GP S2GPU05RE,有效过滤面积40cm2、Merck公司制)过滤至膜堵塞而不能透过水溶液为止。然后,测定经过滤后的透明质酸衍生物组合物水溶液的体积,计算每单位有效过滤面积的经过滤后的透明质酸衍生物组合物水溶液的体积作为最大过滤量。
<透明质酸衍生物组合物的制造>
[实施例1]
(透明质酸衍生物组合物HA-a1的制造)
透明质酸衍生物组合物按照如下步骤1~步骤3进行制备。
1.步骤1
(胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐的合成)
胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐(Chol盐酸盐)按照如下所示的步骤1-1,接着按照步骤1-2进行合成。
(1)步骤1-1
在氩气气氛下,向胆固醇氯甲酸酯(3.37g、7.5mmol)的无水二氯甲烷(20mL)溶液中加入三乙胺(TEA、1.05mL)并搅拌。在冰冷却下,滴加6-(叔丁氧基羰基)氨基-1-氨基己烷(1.12mL,5mmol),直接在冰冷却下搅拌30分钟,然后升温至室温,搅拌该混合物过夜。将反应混合物用超纯水和饱和盐水进行冲洗,用无水硫酸镁干燥,然后减压蒸馏除去溶剂。将得到的残渣用硅胶柱色谱(洗脱液:乙酸乙酯:正己烷=1:4)进行纯化,合并目标物馏分,减压蒸馏除去溶剂。
(2)步骤1-2
将得到的残渣溶于乙酸乙酯(40mL)中,加入4N盐酸/乙酸乙酯溶液(40mL)在室温搅拌过夜。产生的沉淀物通过离心分离回收。将得到的固体用乙酸乙酯冲洗4次,然后减压下进行干燥,得到胆甾基6-氨基己基氨基甲酸酯盐酸盐(Chol盐酸盐)1.2g。生成物的1H-NMR谱图(CS400日本电子公司制,EtOH-d6)示于图1中。
2.步骤2
(透明质酸的四丁基铵(TBA)盐的制备)
透明质酸的TBA盐(HA-TBA)按照如下所示的步骤2-1,接着按照步骤2-2进行制备。
(1)步骤2-1
使DOWEX(注册商标)50WX-8-400(Aldrich公司制)悬浮于超纯水中,通过倾析用超纯水冲洗树脂3次左右。相对于树脂的阳离子交换能力加入约1.5倍摩尔等量的40质量%四丁基氢氧化铵水溶液(TBA-OH)(Aldrich公司制),搅拌30分钟。剩余的TBA-OH溶液通过倾析除去后,进一步用过量的超纯水进行冲洗,由此得到TBA氯化后的阳离子交换树脂。
(2)步骤2-2
将分子量50,000(50kDa)的原料透明质酸钠盐(HA-Na)以15mg/mL的浓度溶于超纯水中。相对于HA单元(单元分子量401.3)的摩尔数以树脂的离子交换能力计添加5倍摩尔等量的在“(1)步骤2-1”中TBA氯化后的阳离子交换树脂的悬浮液。搅拌15分钟后,用0.45μm的滤器进行过滤,将滤液冷冻干燥,得到透明质酸的TBA盐(HA-TBA),为白色固体。生成物的1H-NMR谱图(ECS400日本电子公司制,EtOH-d6)示于图2中。
3.步骤3
制备“2.(2)步骤2-2”中制备的HA-TBA的无水DMSO溶液(10mg/mL)。然后,相对于存在于HA-TBA中的二糖重复单元(HA单元),将“1.步骤1”中合成的Chol盐酸盐的添加量以摩尔比(Chol盐酸盐/HA单元)为15/100进行添加。接着,相对于HA单元的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)的添加量以摩尔比(DMT-MM/HA单元)为21.6/100进行添加,在室温搅拌过夜。反应溶液依次用0.3M乙酸铵/DMSO溶液、0.15M NaCl水溶液、超纯水进行透析(Spectra 4(Spectrum公司制),截留分子量(MWCO):12,000以上且14,000以下)。相对于得到的透析液,乙二醇(EG)以组合物中的含量为0.0062质量ppm进行添加,然后冷冻干燥得到目标物(HA-C6-Chol),为白色固体。生成物的1H-NMR谱图示于图3中。确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3,1.6ppm以上且2.0ppm以下,3H),来自胆甾基中甲基的峰(CH3,0.7ppm,3H)。
[实施例2~25和比较例1~2]
(透明质酸衍生物组合物HA-a2~HA-a25和HA-b1~HA-b2的制造)
“3.步骤3”中,相对于HA单元的Chol盐酸盐的添加量,以及相对于HA单元的DMT-MM的添加量以摩尔比为下述表所示的比率,除了醇的种类和相对于(A)透明质酸衍生物的(B)含极性基团化合物的含量如下述表所示之外,使用与实施例1相同的方法,得到各透明质酸衍生物组合物。对得到的透明质酸衍生物组合物进行1H-NMR测定,各透明质酸衍生物组合物中所含的透明质酸衍生物中,均确认到来自N-乙酰基-D-葡萄糖胺的乙酰基的峰(COCH3,1.6ppm以上且2.0ppm以下,3H),来自胆甾基中甲基的峰(CH3,0.7ppm,3H)。
予以说明,下述表中,醇的种类和略称如下所述。
(醇的种类和略称)
异丙醇:IPA
乙醇:EtOH
对于在实施例和比较例中得到的透明质酸衍生物组合物,使用上述方法测定各物理性质,进行各种评价。结果示于下述表中。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
由上述表1~4可知,当透明质酸的分子量为50kDa时,在含有醇的透明质酸衍生物组合物HA-a1~HA-a12、HA-a17和HA-a18(实施例1~12、17和18)中,在6mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率良好,为74.5%以上且91.3%以下。另一方面,在不含醇的透明质酸衍生物组合物HA-b1(比较例1)中,在6mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率不佳,为46.0%。
另外,在甾基引入率不同的透明质酸衍生物组合物HA-a1、HA-a17和HA-a18(实施例1、17和18)中,观察到甾基引入率越低,则在6mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率趋于越良好。
由表5~6可知,当透明质酸的分子量为100kDa时,在含有醇的透明质酸衍生物组合物HA-a19~HA-a25(实施例19~25)中,在低浓度的1.2mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率良好,为23.9%以上且50.9%以下。另一方面,在不含醇的透明质酸衍生物组合物HA-b2(比较例2)中,在1.2mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率不佳,为12.4%。
另外,在醇的含量不同的透明质酸衍生物组合物HA-a19和HA-a23(实施例19和23)中,观察到醇的含量越少,则最大过滤量越趋于增加。
另外,醇的种类不同的透明质酸衍生物组合物HA-a23~HA-a25(实施例23~25)中,使用乙二醇的情况下,在1.2mg/mL的含NaCl浓缩缓冲液中的沉淀率为良好。
工业上的可利用性
根据本实施方式的透明质酸衍生物组合物,可以提供一种在生理盐水浓度下的沉淀形成能力优异的透明质酸衍生物组合物、含有该透明质酸衍生物组合物的药物组合物和透明质酸衍生物-药物结合体组合物。
Claims (15)
1.一种透明质酸衍生物组合物,其含有:(A)引入有甾基的透明质酸衍生物;
(B)具有选自羟基、羧基、氨基、酰胺基、氨基甲酸酯基、脲基和巯基中的至少一种的官能团的含极性基团化合物,
其中,所述甾基相对于(A)透明质酸衍生物的引入率为0.1%以上且小于35%。
2.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是具有至少一个羟基的含极性基团化合物。
3.根据权利要求1或2所述的透明质酸衍生物组合物,其中,相对于所述(A)透明质酸衍生物的质量,所述(B)含极性基团化合物的含量为0.001质量ppm以上且小于1000质量ppm。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是具有多个极性基团的化合物。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(B)含极性基团化合物是醇。
6.根据权利要求5所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇选自乙醇、异丙醇和多元醇。
7.根据权利要求6所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇是多元醇。
8.根据权利要求7所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述醇是乙二醇。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(A)透明质酸衍生物具有由下述通式(I)表示的重复单元:
[化1]
式中,R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢原子、C1-6烷基、甲酰基和C1-6烷基羰基;
Z表示直接键合或由2个以上且30个以下的氨基酸残基组成的肽接头;
X1选自由下式表示的基团:
-NRb-R、
-NRb-COO-R、
-NRb-CO-R、
-NRb-CO-NRc-R、
-COO-R、
-O-COO-R、
-S-R、
-CO-Ya-S-R、
-O-CO-Yb-S-R、
-NRb-CO-Yb-S-R,以及,
-S-S-R;
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,此处该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NRf-的基团;
Rf选自氢原子、C1-12烷基、氨基C2-12烷基和羟基C2-12烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
R是甾基;
Y是C2-30亚烷基或-(CH2CH2O)m-CH2CH2-,此处,该亚烷基任选插入选自-O-、-NRg-和-S-S-的基团;
Rg选自氢原子、C1-20烷基、氨基C2-20烷基和羟基C2-20烷基,该基团的烷基部分任选插入选自-O-和-NH-的基团;
Ya是C1-5亚烷基;
Yb是C2-8亚烷基或C2-8亚烯基;
m是1以上且100以下的整数。
10.根据权利要求9所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述R是胆甾基。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的透明质酸衍生物组合物,其中,所述(A)透明质酸衍生物的分子量为1,000以上且小于1,000,000。
12.一种药物组合物,其含有药物和载体,所述载体是权利要求1~11中任一项所述的透明质酸衍生物组合物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物,其中,所述药物与(A)透明质酸衍生物形成复合体。
14.根据权利要求12或13所述的药物组合物,其中,所述药物是具有药理活性的蛋白质、肽或核酸。
15.一种透明质酸衍生物-药物结合体组合物,其含有权利要求1~11中任一项所述的透明质酸衍生物组合物和药物,所述透明质酸衍生物组合物中所含的(A)透明质酸衍生物上结合有所述药物。
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