TW202133884A - 玻尿酸衍生物組合物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體組合物 - Google Patents

玻尿酸衍生物組合物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體組合物 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種玻尿酸衍生物組合物、包含該玻尿酸衍生物組合物作為載體之醫藥組合物、及於該玻尿酸衍生物組合物中之(A)玻尿酸衍生物上結合有1種以上之藥物之玻尿酸衍生物-藥物結合組合物，本發明之玻尿酸衍生物組合物包含(A)導入有甾基之玻尿酸衍生物、與(B)具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物，且上述甾基相對於(A)玻尿酸衍生物之導入率為0.1%以上且未達35%。

Description

玻尿酸衍生物組合物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物－藥物結合體組合物
本發明係關於一種玻尿酸衍生物組合物、醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物。 本申請案係基於2020年2月5日於日本提出申請之特願2020-018312號而主張優先權，將其內容援用至此。
近年來，採用蛋白質或肽、核酸作為活性成分之醫藥品即生物醫藥品得以實用化，其數量逐年遞增。生物醫藥品能夠滿足先前之低分子醫藥所未能滿足之未滿足醫療需求(unmet health needs)。然而，存在不易被消化管或黏膜等吸收，以及於體內不穩定、血中半衰期較短之課題。因此，生物醫藥品需要進行高頻次之注射投予，無論對於患者或相關醫療人員而言均為較重負擔。於是，尋求能夠於無損藥理活性之情況下將生物醫藥品膠囊化，使之於生物體內緩慢釋出有效成分之藥物基材(緩釋性藥物遞送系統基材)。
於此種背景下，專利文獻1中提出有包含安全性優異之玻尿酸衍生物之緩釋性藥物遞送系統基材。該玻尿酸衍生物會於水溶液中自發地締合，能夠將藥物、尤其是生物醫藥品於維持其生物活性之狀態下效率良好地封入，於生理食鹽濃度下凝集(或於生理食鹽濃度下分散)，並且血中滯留性良好。認為該玻尿酸衍生物尤其於使用生物醫藥品作為有效成分之情形時，可用作能夠於維持藥理活性之狀態下效率良好地封入較多藥物之載體、及血中滯留性優異之血中緩釋載體以及標靶載體，亦可成為能夠持續緩釋藥物之局部(例如皮下等)緩釋載體。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2010/053140號
[發明所欲解決之問題]
然而，專利文獻1中記載之玻尿酸衍生物由於難以依賴於鹽濃度來調整沈澱形成能力，又，生理食鹽濃度下之沈澱形成能力不充分，故而存在有損包含玻尿酸衍生物之藥物組合物於生物體內之局部滯留性之風險。
本發明鑒於上述情況而成，提供一種於生理食鹽濃度下之沈澱形成能力優異之玻尿酸衍生物組合物、以及使用上述玻尿酸衍生物組合物之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物。 [解決問題之技術手段]
即，本發明包含以下之形態。 (1)一種玻尿酸衍生物組合物，其係包含 (A)導入有甾基之玻尿酸衍生物、與 (B)具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物者，且 上述甾基相對於(A)玻尿酸衍生物之導入率為0.1%以上且未達35%。 (2)如上述(1)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為具有至少一個羥基之含極性基化合物。 (3)如上述(1)或(2)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中相對於上述(A)玻尿酸衍生物之質量，上述(B)含極性基化合物之含量為0.001質量ppm以上且未達1000質量ppm。 (4)如上述(1)至(3)中任一項記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為具有複數個極性基之化合物。 (5)如上述(1)至(4)中任一項記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為醇。 (6)如上述(5)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇係選自由乙醇、異丙醇及多元醇所組成之群。 (7)如上述(6)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇為多元醇。 (8)如上述(7)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇為乙二醇。 (9)如(1)至(8)之任一項記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(A)玻尿酸衍生物具有下述通式(I)所表示之重複單元。
[化1]
Figure 02_image001
式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之胺基酸殘基之肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數。 (10)如上述(9)記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述R為膽固醇基。 (11)如上述(1)至(10)中任一項記載之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(A)玻尿酸衍生物之分子量為1,000以上且未達1,000,000。 (12)一種醫藥組合物，其包含藥物與載體，且上述載體為如上述(1)至(11)中任一項記載之玻尿酸衍生物組合物。 (13)如上述(12)記載之醫藥組合物，其中上述藥物與(A)玻尿酸衍生物形成複合體。 (14)如上述(12)或(13)記載之醫藥組合物，其中藥物為具有藥理活性之蛋白質、肽或核酸。 (15)一種玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物，其包含如上述(1)至(11)中任一項記載之玻尿酸衍生物組合物及1種以上之藥物，上述1種以上之藥物結合於上述玻尿酸衍生物組合物中包含之(A)玻尿酸衍生物。 [發明之效果]
根據上述形態之玻尿酸衍生物組合物，可提供生理食鹽濃度下之沈澱形成能力優異之玻尿酸衍生物組合物、包含其之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物。
以下，對本發明之實施方式(以下稱為「本實施方式」)進行詳細說明，但本發明並不限定於此，可於不脫離其主旨之範圍內進行各種變化。
以下，對本說明書中使用之用語進行說明。
本說明書中使用之「C1-20 烷基」用語意指碳數1以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、異丁基、第三丁基等「C1-4 烷基」，進而包括正戊基、3-甲基丁基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、正己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3-乙基丁基、2-乙基丁基等。C1-20 烷基亦包括碳數1以上12以下之C1-12 烷基、碳數1以上6以下之C1-6 烷基。
本說明書中使用之「C1-6 烷基羰基」用語意指烷基部分為已提及之C1-6 烷基之烷基羰基，例如，包括乙醯基、丙醯基、正丙基羰基、異丙基羰基、正丁基羰基、第二丁基羰基、異丁基羰基、第三丁基羰基等「C1-4 烷基羰基」。
本說明書中使用之「胺基C2-20 烷基」用語意指具有胺基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，胺基可位於烷基末端之碳原子上。胺基C2-20 烷基亦包括碳數2以上12以下之胺基C2-12 烷基。
本說明書中使用之「羥基C2-20 烷基」用語意指具有羥基作為取代基之碳數2以上20以下之直鏈狀或支鏈狀之烷基，例如，羥基可位於烷基末端之碳原子上。羥基C2-20 烷基亦包括碳數2以上12以下之羥基C2-12 烷基。
本說明書中使用之「C2-30 伸烷基」用語意指碳數2以上30以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如，包括伸乙基、伸丙基等，亦包括碳數2以上20以下之C2-20 伸烷基、碳數2以上8以下之C2-8 伸烷基、基「-(CH2 )n -」(此處，n為2以上30以下，較佳為2以上20以下，更佳為2以上15以下)。
本說明書中使用之「C1-5 伸烷基」用語意指碳數1以上5以下之直鏈狀或支鏈狀之二價飽和烴基，例如，包括亞甲基、伸乙基、伸丙基等。
本說明書中提及之「C2-8 伸烯基」用語意指碳數2以上8以下之直鏈狀或支鏈狀之包含1個以上之雙鍵之二價飽和烴基，例如，包括-CH=CH-、-C(CH3 )=CH-、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基、辛-2,4,6-三烯-1,8-二基等。於存在幾何異構之情形時，亦包括各個異構物及該等之混合物。
≪玻尿酸衍生物組合物≫ 本實施方式之玻尿酸衍生物組合物包含：(A)導入有甾基之玻尿酸衍生物(以下有時稱為「(A)玻尿酸衍生物」)、與(B)具有選自由(B)羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物。甾基相對於(A)玻尿酸衍生物之導入率為0.1%以上且未達35%。
本實施方式之玻尿酸衍生物組合物可依賴於鹽濃度來調整沈澱形成能力，於低鹽濃度下良好地溶解，並且於生理食鹽濃度下，對於甾基之導入率為上述範圍內之(A)玻尿酸衍生物而言，(B)具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物作為凝集促進劑發揮作用，生理食鹽濃度下之沈澱形成能力提昇。此處所謂「生理食鹽濃度」，意指作為投予對象之動物之投予部位處之鹽濃度。例如，人體之生理食鹽濃度係指氯化鈉濃度為150 mM左右之濃度。又，所謂「低鹽濃度」，意指遠低於生理食鹽濃度之濃度。
＜(A)導入有甾基之玻尿酸衍生物＞ 於(A)玻尿酸衍生物中，甾基可直接鍵結於玻尿酸，亦可經由連接基鍵結於玻尿酸。 此處之「連接基」，可使用能夠藉由基因工程導入之任意之肽連接基、或合成化合物連接基，於本實施方式之(A)玻尿酸衍生物中，較佳為肽連接基。肽連接基之長度並無特別限定，業者可根據目的而適當選擇，較佳之長度為2個胺基酸以上(上限並無特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。(A)玻尿酸衍生物中包含之肽連接基可使用全部為相同長度之肽連接基，亦可使用不同長度之肽連接基。
[甾基] 本說明書中使用之「甾基」用語，只要為具有類固醇骨架之基，則無特別限制。此處，作為類固醇，具體而言，可例舉：膽固醇、膽固烷醇、菜油固醇、麥角甾烷醇、豆固烷醇、腎固醇、豆固醇、穀固醇、羊毛固醇、麥角固醇、西米杜鵑醇、膽汁酸、睪固酮、雌二醇、孕酮、皮質醇、可體松、醛固酮、皮質酮、脫氧皮質酮等。作為甾基，可例舉：膽固醇基、豆固醇基、羊毛固醇基、麥角甾醇基等，其中，較佳為膽固醇基(尤其是膽甾烷-5-烯-3β-基)。
[甾基導入率] 甾基相對於(A)玻尿酸衍生物之導入率(以下有時簡稱為「甾基導入率」)為0.1%以上且未達35%，較佳為5%以上33%以下，更佳為6%以上22%以下，進而較佳為6%以上20%以下。 藉由甾基導入率為上述範圍內，使玻尿酸衍生物具有於純水中或低鹽濃度下良好地溶解、且於生理食鹽濃度下凝集形成沈澱之性質。藉由甾基導入率為上述範圍內，使玻尿酸衍生物組合物中之(A)玻尿酸衍生物與藥物複合化而成之玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物能夠成為於體內投予(例如皮下投予)時，發揮投予後凝集之獨特優點之沈澱型緩釋製劑。
甾基導入率可依據下述實施例中記載之方法，藉由1 H-NMR測定來進行測定。即，可使用玻尿酸衍生物組合物之1 H-NMR圖譜中之源於(A)玻尿酸衍生物之甾基的波峰之積分值、及源於(A)玻尿酸衍生物中包含之N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)之積分值，基於下式計算。 [甾基導入率(%)]＝[(源於(A)玻尿酸衍生物之甾基的波峰之積分值)/(源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰積分值)]×100
於甾基為膽固醇基之情形時，甾基導入率具體而言係根據源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 、1.6 ppm以上2.0 ppm以下、3H)之積分值、與源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 、0.7 ppm、3H)之積分值而算出。再者，源於膽固醇基之波峰(5H)重疊在包含源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰在內之1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰上，因此，採用自1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰之積分值中減去將源於膽固醇基甲基之波峰(0.7 ppm)之積分值乘以5/3倍所得者而算出之值(即，積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)－積分值(0.7 ppm)×5/3)，作為源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰之積分值。 [甾基導入率(%)]＝[(源於膽固醇基中之甲基的波峰積分值)/(源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰積分值)]×100＝[積分值(0.7 ppm)/｛積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)－積分值(0.7 ppm)×5/3｝]×100
[(A)玻尿酸衍生物之分子量] (A)玻尿酸衍生物之分子量並無特別限定，就期待於局部投予時由擴散延遲產生之緩釋功能之觀點或上述生理食鹽濃度下之沈澱形成能力之觀點而言，較佳為分子量相對較大之(A)玻尿酸衍生物，於最終劑型為溶液製劑之情形時，就通針性之觀點而言，較佳為分子量相對較小之(A)玻尿酸衍生物。作為此種(A)玻尿酸衍生物之分子量，較佳為1,000(1 kDa)以上且未達1,000,000(1,000 kDa)，更佳為3 kDa以上500 kDa以下，更佳為5 kDa以上300 kDa以下，進而較佳為5 kDa以上120 kDa以下，尤佳為10 kDa以上100 kDa以下。(A)玻尿酸衍生物之分子量一般而言可藉由使用具有相應分子量之原料來調節。
此處所謂「(A)玻尿酸衍生物之分子量」係利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)所確定之重量平均分子量。具體而言，可依據後述實施例中記載之方法測定。
作為較佳之(A)玻尿酸衍生物，具體而言，例如可例舉：具有1個以上之下述通式(I)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(I)」)之玻尿酸衍生物等。
[化2]
Figure 02_image003
式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之任意之胺基酸殘基的肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數。
(A)玻尿酸衍生物較佳為包含具有1個以上之下述通式(Ia)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(Ia)」)之玻尿酸衍生物。
[化3]
Figure 02_image005
式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； X為-NRa -Y-NRb -COO-R所表示之疏水性基； Ra 及Rb 分別獨立地選自由氫原子及C1-6 烷基所組成之群； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -， m為1以上100以下之整數。
此處，於(A)玻尿酸衍生物包含2個以上之重複單元(I)或重複單元(Ia)之情形時，該重複單元可相同，亦可不同。
亦可對(A)玻尿酸衍生物中重複單元(I)或重複單元(Ia)以外之位置進行修飾，例如，可將羥基轉化成-O(C1-6 烷基)、-O(甲醯基)、-O(C1-6 烷基羰基)等，可將羧基轉化成醯胺或酯，亦可形成鹽。
[重複單元(I)] 通式(I)中之基「-Z-N(Ra )Y-X1 」較佳為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NH-(CH2 )mz -NH-R； -NH-(CH2 )mz -COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -COO-R、 -NH-(CH2 )mz -O-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -O-COO-R、 -NH-(CH2 )mz -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -O-CO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -NHCO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NHCO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -O-CO-CH(R8 )-CH2 -S-R； -NH-(CH2 )mz -S-S-R；及 -Z-NRa -Y-NRb -COO-R (式中，mz為2以上30以下之整數，R8 為氫原子或甲基，Z、Ra 、Y、Rb 、R及m如本說明書中已作定義)。 作為上述基：-Z-NRa -Y-NRb -COO-R，較佳為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NH-(CH2 )mz -NH-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NH-COO-R； (式中，R、mz及m如本說明書中已作定義)。 該等之中，作為通式(I)中之基「-Z-N(Ra )Y-X1 」，更佳為選自由 -NH-(CH2 )mz -NH-COO-R； -NH-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -NH-COO-R；及 -NH-(CH2 )mz -S-S-R (此處，mz、R、及m如本說明書中已作定義) 所組成之群中之基。
(Z) 通式(I)中，Z較佳為直接鍵。 又，於另一形態中，Z為肽連接基之情形時，X1 較佳為-NRb -COO-R。 進而，於另一形態中，Z亦可為-NH-[CH(-Za )-CONH]n-1 -CH(-Za )-CO-所表示之肽連接基，此處，n為2以上30以下之整數，Za 分別獨立地表示以H2 N-CH(-Za )-COOH表示之α-胺基酸中之取代基。該肽連接基係以N末端鍵結於葡萄糖醛酸部分之羧基，以C末端鍵結於基-N(-Ra )-Y-X1 。作為可用作該肽連接基之胺基酸殘基的胺基酸之例，可例舉：例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺、麩胺酸、甘胺酸(Gly)、組胺酸、異白胺酸、白胺酸(Leu)、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸等天然型(L型)胺基酸、該等之D體等α-胺基酸，可使用包含合成胺基酸在內之全部α-胺基酸。即，作為Za ，例如可例舉：-CH3 、H2 NC(NH)NH(CH2 )3 -、H2 NCOCH2 -等。又，n個Z可相同或不同。n為2以上30以下之整數，較佳為2以上10以下，更佳為2以上4以下。作為肽連接基之較佳例，例如可例舉：-Gly-Phe-Leu-Gly-、-Asn-Phe-Phe-、-Phe-Phe-、Phe-Gly-等。
(Y) 通式(I)中，Y較佳為選自由-(CH2 )n1 -及-(CH2 CH2 O)m1 -CH2 CH2 -(此處，n1為2以上20以下之整數，較佳為2以上15以下之整數，更佳為2以上12以下之整數，進而較佳為2以上6以下之整數。m1為1以上4以下之整數)所組成之群中之基。具體而言，較佳為-(CH2 )2 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )8 -、-(CH2 )12 -、或-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -。又，就實現於純水中或低鹽濃度下之高溶解性、並於生理食鹽濃度下表現出較高沈澱形成能力之觀點而言，Y較佳為選自由-(CH2 )2 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )8 -及-(CH2 )12 -所組成之群中之基，更佳為-(CH2 )6 -。
Y亦可為例如-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -S-S-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -、-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -S-S-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -、-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -S-S-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -、-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -S-S-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -等。
(Ya ) 作為Ya ，較佳為-CH2 -或-CH2 -CH2 -。
(Yb ) 作為Yb ，較佳為-CH2 -CH2 -、-CH(CH3 )CH2 -、2-丁烯-1,4-二基、庚-2,4-二烯-1,6-二基或辛-2,4,6-三烯-1,8-二基，更佳為-CH2 -CH2 -或-CH(CH3 )CH2 -。
(R) 作為R，較佳為膽固醇基。
作為基「-Z-N(Ra )Y-X1 」之具體例，可例舉：-NH-(CH2 )2 -NH-CO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -NH-(CH2 )3 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH-(CH2 )3 -NH2 )-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-CO-NH-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-CO-膽固醇基、-NH-(CH2 )3 -NH-(CH2 )4 -N(-(CH2 )3 -NH2 )-膽固醇基等。作為較佳之基「-Z-N(Ra )Y-X1 」，Ra 、Rb 及Rc 為氫原子，Y為直鏈狀之C2-30 伸烷基或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，Ya 為直鏈狀之C1-5 伸烷基，或者Yb 為直鏈狀之C2-8 伸烷基或直鏈狀之C2-8 伸烯基。
[重複單元(Ia)] 通式(Ia)中，X較佳為-NH-(CH2 )2 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )6 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )12 -NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -NH-COO-膽固醇基，更佳為-NH-(CH2 )2 -NH-COO-膽固醇基、-NH-(CH2 )6 -NH-COO-膽固醇基或-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 CH2 -NH-COO-膽固醇基。
(A)玻尿酸衍生物除包含重複單元(I)以外，亦可進而包含通式(II)所表示之重複單元(以下有時稱為「重複單元(II)」)。
[化4]
Figure 02_image007
式中，R1a 、R2a 、R3a 及R4a 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Xa 選自由羥基及-O-Q＋ 所組成之群；此處，Q＋ 為抗衡陽離子。
此處，於(A)玻尿酸衍生物包含2個以上之重複單元(II)之情形時，該重複單元可相同亦可不同。 於另一形態中，(A)玻尿酸衍生物可為實質上由重複單元(I)、重複單元(Ia)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物。
[重複單元(II)] 通式(II)中，Q＋ 只要為與羧基於水中形成鹽之抗衡陽離子，則無特別限定，於2價以上之情形時，根據價數而與複數個羧基形成鹽。作為抗衡陽離子之例，可例舉：鋰離子、鈉離子、銣離子、銫離子、鎂離子、鈣離子等金屬離子；式：N＋ Rj Rk Rl Rm (式中，Rj 、Rk 、Rl 及Rm 分別獨立地選自由氫原子及C1-6 烷基所組成之群)所表示之銨離子等。其中，Q＋ 較佳為鈉離子、鉀離子或四烷基銨離子(例如四正丁基銨離子等)。Rj 、Rk 、Rl 及Rm 較佳為選自由C1-6 烷基所組成之群中之相同之基，較佳為正丁基。
R1 、R2 、R3 及R4 、以及R1a 、R2a 、R3a 及R4a 較佳均為氫原子。又，Ra 及Rb 較佳均為氫原子。
其中，(A)玻尿酸衍生物較佳為實質上由重複單元(I)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物。(A)玻尿酸衍生物中，包含該衍生物中所含之D-葡萄糖醛酸與N-乙醯基-D-葡糖胺之二糖之重複單元中之 例如80%以上、較佳90%以上、更佳95%以上為重複單元(I)及重複單元(II)。(A)玻尿酸衍生物可僅由重複單元(I)及重複單元(II)構成。
[(B)含極性基化合物] (B)含極性基化合物具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基。
相對於(A)玻尿酸衍生物之質量，(B)含極性基化合物之含量較佳為0.001質量ppm以上且未達1000質量ppm，更佳為0.001質量ppm以上900質量ppm以下，進而較佳為0.005質量ppm以上800質量ppm以下，尤佳為0.006質量ppm以上700質量ppm以下。 藉由使(B)含極性基化合物之含量為上述下限值以上，可進一步提高玻尿酸衍生物組合物於生理食鹽濃度下之沈澱形成能力，另一方面，藉由為上述上限值以下，可更有效地抑制(A)玻尿酸衍生物於純水中或低鹽濃度下之凝集，可進一步提高使用0.22 μm過濾器對玻尿酸衍生物組合物水溶液進行滅菌過濾時之過濾性。 (B)含極性基化合物之含量可藉由氣相層析-質譜分析(GC-MS)法測定，具體而言，可依據後述實施例中記載之方法進行測定。
作為上述(B)含極性基化合物，較佳為包含具有至少一個羥基之化合物，較佳為包含醇。醇於生理食鹽濃度下發揮作為(A)玻尿酸衍生物之凝集促進劑之功能，提昇(A)玻尿酸衍生物於生理食鹽濃度下之沈澱形成能力。醇之中，水溶性化合物較多，又，與甾基骨架之相容性良好，固醇化合物之溶解性相對較高。因此，認為若使(A)玻尿酸衍生物分散於水中，則自發地形成奈米級凝膠，藉由包含醇，膽固醇域之流動性變高，易促進奈米級凝膠彼此之物理交聯。故認為，藉由包含微量之醇，易促進奈米凝膠間之凝集，生理食鹽濃度下之沈澱形成能力提昇。
作為上述醇，可為單醇，亦可為多元醇。作為單醇，例如可例舉：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇(異丙醇)、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、1-戊醇、2-戊醇、異戊醇、1-己醇、2-己醇、1-庚醇、1-辛醇、2-乙基-1-己醇、3,3,5-三甲基-1-己醇、十三碳醇、十五碳醇、棕櫚醇、硬脂醇、環戊醇、環己醇、甲基環己醇、三甲基環己醇等。作為多元醇，可為二元醇，亦可為三元醇。作為二元醇，例如可例舉：乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二丙二醇、新戊二醇、1,4-丁二醇、1,6-己二醇等。作為三元醇，例如可例舉：甘油、三羥甲基丙烷等。 其中，作為醇，較佳為選自由乙醇、異丙醇及多元醇所組成之群中之1種以上之醇，更佳為多元醇，進而較佳為乙二醇。
(B)含極性基化合物較佳為具有複數個極性基之多官能化合物。於該情形時，促進玻尿酸彼此之氫鍵結、此處指奈米級凝膠間之氫鍵結，因此成為易凝集之狀態，存在生理食鹽濃度下之沈澱形成能力提昇之傾向。
作為含有羧基之(B)含極性基化合物，可例舉：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等C1-12 之可具有支鏈之烴酸、苯甲酸等具有芳香族基之羧酸化合物。又，作為多官能羧酸化合物，可例舉：草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸等。就促進凝集狀態之觀點而言，較佳為包含多官能羧酸化合物。具有羧基與羥基之化合物、例如水楊酸等亦具有複數個能夠與氫鍵結之官能基，故較佳。
作為含有胺基之(B)含極性基化合物，就與(A)玻尿酸衍生物之羧基產生相互作用之觀點而言，可使用一級、二級、三級胺化合物，藉由鹽交換，亦可使用四級銨鹽。 作為胺化合物，可例舉：甲基胺、乙基胺、正丙基胺、丁基胺、二甲基胺、二乙基胺、二正丙基胺、三甲基胺、三乙基胺、三正丙基胺等含有C1-12 之可具有支鏈之烴基的一級至三級胺化合物，氟化四甲基銨、氯化四甲基銨、溴化四甲基銨、碘化四甲基銨、氟化四乙基銨、氯化四乙基銨、溴化四乙基銨、碘化四乙基銨、氟化四正丙基、氯化四正丙基、溴化四正丙基、碘化四正丙基、氟化四正丁基、氯化四正丁基、四溴化正丁基、碘化四正丁基等含有C1-12 之可具有支鏈之烴基的四級銨鹽。
作為含有醯胺基之(B)含極性基化合物，可例舉：C1-12 之可具有支鏈之烴酸與含有C1-12 之可具有支鏈之烴基的一級或二級胺化合物之縮合化合物。例如可例舉：N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺。另外，亦可使用β-內醯胺、γ-內醯胺、δ-內醯胺等環狀醯胺化合物。
作為含有硫醇基之(B)含極性基化合物，可例舉：例如甲硫醇、乙硫醇、正丙硫醇等含有C1-12 之可具有支鏈之烴基的化合物。
另外，作為(B)含極性基化合物，亦可使用尿素等含有脲基之化合物、或含有胺基甲酸酯基之化合物。
＜玻尿酸衍生物組合物之製造方法＞ 本實施方式之玻尿酸衍生物組合物可藉由在製造(A)玻尿酸衍生物後，於該(A)玻尿酸衍生物中添加(B)具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物等而製造。
首先，作為(A)玻尿酸衍生物之製造方法，例如將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺，並導入甾基，藉此獲得(A)玻尿酸衍生物。又，藉由相對於原料之玻尿酸或其衍生物，調整所反應之具有甾基之化合物之調配量，可使甾基導入率成為0.1%以上且未達35%。
作為將葡萄糖醛酸之羧基轉化為醯胺並導入甾基之方法，具體而言，例如可例舉如下方法：使原料之玻尿酸或其衍生物、較佳為僅由重複單元(II)構成之玻尿酸或其衍生物與四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)進行離子交換，於存在適宜之縮合劑之狀態下，於溶劑中，使該玻尿酸鹽與式：「HNRa -Y-NRb -R、NHRa -Y-NRb -COO-R、HNRa -Y-NRb -COO-R、HNRa -Y-NRb -CO-R、HNRa -Y-NRb -CO-NRc -R、HNRa -Y-COO-R、HNRa -Y-O-COO-R、HNRa -Y-S-R、HNRa -Y-CO-Ya -S-R、HNRa -Y-O-CO-Yb -S-R、HNRa -Y-NRb -CO-Yb -S-R、HNRa -Y-S-S-R或-Z-NRa -Y-NRb -COO-R(式中，Ra 、Rb 、Rc 、Y、Ya 、Yb 、Z及R如本說明書中已作定義)」所表示之導入有甾基(尤其是膽固醇基)之胺進行反應。
上述反應中可使用之縮合劑並無特別限定，例如可例舉：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤)-4-甲基嗎啉鎓(DMT-MM)、N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、2-苯并三唑-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三𠯤(HODhbt)、苯并三唑-1-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基胺基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺(EDC)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)等。
就於水及有機溶劑之混合溶劑中反應亦高效率地進行之方面而言，較佳為DMT-MM，但並無特別限定。又，藉由使用DMT-MM作為縮合劑，於多個羥基共存之系統中，可抑制酯鍵形成，且可高選擇性地由胺基與羧基形成醯胺鍵。藉由使用該縮合劑，可防止以下情況：例如作為溶劑之醇與玻尿酸部分之羧基反應，或玻尿酸部分同時存在之羧基與羥基於分子內或分子間鍵結而形成意外之交聯。
作為甾基導入反應中使用之溶劑，可例舉：水、DMSO(Dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇、多元醇、乙腈、DMF(Dimethylformamide，二甲基甲醯胺)、THF(Tetrahydrofuran，四氫呋喃)、二氯甲烷、氯仿、己烷、二乙醚、乙酸乙酯、及該等之混合溶劑等。作為多元醇，可例舉與上述醇中之例示相同者。
或者，亦可使原料之玻尿酸或其衍生物與四烷基銨鹽(例如四丁基銨(TBA)鹽)進行離子交換，於存在適宜之縮合劑之狀態下，於溶劑中，使該玻尿酸鹽與間隔基部分進行反應(此時可視需要進行保護及脫保護反應)，而使原料之玻尿酸或其衍生物之羧基(-COOH)發生轉化，其後與適宜之試劑反應。以下例示由羧基衍生之基與反應試劑之組合例。 -CONRa -Y-NRb H＋Hal-R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-COOR； -CONRa -Y-NRb H＋HOCO-R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-CO-R； -CONRa -Y-NRb -COOH＋HNRc -R； -CONRa -Y-NRb -CO-NRc H＋Hal-R； -CONRa -Y-NRb H＋HOCO-NRc -R； -CONRa -Y-NRb H＋Hal-CO-NRc -R； -CONRa -Y-COOH＋HO-R； -CONRa -Y-OH＋Hal-COO-R； -CONRa -Y-OCOOH＋HO-R； -CONRa -Y-OCOOH＋Hal-R； -CONRa -Y-OCO-Hal＋HO-R； -CONRa -Y-SH＋Hal-R； -CONRa -Y-Hal＋HS-R； -CONRa -Y-CO-Ya -Hal＋HS-R； -CONRa -Y-CO-Ya -SH＋Hal-R； -CONRa -Y-O-CO-CH=CH2 ＋HS-R； -CONRa -Y-NRb -CO-CH(CH3 )=CH2 ＋HS-R； -CONRa -Y-SH＋HS-R； -COZ-OH＋HNRa -Y-NRb -COO-R； -COZ-NRa -Y-NRb H＋Hal-COO-R (式中，Ra 、Rb 、Rc 、Y、Ya 、Yb 及Z如本說明書中已作定義，Hal表示選自由氟原子、氯原子、溴原子及碘原子所組成之群中之鹵素原子)。
作為反應樣式，可例舉：脫鹵化氫反應、縮合反應、脫水反應、麥可加成等親核加成反應、氧化形成二硫化物之反應等，該等為周知反應，業者可適當選擇以發現較佳之反應條件來進行反應。於轉化體或反應物具有羧基之情形時，亦可將其變為N-羥基琥珀醯亞胺(以下亦稱為「NHS」)酯後再進行反應。
又，可例舉如下方法：使原料之玻尿酸或其衍生物之羧基與2-胺基乙基2-吡啶二硫醚反應，製備導入有末端具有經脫離基修飾之巰基之間隔基的玻尿酸衍生物，使其與硫代膽固醇進行親核取代反應，而形成雙硫鍵。
進而，亦可例舉如下方法：製備於玻尿酸或其衍生物之羧基導入有間隔基之一部分者、及於甾基導入有間隔基之一部分者，使該等反應。一部分具體例如上所述，進而於Y中插入有-S-S-之情形時，亦可例舉如下方法：分別製備於玻尿酸之羧基導入有末端具有巰基之間隔基之玻尿酸衍生物、及導入有末端具有巰基之間隔基之甾基，使該等發生氧化反應，而形成雙硫鍵。此時，亦可於使一者之巰基與2-巰基吡啶反應而製成二硫化物後，與另一者之巰基進行取代。
又，製備本發明之玻尿酸衍生物後，亦可進而導入其他取代基。例如，亦可藉由將實質上由重複單元(I)及重複單元(II)構成之玻尿酸衍生物中之羧基之0.1%以上99.5%以下、較佳為10%以上40%以下轉化成-CO-Xz ，而使分子內或包含其他分子之分子間交聯而凝膠化。 [此處，Xz 選自由下述基所組成之群： -NH-(CH2 )p1 -O-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 )p1 -O-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 )p1 -NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-(CH2 )r -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(NH2 )-CH2 -SH； -NH-(CH2 )p1 -NH-CO-CH(NH2 )-(CH2 )2 -SH； -NH-NH-CO-(CH2 )4 -CO-NH-NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -O-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -O-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-C(R17 )=CH2 ； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-C(=NH)-(CH2 )3 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-(CH2 )r -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(R17 )-CH2 -S-CH2 -CH(OH)-CH(OH)-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(NH2 )-CH2 -SH； -NH-(CH2 -CH2 -O)q -CH2 -CH2 -NH-CO-CH(NH2 )-(CH2 )2 -SH； -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )-SH； -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )2 -SH；及 -NH-CH(CO2 H)-(CH2 )2 -CONH-CH(CONH-CH2 -CO2 H)-CH2 -SH (此處，R17 表示氫原子或C1-6 烷基，p1表示2以上10以下之整數，q表示1以上200以下之整數，r表示1以上3以下之整數)]
藉由化學交聯使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟可適當選擇其條件。所謂交聯之條件，包括交聯方法、聚合物濃度、交聯劑濃度、溶劑、溶劑pH值、鹽濃度、溫度、時間等。
於使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中，藉由增大形成交聯之反應條件中之例如化學交聯時之聚合物濃度及提昇可形成交聯之基之導入率，能夠提高所生成凝膠之交聯密度。
關於使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中之交聯劑濃度，於使用兩端具有可形成交聯之基者之情形時，較佳為以如該基不會過多或不足而可快速參與交聯反應之濃度添加。例如，於使用DTT(dithiothreitol，二硫蘇糖醇)，藉由麥可加成反應使導入有甲基丙烯醯基(MA基)之聚合物交聯之情形時，較佳為MA基：SH基＝3：1～1：3，尤佳為2：1～1：2。
使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟中之溶劑較佳為可使聚合物及交聯劑充分溶解者，並無特別限定，較佳為使用水、二甲基亞碸(DMSO)、二甲基乙醯胺(DMAc)、二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基吡咯啶酮(NMP)及選自該等中之混合溶劑。又，亦可於該等溶劑中混合使用可溶混之有機溶劑。作為可溶混之有機溶劑，例如可例舉：甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、多元醇、丙酮、乙腈等，但並無特別限定。作為多元醇，可例舉與上述「醇」中之例示相同者，其中，較佳為乙二醇。
(A)玻尿酸衍生物由於在水溶液中形成奈米微粒子，故藉由在稀薄條件下交聯，可形成奈米尺寸之微粒子凝膠，可用作血中緩釋載體、標靶載體。稀薄條件係指10 mg/mL以下，較佳為5 mg/mL以下，進而較佳為1 mg/mL以下。另一方面，藉由在高濃度條件下交聯，可形成微粒子彼此交聯之塊狀凝膠。其可用作皮下緩釋型載體。高濃度條件係指5 mg/mL以上，較佳為20 mg/mL以上，進而較佳為40 mg/mL。
使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟可於塊體狀態下進行，亦可於乳液中或噴霧液滴中等不連續相中進行。例如，於W/O乳液中進行之情形時，使溶解有聚合物或交聯劑等之水相於不可與水溶混之溶劑中乳化，進行凝膠化反應即可。不可與水溶混之溶劑並無特別限定，例如可例舉：己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、中長鏈三酸甘油酯(MCT)、液態石蠟、大豆油等。亦可添加用以使乳化保持穩定之界面活性劑。又，例如亦可於超臨界二氧化碳中或PEG中等能夠脫溶劑之溶劑中進行。於該情形時，藉由使溶解有聚合物或交聯劑等之水相或有機溶劑相於前例之溶劑中進行乳化、分散，實現了伴有脫溶劑(溶劑擴散)之聚合物濃縮，因此可獲得更高交聯密度之凝膠。
亦可進行如下步驟及操作，即，使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟，及其後中止交聯反應之操作以及使殘存之交聯性官能基失活或洗淨去除之操作。就安全性之觀點、保存中穩定性之觀點、與所封入藥物之副反應等觀點而言，較佳為將未參與反應之交聯性官能基、僅交聯劑之一端所鍵結之基、殘存之交聯劑等去除。例如於殘存未反應之交聯劑之情形時，可藉由利用過量之水等洗淨而去除，但並無特別限定。又，例如於殘存聚合物上取代之甲基丙烯醯基之情形時，可藉由添加過量之巰基乙醇等使甲基丙烯醯基失活後，利用過量之水等將剩餘之巰基乙醇洗淨而去除。進而，例如於巰基殘存之情形時，可藉由添加過量之3-順丁烯二醯亞胺基丙酸、碘乙酸等使巰基失活後，利用過量之水等將剩餘之3-順丁烯二醯亞胺基丙酸、碘乙酸洗淨而去除。
於使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟後，亦可進行粉碎步驟。作為粉碎方法，可例舉：使用研杵與研缽之粉碎、或使用研磨機之粉碎，較佳為使用研磨機之粉碎。作為研磨粉碎裝置，可例舉：離心式粉碎機(日本精機制作所)及衝擊式研磨機(DALTON股份有限公司)等旋轉圓板型粉碎裝置、霧化器(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、樣品研磨機(Sample Mill)(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、小型磨機(TOKYO ATOMIZER M.F.G. CO.,LTD.)、及SK Mill(TOKKEN公司)等篩磨機之粉碎裝置、超微少量實驗室噴氣磨機(Lab Jet Mill)(A-O噴射磨機，Seishin Enterprise Co., Ltd)等噴射粉碎裝置、以及能夠進行超低溫粉碎之Linlex Mill(Liquid Gas Co., Ltd.)等，較佳為SK Mill及Linlex Mill。
於使(A)玻尿酸衍生物凝膠化之步驟後，亦可進行乾燥步驟。作為乾燥方法，例如可例舉：通風乾燥、於恆溫槽中之乾燥、減壓乾燥、熱風循環式乾燥等。風速、乾燥時間、溫度、壓力等可於不會使(A)玻尿酸衍生物之凝膠發生分解或變質之範圍內適當選擇。
於上述(A)玻尿酸衍生物之製造中，源自製造時使用之溶劑之(B)含極性基化合物有殘存之情形時，可不添加(B)含極性基化合物而獲得玻尿酸衍生物組合物。或者以使(B)含極性基化合物之含量成為所需量之方式，於上述(A)玻尿酸衍生物之製造後，添加(B)含極性基化合物，藉此可獲得玻尿酸衍生物組合物。於添加(B)含極性基化合物之情形時，較佳為於上述乾燥步驟之前添加。
≪醫藥組合物≫ 本實施方式之醫藥組合物包含藥物與載體，且包含上述玻尿酸衍生物組合物作為載體。於本實施方式之醫藥組合物中，載體與藥物較理想為藉由氫鍵、離子鍵、范德華力等非共價鍵等直接地結合或間接地結合而形成複合體，處於未相互游離之狀態。於向生物體內投予該醫藥組合物時，藥物緩慢地自載體釋出，可期待良好之緩釋性。
本實施方式之醫藥組合物中，較佳為藥物與作為載體之玻尿酸衍生物組合物中之(A)玻尿酸衍生物形成複合體。認為於溶劑中，藉由(A)玻尿酸衍生物之甾基與系統中存在之藥物之疏水性相互作用而自發地締合，藉此形成藥物與(A)玻尿酸衍生物之複合體。藉由形成該複合體，有望提高該藥物之保存穩定性或維持生物活性、改善緩釋性等。
＜藥物＞ 作為本實施方式之醫藥組合物中包含之藥物，並無特別限定，例如可例舉：蛋白質、肽、多糖類、核酸、低分子化合物等。本實施方式之醫藥組合物中，較佳為具有藥理活性之蛋白質、肽、核酸等生物醫藥品或低分子化合物以與玻尿酸衍生物組合物中之(A)玻尿酸衍生物形成複合體之形式包含。
[低分子化合物] 作為低分子化合物，例如可例舉：抗癌劑(例如烷基化劑、抗代謝劑、生物鹼等)、免疫抑制劑、抗炎症劑(類固醇劑、非類固醇劑系抗炎症劑等)、抗風濕劑、抗菌劑(β-內醯胺系抗生素、胺基糖苷系抗生素、大環內酯系抗生素、四環素系抗生素、新喹諾酮系抗生素、磺胺劑等)等。
[蛋白質及肽] 作為蛋白質及肽，例如可例舉：紅血球生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素-α、β、γ、(INF-α、β、γ)、血小板生成素(TPO)、睫狀神經營養因子(CNTF)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子結合蛋白(TNFbp)、介白素-10(IL-10)、FMS樣酪胺酸激酶(Flt-3)、生長激素(GH)、胰島素、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、血小板衍生生長因子(PDGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、腦源性神經營養因子(BDNF)、角質形成細胞生長因子(KGF)、幹細胞因子(SCF)、巨核細胞生長發育因子(MGDF)、骨保護素(OPG)、瘦體素、甲狀旁腺激素(PTH)、鹼性成纖維細胞生長因子(b-FGF)、骨塑型蛋白(BMP)、心房利鈉肽(ANP)、腦利鈉肽(BNP)、C型利鈉肽(CNP)、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、抗體、雙抗體、微型抗體、片段化抗體等。
[核酸] 作為核酸，例如可例舉：DNA、RNA、反義核酸、誘餌核酸、核酶、低分子干擾RNA、核酸適體等。
[多糖類] 作為多糖類，例如可例舉：蘑菇多糖、裂褶菌多糖、茯苓多糖、石耳多糖、酵母葡聚糖、酵母甘露聚糖、海拿登(Marinactan)、卡德蘭多糖、硫酸葡聚糖、肝素、卡拉膠、菊糖、軟骨素、硫酸軟骨素等。
＜形態＞ 本實施方式之醫藥組合物可為分散性微粒子溶液，亦可為沈澱性懸浮液，亦可為冷凍乾燥體。於分散性微粒子溶液之情形時，可成為具有如下優點之沈澱型緩釋製劑：於向體內投予前為溶液狀態，並且藉由體內投予(例如皮下投予)則在投予後於體內之投予部位凝集。於沈澱性懸浮液之情形時，可成為具有活性成分不易被突釋(burst release)之優點之沈澱型緩釋製劑。於該情形時，就亦可賦予通針性之方面而言，沈澱物之大小較佳為200 μm以下，更佳為100 μm以下，進而較佳為20 μm以下。又，於冷凍乾燥體之情形時，可成為如下類型之沈澱型緩釋製劑：由醫生於投予前添加生理鹽水等等張液而即時製備投予液。認為該情形適合包含於溶液狀態下不穩定之活性成分之醫藥組合物。
於本實施方式之醫藥組合物為分散性微粒子溶液或沈澱物懸浮液之情形時，醫藥組合物中之(A)玻尿酸衍生物之濃度較佳為1 mg/mL以上200 mg/mL以下，更佳為4 mg/mL以上100 mg/mL以下，進而較佳為4 mg/mL以上50 mg/mL以下，尤佳為4 mg/mL以上12 mg/mL以下。藉由使醫藥組合物中之(A)玻尿酸衍生物之濃度為上述下限值以上，存在可使生理食鹽濃度下之沈澱形成能力變得更優異，可進一步增大藥物之投予量之傾向。另一方面，藉由使醫藥組合物中之(A)玻尿酸衍生物之濃度為上述上限值以下，存在使用注射針向生物體內投予時之可注射性進一步提高，且滅菌過濾性進一步提高之傾向。
≪玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物≫ 本實施方式之玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物包含上述玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物與1種以上之藥物，上述1種以上之藥物結合於上述玻尿酸衍生物組合物中包含之(A)玻尿酸衍生物。
適用於形成本實施方式之玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物之藥物為蛋白質、肽、核酸等生物醫藥品或低分子化合物。
本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物不限定於上述說明之形態，亦可為奈米微粒子、微米微粒子、溶液、乳液、懸浮液、凝膠、微胞、植體、粉末、或膜之形態。關於粉末，可將藉由冷凍乾燥或噴霧乾燥獲得之固體加以粉碎而製造，亦可由將沈澱物乾燥所得者來製造。
本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物可經由經口、腸道外、鼻腔內、陰道內、眼內、皮下、靜脈內、肌肉內、皮內、腹腔內、腦內或口腔內之路徑來投予。又，本實施方式之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物不限定於注射劑，亦可為貼附製劑或微針製劑、塗抹藥、滴眼藥、噴霧藥、吸入藥等。 [實施例]
以下，藉由實施例來詳細地說明本發明，但該等並非意在將本發明之範圍限於實施例。
實施例及比較例中所製造之玻尿酸衍生物組合物之各物性之測定方法及評價方法如下所述。
[物性1] (玻尿酸衍生物之分子量) 玻尿酸衍生物之分子量係利用尺寸排除層析-多角度光散射檢測器(SEC-MALS)所確定之重量平均分子量。使玻尿酸衍生物組合物(20 mg)溶解於超純水(10 mL)，於室溫下攪拌12小時以上，而獲得玻尿酸衍生物組合物水溶液(2 mg/mL)。對於該玻尿酸衍生物組合物水溶液(750 μL)添加300 mM羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)水溶液(750 μL)，使用振盪機進行10秒混合，於37℃下培養1小時。進而，將所獲得之試樣供於SEC-MALS測定來確定重量平均分子量。以下揭示SEC-MALS測定之條件。
(測定條件) 管柱：TSKgel GMPWXL(Tosoh股份有限公司製造)2根 管柱溫度：30℃ 溶離液：添加有10 mM HP-β-CD之磷酸緩衝生理鹽水(pH值7.4) 流速：1 mL/min 注入量：200 μL
[物性2] (甾基導入率) 玻尿酸衍生物之甾基導入率係藉由1 H-NMR測定來確定。首先，將二甲基亞碸-d6 (99.9 v/v%，含有0.05 v/v%之三甲基矽烷(TMS)，FUJIFILM Wako公司製造)與20%氘代鹽酸(99.5 v/v%，FUJIFILM Wako公司製造)以質量比99：1進行混合，而製備測定溶劑。繼而，於該測定溶劑(0.6 mL)中添加玻尿酸衍生物組合物(2 mg)，利用超音波浴進行30分鐘處理使之完全溶解後，供於1 H-NMR測定。1 H-NMR測定係使用傅立葉變換核磁共振裝置(FT-NMR裝置)(ECS400，日本電子製造)，於試樣溫度85℃下實施。甾基導入率係由源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)之積分值、與源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)之積分值，使用以下所示之式，算出膽固醇基相對於玻尿酸單元之導入率。再者，源於膽固醇基之波峰(5H)重疊在包含源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰在內之1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰上，因此，採用自1.6 ppm以上2.0 ppm以下附近之波峰之積分值中減去將源於膽固醇基甲基之波峰(0.7 ppm)之積分值乘以5/3倍所得者而算出之值(即，積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)－積分值(0.7 ppm)×5/3)作為源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰之積分值，用於計算甾基導入率。
[甾基導入率(%)] ＝[(源於膽固醇基中之甲基的波峰積分值)/(源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰積分值)]×100 ＝[積分值(0.7 ppm)/｛積分值(1.6 ppm以上2.0 ppm以下)－積分值(0.7 ppm)×5/3｝]×100
[物性3] (含極性基化合物之含量) 玻尿酸衍生物組合物中之(B)含極性基化合物之含量係藉由氣相層析-質譜分析(GC-MS)法進行測定。 首先，將玻尿酸衍生物組合物(16.0 mg)添加至超純水(2.0 mL)中，攪拌12小時以上使之溶解，而獲得8.0 mg/ mL之玻尿酸衍生物組合物水溶液。其後，將獲得之水溶液供於GC-MS測定，藉由外部標準法求出測定試樣中之(B)含極性基化合物之含量。其後，算出測定試樣中之(B)含極性基化合物相對於所添加之玻尿酸衍生物量的質量比，作為相對於玻尿酸衍生物之(B)含極性基化合物之含量。定量分析所需之校準曲線係使用市售樣品製得。以下揭示GC-MS測定之條件。
(測定條件) GC裝置：Agilent Technologies，7890A 管柱：DB-624(60 m×0.25 mmΦ)、膜厚1.40 μm 管柱溫度：50℃(5分鐘)→以20℃/min之速度升溫→158℃(2分鐘)→以3℃/min之速度升溫→180℃(0分鐘)→以20℃/min之速度升溫→250℃(5.8分鐘) 流速：1 mL/min 注入口溫度：250℃ 分流比：1/50
於有些定量之化合物為50質量ppm以下之情形時，採用以下之方法。 (測定條件：乙二醇之情形) 將0.1 g玻尿酸衍生物裝入玻璃管中，於200℃下進行10分鐘加熱脫附，於-130℃下捕集揮發成分。其後，將冷卻後之捕集器於250℃下迅速加熱，進行GC-MS測定。 於相同條件下測定已知濃度之乙二醇標準品，由檢測峰面積值來製作校準曲線。根據校準曲線，算出試樣中之乙二醇之質量。其後，算出試樣中之乙二醇相對於所使用之(A)玻尿酸衍生物之質量的質量比，作為相對於(A)玻尿酸衍生物之(B)含極性官能基化合物之含量。 加熱脫附裝置：GERSTEL TDU，CIS4 脫附溫度：200℃ 脫附時間：10分鐘 分流：不分流 冷集溫度：-130℃ 注入溫度：250℃ CIS襯墊：Tenax(GL Science公司) GC裝置：Agilent Technologies 7890 管柱：GL Science DB-WAX(30 m×0.25 mmΦ、膜厚0.25 mm) 溫度條件：40℃(5分鐘)→20℃/min→250℃(保持5分鐘) MS裝置：Agilent Technology 7000 離子化：EI 70 eV 離子源溫度：250℃ 掃描範圍：SIM(m/z33) 於異丙醇及乙醇之情形時，將溫度條件設為50℃(5分鐘)→10℃/min→240℃(保持6分鐘)，除此以外，與乙二醇同樣地測定。
[評價1] (沈澱率) 玻尿酸衍生物組合物之沈澱率係藉由以下所示之順序來確定。首先，製備添加有600 mM氯化鈉之40 mM磷酸緩衝液(pH值7.4)(稱為濃縮緩衝液)。其次，於玻尿酸衍生物組合物中添加超純水，攪拌12小時以上使之溶解而獲得玻尿酸衍生物組合物水溶液。使該水溶液流入過濾管(孔徑：5.0 μm；UFC40SV25；Merck公司製造)而供於離心分離機進行過濾處理。繼而，製備如下試樣：混合有過濾後之玻尿酸衍生物水溶液(600 μL)與濃縮緩衝液(200 μL)之沈澱形成試樣(N數：3)、及混合有過濾後之玻尿酸衍生物水溶液(600 μL)與超純水(200 μL)之參考試樣(N數：2)。其後，將沈澱形成試樣及參考試樣於37℃下培養20分鐘，其後供於離心分離機(2,000×g、10分鐘)。離心分離後採集試樣各自之上清液200 μL，均添加300 mM羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)水溶液(200 μL)進行2倍稀釋後，於37℃下培養2小時。進而，對全部試樣添加10 mM HP-β-CD水溶液(1000 μL)進行稀釋，利用針筒過濾器(孔徑：0.45 μm)進行處理。進而，將獲得之沈澱形成試樣及參考試樣供於尺寸排除層析(SEC)測定。玻尿酸衍生物組合物之沈澱率係使用沈澱形成試樣及參考試樣之SEC層析圖中，源於玻尿酸衍生物的波峰(7分鐘附近)之面積值，基於下式而算出。
[沈澱率](%) ＝[1－(沈澱形成試樣中之源於玻尿酸衍生物的波峰之面積值)/(參考試樣中之源於玻尿酸衍生物的波峰之面積值)]×100
此處，沈澱形成試樣中之源於玻尿酸衍生物的波峰之面積值係使用三次(N＝3)製備之沈澱形成試樣各自之面積值之平均值，參考試樣中之源於玻尿酸衍生物的波峰之面積值係使用兩次(N＝2)製備之參考試樣各自之面積值之平均值。再者，以下揭示SEC測定之條件。
(測定條件) 管柱：TSKgel G4000SWXL(Tosoh股份有限公司製造) 管柱溫度：35℃ 溶離液：添加有10 mM HP-β-CD之磷酸緩衝生理鹽水(pH值7.4) 流速：1 mL/min 注入量：90 μL 檢測：示差折射率檢測器(RI檢測器)或紫外檢測器(UV檢測器)
[評價2] (滅菌過濾性) 滅菌過濾性係根據利用0.22 μm過濾器對玻尿酸衍生物組合物水溶液進行處理時之過濾最大量來評價。即，使玻尿酸衍生物組合物溶解於超純水而使之成為0.9 mg/mL，利用0.22 μm過濾器(Stericup-GP S2GPU05RE，有效過濾面積40 cm2 ，Merck公司製造)對獲得之玻尿酸衍生物組合物水溶液持續進行過濾，直至膜堵塞而無法再使水溶液通過。然後，測定過濾後之玻尿酸衍生物組合物水溶液之體積，計算單位有效過濾面積之過濾後之玻尿酸衍生物組合物水溶液之體積，作為過濾最大量。
＜玻尿酸衍生物組合物之製造＞ [實施例1] (玻尿酸衍生物組合物HA-a1之製造) 依據以下之步驟1～步驟3，製備玻尿酸衍生物組合物。
1.步驟1 (6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之合成) 依序按照以下所示之步驟1-1、及步驟1-2，合成6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)。
(1)步驟1-1 於氯甲酸膽固醇酯(3.37 g、7.5 mmol)之無水二氯甲烷(20 mL)之溶液中，於氬氣氛圍下，添加三乙胺(TEA，1.05 mL)進行攪拌。於冰浴冷卻下滴加6-(第三丁氧基羰基)胺基-1-胺基己烷(1.12 mL、5 mmol)，直接於冰浴冷卻下攪拌30分鐘後，升溫至室溫，將該混合物攪拌一夜。利用超純水及飽和鹽水將反應混合物洗淨，經無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下蒸餾去除溶劑。藉由矽膠管柱層析(溶離液：乙酸乙酯：正己烷＝1：4)精製所獲得之殘渣，將目標物之溶出分進行合併，於減壓下蒸餾去除溶劑。
(2)步驟1-2 使所獲得之殘渣溶解於乙酸乙酯(40 mL)，添加4N鹽酸/乙酸乙酯溶液(40 mL)，於室溫下攪拌一夜。藉由離心分離來回收所生成之沈澱物。利用乙酸乙酯將獲得之固體清洗4次後，於減壓下乾燥，而獲得6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽(Chol鹽酸鹽)1.2 g。將生成物之1 H-NMR圖譜(CS400 日本電子製造，EtOH-d6 )示於圖1。
2.步驟2 (玻尿酸之四丁基銨(TBA)鹽之製備) 依序按照以下所示之步驟2-1、及步驟2-2，製備玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。
(1)步驟2-1 使DOWEX(註冊商標)50WX-8-400(Aldrich公司製造)懸浮於超純水，藉由傾析法利用超純水將樹脂清洗3次左右。添加約為樹脂之陽離子交換能之1.5倍莫耳當量之40質量%氫氧化四丁基銨水溶液(TBA-OH)(Aldrich公司製造)，攪拌30分鐘。藉由傾析法去除剩餘之TBA-OH溶液後，進而利用過量之超純水洗淨，藉此獲得經TBA鹽化之陽離子交換樹脂。
(2)步驟2-2 使分子量50,000(50 kDa)之原料玻尿酸鈉鹽(HA-Na)以濃度15 mg/mL溶解於超純水。添加相對於HA單元(單元分子量401.3)之莫耳數，以樹脂之離子交換能換算為5倍莫耳當量的「(1)步驟2-1」中經TBA鹽化之陽離子交換樹脂之懸浮液。攪拌15分鐘後，使用0.45 μm之過濾器進行過濾，將濾液冷凍乾燥，而獲得為白色固體之玻尿酸之TBA鹽(HA-TBA)。將生成物之1 H-NMR圖譜(ECS400 日本電子製造，EtOH-d6 )示於圖2。
3.步驟3 製備「2. (2)步驟2-2」所製備之HA-TBA之無水DMSO溶液(10 mg/mL)。其後，以相對於HA-TBA中存在之二糖重複單元(HA單元)，按莫耳比(Chol鹽酸鹽/HA單元)計為15/100之方式添加「1.步驟1」中合成之Chol鹽酸鹽。其次，以相對於HA單元，按莫耳比(DMT-MM/HA單元)計為21.6/100之方式添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三𠯤-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMT-MM)，於室溫下攪拌一夜。依序利用0.3 M乙酸氨/DMSO溶液、0.15 M NaCl水溶液、超純水，對反應溶液進行透析(Spectra/Por4(Spectrum公司製造)，區分分子量(MWCO)：12,000以上14,000以下)。於所獲得之透析液中，以組合物中之含量成為0.0062質量ppm之方式添加乙二醇(EG)，其後進行冷凍乾燥，而獲得為白色固體之目標物(HA-C6 -Chol)。將生成物之1 H-NMR圖譜示於圖3。確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
[實施例2～25及比較例1～2] (玻尿酸衍生物組合物HA-a2～HA-a25及HA-b1～HA-b2之製造) 於「3.步驟3」中，使Chol鹽酸鹽相對於HA單元之添加量、及DMT-MM相對於HA單元之添加量以莫耳比計成為下表所示之比率，將醇之種類及(B)含極性基化合物相對於(A)玻尿酸衍生物之含量設為下表所示，除此以外，採用與實施例1相同之方法，獲得各玻尿酸衍生物組合物。對所獲得之玻尿酸衍生物組合物之進行1 H-NMR測定，於各玻尿酸衍生物組合物所含之玻尿酸衍生物中，均確認到源於N-乙醯基-D-葡糖胺之乙醯基的波峰(COCH3 ，1.6 ppm以上2.0 ppm以下，3H)、源於膽固醇基中之甲基的波峰(CH3 ，0.7 ppm，3H)。
再者，下述表中，醇之種類及簡稱如下所示。 (醇之種類及簡稱) 異丙醇：IPA 乙醇：EtOH
針對實施例及比較例中獲得之玻尿酸衍生物組合物，採用上述方法，測定各物性，進行各種評價。將結果示於下表。
[表1]
   實施例1 實施例2 實施例3 實施例4 實施例5
HA衍生物組合物 HA-a1 HA-a2 HA-a3 HA-a4 HA-a5
組 成 HA之分子量 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 15 15 15
醇之種類 EG EG EG EG IPA
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 0.0062 10 60 99 0.0062
評 價 HA衍生物組合物之沈澱率(%) 85.4 85.5 86.2 85.6 74.5
[表2]
   實施例6 實施例7 實施例8 實施例9 實施例10
HA衍生物組合物 HA-a6 HA-a7 HA-a8 HA-a9 HA-a10
組 成 HA之分子量 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 15 15 15
醇之種類 IPA IPA IPA EtOH EtOH
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 10 60 99 0.0062 10
評 價 HA衍生物組合物之沈澱率(%) 80.3 82.2 83.9 75.3 81.2
[表3]
   實施例11 實施例12 實施例13 實施例14 實施例15
HA衍生物組合物 HA-a11 HA-a12 HA-a13 HA-a14 HA-a15
組 成 HA之分子量 50 kDa 50 kDa 35 kDa 35 kDa 35 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/19/26.6 100/19/26.6 100/19/26.6
甾基導入率(%) 15 15 19 19 19
醇之種類 EtOH EtOH EG EG EG
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 60 98 0.0062 10 60
評 價 HA衍生物組合物之沈澱率(%) 82.6 85.3 90.5 91.2 90.2
[表4]
   實施例16 實施例17 實施例18 比較例1
HA衍生物組合物 HA-a16 HA-a17 HA-a18 HA-b1
組 成 HA之分子量 35 kDa 50 kDa 50 kDa 50 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/19/26.6 100/12/17.3 100/17/24.5 100/15/21.6
甾基導入率(%) 19 12 17 15
醇之種類 EG EG EG -
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 99 0.0061 0.0062 0
評 價 HA衍生物組合物沈澱率(%) 90.1 91.3 82.5 46
[表5]
   實施例19 實施例20 實施例21 實施例22 實施例23
HA衍生物組合物 HA-a19 HA-a20 HA-a21 HA-a22 HA-a23
組 成 HA之分子量 100 kDa 100 kDa 100 kDa 100 kDa 100 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/6/8.64 100/20/28.8 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 6 20 15
醇之種類 EG EG EG EG EG
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 0.0064 60 0.0064 0.0063 700
評 價 HA衍生物組合物之沈澱率(%) 48.8 46.6 50.9 25.1 50.3
過濾最大量(mL/cm2 ) 8.22    - - 1.74
[表6]
   實施例24 實施例25 比較例2
HA衍生物組合物 HA-a24 HA-a25 HA-b2
組 成 HA之分子量 100 kDa 100 kDa 100 kDa
HA單元/Chol鹽酸鹽/DMT-MM之莫耳比 100/15/21.6 100/15/21.6 100/15/21.6
甾基導入率(%) 15 15 15
醇之種類 EtOH IPA -
醇相對於HA衍生物之含量(質量ppm) 0.0064 0.0065 0
評 價 HA衍生物組合物之沈澱率(%) 24.3 23.9 12.4
過濾最大量(mL/cm2 )       -
根據上述表1～4，於玻尿酸之分子量為50 kDa之情形時，含有醇之玻尿酸衍生物組合物HA-a1～HA-a12、HA-a17及HA-a18(實施例1～12、17及18)於含有6 mg/mL之NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率良好，為74.5%以上91.3%以下。另一方面，不含醇之玻尿酸衍生物組合物HA-b1(比較例1)於含有6 mg/mL之NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率不良，為46.0%。 又，於甾基導入率不同之玻尿酸衍生物組合物HA-a1、HA-a17及HA-a18(實施例1、17及18)中發現如下傾向：甾基導入率越低，於含有6 mg/mL之NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率越佳。
根據表5～6，於玻尿酸之分子量為100 kDa之情形時，含有醇之玻尿酸衍生物組合物HA-a19～HA-a25(實施例19～25)於含有1.2 mg/mL之低濃度NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率良好，為23.9%以上50.9%以下。另一方面，不含醇之玻尿酸衍生物組合物HA-b2(比較例2)於含有1.2 mg/mL NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率不良，為12.4%。 又，於醇之含量不同之玻尿酸衍生物組合物HA-a19及HA-a23(實施例19及23)中發現如下傾向：醇之含量越少，過濾最大量越增加。 又，於醇之種類不同之玻尿酸衍生物組合物HA-a23～HA-a25(實施例23～25)中，於使用乙二醇之情形時，於含有1.2 mg/mL NaCl之濃縮緩衝液中之沈澱率良好。 [產業上之可利用性]
根據本實施方式之玻尿酸衍生物組合物，可提供於生理食鹽濃度下之沈澱形成能力優異之玻尿酸衍生物組合物、包含其之醫藥組合物及玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物。
圖1係實施例1中之6-胺基己基胺基甲酸膽固醇酯鹽酸鹽之1 H-NMR圖譜。 圖2係實施例1中之玻尿酸(HA)之四丁基銨(TBA)鹽之1 H-NMR圖譜。 圖3係實施例1中之導入有6-胺基己基胺基甲酸酯之HA衍生物(HA-C6 -Chol)之1 H-NMR圖譜。

Claims (15)

  1. 一種玻尿酸衍生物組合物，其係包含 (A)導入有甾基之玻尿酸衍生物、與 (B)具有選自由羥基、羧基、胺基、醯胺基、胺基甲酸酯基、脲基及硫醇基所組成之群中之至少一種官能基的含極性基化合物者，且 上述甾基相對於(A)玻尿酸衍生物之導入率為0.1%以上且未達35%。
  2. 如請求項1之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為具有至少一個羥基之含極性基化合物。
  3. 如請求項1之玻尿酸衍生物組合物，其中相對於上述(A)玻尿酸衍生物之質量，上述(B)含極性基化合物之含量為0.001質量ppm以上且未達1000質量ppm。
  4. 如請求項1之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為具有複數個極性基之化合物。
  5. 如請求項2之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(B)含極性基化合物為醇。
  6. 如請求項5之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇係選自由乙醇、異丙醇及多元醇所組成之群。
  7. 如請求項6之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇為多元醇。
  8. 如請求項7之玻尿酸衍生物組合物，其中上述醇為乙二醇。
  9. 如請求項1之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(A)玻尿酸衍生物具有下述通式(I)所表示之重複單元， [化1]
    Figure 03_image009
    式中，R1 、R2 、R3 及R4 分別獨立地選自由氫原子、C1-6 烷基、甲醯基及C1-6 烷基羰基所組成之群； Z表示直接鍵、或包含2個以上30個以下之胺基酸殘基之肽連接基； X1 為選自由下述式所表示之基所組成之群中之基： -NRb -R、 -NRb -COO-R、 -NRb -CO-R、 -NRb -CO-NRc -R、 -COO-R、 -O-COO-R、 -S-R、 -CO-Ya -S-R、 -O-CO-Yb -S-R、 -NRb -CO-Yb -S-R、及 -S-S-R； Ra 、Rb 及Rc 分別獨立地選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，此處，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NRf -所組成之群中之基； Rf 選自由氫原子、C1-12 烷基、胺基C2-12 烷基及羥基C2-12 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； R為甾基； Y為C2-30 伸烷基、或-(CH2 CH2 O)m -CH2 CH2 -，此處，該伸烷基可插入有選自由-O-、-NRg -及-S-S-所組成之群中之基； Rg 選自由氫原子、C1-20 烷基、胺基C2-20 烷基及羥基C2-20 烷基所組成之群，該基之烷基部分可插入有選自由-O-及-NH-所組成之群中之基； Ya 為C1-5 伸烷基； Yb 為C2-8 伸烷基或C2-8 伸烯基； m為1以上100以下之整數。
  10. 如請求項9之玻尿酸衍生物組合物，其中上述R為膽固醇基。
  11. 如請求項1之玻尿酸衍生物組合物，其中上述(A)玻尿酸衍生物之分子量為1,000以上且未達1,000,000。
  12. 一種醫藥組合物，其包含藥物與載體，且上述載體為如請求項1至11中任一項之玻尿酸衍生物組合物。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其中上述藥物與(A)玻尿酸衍生物形成複合體。
  14. 如請求項12或13之醫藥組合物，其中上述藥物為具有藥理活性之蛋白質、肽或核酸。
  15. 一種玻尿酸衍生物-藥物結合體組合物，其包含如請求項1至11中任一項之玻尿酸衍生物組合物及藥物，上述藥物結合於上述玻尿酸衍生物組合物中包含之(A)玻尿酸衍生物。
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