KR102574864B1 - 온도감응성 히알루론산 비드 겔 제조 방법 - Google Patents

온도감응성 히알루론산 비드 겔 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온도감응성 특성을 나타내는 히알루론산 비드 겔 제조 방법으로서, (a) 히알루론산 또는 그의 염을 알칼리 수용액에 넣고, 가교제를 첨가한 후 균질하게 혼합한 반응물을 반응시키는 반응 단계; (b) 상기 반응물을 오일과 함께 교반 시켜 가교 공유결합을 형성하는 가교 반응 단계; (c) 상기 가교 반응 단계에서 수득한 생성물을 정제하는 단계; 및 (d) 온도감응성 합성 고분자를 혼합하는 단계;를 포함하는 균질한 구형의 히알루론산 비드 겔 제조방법이다.
본 발명의 온도감응성 히알루론산 비드 겔 제조방법에 따르면 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형 형태의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔의 제조가 가능하며, 이와 같은 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 투명한 구형 형태로 선택된 크기와 분해 기간, 점탄성, 팽윤도를 나타내며, 생체적합성이 우수하며, 열과 효소에 대하여 매우 안정하다.

Description

온도감응성 히알루론산 비드 겔 제조 방법{A PRODUCTION METHOD OF HYALURONIC ACID BEAD GEL HAVING THERMOSENSITIVE CHARACTERISTICS}
본 발명은 가교 반응 후, 오일에 분산되어 있는 상태에서 다시 가교 반응을 통하여 히알루론산 용액이 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형 형태의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형 형태의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 유화제 및 계면활성제, 가용화제 등을 사용하지 않고, 오일과 히알루론산 용액의 비율을 조절하여 다양한 크기의 비드 겔을 안정적으로 얻을 수 있고, 수득 단계에서 구형을 유지하기 위해 외피 형성 물질인 PLGA, PCL 등의 합성고분자 첨가 방법, 이온결합을 통해서 불용성 침전물 형태로 제조하는 방법, 유기용매에서 침전하는 방법 등을 사용하지 않고, 첨가물 없이 오일상에서 분산된 히알루론산 용액에서 2단계 가교 반응을 통하여 구형을 유지한다. 또한, 오일과 미반응 물질 등 불순물을 제거하여 투명한 비드 겔로 제조하기 위해, 3단계 정제법을 적용하여 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 온도감응성 고분자를 최소로 적용하여 온도에 따른 물성 변화 특성을 부여하는 방법에 관한 것이다. 수득 된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 투명한 구형 형태로 선택된 크기와 분해 기간, 점탄성, 팽윤도를 나타내며, 생체적합성이 우수하며, 열과 효소에 대하여 매우 안정하다. 이러한 특징을 갖는 본 발명의 투명한 구형 형태의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 주름제거용 필러(filler), 성형보조물(implant), 약물전달체(drug delivery matrix), 세포전달체(cell carrier), 세포지지체(scaffold), 관절주사제, 화장품 등 다양하게 사용될 수 있다.
히알루론산(Hyaluronic acid(HA), Hyaluronan, (C14H20NNaO11)n (n>1000))은 생체에 존재하는 고분자로써 glycosaminoglycan이라는 다당류이다. 그 구조는 D-glucuronic acid와 N-acetylglucosamine이 β-1,3 과 β-1,4 결합으로 반복적으로 연결된 구조를 띠고 있다. 또한, 수용성 물질이며 점도가 매우 높고 고탄성의 특성을 가지고 있으며 분자량은 1,000~10,000,000 Da(daltons)에 이르는 광범위한 직쇄의 다당류이다.
히알루론산은 보습효과가 강하여 물리적 마찰 상태에서 강력한 윤활작용 기능이 매우 우수하고 세균 등의 침입에 대한 보호 효과 등의 효능과 물성에 있어서 매우 바람직한 장점을 보유하고 있기 때문에 미용, 의료용으로 큰 적용 범위를 가지고 있다.
이러한 히알루론산을 개발하기 위해서는 기본적으로 생체 조직 추출법이나 미생물 배양법이 사용되지만 최근에는 바이러스 침입, 불순물, 염증 반응등 많은 단점으로 인해서 닭 벼슬 추출법보다는 분자량과 생산성을 조절할 수 있고 고품질의 원료 수득이 가능한 미생물 배양생산법이 대세를 이루고 있다.
특히 미생물 배양에 의해 조절되어 생산된 히알루론산의 분자량 범위에 따라서 개발 용도가 결정되는 것이 최근의 추세이다. 즉, 10만 Da 이하의 초저분자 히알루론산은 주로 식품이나 화장품의 용도로 사용되며 평균분자량 100만Da의 저분자 히알루론산은 점안제 원료나 유도체 개발 대상으로 활용되기도 하며평균분자량 300만~400만 Da의 히알루론산은 슬관절 주사제 원료로 활용 가치가 높은 편이다.
그 외에도 안과수술보조제로의 사용도 증가하고 있으며, 신체 내의 초고분자로서 유착방지제의 원료로 각광받고 있다.
그러나, 히알루론산은 생체 내에서 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 분해가 쉽게 되고 가공성이 떨어져 이를 여러 가지 용도로 개발하는데 한계가 있어 히알루론산을 구조적으로 안정화시킨 물질을 개발하기 위한 노력이 널리 진행되고 있다 (Laurent, T.C. "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives" Portland Press Ltd, London, 1998).
가교 된 히알루론산으로 구성된 비드를 제조하는 일반적으로 널리 알려진 방법들로는 화학적 방법과 물리적 방법으로 혼합하여 사용하였으며, 비드를 분리하는 방법으로는 미세 노즐을 통해 첨전을 하거나, 외부를 지질화 및 캡슐화를 진행하는 방법, 가용화 된 생분해성 고분자를 계면활성제를 이용하여 분산 후 용매 추출 증발에 의해 수득하는 방법 등이 알려져 있다.
물리적 방법으로 입자의 균일도를 높이기 위해서는 impeller의 모양 및 교반 속도에 영향을 받는데 대부분 고속의 교반 속도를 유지해야한다. 미세 노즐을 통한 방법은 석류열매와 유사한 외관을 만들어내 완벽한 구 형태를 유지하지 못하고, 외부를 지질화 및 캡슐화를 통해 구형 비드를 수득했을 경우는 물리적 외력에 파손되어 내부의 액상이 흘러나오고, 용매 추출 증발법을 사용시 인체에 유해한 계면활성제와 유기용매가 필수적으로 사용되어 최종산물에 대한 완벽한 제거가 필요하다.
그 외 가교 된 히알루론산으로 구성된 비드를 제조하는 일반적인 방법은 양이온을 나타내는 물질을 과량 사용하여 음이온 히알루론산과의 이온결합을 통해서 불용성 침전물 형태로 제조하거나, 과량의 가교제를 사용하여 불용성 형태를 만든 후 건조하여 물리적으로 입자화 시키거나, 또는, 히알루론산의 카르복실기에 소수성 물질을 결합시켜 유기용매에 녹인 후 상 분리되는 두 개의 다른 용매에서 유화제등을 사용하여 마이크로비드를 형성시키고 용매 추출법 등으로 마이크로비드 들을 회수하는 방법을 나타나고 있다. 예로, 미국 특허 제6,066,340호, 6,039,970에서는 히알루론산의 카르복실기에 에틸알콜이나 벤질알콜을 결합 반응시켜 합성한 히알루론산 유도체를 이용한 것이 있다. 이 물질은 물에 녹지 않고 디메틸설폭사이드 같은 유기용매에 녹는다. 이 같은 소수성을 지닌 히알루론산 유도체를 사용하여 에멀젼 용매추출법으로 고체상의 마이크로비드를 제조한 예들이 있다.
또한, 키토산과 함께 비드를 제조하여 약물전달 매개체로 이용하는 연구가 이루어지고 있다 (S. T. Lim, G. P. Martin, D. J. Berry and M. B. Brown, Journal of Controlled Release, 2-3, 66(2000), 281-292, S. T. Lim, B. Forbes, D. J. Berry, G. P. Martin and M. B. Brown, International Journal of Pharmaceutics, 1, 231(2002), 73-82).
그 외, 1,3-Butadiene diepoxide에 의해 가교 된 히알루론산 비드의 제조 관련 문헌에서는 알카리 수용액에 히알루론산과 식물성 기름 혼합물을 교반 후, 1,3-butandiene diepoxide을 첨가하여 가교 반응하는 조건으로, 히알루론산 100mg에 과량의 3-butandiene diepoxide 0.4 mL(가교 반응 site 대비 약 800 mol% 정도)을 적용하여 팽윤도(Swelling, %)가 500% 전 후로 너무 단단하고 불균일한 모양을 지니고 있고, 과량의 가교제 사용으로 인해 응용분야에서 한계를 보이고 있다(Polymer(Korea), Vol.29, No.5, pp445-450, 2005).
또한, 히알루론산 미세비드를 제조하는 방법으로 미세 비드 생성장치를 통해 압축공기의 압력으로 노즐을 통해 히알루론산 수용액 방울을 교반 중인 가교액에 낙하 시켜 제조하는 방법으로, 가교제로 디비닐슬폰을 사용하여 안전성에 대한 문제가 발생 할 수 있고, 입자 간의 불균일한 모양과 균일성이 떨어지고 고가의 장비를 사용해야 하는 문제점이 존재한다(Biomaterials Research (2009) 13(3) : 105-108, Biomaterials Research (2010) 14(4) : 157-160, Chun et al, Biomaterials Research (2016) 20:24, 고분자 다당류를 주제로 한 미세구슬 및 그의 제조 방법(국내 특허 등록번호 1005489650000(2006.01.26)).
또한, -10℃ ~ -200℃의 동결 냉매에 적하 하여 고체상 구슬형 에멀젼 비드를 제조하는 방법으로 다수의 성분들이 들어가고 정제공정이 없어 응용분야 사용에 한계를 보이고 있다(저온냉각에 의한 구슬형 에멀젼 비드의 제조방법 및 수득된 구슬형 에멀젼 비드, 국내 특허 등록번호 1015532330000(2015.09.09)).
또한, BDDE에 의해 가교 된 히알루론산 비드의 제조 관련 문헌에서는 알카리 수용액에 히알루론산을 10℃에서 overnight 용해시켜 분자량 저하가 일어난 후, 과량의 BDDE(히알루론산 100mg 당 BDDE 20mg, 약 가교 반응 site 대비 약 40 mol% 정도)를 첨가 한 후, olive oil 교반 반응 후, filer를 통해 회수 하고, 70% 아세톤 수용액, distilled water (DW), PBS로 정제하는 제조 방법으로 20 ~ 30%에 가까운 높은 화학적 변형률과 낮은 팽윤도 18.99 ~ 23.02로 너무 단단하고 불균일한 모양을 지니고 있고, 응용분야에서 사용에 한계를 보이고 있다(ACS Omega 2019, 4, 9, 13834-13844, Hyaluronic Acid-Based Hybrid Hydrogel Microspheres with Enhanced Structural Stability and High Injectability).
또한, 가교제로 알렌드로네이트(ALD), 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 이루어진 군의 리간드와 가교반응을 시켜서 가교 된 히알루론산을 만들고, 이를 용해시킨 후, 다가 양이온에 떨어 뜨러 나노/마이크로비드를 제조하는 방법으로, 안전성 및 안정성에 대한 문제로 인해 응용분야 사용에 한계를 보이고 있다(히알루론산 마이크로비드의 제조 방법 및 상기 히알루론산 마이크로비드의 용도, 국내 특허 등록번호 1021085520000(2020.04.29)).
또한, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 삼원 공중합체 15~30중량%, 수불용상 히알루론산 2.5~4.5중량%(가교제 0.02~0.1중량%), 소듐알지네이트 0.1~1중량%로 구성이 된 조직유착 방지용 하이드로겔 조성물 특허가 있는데, 가교 된 히알루론산이 구형이 아닌 무정형 겔이고, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 삼원 공중합체은 일반적으로 온도감응성 특성을 보유하기 위한 일반적인 범위인 15~30중량%로 보이고 있다(온도감응성 조직유착 방지용 하이드로겔 조성물 및 그 제조방법, 국내 특허 등록번호 102093660000(2020.03.20)).
또한, 0.2~1중량% 아크릴아미드(acrylamide)-히알루론산 유도체, 15~25중량%의 플루로닉(pluronic)-F127로 구성이 된 조직유착 방지용 하이드로겔 조성물 특허가 있는데, 화학적으로 개질 된 히알루론산은 상업적으로 사용 된 사례가 없어 응용분야에 대한 사용성에 문제가 있을 수 있고, 플루로닉(pluronic)-F127은 일반적으로 온도감응성 특성을 보유하기 위한 일반적인 범위인 15~25중량%로 보이고 있다(히알루론산 유도체를 이용한 온도감응성 유착방지용 하이드로겔 및 이의 제조방법, 국내 특허 등록번호 1018719300000(2018.06.21)).
또한, 입자형 무세포 진피, 히알루론산 및 온도감응성 고분자로 구성이 된 조직유착 방지용 하이드로겔 조성물 특허가 있는데, 비가교된 히알루론산을 포함하고, 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼블록 공중합체(triblock copolymer)가 일반적으로 온도감응성 특성을 보유하기 위한 일반적인 범위인 13~25중량%로 보이고 있다(입자형 무세포 진피 기반의 온도감응성 유착방지 조성물의 제조방법, 국내 특허 등록번호 1018458850000(2018.03.30)).
하지만, 히알루론산이라는 물질은 친수성이 상당히 높은 물질로서 일반적으로 알려진 상기 방법으로 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형 비드를 제조하는 데에는 그 동안 한계를 가지고 있었다. 오일 상 내에서 수용액상의 히알루론산은 친수성이 상당히 높은 관계로 용매 증발법으로 수분을 제거하기가 어렵고, 용매추출법으로 유기용매를 첨가할 경우, 입자가 서로 엉기는 현상을 보여서 균일한 크기의 비드를 제조할 수가 없었다. 또한, 현재까지 알려진 히알루론산의 비드 제조 방법은 양이온을 나타내는 물질을 과량 사용하여 음이온 히알루론산과 이온결합을 통해서 불용성 침전물 형태로 제조하거나, 과량의 가교제를 사용하여 불용성 형태를 만든 후 건조하여 물리적으로 입자화 시키거나, 또는 히알루론산의 카르복실기에 소수성 물질을 결합시켜 유기용매에 녹인 후 용매 추출법으로 제조하는 것들이었는데, 이는 입자의 크기가 상당히 작고, 불균일한 모양을 가지면서, 수용액상에 팽윤 정도가 매우 낮은 단단한 불투명한 입자형태로서 응용분야에서 한계를 보여 왔다.
위와 같이 히알루론산의 독특한 물질 특성으로 인해, 공지된 제조 방법으로는 균일한 구형의 모양과 투명하면서도, 수용액상에서 팽윤 정도가 매우 높은 비드를 제조할 수가 없었다.
또한, 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼블록 공중합체(triblock copolymer)를 사용하여 온도감응성 특성을 부여하기 위해서는 13중량% ~ 30중량%의 고함량을 적용해서 제조할 수밖에 없었다.
따라서, 본 발명은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결할 수 있는 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형 형태의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명의 목적은 균일한 구형 모양 및 크기 조절, 가교를 통한 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔의 분해기간 조절, 수용액에 대한 높은 팽윤성, 우수한 물리적인 안정성을 가짐으로써 체내, 체외의 다양한 환경에서도 생체적합성이 우수하여 의료기기, 제약, 화장품, 식품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있는 투명하고, 팽윤도가 높으면서도 균일한 구형의 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조함에 있어 구형을 형성하기 위한 소량의 가교제를 사용하는 고효율의 2단계 반응 공정과 3단계 정제 공정을 통해서 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 이는 기존 방법 들이 구형 비드의 외부를 지질화 및 캡슐화를 진행하는 방법, 유화제 및 계면활성제 등을 사용하는 방법, 과량의 가교제를 사용하여 불용성 형태를 만든 후 건조하여 물리적으로 입자화 방법, 소수성 물질을 결합시켜 유기용매에 녹인 후 상분리하는 방법을 실시하지 않아, 투명한 고순도의 히알루론산 구형 비드 겔을 제공하기에 적합하다. 또한, 온도감응성의 특성을 부여하기 위해 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼블록 공중합체(triblock copolymer) 사용 함량을 12중량% 이하로 제조하여 안전한 제형을 구현할 수 잇다.
본 발명자들은 이러한 목적을 달성하기 위하여 광범위한 연구와 수많은 실험을 거듭한 끝에, 화학 유화제 및 화학 계면활성제 등를 사용하지 않고 히알루론산 용액과 오일의 상대 비율을 통하여 비드의 크기를 조절하고, 소량의 가교제를 사용한 2단계 가교 반응으로 고효율의 화학적 결합과 3단계 정제공정을 통해서 제조하게 되었다. 또한, 낮은 함량의 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼블록 공중합체(triblock copolymer)를 적용하여 온도감응성 특성을 부여하게 되었다. 상기 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 고순도이면서 균일하고 선택적인 크기의 투명한 구형 형태를 지닐 뿐만 아니라 121도씨 멸균조건에서도 그 형태가 분해되지 않는 특성을 가지며, 생체적합성, 점탄성, 팽윤성, 안정성 등이 우수함이 확인되어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 온도감응성 특성을 나타내는 히알루론산 비드 겔 제조 방법으로서, (a) 히알루론산 또는 그의 염을 알칼리 수용액에 넣고, 가교제를 첨가한 후 균질하게 혼합한 반응물을 반응시키는 반응 단계; (b) 상기 반응물을 오일과 함께 교반 시켜 가교 공유결합을 형성하는 가교 반응 단계; (c) 상기 가교 반응 단계에서 수득한 생성물을 정제하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 생성물을 온도감응성 고분자 혼합 조제하는 단계를 포함하는 균질한 구형의 히알루론산 비드 겔 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시 태양으로서, 온도감응성 히알루론산 비드 겔의 frequency sweep을 통해 1Hz에서 storage modulus(G', Pa) 값이 37℃에서 25℃보다 2배 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 본 발명의 제조 방법은 유화제, 화학 계면활성제 및 화학 가용화제를 사용하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 본 발명의 제조 방법은 (a) 단계에서 가교제는 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위를 기준으로 1% 내지 30당량% 만큼 투입되는 것을 특징으로 한다.
가교제는 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위(repeating unit)를 기준으로 1당량% 미만으로 투입하면 쉽게 분해가 되고 형태가 유지되지 못하는 단점을 보이게 되고, 30당량%를 초과하여 투입하면, 높은 가교제 사용으로 인한 부작용 빈도수가 증가하고 또한, 팽윤도가 낮은 단단한 물성으로 인해 사용 편의성 측면에서도 바람직하지 못하다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, (a) 단계에서 반응물 중 히알루론산 또는 그의 염의 농도는 0.1 내지 10 N의 알칼리 수용액에 대하여 1 내지 30중량%일 수 있으며, 5 내지 20중량%인 것이 더욱 바람직하다.
히알루론산 또는 염의 농도는 0.1 내지 10 N의 알칼리 수용액에 대하여 1중량% 미만이면 가교가 제대로 되지 않아서 형태 유지가 어려워 바람직하지 못하며, 30중량%를 초과하면 너무 높은 농도로 인해 균질한 혼합이 어려워서 불균일한 반응이 일어나고 너무 높은 가교로 인해 단단한 특성이 나타나므로 바람직하지 못하다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, (a)단계는 반응 온도 5 내지 50℃, 반응 시간은 30 분 ~ 24 시간 범위 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, (b)단계는 반응 온도 5 내지 50℃, 반응 시간은 1시간 내지 96 시간 범위 내에서 수행될 수 있으며, 교반 속도는 100 rpm 내지 2,000 rpm으로 반응을 시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, (b)단계에서 가교제가 첨가된 히알루론산 또는 그의 염 알칼리 수용액과 오일의 중량비는 1:1 ~ 1:9일 수 있다.
(c) 단계에서 가교 공유결합 후, 가교물에 남아있는 수분을 제거하기 위해 다양한 종류의 유기 용매를 사용하여 침전을 시켜주고, 오일을 제거하기 위해 수회 세척하면서 가교가 된 히알루론산 비드를 회수한다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 가교제는 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글라콜 다이글라이시딜에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산다이올다이글라이시딜에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리터드라메틸렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜다이글라이시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글라이시딜에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 다이글리세롤폴리글라이세롤에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리그라이딜에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판몰리글라이시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌 (1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨폴리글라이시딜에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글라이시딜에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 오일은 미네랄 오일 (mineral oil), 미디움 체인 트리글라이세라이드 (medium chain triglycerides), 맨헤이든유 (menhaden oil), 아마인유 (linseed oil), 코코넛 오일 (coconut oil), 대구 오일 (cod oil, fish oil), 대두유 (soya bean oil), 고래기름 (whale oil), 목화 씨 오일 (cotton seed oil), 참깨 씨 오일 (sesame seed oil), 땅콩 기름 (peanut oil), 올리브 오일 (olive oil), 라드 기름 (lard oil), 야자유 (palms oil), 옥수수 기름 (corn oil), 채유 (rapeseed oil), 골유 (bone oil), 챠이나 우드 오일 (china wood oil) 및 피마자유 (castor oil)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 정제 단계는 (a) 상기 가교 반응 단계를 거친 히알루론산 비드 겔을 회수하는 단계; (b) 상기 회수된 구형 겔을 증류수, 산성용액, 산성염이 첨가된 수용액 및 PBS 중에서 선택된 하나 이상을 사용하여 세척하는 제1 정제 단계; (c) 상기 제1 정제 단계를 거친 히알루론산 비드 겔을 유기용매 수용액으로 세척하는 제2 정제 단계; (d) 상기 제2 정제 단계를 거친 히알루론산 비드 겔을 증류수, 산성용액, 산성염이 첨가된 수용액 및 PBS 중에 서 선택된 하나 이상을 사용하여 세척하는 제3 정제 단계; 및 (e) 상기 제3 정제 단계에서 수득된 히알루론산 비드 겔을 분리 회수하고 온도감응성 고분자 혼합 조제하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
정제 단계에서 일정이상의 가교가 이루어진 히알루론산 또는 그의 염 가교물을 (b) 단계에서 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액 및 PBS으로 수회 세척을 하여 미반응의 가교제 및 수산화 이온을 제거한다.
(b) 단계에서 정제가 된 비드 겔을 다시 유기용매에 침전시킨 후, (c) 단계에서 유기용매 수용액에 일정시간 팽윤을 시켜 준 후, 유기용매로 수회 세척을 하여 오일과 미반응의 가교제 및 불순물을 제거한다.
다시 (d) 단계에서 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액 및 PBS으로 수회 세척을 하여 미반응의 가교제, 불순물 및 유기용매를 제거한 후 최종적으로 (e) 단계에서 온도감응성 고분자 혼합 조제하여 최종적으로 히알루론산 비드 겔을 제조한다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 유기용매는 DMSO, DMF, 아세트나이트릴, 메탄올, THF, 아세톤, 아세톤 수용액 및 탄소수 2 내지 6의 알코올 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 팽윤 단계에서 사용하는 유기용매 수용액은 유기용매 대비 증류수의 중량비가 9:1 ~ 1:9인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 일 실시 태양으로서, 온도감응성 고분자 혼합 조제 단계에서 사용하는 고분자는 분자량이 1 ~ 500kDa의 범위의 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 삼원 공중합체를 80mg/mL ~ 120mg/mL의 농도로 하는 것이 바람직하다.
이상 설명한 바와 같이, 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔 제조 시 오일상에서 유화제를 사용하지 않고 다양한 종류의 오일 및 수용액과 오일의 종류 및 상대 비율을 조절하여 히알루론산 구형 비드 겔 크기와 물성을 조절할 수 있다.
또한, 2단계 가교 반응을 통하여 소량의 가교제를 사용하면서도 고효율의 가교 효율 및 수율을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 3단계 정제 방법을 통하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드겔의 투명도 및 물성 조절이 가능하다.
본 발명을 통해 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 투명한 구형 형태로 선택된 크기와 분해 기간, 점탄성, 온도감응성 특성을 나타내며, 생체적합성이 우수하며, 열과 효소에 대하여 매우 안정하다.
도 1은 실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조한 구형의 히알루론산 비드 겔에 대한 rheometer을 사용하여 temperature sweep 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 투명하고, 구형의 형태를 지니고 있는 히알루론산 비드 겔이 PBS에 팽윤 되어 있는 것을 광학현미경로 관찰한 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 구형의 온도감응성 히알루론산 비드 겔에 대한 rheometer을 사용하여 25℃와 37℃에서의 frequency sweep 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조한 구형의 히알루론산 비드 겔에 대한 Extrusion force 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1에서 제조한 구형의 온도감응성 히알루론산 비드 겔에 대한 주사침 통과 후 성상을 관찰한 도면이다.
본 발명은 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔 제조 시 오일상에서 유화제를 사용하지 않고 히알루론산 용액과 오일의 종류 및 상대 비율로 비드 크기를 조절하고, 에폭시 반응기를 둘 이상 가지고 있는 소량의 가교제 (polyfunctional epoxide)와 화학적으로 결합시킨 히알루론산 구형의 비드 겔 및 그 제조방법을 제공한다.
상기 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 그 크기가 특별히 제한되지 않으나, 미세입자의 평균 직경이 50 ~ 2,000 um가 바람직하다. 히알루론산 구형 비드 겔의 크기에 따라서 의학적으로 적용되는 범위를 다양화할 수 있다.
본 발명에서 히알루론산의 용어는 산의 형태와 그의 염을 간략하게 표현하고 있는데, 상기 히알루론산 염에는, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염이 모두 포함된다.
투명하고 팽윤도가 높으면서도 균일한 온도감응성 히알루론산 구형의 비드 겔을 형성하고 다양한 물성 및 생체적합성을 형성하기 위하여, 상기 히알루론산 또는 그 의 염의 분자량은 특별히 제한되지 않으며 100,000 내지 5,000,000 달톤(dalton)인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법은, 히알루론산 또는 그의 염을 알칼리 수용액에 넣고, 동시에 소량의 가교제를 넣어 균일하게 혼합하여 반응하는 1단계 반응 단계, 상기 반응 혼합물을 다양한 종류의 오일 상에서 분산시켜서 진행하는 2단계 가교 반응 단계, 이러한 반응을 거친 반응물을 회수하여 미반응물 및 불순물을 제거하기 위하여 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액 및 PBS로 정제하는 제1 정제 단계, 유기용매 수용액으로 정제하는 제2 정제 단계, 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액 및 PBS로 정제하는 제3 정제 단계를 포함한다. 또한, 온도감응성 고분자를 최소로 적용하여 온도에 따른 물성 변화 특성을 부여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 히알루론산 구형 비드 겔에는 본 발명의 효과를 손상시키 지 않는 범위 내에서 기타 성분들이 더 포함될 수도 있다.
앞서의 설명과 같이, 본 명세서에서 사용되는 히알루론산은 산의 형태와 그의 염을 모두 포함하는 개념이므로, 본 발명의 제조방법에서 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함한다.
상기 히알루론산을 용해하는 알칼리 수용액 제조에 이용되는 알칼리 시약은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직한 예로서 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아수와 같은 시약이 사용된다. 상기 알칼리 수용액의 농도는 특별히 제한되지 않으며 농도는 0.1 내지 10N인 것이 히알루론산의 용해 및 가교 반응을 위해 바람직하다.
상기 가교제는, 히알루론산 또는 그의 염의 알코올기와 반응하여 에테르 결합을 형성하여 히알루론산 또는 그의 염 간에 가교가 이루어진다. 에폭시 작용기와 알코올과의 반응은 고온과 알칼리 상태에서 반응이 진행되는 것으로 알려져 있고, 반응 진행에 따라서 히알루론산 또는 그의 염에 붙어있게 되므로 부산물은 발생하지 않는다. 단, 반응 효율이 낮을 경우, 히알루론산 또는 그의 염과 결합한 가교제의 여러 에폭시 작용기중 미반응의 에폭시 작용기가 히알루론산 또는 그의 염에 남아있게 되며, 이러한 잔량의 미반응 에폭시 작용기는 향후 생체 내 물질과 반응할 위험이 있어 이를 최소화하거나 에폭시 작용기를 가수분해하여 비활성 작용기로 변환시키는 추가의 반응과 공정이 필요하다. 또한, 과량의 가교제를 첨가하는 경우는 미반응의 가교제가 히알루론산 또는 그의 염의 가교 물질에 남아있을 위험성이 매우 크다. 따라서 이러한 위험을 최소화하기 위하여, 본 발명에 기술된 바와 같이 적당한 양의 가교제를 사용하여 고효율의 반응을 유도하는 것이 히알루론산 구형 비드 겔의 생체적합성의 관점에서 뿐만 아니라 제조공정효율 측면에서도 매우 바람직하다.
상기 가교제가 균일하게 혼합된 히알루론산 또는 그의 염 알칼리 수용액을 다양한 종류의 오일과 혼합한 후 적절히 교반하고 일정 온도에서 가교 반응을 시켜 주게 된다. 오일 상에서 분산되어 있는 히알루론산 또는 그의 염 알칼리 수용액은 용매가 증발하면서 서서히 고농도로 바뀌게 되고 이에 따라 실질적인 반응농도가 증가하면서 반응의 효율성을 극대화 시킬 수 있어 소량의 가교제를 사용하여 우수한 물성을 지닌 히알루론산 구형 비드 겔을 제조할 수 있다. 따라서, 상기 기술된 히알루론산 가교 반응 공정은 낮은 농도로 가교제가 혼합되고 용매가 증발함에 따라 가교 반응은 상대적으로 고농도에서 이루어지기 때문에 낮은 농도의 가교제가 사용되었을 때의 장점과 고농도의 가교제가 사용되었을 때의 장점을 동시에 취할 수 있다. 이러한 히알루론산 구형 비드 겔 제조방법은 견고하고 특별한 물성을 지닌 히알루론산 구형 비드 겔을 제조할 수 있을 뿐만 아니라 가교 반응의 효율성을 동시에 가질 수 있다.
또한, 상기 가교제가 포함된 히알루론산 또는 그의 염 알칼리 수용액을 다양한 종류의 오일과 혼합 시 그 혼합시간과 수용액 대비 오일 비율을 조절하여 히알루론산 구형 비드 겔의 물성을 조절할 수도 있다.
유화제가 첨가되지 않는 상태에서 히알루론산 구형 비드 겔의 크기는 교반 속도, 오일의 종류 및 수용액 대비 오일의 비율을 통해서 조절이 되고 있는데, 오일 상의 점도가 높을수록 히알루론산 구형 비드 겔의 크기가 작아지는 결과를 보이고 있다. 이는 상대적으로 오일 상 보다 높은 점도를 보이고 있는 히알루론산 및 그의 염 알칼리 수용액이 두 개의 상 간의 점도 차이가 줄어 들면서 보다 원활하게 분산이 되고 있기 때문으로 보인다.
또한, 비드의 크기는 교반 속도가 증가할수록, 히알루론산 및 그의 염 알칼리 수용액의 점도가 낮을수록 작아지고 있다.
상기 공유 가교 결합 후, 비드 겔의 회수에는 DMSO, DMF, 아세트나이트릴, 메탄올, THF, 아세톤, 아세톤 수용액, 에탄올 등의 탄소수 2 내지 6의 알코올 또는 알코올 수용액을 포함하는 유기용매를 사용할 수 있다.
본 발명자들은 여러 실험들을 통해 히알루론산 또는 그 염의 알칼리 수용액이 상기 기술된 다양한 유기용매와 오일 상에 섞이는 특성에 따라 제조된 히알루론산 구형 비드 겔의 물성이 달라짐을 관찰하였고, 유기용매의 극성지표가 증류수와 가까울수록 제조된 히알루론산 구형 비드 겔의 투명도는 증가하고 복합 점도는 낮아짐을 알 수 있어서 다양한 물성의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조할 수 있는 방법을 제시하게 되었다.
상기 혼합물의 가교 반응 시 온도는 특별히 제한되고 있지 않지만 5℃ 내지 50℃인 것이 바람직하고 15 ~ 40℃이 더욱 바람직하다. 또한, 반응 용액에서 가교 결합의 생성을 위한 지속시간은 특별히 제한되지 않으나 반응 시간이 길어질수록 히알루론산이 알칼리 조건에 의해 가수 분해되어 제조된 히알루론산 구형 비드 겔의 물리적 점탄성이 낮아지는 문제점이 있으므로, 반응 시간은 1단계에서는 30분 내지 24 시간, 2단계에서는 1시간 내지 96시간으로 하는 것이 바람직하다.
상기 히알루론산 또는 그의 염의 가교 반응 후 히알루론산 구형 비드 겔 산물은 유기용매를 사용하여 오일을 제거해 준다. 상기 유기용매에는 디에틸에테르, DMSO, DMF, 아세트나이트릴, 메탄올, THF, 아세톤, 아세톤 수용액, 에탄올 등의 탄소수 2 내지 6의 알코올 또는 알코올 수용액을 사용할 수 있다.
상기 오일이 제거된 히알루론산 구형 비드 겔 산물은 증류수나 산성 용액 또는 염이 첨가된 수용액 및 PBS에서 수회 세척을 하여 미반응의 가교제와 수산화 이온을 제거한다.
상기 염이 첨가된 수용액을 사용함으로써 미반응물의 세척 효율을 증대시킬 수 있는데, 이 경우 염화나트륨 수용액, 인산 수용액, 인산염이 포함된 염화나트륨 수용액이 가장 적합하다.
상기 정제된 히알루론산 구형 비드 겔을 PBS에 팽윤시키고, 온도감응성 합성고분자를 첨가하여 조제하고, 121oC에서 멸균하여 최종적으로 생체에 적용할 수 있는 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하거나, 유기용매 또는 유기용매 수용액을 이용하여 히알루론산 구형 비드 겔을 침전상태로 회수하고 질소, 공기, 열, 감압을 통하여 건조한 후 의약용 적용 목적에 따라 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 크기 형태별로 분류하고 PBS에 재 팽윤시키고, 온도감응성 합성고분자를 혼합 조제하고, 121oC에 멸균하는 과정을 거쳐 최종적으로 생체에 적용할 수 있는 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조할 수도 있다.
상기 히알루론산 구형 비드 겔 침전에 사용하는 유기용매에는 DMSO, DMF, 아세트나이트릴, 메탄올, THF, 아세톤, 아세톤 수용액, 에탄올 등의 탄소수 2내지 6의 알코올 또는 알코올 수용액을 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 제조된 히알루론산 또는 그의 염 가교물질은 기타 당 업계에 공지된 통상의 방법들에 의하여 다양하게 분리 및/또는 정제될 수 있으며, 그러한 대표적인 예로는, 증류 (대기압 하에서의 증류 및 감압증류를 포함), 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석, 세척 등이 있다. 상기 분리 및/정제는 히알루론산 유도체 마이크로비드 제조 시 각 공정 후 마다, 또는 일련의 반응 후에 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 결과물인 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔은 121oC 멸균이 가능하고, 체내에 도입된 상태에서 어떠한 부작용도 없을 뿐만 아니라, 주름개선 필러, 성형보조제, 관절주사제, 유착방지제로 사용할 수 있는 물성을 제공할 수 있으며, 약물전달체 또는 세포전달체로써 특정한 약물 또는 세포를 특정 생체부위에 전달하는 매개체 (vehicle)로도 사용될 수 있고, 조직공학용 세포지지체 등으로도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1] 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 100mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[비교예 1] 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 25mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[비교예 2] 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 50mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[비교예 3] 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 75mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[비교예 4] 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 125mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[비교예 5] 히알루론산 구형 비드 겔 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨 (분자량: 1,000,000)을 0.25 N 166mL NaOH 용액에 넣고, 동시에 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (BDDE)를 0.4183g첨가하였다 (히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 10 mol%). 30분 동안 자공전원심믹서를 통해 혼합을 시켜 준 후, 40℃에서, 1시간 동안 1단계 반응을 시켜준다. 상기 반응물을 332g의 MCT 오일상에 떨어뜨린다. 700rpm 속도로 교반 시켜 주면서 40℃에서 24 시간 동안 2단계 반응을 시켜 주었다.
24 시간 후, 500 ml의 아이소프로판올을 서서히 첨가시켜 혼합액에서 분산되어 있는 히알루론산 비드들을 회수시켜 주었다. 아이소프로판올로 3회 세척하였다. 회수된 히알루론산 비드들을 각 5L PBS로 5회 세척하였다. 세척이 된 히알루론산 비드에 아이소프로판올 1L을 첨가하여 침전을 시켜준다. 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 30% 아이소프로판올 1.5L을 첨가하여 1시간 동안 팽윤을 시켜준다. 팽윤 후, 3회 반복하여 아이소프로판올 교체를 실시하였다. 침전물을 다시 각 5L PBS로 5회 세척하였다.
세척된 히알루론산 구형 비드 겔의 일부는 PBS에 팽윤 시킨 후, 비드 겔에 Pluronic F127을 150mg/mL이 되도록 첨가한 후, 121oC 멸균하여 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하고, 다른 히알루론산 구형 비드 겔 일부는 유기용매 침전공정, 질소가스 건조공정, 분류공정, PBS 재 팽윤 공정, 121oC 멸균공정을 거쳐 용도별로 적합한 크기 및 형태의 히알루론산 구형 비드 겔을 제조하였다.
[실험예] 실시예 1에서 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔과 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조된 히알루론산 구형 비드 겔의 물성 비교
실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조된 온도감응성 하알루론산 비드 겔이 구형임을 확인하였다(도면 2).
실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔의 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터 (rheometer)를 사용하여 25℃에서 40℃까지 temperature sweep(1Hz, frequency)을 통해 온도에 따른 storage modulus(G', Pa)의 값 변화를 확인하였다(도면 1, 표 1). 실시예 1에서 온도에 따른 물성변화가 크게 일어나고 있음을 확인하였고, 25℃와 37℃에서 frequency sweep을 통해 0.02 ~ 1 Hz의 진동수에서 (complex modulus, Storage modulus, Loss modulus)을 측정하였고(도면 3), 그 결과 체온에서 높은 물성을 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔의 25℃와 37℃에서의 storage modulus(G') 비교
실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
G'25℃(Pa) 105.4 74.15 113.6 82.78 2,317 4,074
G'37℃(Pa) 1,023 110 132.3 92.18 2,885 4,726
G'37℃(Pa)/G'25℃(Pa) 9.71 1.48 1.16 1.11 1.25 1.16
실시예 1 및 비교예 1, 2, 3, 4, 5에서 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔의 Extrusion force를 측정한 결과(도면 5), 실시예 1의 경우 27G needle 장착 시 7.14 ± 2.39N, 비교예 1의 경우 27G needle 장착 시 10.31 ± 2.55N, 비교예 2의 경우 27G needle 장착 시 8.79 ± 2.55N, 비교예 3의 경우 27G needle 장착 시 10.09 ± 2.49N, 비교예 4의 경우 27G needle 장착 시 12.91 ± 1.09N, 비교예 5의 경우 27G needle 장착 시 12.79 ± 2.15N 값을 보이고 있어, 현재 시장에서 판매가 되고 있는 주요 제품들의 Extrusion force인 10 ~ 20 N과 유사한 결과를 보이고 있다.
실시예 1에서 제조된 온도감응성 히알루론산 구형 비드 겔을 27G Needle 통과 후에도 모양이 변하지 않고 구형의 형태를 잘 유지하고 있음을 확인하였다(도면 5).

Claims (13)

  1. 온도감응성 특성을 나타내는 히알루론산 비드 겔 제조 방법으로서,
    (a) 히알루론산 또는 그의 염을 알칼리 수용액에 넣고, 가교제를 첨가한 후 균질하게 혼합한 반응물을 반응시키는 반응 단계;
    (b) 상기 반응물을 오일과 함께 교반 시켜 가교 공유결합을 형성하는 가교 반응 단계;
    (c) 상기 가교 반응 단계에서 수득한 생성물을 정제하는 단계; 및
    (d) 상기 수득한 생성물에 삼원 공중합체를 80mg/mL ~ 120mg/mL의 농도로 처리하여 혼합 조제하는 단계;
    를 포함하는 히알루론산 비드 겔 제조방법으로,
    상기 삼원 공중합체는 8 내지 12중량%로 포함하고,
    상기 히알루론산 비드 겔은 구형의 형태이고, 주파수 스윕(frequency sweep)을 통해 1Hz에서 저장 탄성률(G', Pa) 값이 37℃에서 25℃보다 2 내지 20배인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 가교제는 히알루론산 또는 그의 염의 반복단위를 기준으로 1 내지 30당량% 범위로 투입되는 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 반응물 중 히알루론산 또는 그의 염의 농도는 0.1 내지
    10 N의 알칼리 수용액에 대하여 1 내지 30중량%인 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계는 반응 온도 5 내지 50℃, 반응 시간은 30 분 ~ 24 시간 범위 내에서 수행되는 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계는 반응 온도 5 내지 50℃, 반응 시간은 1시간 내지 96 시간 범위 내에서 수행되는 히알루론산 비드 겔 제조방법
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계에서 가교제가 첨가된 히알루론산 또는 그의 염 알칼리 수용액 과 오일의 중량비는 1:1 ~ 1:9인 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (d)단계에서 삼원 공중합체는 분자량이 1 ~ 500kDa의 범위의 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 삼원 공중합체인 것을 특징으로 하는 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 가교제는 부탄다이올다이글라이시딜에테르 (1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글라콜 다이글라이시딜에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 헥산다이올다이글라이시딜에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리터드라메틸렌글라이콜다이글라이시딜에테르 (polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜다이글라이시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글라이시딜에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 다이글리세롤폴리글라이세롤에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리그라이딜에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판몰리글라이시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌 (1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨폴리글라이시딜에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글라이시딜에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 오일은 미네랄 오일 (mineral oil), 미디움 체인 트리글라이세라이드 (medium chain triglycerides), 맨헤이든유 (menhaden oil), 아마인유 (linseed oil), 코코넛 오일 (coconut oil), 대구 오일 (cod oil, fish oil), 대두유 (soya bean oil), 고래기름 (whale oil), 목화 씨 오일 (cotton seed oil), 참깨 씨 오일 (sesame seed oil), 땅콩 기름 (peanut oil), 올리브 오일 (olive oil), 라드 기름 (lard oil), 야자유 (palms oil), 옥수수 기름 (corn oil), 채유 (rapeseed oil), 골유 (bone oil), 챠이나 우드 오일 (china wood oil) 및 피마자유 (castor oil)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 히알루론산 비드 겔 제조방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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